KR101267886B1

KR101267886B1 - 참바늘버섯을 이용한 당뇨성 이상지질혈증 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101267886B1
Application number: KR1020100062699A
Authority: KR
Inventors: 오득실; 위안진; 박화식; 윤병선; 김상겸
Original assignee: 전라남도
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2010-06-30
Publication date: 2013-05-27
Also published as: KR20120002025A

Abstract

본 발명은 참바늘버섯, 일명 침버섯을 이용한 당뇨성 이상지질혈증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 참바늘버섯의 최적 배양 조건을 확립하였고, 이로부터 얻은 참바늘버섯의 총콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 함량을 낮추고, HDL-콜레스테롤 함량을 높이며, 혈중 중성지질 함량을 낮추는 참바늘버섯의 당뇨성 이상지질혈증 예방 및 치료 활성을 밝힌 참바늘버섯의 당뇨성 이상지질혈증 치료 및 예방 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 참바늘버섯의 당뇨성 이상지질혈증 치료제 등의 의약품, 건강식품 등의 용도를 제시하면서 농가소득 향상에 기여할 수 있다.

Description

참바늘버섯을 이용한 당뇨성 이상지질혈증 예방 및 치료용 조성물{composition using Mycoleptodonoides aitchisonii for preventing and treating dyslipidemia in diabetes}

본 발명은 총콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 함량을 낮추고, HDL-콜레스테롤 함량을 높이며, 혈중 중성지질 함량을 낮추는 참바늘버섯을 이용한 당뇨성 이상지질혈증 예방 및 치료용 조성물 및 이를 포함하는 건강식품에 관한 것이다.

버섯은 칼로리, 나트륨, 지방, 그리고 콜레스테롤 함량이 낮은 반면, 단백질, 탄수화물, 섬유, 비타민 그리고 무기질 등이 풍부한 영양학적 특성을 지녀 최근 천연 건강식품으로 각광을 받고 있다[Buswell, J. A. and Chang, S. T., Edible mushrooms : attributes and applications, In : Chang, S. T., Buswell, J. A. and Miles, P. G., (eds). 1993. Genetics and breeding of edible mushrooms, Gordong and Breach, Y-parc, Switzerland, 297-324.;, 1993; Rajarathnam, S., Shashireka, M. N. and Bano, Z., 1993. Biopotentialities of the Basidiomycetes, Adv . Appl . Microbiol., 64, 1088-1117].

예로부터 버섯은 한방에서 자양강장, 소자, 혈중지질강하, 거담, 관상동맥의 혈류량 증대, 혈압강하 등의 약리효과와 면역증강 효과가 있는 것으로 알려져 왔다. 버섯류에 관한 연구는 중국, 일본 및 한국에서 활발히 이루어지고 있으며 일본의 경우 기린과 야쿠르트가 공통 출하한 회사인 기린 야쿠르트 넥스트 스테이지가 참바늘버섯(일명 침버섯; Mycoleptodonoides aitchisonii)을 사용한 건강 보조 식품인「브나하리다케」를 개발하여 발매를 시작하였으며 동 상품은 기린그룹이 세계 최초로 균상재배에 성공해 특허를 취득한「브나하리타케」를 이용한 과립 타입의 건강보조식품이다.

또한, 일본의 기린그룹에서는 맥주박을 이용한 버섯 균상용 영양원 「겐키노코」를 개발, 상품화하여 재배한 버섯재배 기술을 살려 1998년에 브나하리버섯 Mycoleptodonoides aitchisonii의 균상 재배에 성공하여 시즈오카 공립대학과의 공동 연구 등에서 브나하리버섯의 각종 기능성에 대한 연구를 실시하여 동물로 뇌기능 개선작용이나 발암 프로세스 억제작용 등의 작용을 확인하였다.

이외에도 참바늘버섯에서 분리 정제한 렉틴의 혈구응집평가를 실시한 결과 당응집력이 매우 강한 것으로 나타났으며[Hirokazu Kawagishi, Jun-ichi Takagi, Tomoko Taira, Takeomi Murata, Taichi Usui. 2001. Purification and characterization of a lectin from the mushroom Mycoleptodonoides aitchisonii. Phytochemistry 56(2001) : 53-58], 참바늘버섯 추출물이 스트레스나 우울증에 효과가 있는 도파민 방출 또한 증진시키는 효과가 있었다[Jae-hoon Choi, Madoka Horikawa, Hiroshi Okumura, Shinya Kodani, Kaoru Nagai ,Daisuke Hashizume, Hiroyuki Koshino, Hirokazu Kawagishi,. 2009. Endoplasmic reticulum (ER) stress protecting compounds from the mushroom Mycoleptodonoides aitchisonii. Tetrahedron 65 (2009) 221-224; .Satoshi Okuyama, Emi Sawasaki, Hidehiko Yokogoshi. 2004. Conductor Compounds of Phenylpentane in Mycoleptodonoides aitchisonii Mycelium Enhance the Release of Dopamine from Rat Brain Striatum Slices. Nutritional Neuroscience 7(2) : 107-111; Okuyama S, Lam NV, Hatakeyama T, Terashima T, Yamagata K, Yokogoshi H. 2004. Mycoleptodonoides aitchisonii affects brain nerve growth factor concentration in newborn rats. Nutritional Neuroscience 7(5-6) : 341-349].

