KR101264379B1 - 이미지 데이터 처리 방법 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

이미지 데이터 처리용 방법, 저장매체, 및 시스템이 제공된다. 상기 방법, 저장매체, 및 시스템에 대한 실시예는 아래의 단계 중 하나 이상을 수행하는 구성을 포함한다: 백그라운드 신호 측정, 분류 염료 방출 및 클러스터 거부를 이용한 미립자 식별, 인터-이미지 정렬, 인터-이미지 미립자 상관관계, 리포터 방출의 형광 통합, 및 이미지 평면 표준화.
이미지 데이터 처리, 저장매체, 미립자, 신호, 염료

Description

이미지 데이터 처리 방법 및 시스템{METHODS AND SYSTEMS FOR IMAGE DATA PROCESSING}
본 발명은 전체적으로 이미지 데이터 처리 방법 및 시스템에 관한 것이다. 특정 실시예는 멀티플렉스 애플리케이션용 미립자의 이미지를 처리하는 하나 이상의 단계를 수행하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
아래의 설명 내용과 예들은 본 섹션 내에 포함됨으로써 종래기술로 인정되는 것은 아니다.
바이오기술분야에서 현재 이용할 수 있는 다수의 도구 내에서 전하결합소자(CCD) 검출기와 같은 검출기를 사용하는 이미지작업이 이용되고 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 다수의 시스템은 타겟 인간(또는 다른 동물) 세포를 이미지화하도록 되어 있다. 그러나, 이러한 시스템은 세포가 속하는 고유성 또는 하위세트를 측정하는 빛의 상이한 파장을 이용하여 이미지를 생성하는데 사용되지 않는다. CCD 검출기가 세포의 형광을 측정하는데 사용되는 멀티플렉스 애플리케이션에 대해, 세포 또는 다른 미립자의 하위세트 또는 클래스는 파장의 구성과 같은 형광 방출의 특성이라기보다 이미지 내에서의 형광의 방출의 절대 위치에 기초하고 있다.
따라서, 멀티플렉스 애플리케이션의 미립자의 이미지에 대한 데이터 처리 방법 및 시스템을 개발하는 것이 바람직하다.
위에서 제기한 문제는 대부분 컴퓨터-구현 방법, 저장 매체, 미립자의 데이터 이미지 처리와 관련된 하나 이상의 단계를 수행하는 시스템에 의해 해결된다. 아래의 내용은 컴퓨터-구현 방법, 저장 매체, 및 시스템을 예를 들어 설명하는 실시예일 뿐이며, 청구범위의 내용을 제한하는 의미로 해석되어서는 안된다.
컴퓨터-구현 방법, 저장 매체, 및 시스템에 대한 실시예는 관련된 형광물질을 갖는 미립자의 이미지를 하위섹션 배열로 분리하고, 하위섹션 내에 다수의 픽셀에 대한 광 매개변수의 통계값을 측정하고, 또한 측정된 통계값을 대응하는 하위섹션에 대한 백그라운드 신호로 할당하도록 구성될 수 있다.
컴퓨터-구현 방법, 저장매체, 시스템에 대한 다른 실시예들은 부가적으로 또는 대안으로서 제1 미리 정해진 임계값 이상의 광 매개변수 값을 나타내는 이미지 내에서 하나 이상의 픽셀을 식별하기 위해 관련된 형광물질을 갖는 미립자의 이미지를 분석하도록 구성될 수 있다. 나아가, 이 방법, 저장매체, 및 시스템은 각각 세트 내에서 광 매개변수의 최대값을 나타내고 적어도 하나의 위치를 둘러싸는 다수의 픽셀에 대한 광 매개변수의 강도 변화율을 연산하는 하나 이상의 식별된 픽셀 세트 내에서 위치를 측정하도록 구성될 수 있다.
컴퓨터-구현 방법, 저장매체, 및 시스템에 대한 다른 예는 부가적으로 또는 대안으로서 미립자의 다중 이미지에 대한 데이터를 획득하도록 구성될 수 있고, 여기에서 각각의 다중 이미지는 상이한 파장 대역에 대응한다. 나아가, 이 방법, 저장매체, 및 시스템은 다중 이미지의 복합 이미지를 생성하고 다중 이미지 중 적어도 하나의 좌표를 조종하여 각각의 다중 이미지 내에서 미립자에 대응하는 스팟(spot)이 뒤이어 일어나는 복합 이미지 내에 수렴하도록 구성될 수 있다.
컴퓨터-구현 방법, 저장매체, 및 시스템에 대한 또 다른 실시예는 부가적으로 또는 대안으로서, 제1의 미리 정해진 임계값 이상의 광 매개변수 값을 나타내는 제1 이미지 및 제2 이미지 내에서 하나 이상의 픽셀을 각각 식별하기 위해, 관련된 형광물질의 농도가 균일한 미립자의 제1 이미지와 관련된 형광물질의 농도를 알 수 없는 미립자의 제2 이미지를 분석하도록 구성될 수 있다. 또한, 이 방법, 저장매체, 시스템은 제1 이미지와 제2 이미지 내에서 제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하는 단계가 수행되는 동안 각각 식별된 픽셀 모음을 카테고리화하도록 구성될 수 있고, 제1 이미지 및 제2 이미지의 하위섹션의 치수는 실질적으로 동일하다. 이 방법, 저장매체, 및 시스템은 또한 제1 이미지 내의 각 하위섹션에 대해 카테고리화된 픽셀 모음의 형광 방출의 레벨을 통계적으로 나타내는 것을 전개하도록 구성될 수 있다. 또한, 이 방법, 저장매체, 및 시스템은 형광의 표준화된 값을 얻기 위해 대응하는 제1 이미지 하위섹션에 대해 전개된 통계에 의해 제2 이미지를 분석하는 단계가 수행되는 동안 식별된 각각의 픽셀 모음의 형광 방출 레벨을 구분하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 목적과 특징들은 첨부된 도면을 참고하여 아래의 상세한 설명 내용을 읽어보면 명확히 이해할 수 있을 것이다.