또한, 쥐의 피부를 대상으로 참바늘버섯 메탄올 추출물을 쥐의 피부암 2단계에서 처리한 결과 발암증진 억제효과가 있는 것으로 나타나는(Ken 등 1998) 등 국내에는 아직 알져지지 않아 연구가 미흡한 실정이지만 기능성이 높은 버섯으로 드러났다.

참바늘버섯은 약리적 효능과 함께 영양학적으로 매우 우수한 것으로 기대되고 있으나, 우리나라에서도 강원도와 제주도 등의 참나무 등 활엽수의 고목에 드물게 발생하는 것으로 알려져 있고, 지금까지 자연채취만 가능했다.

본 발명자들은 참바늘버섯의 균을 배양하여 최적의 자생조건을 연구한 결과 참바늘버섯을 농가에서 손쉽게 인공 재배할 수 있는 방법을 발명하여 단기간에 대량 생산할 수 있음을 실험을 통해 확인하고 이를 국내 특허 출원한 바 있다[국내 특허 출원번호 제2009-0128824호].

또한, 본 발명자들은 상기 재배방법을 기초로 하여 최적의 배양 조건을 확립하였고, 이로부터 얻어진 참바늘버섯의 자실체가 당뇨성 이상지질혈증 치료 및 예방 활성이 우수함을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 참바늘버섯을 유효성분으로 함유하는 당뇨성 이상지질혈증 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

특히, 상기 참바늘버섯은 글루코오스 1 ~ 10 g, 말트 추출물 5 ~ 20 g, 효모 추출물 1 ~ 10 g 및 아가 10 ~ 30 g을 첨가한 후 1 L로 조정한 기내배양용 고체배지에서 배양하여 얻거나, 글루코오스 5 ~ 20g, 펩톤 5 ~ 20 g, 말트 추출물 10 ~ 30 g 및 효모 추출물 5 ~ 20 g을 첨가한 후 1 L로 조정한 기내배양용 액체배지에서 배양하여 얻은 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건강식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 참바늘버섯을 유효성분으로 함유하는 당뇨성 이상지질혈증 예방 및 치료용 조성물을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건강식품을 또 다른 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 참바늘버섯을 유효성분으로 함유하는 당뇨성 이상지질혈증 예방 및 치료용 조성물, 및 이를 포함하는 건강식품에 관한 것이다.

상기 참바늘버섯은 참바늘버섯의 균체, 자실체, 배양액 또는 배양물을 포함한다.

본 발명에 사용한 참바늘버섯은 일반적인 참바늘버섯 배양에 의해 얻어진 추출물이면 모두 가능하나, 다음과 같은 배양 조건에 의해 얻어지는 것이 더욱 바람직하다.

참바늘버섯 기내배양을 위한 고체 접종배지로는 덱스트로오스 효모 아가 배지(HA), 말트 효모 펩톤 아가 배지(MYPA), 포테이토 덱스트로오스 아가 배지(PDA), 글루코오스 말트 효모 아가 배지(YMG), 펩톤 말트 추출물 아가 배지(ME), 글루코오스 펩톤 말트 효모 아가 배지(YM) 등이 제한 없이 사용 가능하다. 바람직하게는 글루코오스 말트 효모 아가 배지(YMG), 펩톤 말트 추출물 아가 배지(ME), 말트 효모 펩톤 아가 배지(MYPA) 배지이다. 고체 접종배지의 참바늘버섯 접종 후 5일 동안 글루코오스 말트 효모 아가 배지(YMG) 배지가 가장 우수한 균사 생장을 보였으며, 펩톤 말트 추출물 아가 배지(ME), 말트 효모 펩톤 아가 배지(MYPA) 등도 우수한 결과를 나타낸다.

상기 고체 접종배지는, 예를 들어 글루코오스 말트 효모 아가 배지(YMG) 배지의 경우, 글루코오스 1 ~ 10 g, 말트 추출물 5 ~ 20 g, 효모 추출물 1 ~ 10 g 및 아가 10 ~ 30 g을 첨가한 후 1 L로 조정하여 제조할 수 있다.

참바늘버섯 기내배양을 위한 액체 접종배지로는 포테이토 덱스트로오스 배지(PDB), 말트 이스트 추출물 배지(Malt Yeast Extract media), 버섯 완전배지(Mushroom Complete Media), 백합 배지(Lilly media), 글루코오스 트립톤 배지(Glucose Tryptone media), 글루코오스 펩톤 배지(Glucose Peptone media) 등이 제한 없이 사용 가능하다. 바람직하게는 포테이토 덱스트로오스 배지, 말트 이스트 추출물 배지, 글루코오스 트립톤 배지, 글루코오스 펩톤 배지이고, 가장 바람직하게는 글로코오스 펩톤 배지이다. 액체 접종배지의 참바늘버섯 접종 후 30일째 균사체 중량을 비교하면 글루코오스 펩톤 배지는 버섯 완전배지 또는 백합 배지의 7배 이상의 균사체 생장을 나타내고, 포테이토 덱스트로오스 배지, 말트 이스트 추출물 배지, 글루코오스 트립톤 배지의 2 배 이상의 균사체 생장을 나타낸다.

상기 액체 접종배지는, 예를 들어 글루코오스 펩톤 배지의 경우 글루코오스 5 ~ 20g, 펩톤 5 ~ 20 g, 말트 추출물 10 ~ 30 g 및 효모 추출물 5 ~ 20 g을 첨가한 후 1 L로 조정하여 제조할 수 있다.

또한, 참바늘버섯 배양을 위한 pH는 4.5 ~ 6.3이며, 보다 바람직하게는 5.0 ~ 6.0이다. 또한, 균사체 배양을 위한 배양온도는 18 ~ 28 ℃, 보다 바람직하게는 22 ~ 27 ℃이고, 가장 바람직하게는 24 ~ 26 ℃이다.

또한, 본 발명에서 높은 생산성으로 단기간에 접종원을 제조하기 위해서는 상기 접종배지 100 중량부에, 말토오스 및 수크로오스 중 어느 하나 이상의 탄소원 0.3 ~ 3 중량부; 아스파라긴 및 질산나트륨 중 어느 하나 이상의 질소원 0.02 ~ 0.2 중량부; 및 제이인산칼륨 및 황산마그네슘 중 어느 하나 이상의 미네랄 0.02 ~ 0.2 중량부; 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 영양원을 첨가 배양하는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는 탄소원으로 수크로오스를 0.8 ~ 2.4 중량부 사용하고, 질소원으로 아스파라긴을 0.03 ~ 0.15 중량부 사용하며, 미네랄로 황산마그네슘을 0.06 ~ 0.12 중량부 사용하는 것이다. 접종배지에 상기 탄수화물원, 질소원 및 미네랄을 첨가함으로써 일정 배양기간 내 균사체 중량을 1.5배, 바람직하게는 2배 이상 증진시켜, 접종원 배양기간을 단축시킬 수 있다.

본 발명의 참바늘버섯 자실체를 발생시키기 위한 톱밥배지는 활엽수 톱밥 60 ~ 90 중량부, 미강, 소맥분, 맥주박 및 건비지 중 어느 하나 이상의 영양원 10 ~ 40 중량부를 혼합하고, 배지 총 중량에 대하여 수분 함량이 55 ~ 70 중량%가 되도록 물을 첨가한 후 입병하고 살균한다. 상기 참바늘버섯 자실체를 발생시키기 위한 배양배지의 영양원으로는 미강 또는 소맥분이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 미강을 사용하는 것이다.

자실체 발생을 위한 톱밥배지로 사용되는 활엽수로는 참나무류, 벚나무, 단풍나무, 뽕나무, 구실잣밤나무, 너도밤나무, 포플러, 서어나무 등을 사용할 수 있다. 활엽수의 종류에 따라 사용되는 톱밥배지의 영양원도 달리하는 것이 바람직하고, 참바늘버섯의 자실체 발생에 가장 적합한 것은 참나무류 톱밥에 소맥분을 첨가하거나, 또는 벚나무 톱밥에 미강을 첨가한 것이 가장 효율적이다.

또한, 자실체 발생용 배지 제조 시 사용되는 증류수에 탄소원, 질소원, 미네랄 등 영양원을 첨가하는 경우 배양속도도 비교적 빠르고 버섯발생도 우수하다.

따라서 자실체 발생용 배지 100 중량부에 말토오스 및 수크로오스 중 어느 하나 이상의 탄소원 0.3 ~ 3 중량부; 아스파라긴 및 질산나트륨 중 어느 하나 이상의 질소원 0.02 ~ 0.2 중량부; 및 제이인산칼륨 및 황산마그네슘 중 어느 하나 이상의 미네랄 0.02 ~ 0.2 중량부; 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 영양원을 첨가하는 것이 바람직하다.

참바늘버섯 균체와 자실체에 대하여 in vitro 항당뇨 효과를 평가한 결과, 참바늘버섯 균체는 고농도에서는 IL-6에 의한 Akt의 인산화 감소에 크게 영향을 미치지 못한 것으로 나타났으나 참바늘버섯 자실체는 농도 의존적으로 IL-6에 의한 Akt의 인산화 감소를 차단하였다. 이는 최고농도인 100㎍/ml에서 IL-6에 의해 인슐린 단독 처리군 대비 약 50% 감소한 Akt의 인산화를 77%로 증가시키는 효과였다.

STZ 당뇨 유발군에서 참바늘버섯 자실체 5% 첨가사료를 급여함으로써 혈당농도가 약 100mg/dL 저하됨은 물론 혈중콜레스테롤 역시 조절 효과가 있는 것으로 보여 혈당 조절 기능 이상 및 혈청 지질 대사 이상에서 오는 각종 질환의 예방 및 개선 작용에 효과가 있다고 사료된다.