도 1은 멀티플렉스 애플리케이션 용 이미지를 획득하고 처리하는 시스템의 한 실시예의 단면도이다.
도 2는 이미지 내 백그라운드 신호를 측정하는 방법을 개략적으로 나타내는 흐름도이다.
도 3은 추가 이미지 처리를 위해 미립자의 발견 및 미립자 수용 또는 거절의 측정에 대한 방법을 개략적으로 나타내는 흐름도이다.
도 4는 인터 이미지 정렬 방법을 개략적으로 나타내는 흐름도이다.
도 5는 이미지 시스템에 대해 표준화 매트릭스를 생성하고 또한 후속 이미지에 대한 표준화 매트릭스를 적용하는 방법을 개략적으로 나타내는 흐름도이다.
본 발명은 여러가지로 변형되거나 다른 형태를 취할 수 있지만, 그 특정 실시예가 도면에 예를 들어 도시되어 있고 아래에서 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 도면과 상세한 설명은 본 발명을 특정 실시예로 제한하려는 것은 아니며, 그와 반대로 첨부된 청구항에 의해 이루어지는 본 발명의 사상과 범위 내에 속하는 변형물, 등가물, 및 대체물을 모두 포함한다는 것을 이해하여야 한다.
실시예들이 미립자에 대해 설명되고 있지만 여기에 기술된 시스템과 방법은 또한 마이크로스피어, 폴리스티렌 비드, 마이크로입자, 금 나노입자, 퀀텀 도트, 나오 도트, 나노 쉘, 비드, 마이크로비드, 라텍스입자, 라텍스비드, 형광 비드, 형광 입자, 컬러 입자, 컬러 비드, 조직, 세포, 마이크로-유기체, 유기물, 무기물, 또는 기타 공지된 모든 이산 물질에 의해 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 미립자는 분자반응에 대해 전달수단(vehicle)의 기능을 할 수 있다. 적절한 미립자에 대한 예는 풀턴(Fulton)에게 허여된 미국특허 제5,736,330호, 챈들러(Chandler)등에게 허여된 미국특허 제5,981,180호, 풀턴(Fulton)에게 허여된 미국특허 제6,057,107호, 챈들러(Chandler)등에게 허여된 미국특허 제6,268,222호, 챈들러(Chandler)등에게 허여된 미국특허 제6,449,562호, 챈들러(Chandler)등에게 허여된 미국특허 제6,514,295호, 챈들러(Chandler)등에게 허여된 미국특허 제6,524,793호, 챈들러(Chandler)등에게 허여된 미국특허 제6,528,165호에 기술되어 있다. 본 문서에 기술된 시스템과 방법은 이러한 특허에 기술된 모든 미립자에 의해 사용될 수 있다. 또한, 본 문서에 기술된 방법과 시스템에서 사용되는 미립자는 텍사스 오스틴에 있는 주식회사 루미넥스(Luminex)와 같은 제조자를 통해 구입할 수 있다. "미립자"와 "마이크로스피어"와 같은 용어는 상호교환되면서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 시스템 및 방법과 양립하는 미립자의 유형은 미립자의 표면에 부착된 또는 미립자의 표면과 관련된 형광 물질을 갖는 미립자를 포함한다. 분류 형광(즉, 미립자가 속하는 하위세트 또는 미립자의 정체를 측정하는데 사용되고 측정되는 형광 방사물)을 제공하기 위해 형광 염료 또는 형광 미립자가 미립자의 표면에 직접 연결되어 있는, 이러한 유형의 미립자는 챈들러등에 허여된 미국특허 제6,268,222호 및 챈들러등에 허여된 미국특허 제6,649,414호에 기술되어 있고, 이들 특허문헌은 본 문서에 완전히 기재된 것처럼 통합되어 있다. 본 문서에 기재된 방법 및 시스템에서 사용될 수 있는 미립자의 유형은 또한 미립자의 코어에 통합된 하나 이상의 형광 색소 또는 형광 염료를 갖는 미립자를 포함한다.
본 문서에 기재된 방법과 시스템에서 사용될 수 있는 미립자는 하나 이상의 적절한 광원에 노출될 때 하나 이상의 형광 신호를 나타낼 수 있는 미립자를 더 포함한다. 나아가, 여기될 경우 미립자가 다수의 형광 신호를 나타낼 수 있고 각각의 신호는 미립자의 정체를 측정하도록 개별적으로 또는 함께 사용될 수 있도록, 미립자를 제조할 수 있다. 아래에서 기술하는 것처럼, 이미지 데이터 처리는 특히 다중-분석대상 유체에 대해 미립자를 분류하는 것과, 미립자에 속한 분석대상물의 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 미립자에 속한 분석대상물의 양을 나타내는 리포터 신호는 보통 작업중에 알려져 있지 않고, 특히 분류 파장 또는 파장 대역에서뿐만 아니라 리포터 파장 또는 파장 대역에서 형광을 방출하는 염색된 미립자가 여기에 기재된 프로세스를 위해 사용될 수 있다.
일반적으로 여기에서 기술하는 방법은 하나 이상의 미립자의 이미지를 분석하는 것과, 미립자의 하나 이상의 특성을 측정하기 위해 이미지로부터 측정된 데이터를 처리하는 것을 포함하고, 상기 특성은 다중 검출 파장에서 미립자의 형광 방출의 크기를 나타내는 수치값이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이어서 미립자의 하나 이상의 특성을 처리하는 것은, 미립자 표면에 속한 분석대상물의 양 및/또는 존재를 나타내는 리포터 값 및/또는 미립자가 속하는 다수의 하위세트를 나타내는 토큰 ID를 측정하기 위한 하나 이상의 수치값을 사용하는 것처럼, 풀턴에게 허여된 미국특허 제5,736,330호, 챈들러 등에게 허여된 미국특허 제5,981,180호, 챈들러 등에게 허여된 미국특허 제6,449,562호, 챈들러 등에게 허여된 미국특허 제6,524,793호, 챈들러 등에게 허여된 미국특허 제6,592,822호, 챈들러 등에게 허여된 미국특허 제6,939,720호에 기재되어 있는 방법에 따라 수행될 수 있고, 이 특허문헌들은 참고로 본 문서에 완전히 기재된 것처럼 포함된다. 한 실시예에서, 챈들러 등에게 허여된 미국특허 제5,981,180호에 기재된 기술은, 미립자가 단일 샘플 내에서 다중 분석대상물을 분석하기 위해 하위세트로 분류되는 멀티플렉스 계획 내에서 본 문서 내에 기술된 형광 측정과 함께 사용될 수 있다.