따라서, 본 발명은 참바늘버섯을 유효성분으로 포함하는 당뇨성 이상지질혈증 예방 및 치료용 조성물을 포함한다.

한편, 야콘은 포도당, 과당과 같은 단당류, 설탕과 같은 2당류, 그리고 3~10탄당의 올리고당 등 몇 가지 형태의 탄수화물을 저장하며 약간의 전분과 이눌린(inulin), 감미성분으로 프락토올리고당이 주성분이다. 특히, 프락토 올리고당은 설탕과 유사한 구조를 가지면서 설탕 고유의 식품가공 특성을 가질 뿐만 아니라, 설탕과는 다르게 난소화성이므로 비만이나 당뇨병 환자에게 사용할 수 있는 천연 대체 감미료로 알려져 있다.

본 발명은 상기 참바늘버섯 추출물 외에 야콘 추출물을 추가로 포함시킴으로써 항당뇨 및 항산화 활성을 상승시킬 수 있다.

상기 야콘 추출물은 야콘 건조 분말을 물, 알코올 또는 이의 혼합물에 의해 추출한 것을 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 참바늘버섯 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에이스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 웨텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 참바늘버섯의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 참바늘버섯은 1일 0.0001 내지 200 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 참바늘버섯을 유효성분으로 포함하는 건강식품을 제공한다. 상기 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 첨가할 수 있다. 상기 건강식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

이때, 건강식품 중의 참바늘버섯의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 20 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 15 g, 바람직하게는 5 내지 12 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명은 동물실험에서 총콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 함량을 낮추고, HDL-콜레스테롤 함량을 높이며, 혈중 중성지질 함량을 낮추는 참바늘버섯의 당뇨성 이상지질혈증 예방 및 치료 활성을 밝히고, 이로써 참바늘버섯의 당뇨성 이상지질혈증 치료제 등의 의약품, 건강기능식품, 사료첨가제 등의 용도를 제시하면서 농가소득 향상에 기여할 수 있다.

도 1은 제조예 S1 내지 S6의 고체 접종배지에서 참바늘버섯 균주를 접종하여 5일간 배양한 후의 균체 생장 길이를 나타낸 그래프이다.
도 2는 제조예 L1 내지 L6의 액체 접종배지에서 참바늘버섯 균주를 접종하여 30일간 배양한 후의 균사체 중량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 톱밥 배지의 활엽수 수종과 영양원의 종류에 따른 배양 25일째의 균사 생장 길이를 나타낸 그래프이다.
도 4는 참바늘버섯 균체의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 5는 참바늘버섯 자실체의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 6은 인슐린에 의한 Akt 인산화 평가 결과는 나타낸 것이다.
도 7은 IL-6에 의한 인슐린 저항성을 나타낸 것이다.
도 8은 메트포르민에 의한 Akt의 인산화 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 참바늘버섯의 균체에 의한 Akt 인산화 반응에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 참바늘버섯의 자실체에 의한 Akt 인산화 반응에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 사용한 동결건조한 참바늘버섯과 그 건조 분말을 나타낸 것이다.
도 12는 당뇨 유발 쥐에 참바늘버섯 5%첨가 사료를 먹이로 투여한 STZ+MA 5% 식이군의 항당뇨 효능을 확인한 것이다.
도 13은 STZ 당뇨 유발군에서 참바늘버섯 자실체 5% 첨가사료를 급여하여 콜레스테롤 조절 효과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하나, 본 발명이 아래 실시예 만으로 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 고체 접종배지 제조

하기 표 1의 배지 조성에 따라 재료를 증류수에 투입하여 1L로 조정하고 5반복으로 조제한 후 121℃에서 15분 동안 고압 멸균하였다. 15℃로 냉각하여 고체 접종배지를 제조하고, 여기에 참바늘버섯 접종원 20cc를 접종하여 25 ℃, 5일간 배양하였다.

구분	제조예S1	제조예S2	제조예S3	제조예S4	제조예S5	제조예S6
포테이토	-	200	-	-	-	-
K₂HPO₄	-	-	-	-	-	-
KH₂PO₄	-	-	-	-	-	-
MgSO₄7H₂O	-	-	-	-	-	-
글루코오스	-	-	-	10	4	-
말토오스	-	-	-	-	-	-
덱스트로스	-	20	-	-	-	20
티아민 HCl	-	-	-	-	-	-
DL-아스파라긴	-	-	-	-	-	-
펩톤	1	-	5	5	-	-
말트 추출물	30	-	20	3	10	-
효모 추출물	2	-	-	3	4	2
한천	20	20	20	20	20	20

제조예 2: 액체 접종배지 제조

하기 표 2의 배지 조성에 따라 재료를 증류수에 투입하여 1L로 조정한 후 100 ℃로 가열 교반한다. 이를 121℃에서 15분간 고압 살균한 후 15℃로 냉각하여 액체 접종배지를 제조하고, 여기에 참바늘버섯 접종원 20cc를 접종하여 25 ℃, 30일간 배양하였다.