도면을 참고하면, 도 1은 축적에 맞지 않게 도시되어 있다는 것을 알 수 있다. 특히, 도면의 일부 요소에 대한 축적은 그 요소의 특징을 강조하기 위해 매우 과장되어 있다. 시스템의 일부 요소는 명확하게 하기 위해 도면에 포함시키지 아니하였다.
본 문서에 기재된 방법의 실시예에 따라 미립자의 이미지를 생성, 획득, 또는 공급하기 위한 그리고 이미지를 처리하기 위한 시스템의 한 실시예가 도 1에 도시되어 있다. 도 1에 도시된 시스템은 미립자의 다중-분석대상 측정과 같은 애플리케이션에서 사용될 수 있다. 시스템은 광원(10)을 포함하는 이미지 하위시스템을 포함한다. 광원(10)은 발광 다이오드(LED), 레이저, 아크 램프, 백열 램프, 또는 기술분야에 알려져 있는 기타의 다른 적절한 광원과 같은 광원을 하나 이상 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로서, 광원은 하나 이상의 광원(도시 안됨)을 포함할 수 있고, 이 광원은 각각 상이한 파장 또는 파장 대역을 갖는 빛을 생성한다. 도 1에 도시된 시스템에서 사용되는 광원에 대한 적절한 조합의 예는 두 개 이상의 LED를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 광원으로부터 나오는 빛이 미립자쪽으로 동시에 향하도록, 하나 이상의 광원으로부터 나오는 빛은 빔 분산기(도시 안됨) 또는 기술분야에 알려져 있는 다른 적절한 광학 소자에 의해 공통 조명 경로로 통합될 수 있다. 또는, 이미지 하위시스템은 반사 거울 및 미립자에 빛을 조명하기 위해 어느 광원이 사용되는지에 따라 광학 소자를 조명 경로 안팎으로 이동시키는 장치(도시 안됨)와 같은 광학 소자(도시 안됨)를 포함할 수 있다. 이런식으로, 광원은 미립자를 순차적으로 상이한 파장 또는 상이한 파장 대역으로 조명하도록 사용될 수 있다. 광원은 또한 기판(도시 안됨)의 하부로부터가 아니라 위로부터 기판에 빛을 비출 수 있다.
광원은 결합된 미립자 또는 물질이 형광을 방출하게 하는 파장 또는 파장 대역에서 빛을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 파장 또는 파장 대역은 미립자 내에 포함 및/또는 미립자 표면에 연결된 형광 염료 또는 다른 형광 물질을 여기시키도록 선택될 수 있다. 이런식으로, 미립자를 분류하기 위해 사용되는 형광을 미립자가 방출하도록 파장 또는 파장 대역이 선택될 수 있다. 또한, 파장 또는 파장 대역은 형광 염료 또는 미립자의 표면의 시약을 통해 미립자에 연결된 다른 형광 물질을 여기시키도록 선택될 수 있다. 이와 같이 미립자가 미립자 표면에서 발생한 반응을 검출 및/또는 그 양을 측정하는데 사용되는 형광을 방출하도록 파장 또는 파장 대역이 선택될 수 있다.
도 1에 도시된 것처럼, 이미지 하위시스템은 광원(10)으로부터 미립자(16)가 고정되어 있는 기판(14)으로 빛을 쏘는 광학 소자(12)를 포함할 수 있다. 한 예로서, 광학 소자(12)는 시준 렌즈(collimating lens)일 수 있다. 그러나, 광학 소자(12)는 광원(10)으로부터 나오는 빛이 기판(14)에 상을 형성하도록 사용될 수 있는 다른 적절한 광학 소자를 포함할 수 있다. 또한, 광학 소자는 단일 광학 소자로서 도 1에 도시되어 있지만, 광학 소자(12)는 하나 이상의 굴절 소자를 포함할 수 있다. 또한, 광학 소자(12)가 굴절 광학 소자로서 도 1에 도시되어 있지만, 광원(10)으로부터 나오는 빛이 기판(14) 위에서 상이 형성되도록, 하나 이상의 반사 광학 소자를 사용(하나 이상의 굴절 광학 소자와 함께도 이루어질 수 있음)할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
미립자(16)는 상술한 미립자 모두를 포함할 수 있다. 기판(14)은 기술분야에 알려진 어떤 적절한 기판을 포함할 수 있다. 기판(14)에 고정된 미립자는 이미지 챔버(도시 안됨) 또는 이미지 하위시스템에 대하여 고정된 미립자(16)와 기판(14)의 위치를 유지시키는 어떤 다른 장치에 놓여 있을 수 있다. 기판(14)의 위치를 유지하는 장치는 또한 이미지화하기 전에 기판의 위치를 변경하도록(예를 들어, 이미지 하위시스템이 기판에 초점을 맞추게 하도록) 구성될 수도 있다. 기판 위에 미립자를 고정하는 것은 자기인력(magnetic attraction), 진공 필터판, 또는 기술분야에 알려진 적절한 다른 방법을 이용하여 이루어질 수 있다. 이미지화를 위해 마이크로스피어의 위치를 조정하는 방법 및 시스템에 대한 예는 펨셀(Pempsell)이 2005 년 11월 9일에 출원한 미국특허출원 제11/270,786호에 기재되어 있다. 미립자 고정 방법 그 자체는 여기에 기재된 방법 및 시스템에 대해서 특히 중요한 것은 아니다. 그러나, 바람직하게, 수 초 정도 걸리는 검출기 통합 시간 동안 미립자가 인식할 수 있게 움직이지 않도록 미립자는 고정되어 있다.
도 1에 도시된 것처럼, 이미지 하위시스템은 광학 소자(18)와 광선 분할기(20)를 포함할 수 있다. 광학 소자(18)는 기판(14)으로부터 나오는 빛과 고정된 미립자(16)가 광선 분할기(20)에 대해 초점이 맞추어지도록 구성될 수 있다. 광학 소자(18)는 광학 소자(12)에 대하여 상술한 것처럼 더 구성될 수 있다. 광선 분할기(20)는 기술분야에 알려진 적절한 광선 분할기를 포함할 수 있다. 광선 분할기(20)는 광학 소자(18)로부터 나오는 빛을 빛의 파장에 기초하는 상이한 검출기 쪽으로 향하게 하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 제1 파장 또는 파장 대역을 갖는 빛이 광선 분할기(20)에 의해 전송될 수 있고, 제1 파장 또는 파장 대역과 상이한 제2 파장 또는 파장 대역을 갖는 빛이 광선 분할기(20)에 의해 반사될 수 있다. 이미지 하위시스템은 또한 광학 소자(22)와 검출기(24)를 포함할 수 있다. 광선 분할기(20)에 의해 전송되는 빛은 광학 소자(22) 쪽으로 향해질 수 있다. 광학 소자(22)는 광선 분할기에 의해 전송되는 빛의 초점을 검출기(24) 위에 맞추도록 구성되어 있다. 이미지 하위시스템은 광학 소자(26)와 검출기(28)를 더 포함할 수 있다. 광선 분할기(20)에 의해 반사되는 빛은 광학 소자(26) 쪽으로 향해질 수 있다. 광학 소자(26)는 광선 분할기에 의해 반사되는 빛이 검출기(28) 위에 초점이 맞추어지도록 구성될 수 있다. 광학 소자(22, 26)는 광학 소자(12)에 대해 상술한 것처 럼 구성될 수 있다.
검출기(24, 28)는 예를 들어 전하결합소자(CCD) 또는 CMOS 검출기, 광감 소자의 이차원 어레이, 시간지연적분(TDI) 검출기, 등과 같이 기술분야에 공지된 적절한 이미지 검출기를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 이차원 CCD 이미지 어레이와 같은 검출기는 실질적으로 전체 기판의 이미지를 얻기 위하여 또는 동시에 기판에 고정된 모든 입자의 이미지를 얻기 위하여 사용될 수 있다. 이런식으로, 기판의 조명을 받는 영역으로부터 나오는 모든 광자가 동시에 수집될 수 있고, 따라서 광전자증배관(PMT)과 스캔 장치를 포함하는 현재 이용할 수 있는 다른 시스템에서 사용되는 샘플링 간극에 의해 일어나는 에러를 제거할 수 있다. 또한, 각각의 검출기가 파장 또는 파장 대역 중 하나에서 이미지를 생성하는데 사용되도록, 시스템에 포함된 검출기의 수는 관심 대상 파장 또는 파장 대역의 수와 동일하다.
검출기에 의해 생성되는 각각의 이미지는 광학 대역통과 소자(도시 안됨) 또는 광선 분할기로부터 검출기까지의 광 경로에 배치되어 있는 기술분야에 알려진 다른 적절한 광학 소자를 사용하여 스펙트럼으로 필터링될 수 있다. 상이한 필터 "대역"은 각각의 캡쳐된 이미지에 대해 사용될 수 있다. 이미지가 획득되는 각각의 파장 또는 파장 대역에 대한 검출 파장의 중심과 폭은 미립자 분류에 대해 사용되든지 아니면 리포터 신호에 대해 사용되든지 대상 형광 방출에 부합될 수 있다. 이런식으로, 도 1에 도시된 시스템의 이미지 하위시스템은 상이한 파장 또는 파장 대역에서 동시에 다수의 이미지를 생성하도록 되어 있다. 도 1에 도시된 시스템이 두 개의 검출기를 포함하고 있을지라도, 시스템은 둘 이상의 검출기(예를 들어, 세 개 의 검출기, 네 개의 검출기, 등등)를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 상술한 것처럼, 상이한 파장 또는 파장 대역의 빛을 상이한 검출기에 동시에 향하도록 하는 하나 이상의 광학 소자를 포함함으로써, 각각의 검출기는 동시에 상이한 파장 또는 파장 대역에서 이미지를 생성하도록 구성될 수 있다.
또한, 시스템이 검출기를 다수 포함하는 것으로 도 1에 도시되어 있지만, 시스템은 하나의 검출기를 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 하나의 검출기가 여러 파장 또는 파장 대역에서 순차적으로 여러 이미지를 생성하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 상이한 파장 또는 파장 대역의 빛을 기판에 순차적으로 향하게 할 수 있고, 각각 상이한 파장 또는 파장 대역으로 기판을 조명하는 동안 상이한 이미지가 생성될 수 있다. 또 다른 예로서 단일 검출기 쪽으로 향하는 빛의 파장 또는 파장 대역을 선택하는 상이한 필터가 변경되어(예를 들어, 상이한 필터를 이미지 경로 안팎으로 이동시킴으로써), 상이한 파장 또는 파장 대역에서 순차적으로 이미지를 생성할 수 있다.