구분	제조예L1	제조예L2	제조예L3	제조예L4	제조예L5	제조예L6
PDB 혼합배지	24g	-	-	-	-	-
KH₂PO₄	-	-	-	0.05g	1g	-
MgSO₄7H₂O	-	-	-	0.05g	0.5g	-
글루코오스	-	10g	10g	-	-	5g
말토오스	-	-	-	-	10g	-
덱스트로스	-	-	-	2g	-	-
DL-아스파라긴	-	-	-	-	2g	-
펩톤	-	10g	5g	0.2g	-	-
말트 추출물	-	15g	-	-	-	-
효모 추출물	-	10g	3g	0.2g	-	3g
트립톤	-	-	-	-	-	10g

실험예 1: 최적 배지 선발

제조예 S1 내지 제조예 S6 고체 접종배지에서 25 ℃, 5일간 배양한 후 균사생장 길이의 평균을 구하여 도 1에 나타내었다. 도 1과 같이, 제조예S5 배지가 7.9 cm로 가장 균사생장이 우수했으며, 그 다음은 제조예S3 배지가 7.2 cm의 생장량을 보였다.

제조예 L1 내지 제조예 L6 액체 접종배지에서 25 ℃, 30일간 배양한 후 균체를 필터링 한 후 항량이 될 때까지 건조시키고, 배지별로 순수 균체 무게를 측정하여 도 2에 나타내었다. 제조예 L2의 글루코오스 펩톤 배지는 제조예 L4의 버섯 완전배지 또는 제조예 L5의 백합 배지의 7배 이상의 균사체 생장을 나타내었다.

제조예 L1, L3 및 L6의 포테이토 덱스트로오스 배지, 말트 효모 추출물 배지, 글루코오스 트립톤 배지 또한 제조예 L2 보다는 못하지만, 제조예 L4에 비해서는 3 배 이상의 균사체 생장을 나타내었다.

실험예 2: 최적 배양조건

제조예 L2 배지를 1N 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 3 ~ 7로 조정하고, 그 배지에 참바늘버섯 균주를 접종하여 25 ℃, 30일간 배양하여 균체 생성량을 비교한 결과, 액체 접종배지에서 균사체 배양을 위한 최적 pH는 5.0 ~ 6.0이었다.

최적 배양 온도조건 선발을 위해 제조예 S5 배지를 기본배지로 사용하여 5반복으로 조제한 후 121℃에서 15분 동안 고압 멸균하였다. 15 ℃ 냉각된 배지에 기 배양된 균주를 접종하여 15 ~ 30 ℃에서 5일간 배양하여 균사생장 길이를 비교한 결과, 고체 접종배지에서 균사체 배양을 위한 온도는 20 ~ 30 ℃이고, 최적 온도는 25 ℃였다.

균사체의 생장이 가장 우수한 제조예 L2 배지 100 중량부에 하기 표 3과 같이 탄수화물원, 질소원, 미네랄 및 비타민을 첨가한 액체 접종배지를 제조한 후 제조예 2와 같이 멸균하고, 참바늘버섯 균주를 접종하여 25 ℃, 30일간 배양하였다.

각각 균체를 필터링 한 후 항량이 될 때까지 건조시키고, 배지별로 순수 균체 무게를 측정하여 하기 표 3에 함께 나타내었다.

구분	제조예L2 배지에 추가된 성분	함량 (중량부)	균체량 (g)
제조예 L2	-	-	0.55
탄수화물원	말토오스	0.5	0.66
		1.0	0.63
		2.0	0.68
	수크로오스	0.5	0.60
		1.0	0.79
		2.0	0.73
	덱스트로오스	0.5	0.62
		1.0	0.56
		2.0	0.65
질소원	아스파라긴	0.025	0.58
		0.05	0.69
		0.1	0.69
	질산나트륨	0.025	0.67
		0.05	0.08
		0.1	0.49
	글리신	0.025	0.52
		0.05	0.51
		0.1	0.64
미네랄	제이인산칼륨	0.025	0.67
		0.05	0.65
		0.1	0.73
	황산마그네슘7수화물	0.025	0.64
		0.05	0.71
		0.1	0.78
비타민	티아민	0.025	0.48
		0.05	0.57
		0.1	0.53

특히, 제조예 L2 배지 100 중량부에 수크로오스를 1 중량부, 아스파라긴을 0.05 중량부 및 황산마그네슘7수화물 0.1 중량부 추가한 배지에서 제조예 2와 같이 멸균하고, 참바늘버섯 균주를 접종하여 25 ℃, 30일간 배양하였을 때는, 균체량을 1.07 g 얻어 제조예 L2 배지로만 배양한 것에 비해 동일 배양기간 동안 1.95 배의 균체를 얻을 수 있었다.

제조예 3: 자실체 발생 배지 제조

오리나무, 참나무류, 포플러, 벚나무, 중국단풍나무, 뽕나무 총 6 종 중에서 하나의 톱밥 80 중량%에 미강 또는 소맥분을 20 중량% 혼합한 다음 증류수를 첨가하여 수분함량을 60 중량% 내외로 조정하였다. 수분 조절이 완료된 배지를 시험관 30 g씩 5반복으로 입병하여 봉합 후, 121℃에서 90분간 고압살균하고, 15℃로 냉각하여 톱밥배지를 제조하고, 참바늘버섯 접종원 20cc을 접종하여 25 ℃, 25일간 배양하였다.