따라서, 도 1에 도시된 이미지 하위시스템은 해당하는 여러 파장에서 미립자(16)의 형광 방출을 나타내는 다수의 또는 일련의 이미지를 생성하도록 구성될 수 있다. 또한, 본 시스템은 프로세서(즉, 프로세싱 엔진)에 대한 미립자의 형광 방출을 나타내는 다수의 또는 일련의 디지털 이미지를 공급하도록 구성될 수 있다. 이러한 예에서, 시스템은 프로세서(30)를 포함할 수 있다. 프로세서(30)는 검출기(24, 28)로부터 이미지 데이터를 획득(예를 들어 수신)하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 프로세서(30)는 공지된 어떤 적절한 방법으로 검출기(24, 28)에 연결될 수 있다(예를 들어, 전송 매체(도시 안됨)를 통해, 프로세서에 대해 검출기 중 하나를 각각 연결시킴, 또는 아날로그-디지털 변환기와 같은 하나 이상의 전자 요소(도시 안됨)를 통해서, 검출기 중 하나와 및 프로세서 사이에서 각각 연결됨, 등등). 바람직하게, 미립자의 분류 및 미립자의 표면에서 일어나는 반응에 대한 정보와 같은 미립자(16)의 하나 이상의 특징을 측정하기 위해, 프로세서(30)는 이러한 이미지를 처리하고 분석하도록 구성되어 있다. 각 파장에 대한 각 미립자의 형광의 양의 입력을 갖는 데이터 배열과 같이 적절한 포맷으로 프로세서에 의해, 하나 이상의 특징이 출력된다. 특히, 프로세서는 이미지를 처리하고 분석하기 위해 본 문서에 기술된 방법 실시예의 하나 이상의 단계를 수행하도록 구성될 수 있다.
프로세서(30)는 일반적인 개인 컴퓨터, 메인프레임 컴퓨터 시스템, 워크스테이션, 등등에 공통적으로 포함되어 있는 것과 같은 프로세서일 수 있다. 일반적으로, "컴퓨터 시스템"이라는 용어는 메모리 매체로부터 명령을 실행하는 하나 이상의 프로세서를 구비한 장치를 포괄하도록 넓게 정의될 수 있다. 프로세서는 다른 적절한 기능성 하드웨어를 사용하여 구현될 수 있다. 예를 들어, 프로세서는 펌웨어 내에 고정된 프로그램, 현장 프로그램가능 게이트 배열(FPGA), 또는 고속 집적회로(VHSIC) 하드웨어 기술 언어(VHDL)와 같은 고급 프로그래밍 언어에 "기록된" 순차회로를 이용하는 다른 프로그램 가능 로직 장치(PLD)를 갖는 디지털 신호 처리장치(DSP)를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 문서에 기술된 컴퓨터 구현 방법의 하나 이상의 단계를 수행하도록 프로세서(30)에서 실행할 수 있는 프로그램 명령(도시 안됨)은 필요에 따라 적절히 C++로 구분되는 C#과 같은 고급 언어, 액티브 X콘트롤(ActiveX controls), 자바빈즈(JavaBeans), 마이크로소프트파운데이션클래시스(Microsoft Foundation Classes)("MFC"), 또는 다른 기술 내지 방법으로 코딩될 수 있다. 프로그램 명령은 절차기반 기술, 요소기반 기술, 및/또는 객체지향 기술을 포함하는 다른 여러 방식으로 구현될 수 있다.
본 문서에 기술된 것과 같은 방법을 구현하는 프로그램 명령은 전송되거나 저장 매체에 저장될 수 있다. 저장 매체는 롬 메모리, 램 메모리, 자기 디스크, 광 디스크, 또는 자기 테이프를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 각각의 이미지에 대해, 각각의 식별된 미립자에 대해 측정된 모든 위치된 미립자와 값 및/또는 통계는 저장 매체 내의 메모리 매체에 저장될 수 있다. 본 문서에 기술된 이미지 처리 방법은 하나 이상의 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 아래에서 보다 구체적으로 설명하는 것처럼, 알고리즘은 복잡할 수 있고, 따라서 컴퓨터를 통해 최적으로 구현될 수 있다. 이와 같이, 본 문서에 기재된, 특히 도 2 내지 도 5를 참고하여 기재된 방법은 "컴퓨터 구현 방법"으로 불리며, 따라서 "방법" 및 "컴퓨터 구현 방법"은 상호 교환하면서 사용될 수 있다. 본 문서에 기술된 시스템의 프로그램 명령과 컴퓨터 구현 방법은 일부 경우에 본 문서에 기재된 방법과 관련된 것이 아닌 프로세스를 수행하도록 구성될 수 있고, 따라서, 본 문서에 기재된 시스템의 프로그램 명령과 컴퓨터 구현 방법은 항상 도 2 내지 도 5의 설명에 제한되는 것은 아니다.
본 문서에 기재된 이미지 기초 시스템은 종래의 유세포분석기 유형의 측정 시스템을 교체할 수 있는 확실한 후보이다. 본 문서에 기재된 방법, 저장매체, 및 시스템은 유세포분석기 기반의 애플리케이션에 대해 필요한 것보다 데이터 처리 개념상 더 복잡할 수 있다. 그러나, 본 문서에 기재된 하드웨어(예를 들어, 광원, 광학 소자, 검출기, 등등)는 종래의 유세포분석기 보다 비용이 더 싸고 더 강건한 가능성을 갖고 있다. 본 문서에 기재된 방법이 갖는 추가 평가와 개선사항(예를 들어, 방법을 구현하는데 사용될 수 있는 알고리즘의 개선 및 추가 평가)에 의하면 처리능력에 대한 요구사항이 줄어들 수 있고 나아가 형광 방출값에 대해 더욱 정확하게 측정할 수 있게 되고, 따라서 미립자의 하나 이상의 특성을 더욱 정확하게 측정할 수 있게 될 것이다.
한 실시예에 따르면, 이미지 데이터를 처리하기 위한 컴퓨터 구현 방법은 아래와 같이 하나 이상의 단계(즉, 높은 레벨의 작업)를 포함한다: 백그라운드 신호 측정, 분류 염료 방출 및 클러스터 거부를 이용한 미립자 식별(즉, 발견), 인터-이미지 정렬, 인터-이미지 미립자 상관관계, 리포터 방출의 형광 통합, 및 이미지 평면 정규화. 이러한 단계들은 위에 열거된 순서에 따라 순차적으로 수행될 수 있다.
일반적으로, 백그라운드 신호 측정은 미립자로부터 나오는 형광이 정확하게 측정될 수 있도록 수행될 수 있다(즉, 미립자로부터 나오는 형광의 측정은 미립자를 이미지화하는데 사용되는 이미지 시스템으로부터 오프셋된 암전류 및 노이즈뿐만 아니라 이미지의 백그라운드에서 반사광의 레벨과 상관없이 측정될 수 있다). 도 2는 이미지의 백그라운드 신호를 측정하는 단계의 예시적인 시퀀스를 나타내는 흐름도이다. 도 2의 블록 40에 도시된 것처럼, 본 발명의 방법은 관련된 형광 물질을 갖는 미립자의 이미지를 하위 섹션들의 배열로 구별하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 배열은 다수의 행과 열을 포함할 수 있고, 이는 요구하는 백그라운드 신호의 명확도와 시스템의 처리능력 및/또는 분석되는 미립자의 수에 따라 달라진다. 도 2에 더 도시된 것처럼, 블록 40 이후에 계속되는 방법의 루트는 이미지 내의 미립자의 점유에 따라 달라질 수 있다. 특히, 블록 40 이후에, 흐름도는 블록 42로 계속 이어지고, 이미지 내 미립자의 점유의 양이 측정되었는지 여부에 대하여 측정이 이루어진다.
미립자의 점유에 대한 양이 측정된 실시예에서, 본 발명의 방법은 블록 44로 계속 되고, 점유가 미리 정한 임계값보다 작은지 여부에 대한 결정이 이루어진다. 도 2의 흐름도는 특히 블록 44 내에서 50% 점유의 임계값을 나타내지만, 이 방법은 항상 이렇게 제한되는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 방법은 어떤 특정 점유량을 고려하도록 수정될 수 있고, 이 점유량에 의해 이미지의 백그라운드 신호를 측정하기 위한 액션 과정을 측정한다. 관심대상 미립자가 이미지 영역의 미리 정해진 임계값(예들 들어 약 50% 이하) 보다 적게 점유하는 실시예에서, 백그라운드 신호 측정은 블록 46에 기재된 하위섹션 내의 모든 픽셀 중에서 광학 매개변수의 통계값을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 하위 섹션 내의 미립자에 대응하는 비교적 밝은 픽셀의 형광값은 하위 섹션 내의 백그라운드 픽셀(픽셀의 존재에 대응하지 않는 픽셀)로부터 나오는 신호와 병합될 수 있다. 그러나 미립자가 더 적은 양의 하위섹션을 점유하기 때문에, 통계값은 백그라운드 픽셀을 더욱 잘 나타낼 수 있다. 일반적으로, 통계값은 다수의 통계 매개변수를 포함할 수 있고, 이 통계 매개변수는 중앙값, 평균값, 최빈값, 절사평균값을 포함하며 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시예에서, 중앙값을 측정하는 것은 매우 바람직할 수 있다.
다른 실시예에서, 하위 섹션 내의 픽셀 모두 보다 적은 광학 매개변수의 통계값을 측정하기 위해 본 발명의 방법은 블록 50, 52, 54로 이어질 수 있다. 특히, 관심대상 미립자의 점유가 이미지 영역의 미리 정해진 임계값보다 크거나 동일한 실시예에서(예를 들어, 블록 44를 블록 50에 연결시키는 화살표에 의해 표시되는 것처럼 약 50% 이상), 또는 미립자에 의한 이미지 영역의 점유가 알려지지 않았을 때(예를 들어 블록 42를 블록 50에 연결시키는 화살표에 의해 표시된 것처럼), 하위 섹션 내의 모든 픽셀보다 적은 광학 매개변수의 통계값을 측정함으로써, 백그라운드 신호 측정을 위한 방법은 백그라운드 영역에 대한 미립자 영역의 더 큰 또는 알려지지 않은 비율을 보상할 수 있다. 특히, 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수 값을 나타내는 이미지 내의 픽셀은 블록 50 내에 기재된 것처럼 식별될 수 있다. 일부 경우에, 블록 50 내에서 식별된 픽셀은 블록 52 내에 기재된 것처럼 인접하여 배열된 픽셀로 그룹화될 수 있다. 그러나, 이러한 프로세스 단계는 블록의 점선 경계부에 의해 표시된 것처럼 선택적이고, 따라서 일부 경우에 이 방법에서 생략될 수 있다.
어떤 경우에, 본 발명의 방법은 광학 매개변수의 통계값이, 블록 50에 기재된 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수를 나타내도록 식별되지 않는 하위 섹션 내 픽셀 세트 중에서 단독으로 측정되는 블록 54로 계속 이어질 수 있다. 일부 실시예에서, 이렇게 식별된 픽셀로 그룹화된 픽셀은 또한 광학적 매개변수의 통계값을 측정하는 것으로부터 제외될 수도 있다. 이런 식으로, 블록 50에서 식별된 픽 셀, 또한 일부 경우에 블록 52에서 식별된 필셀로 그룹화된 픽셀은 백그라운드 신호를 측정하는 것과 격리될 수 있다.