오리나무를 제외한 모든 활엽수 톱밥에서 소맥분을 첨가한 것에 비해 미강을 첨가한 경우가 균사의 생육이 현저히 우수함을 확인할 수 있었고, 그 중에서도 참나무, 벚나무, 중국단풍나무, 뽕나무 톱밥의 균사 생장이 우수함을 확인할 수 있었다[도 3].

실시예 1: 항당뇨 활성 평가

1. 버섯 추출물의 시료 조제

제조예 2의 참바늘버섯 균체, 벚나무톱밥 및 미강배지를 이용한 제조예 3의 참바늘버섯 자실체를 각각 에탄올로 80℃에서 2 시간 동안 환류 추출하고 이를 동결 건조시켰다. 시료를 멸균 주사용 증류수로 용해시킨 후 0.25㎛의 여과지가 장착된 주사기를 이용하여 멸균시켰다. 멸균된 시료를 1.5 ml 튜브에 분주하여 -70 ℃에서 실험에 사용할 때까지 보관하였다.

2. 세포 독성 평가

SK-hep-1 세포(human hepatic carcinoma cell)을 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/ml 페니실린과 100 mg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Medium) 배지에서 37 ℃ 다습한 공기/CO₂ 배양기에서 배양하였다.

상기 96 웰 플레이트에 배양된 세포가 80% 정도의 confluency에 도달한 후 배지를 혈청이 고갈된 배지로 교체하여 밤새도록 안정화시킨 후 다양한 농도의 시험물질을 가하여 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후 배양액을 MTT용 배지로 교체하고 2 시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 DMSO로 세포 용해 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

버섯 추출물을 24시간 동안 세포에 처리하고 MTT법을 이용하여 세포 생존율(cell viability)을 측정하였다[도 4 및 도 5].

예비실험 결과, 참바늘버섯 자실체는 독성이 나타나지 않아서 0.1, 1, 10과 100㎍/ml로 농도조건을 설정하였으며, 반면 참바늘버섯 균체는 100㎍/ml에서 세포 생존율의 큰 변화가 관찰되어 0.1, 1, 10과 25㎍/ml로 농도 조건을 설정하였다. 참바늘버섯 자실체는 최고농도인 100㎍/ml에서 약 15% 정도 세포 생존율을 증가시켰다. 그러나, 참바늘버섯 균체는 25㎍/ml에서 세포 생존율을 각각 10% 감소시켜 독성을 유발하였다.

이상의 결과는 참바늘버섯 자실체의 경우 고농도에서는 세포증식에 영향을 미칠 가능성을 추측할 수 있는 반면 참바늘버섯 균체의 경우는 고농도에서 세포독성을 유발할 가능성을 시사하였다. 따라서, 참바늘버섯 자실체는 100㎍/ml을 최대 농도로, 참바늘버섯 균체는 10㎍/ml을 최대 농도로 하여 이후 항당뇨 평가 실험을 수행하였다.

3. 인슐린 저항성 모델에서 참바늘버섯 추출물의 항당뇨 효과

SK-hep1 세포를 배양하여 12 웰 플레이트에 세포를 배양하여 80% 정도의 컨플런시(confluency)에 도달한 후 배지를 혈청이 고갈된 배지로 교체하여 밤새도록 안정화시켰다. 100 ng/ml의 IL(interleukin)-6을 처리하고 1.5, 3, 6, 12 그리고 24시간 후에 100 nM의 인슐린을 처리하고 10분후에 세포를 포집하였다. 대조군 실험으로 동일한 농도와 시간동안 인슐린 처리 없이 IL-6만을 처리한 후 세포를 포집하였다.

12 웰 플레이트에 세포를 배양하여 80% 정도의 컨플런시(confluency)에 도달한 후 배지를 시험물질을 포함하는 혈청이 고갈된 배지로 교체하여 배양하였다. 22시간 동안 배양한 후 IL-6를 100 ng/ml 농도로 1.5시간 동안 처리하고 100 nM의 인슐린을 10 분 동안 처리한 후 세포를 포집하였다.

정해진 시간에 세포를 PBS로 3회 세척 후 Laemmli 용액(loading buffer)를 70㎕가하고 셀 스크랩퍼(cell scraper)로 긁어 세포를 포집하였다. 시료를 25G의 바늘이 달린 주사기로 4 ~ 5회 통과시켜 균질화시킨 후 분주하여 -70 ℃에 보관하였다. SDS-PAGE는 Laemmli 법에 준하여 시행한 후 인산화된 Akt와 반응하는 선택적인 항체를 사용하여 이뮤노블랏(immunoblot)을 수행하였다.