어떤 경우에, 사용되는 프로세스 단계의 시퀀스와 상관없이, 통계값을 측정하는 광학 매개변수는 하나 이상의 검출 파장에서 측정된 미립자의 형광 방출이 될 수 있고, 또한 미립자를 이미지화하기 위해 사용되는 이미지 시스템으로부터 오프셋된 암전류 및 노이즈 뿐만 아니라 이미지의 백그라운드 내 산란광의 방출일 수 있다. 또한, 사용된 프로세스 단계의 시퀀스와 관계없이, 본 발명의 방법은 대응하는 하위섹션에 대한 백그라운드 신호로서 측정된 통계값을 할당하도록 블록(56)으로 이어질 수 있다. 보다 구체적으로, 하위 섹션 내 모든 픽셀에 대한 백그라운드 신호 레벨은 하위 섹션에 대해 연산된 통계값으로 할당될 수 있다. 일부 경우, 블록 46, 50, 52, 54, 및 56의 프로세스 단계는 이미지 내의 다른 하위섹션에 대해, 또한 일부 경우에는 이미지 내 모든 하위섹션에 대해 반복될 수 있다. 이런식으로, 광학 매개변수의 통계값은 다수의 하위섹션 각각에 대해 또한 일부 경우에는 모든 하위섹션에 대해 측정될 수 있다. 일부 경우에, 두 하위섹션 사이의 경계지점에 통계값의 비교적 심한 콘트라스트가 존재할 수 있다. 인접하는 하위섹션 사이의 통계값에 있어서 불연속적인 차이를 완화하기 위해, 이차원 통계 필터(예를 들어, 중앙값 필터 또는 평균 필터)가 하위섹션의 배열에 수행될 수 있다. 결과적으로, 하위섹션은 엣지에서 부드럽게 될 수 있다. 이러한 통계 필터가 사용되는지 여부에 상관없이, 연산된 통계값을 포함하는 픽셀의 하위섹션의 n x m 행렬은 "백그라운드 이미지"로 저장될 수 있고, 이 이미지는 본 문서에서 더 설명하는 것처럼 사용될 수 있다.
도 2를 참고하여 기술되는 방법은 백그라운드 신호 측정에 대한 상술한 방법의 추가 단계를 포함할 수 있고, 따라서 이 방법은 항상 도 2에 묘사된 것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 도 2의 블록 46, 50, 52, 54, 및 56을 반복하는 것을 생략하는 것은 본 문서에 기재된 방법에 대한 가능성을 포함하는 것을 항상 제한하는 것은 아니다. 상술한 것처럼, 이미지 데이터 처리를 위해 본 문서에 기재한 방법은 분류 염료와 클러스터 거부(즉, 비교적 가까이 배치된 미립자의 거부)으로부터 형광 방출을 이용하는 미립자 발견 프로세스를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 문서에 기재된 미립자 발견 프로세스는 이미지 내 백그라운드 신호의 레벨을 측정한 후에 수행될 수 있고, 또한 일부 경우 도 2를 참고하여 기술된 백그라운드 신호 측정의 방법 이후에 수행될 수 있다. 그러나, 다른 실시예에서, 본 문서에 기재된 미립자 발견의 프로세스는 백그라운드 신호 측정과 상관없이 수행될 수 있다.
도 3은 미립자 발견 프로세스에 대한 단계들의 예시적인 시퀀스를 나타내는 흐름도이다. 도 3의 블록 60에 도시된 것처럼, 본 발명의 방법은 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수 값을 나타내는 이미지 내의 하나 이상의 픽셀을 식별하기 위해 관련된 형광물질을 갖는 미립자의 이미지를 분석하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분류 이미지(즉, 분류 염료의 파장 또는 파장 대역에서 방출되는 빛에서 생성되는 이미지)가 이미지의 백그라운드 신호보다 강도가 더 센 형광을 나타내는 픽셀에 대해 검색될 수 있다. 일부 실시예의 경우, 이미지는 강도가 2배 내지 1000배 더 높은 정도로 강도가 이미지의 백그라운드 신호보다 매우 높은 픽셀에 대 해 검색될 수 있다. 이미지의 백그라운드 신호에 대하여 더 작은 또는 더 큰 강도 레벨도 또한 사용될 수 있다. 다른 경우에, 이미지는 형광의 고정값을 나타내는 픽셀에 대해 검색될 수 있고, 이는 이미지의 백그라운드 신호에 따라 달라질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 어떤 경우에는, 픽셀에 의한 형광 방출의 더 높은 레벨 또는 픽셀 모음이 형광 방출 미립자의 존재를 나타낼 수 있다. 일부 실시예에서, 미립자는 단일 픽셀 내에 포함되어 있을 수 있다. 그러나, 다른 실시예에서 미립자는 다수의 픽셀을 가로질러 퍼질 수 있다.
어떤 경우에는, 블록 60 내에서 식별된 픽셀은 이미지 내 미립자의 위치를 측정하기 위해 평가될 수 있다. 특히, 도 3의 방법은 이미지 내 미립자의 존재를 검출하기 위해 광학 매개변수에 대한 최대값을 각각 나타내는 하나 이상의 식별된 픽셀 세트 내의 위치를 측정하기 위해 블록 62로 이어질 수 있다. 픽셀이 개별적으로 평가될 수 있고 따라서 단일 픽셀 내의 위치가 블록 62에 의해 측정될 수 있을지라도, 블록 62는 또한 식별된 픽셀 모음 사이에서 위치를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 여기에서 사용되는, "픽셀 모음"이라는 것은 일반적으로 서로 인접하여 배치된 픽셀 그룹을 나타낼 수 있다(즉, 가까이 배열된 픽셀의 클러스터 또는 덩어리).
일부 실시예에서, 이미지 내 미립자의 위치를 측정하기 위해 픽셀 모음을 평가하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 상술한 것처럼, 미립자는 다수의 픽셀을 가로질러 퍼질 수 있고, 이와 같이 개별 픽셀 내에서 위치를 측정하는 것은 실제로 이미지화된 것보다 더 많은 미립자의 존재를 거짓으로 전달할 수 있다. 나아가, 미 립자가 이미지 내 하나 이상의 다른 미립자에 비교적 가까이 위치되어 있는 경우, 미립자의 형광은 각각의 다른 특징의 평가에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 미립자에 대한 데이터는 정확하게 측정될 수 없다. 일부 경우에, 둘러싸인 미립자의 특징이 정확하게 평가될 수 없다는 것이 측정되는 경우, 픽셀 모음은 거부될 수 있다(예를 들어 추가 이미지 처리로부터 제거될 수 있다). 추가 이미지 처리에 대해 픽셀 모음이 허용될지 거부될지 여부를 결정하기 위한 예시적인 방법이 도 3의 블록 70-78을 참고하여 아래에 보다 구체적으로 기술된다.