버섯 추출물의 항당뇨 효과를 인슐린 유래 Akt의 인산화로 평가하였다[도 6 및 도 7]. 인슐린의 처리는 농도 의존적으로 Akt의 인산화를 증가시켰으며, 또한 시간에 따른 변화에서도 처리 후 5분 이내부터 Akt의 인산화를 증가시켜 실험에 사용한 SK-hep1 세포가 인슐린에 반응하는 세포임을 확인하였다. SK-hep1 세포에 처리된 100 ng/ml의 IL-6는 1.5시간 이내부터 인슐린에 의한 Akt의 인산화를 억제하여 인슐린 신호를 부분적으로 차단하였다. 따라서, 본 실험에 사용한 세포주와 IL-6 그리고 인슐린의 농도 및 시간 조건이 인슐린의 반응성을 평가하기에 적합하였다. 인간 간암 유래 세포주인 SK-hep1세포에서 인슐린은 Akt의 인산화를 시간 및 농도의존적으로 증가시키는 것을 도 11에서와 같이 확인하였다. 이 결과는 실험에 사용한 세포가 인슐린 반응성 세포임을 의미한다고 말할 수 있다.

또한, 인간간암 세포주인 SK-hep1 세포에 염증성 사이토카인인 IL-6를 100 ng/ml 농도로 처리하였을 경우 인슐린에 의한 Akt의 인산화는 현격하게 감소하는 것을 확인하였다[도 7]. 본 실험에서는 1.5시간부터 24 시간까지 억제 효과가 유지되었음을 알 수 있었으므로 이후 실험에서는 IL-6를 처리하고 1.5 시간 후에 인슐린을 처리하고 10분에 세포를 포집하였다. 그리고 양성대조군으로 간에서 작용하는 항당뇨병 의약품인 메트포르민(metformin)을 사용하였다.

실험결과, 양성대조군인 메트포르민은 0.3 mM 농도부터 IL-6에 의한 인슐린

유래 Akt의 인산화 감소를 도 8과 같이 억제하였으며, 3 mM 농도에서 완벽한 억제가 관찰되었다. 이 결과는 메트포르민이 IL-6 유래 인슐린 저항성 모델에서 효과적으로 인슐린 신호를 활성화시켜 양성대조군으로 사용할 수 있음을 보인다.

또한, 본 실험에서 항당뇨 효과를 평가하기 위해 사용된 참바늘버섯 균체는 도 9와 같이 고농도에서는 IL-6에 의한 Akt의 인산화 감소에 크게 영향을 미치지 못한 것으로 나타났다. 그러나, 참바늘버섯 자실체는 농도의존적으로 IL-6에 의한 Akt의 인산화 감소를 차단하였다. 최고 농도인 100㎍/ml에서 IL-6에 의해 인슐린 단독 처리군 대비 약 50% 감소한 Akt의 인산화를 77%로 증가시키는 효과가 있었다[도 10].

종합적으로 Akt의 인산화로 평가된 인슐린의 반응성은 IL-6의 처리에 의해서 유효하게 억제되어 인슐린 저항성이 유발되었으며 양성대조군인 3 mM의 메트포르민은 완벽하게 IL-6의 억제 효과를 차단하였다. 실험에 사용한 참바늘버섯 자실체 시료는 IL-6에 의해 억제된 Akt의 인산화를 활성화시켰다. 특히, 참바늘버섯은 양성대조군과 비교하였을 때 의미 있는 항당뇨 효과를 보일 가능성을 시사하였다.

4. 동물실험에 의한 in vivo 항당뇨 및 당뇨성 이상지질혈증 효능 평가

1) 실험모델 및 동물 사육

실험 동물은 4주령 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐를 모델로 사용하기 하여 1주일간 안정화 사육한 후 3마리씩 그룹화하여 정상 대조군, STZ(Streptozotocin) 당뇨병 유발군, STZ 당뇨병 유발 후 참바늘버섯 분말(5%) 식이군으로 구분하여 실험을 수행하였다.

2) 당뇨 유발

STZ 그룹과 STZ+참바늘버섯 식이군에 사용할 쥐는 다음의 방법으로 당뇨병을 유발시켜 실험에 사용하였는데, 5mM 시트릭 버퍼(citric buffer, pH 4.5)에 녹인 STZ(50mg/kg body weight)을 쥐의 복강에 1회 주사하여 취장의 β-세포를 파괴시켜 인슐린 결핍의 영구당뇨를 유발하였다. 사육 6일째에는 16시간 절식 후 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당을 검사하고 혈당치가 200mg/dL 이상인 쥐만을 실험동물로 선별하였다.

3) 사료 식이 및 사육

당뇨 유발을 위하여 정상 대조군을 제외한 STZ 당뇨병 유발군, STZ 당뇨병 유발 후 참바늘버섯 분말(5%) 식이군 그룹은 STZ 주사 후 사육 7일째 참바늘버섯 분말을 5% 첨가한 먹이를 주면서 3주간 사육하였다.

4) 당뇨 효능 조사

3주 동안 사육이 끝난 후 대조군(정상 쥐에 일반사료 투여), STZ 대조군(당뇨 유발쥐에 일반사료 투여), STZ + MA 5% 식이군(당뇨 유발 쥐에 참바늘버섯 5% 첨가사료 투여)으로 구분하여 혈청 내 글루코오스 함량과 총 콜레스테롤 함량, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 중성지질 함량을 조사하였다.

5) 혈청 내 글루코오스 함량 비교

3주 동안 사육이 끝난 후 대조군(정상 쥐에 일반사료 투여), STZ 대조군(당뇨 유발 쥐에 일반사료 투여), STZ+MA 5% 식이군(당뇨 유발 쥐에 참바늘버섯 5% 첨가사료 투여)으로 구분하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

글루코오스를 발색시켜 STZ에 주입한 후, 참바늘버섯 5%첨가 사료를 먹이고 쥐의 혈청 내 글루코오스 함량을 조사하였다.

그 결과, 당뇨 유발 쥐에 일반사료를 투여한 STZ 대조군에 비해서 당뇨 유발 쥐에 참바늘버섯 5%첨가 사료를 먹이로 투여한 STZ+MA 5% 식이군에서 혈당치가 100mg/dL 감소한 233.8100 mg/dL로 측정되어 참바늘버섯이 항당뇨에 효능이 있는 것으로 나타났다[도 12].

6) 혈청 내 지질 함량 비교

3주 동안 사육이 끝난 후 대조군(정상 쥐에 일반사료 투여), STZ 대조군(당뇨 유발 쥐에 일반사료 투여), STZ+MA 5% 식이군(당뇨 유발 쥐에 참바늘버섯 5% 첨가사료 투여)으로 구분하여 혈청 내 총 콜레스테롤 함량, HDL-콜레스테롤, 중성지질(Triglyceride), LDL-콜레스테롤 함량을 조사한 결과 총 콜레스테롤 함량은 STZ 대조군 148.0mg/dL에 비해 STZ+MA 5% 식이군이 정상 쥐에 가까운 155.3mg/dL로 조사되었다.

STZ+MA 5% 식이군의 경우 HDL-콜레스테롤은 STZ 대조군 51.8mg/dL에 비해 비교적 높은 59.9mg/dL로 대조군 65.8mg/dL에 유사한 결과를 보였다. 따라서, 참바늘버섯 추출물 5%를 사료로 먹인 식이군이 동맥경화를 지연시키거나 감소시키는 HDL-콜레스테롤 함량을 높이는 것으로 나타났다[도 13].

LDL-콜레스테롤 역시 STZ+MA 5% 식이군이 대조군 62.7mg/dL에 가까운 71.3mg/dL으로 조사되어 STZ 대조군 101.6mg/dL에 비해 현저히 낮은 것으로 조사되어 참바늘버섯 추출물이 항당뇨 효능과 함께 나쁜 콜레스테롤인 LDL-콜레스테롤 함량을 낮추는 것으로 드러났다[도 13].

또한, 중성지질 함량은 STZ+MA 5% 식이군이 120.0mg/dL로 대조군 97.7mg/dL에 비해서는 비교적 높은 수치였지만 STZ 대조군 153.8mg/dL에 비하면 낮은 수준으로 참바늘버섯 추출물이 체내 혈중 중성지질 함량을 조절해 주는 것으로 드러났다[도 13].

이러한 결과는 STZ 당뇨 유발군에서 참바늘버섯 자실체 5% 첨가사료를 급여함으로서 혈당 농도가 저하됨은 물론 혈중 콜레스테롤 조절 효과가 있는 것으로 보여 혈당 조절 기능 이상 및 혈청 지질 대사 이상에서 오는 각종 질환의 예방 및 개선 작용에 효과가 있다고 사료된다.

제조예 4: 야콘 건조분말의 제조

실험에 사용한 야콘 괴근은 전라남도 순천시 승주읍에서 재배하여 2009년 10월 하순 수확한 후 깨끗이 씻어낸 다음 껍질째 세절하여 열풍 건조한 후 시료를 분쇄하여 건조 분말을 제조하였다.

제조예 5: 야콘 조추출물의 제조

상기 야콘 건조분말 가루 100g과 물 2L를 혼합하여 100℃ 4시간 동안 추출하였고, 추출된 상기 시료는 여과지(whatman No. 2)를 이용하여 여과하여 진공 회전 농축기로 감압농축 후 동결건조하여 추출물 시료를 얻었다.

제제예 1: 산제의 제조

참바늘버섯 추출물 20 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2: 정제의 제조

참바늘버섯 추출물 10 ㎎

옥수수 전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3: 건강 음료의 제조

참바늘버섯 추출물 10 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3 g

물 적량

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ의 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 건강 음료를 제조하였다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층이나 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

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참바늘버섯 자실체를 유효성분으로 하고, 당뇨환자의 혈당, LDL(저밀도지단백)-콜레스테롤 및 중성지질을 저하시키고 동시에 HDL(고밀도지단백)-콜레스테롤을 상승시킴으로써 당뇨환자의 당뇨성 이상지질혈증(dyslipidemia)을 예방 및 치료하기 위한 경구용 약학 조성물.
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