일반적으로, 하나 이상의 식별된 픽셀 세트 내에서 위치를 측정하기 위한 블록 62 내에 기재된 프로세스는 다수의 상이한 방법으로 수행될 수 있다. 일부 예시적인 방법은 도 3의 블록 64, 66, 및 68에 개략적으로 설명되어 있다(블록 64, 66, 및 68은 점선에 의해 블록 62로부터 뻗어나가고 점선으로 경계가 설정되고, 이는 프로세스가 예시적이라는 것을 의미한다). 도 3에 도시된 것처럼, 블록 64은 광학 매개변수에 대한 최대값을 각각 나타내는 하나 이상의 식별된 픽셀 세트 사이에서 피크 픽셀을 규명하는 프로세스를 그리고 있다. 이러한 프로세스에서, 각 픽셀에 대해 측정된 형광값이 픽셀 세트 내의 최대값을 갖는지 여부를 측정하기 위해, 각 픽셀 세트는 반복될 수 있다. 최대값을 갖는 픽셀은 "피크 픽셀"로 확정될 수 있다. 일부 경우, 피크 픽셀의 특정 부분은 위치로 지정될 수 있다. 이러한 경우, 블록 62에 기재된 위치를 측정하는 프로세스는 블록 64에 기재된 프로세스에 의해 간단하게 실행될 수 있다.
그러나, 일부 실시예에서 피크 픽셀의 다른 부분이 광학 매개변수에 대한 최 대값을 나타내는 위치에 대해 더욱 적절한지 여부를 측정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 미립자는 이미지 픽셀 사이에 완벽하게 정렬될 수 없고, 따라서 미립자로부터 나오는 에너지는 실별된 픽셀 세트 사이에 고르게 분배될 수 없다. 이러한 경우에, 피크 픽셀의 중앙부분은 미립자의 최대 형광값을 나타낼 수 없고, 따라서 피크 픽셀의 중심에서 벗어난 부분이 미립자의 최대 형광값을 더욱 잘 나타내는지 여부를 측정하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 경우, 본 발명의 방법은 블록(66)으로 이어져서 광학 매개변수에 대한 최대값을 나타내는 하나 이상의 식별된 픽셀의 적어도 하나의 세트 내에서 중심 위치를 연산하게 된다. 특히, 본 발명의 방법은 피크 픽셀의 미리 정해진 반경 내에서 그리고 이에 인접한 픽셀의 형광값을 통합하는 것을 포함한다. 예를 들어 피크 픽셀에 대한 반경은 1개 내지 10개의 픽셀에서 선택될 수 있지만, 다른 반경도 고려할 수 있다. 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수를 갖도록 미리 정해진 반경이 식별되지 않은 픽셀을 둘러싸는 실시예에서, 이러한 "백그라운드 픽셀"의 모든 백그라운드 신호는 전체값에서 공제될 수 있다.
일부 경우에, 연산된 중앙 위치를 광학 매개변수에 대한 최대값을 나타내는 위치에 할당할지 여부를 분석하는 것은 바람직할 수 있다. 이와 같이, 일부 실시예에서, 이 방법은 연산된 중앙 위치의 특성에 의존하는 블록 68로 이어질 수 있다. 예를 들어, 중앙 위치가 모든 방향으로 픽셀 폭의 절반 보다 크면, 다음 정수값으로 반올림된 연산된 위치(예를 들어 x 및 y 좌표 내)는 광학 매개변수의 최대값을 나타내는 위치로 할당될 수 있다. 블록 68이 중앙 위치를 할당하기 위해 픽셀 치수 의 50% 이상이 되도록 연산된 중앙 위치에 대한 치수 임계값을 특정할지라도, 그 부수적인 프로세스는 항상 이렇게 제한되는 것은 아니다. 특히, 중앙 위치에 대한 치수 임계값(픽셀 치수와 상관없음)은 중앙 위치를 할당할지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
광학 매개변수의 최대값을 나타내는 위치를 측정하는 프로세스에 이어서, 본 발명의 방법은 추가 이미지 프로세스에 대한 픽셀을 수용하기 거부하는 프로세스로 계속 이어질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본 발명의 방법은 두 피크 픽셀 사이의 거리를 연산하는 블록 70으로 이어질 수 있다. 피크 픽셀의 식별은 일반적으로 블록 64를 참고하여 위에서 설명한 프로세스에 의해 수행될 수 있고, 따라서 도 3의 흐름도는 상호관계를 나타내기 위해 블록 64와 블록 70을 연결하는 점선을 포함한다. 블록 70에서 연산된 거리에 기초하여, 두 피크 픽셀 중 한 픽셀에 대응하는 픽셀 세트는 블록 72에 표시된 추가 이미지 프로세스에 대해 수용되거나 거부될 수 있다. 예를 들어, 피크 픽셀 사이의 거리는 하나 또는 두 이미지화된 미립자의 투영된 직경 또는 그 사이의 거리에 상응하는 임계값 그러나 이에 제한되지는 않는 임계값과 같은 미리 정해진 임계값보다 작으면(및/또는 동일) 추가 이미지 처리에 대하여 두 피크 픽셀 중 한 픽셀에 대응하는 픽셀 세트는 거절될 수 있다. 이런식으로, 대상 미립자를 평가하는 것을 방해할 수 있는, 대상 미립자에 대해 너무 가깝게 배열된 미립자의 형광 방출은 막을 수 있다.
일반적으로, 본 문서에서 사용되는 "이미지화된 미립자의 투영된 직경"이라는 용어는 미립자를 이미지화하기 위해 사용되는 시스템의 요소 구조에 기초하여 이미지화된 미립자에 대한 추정 직경을 의미할 수 있다. 일반적으로, 이미지화된 미립자의 크기는 미립자를 이미지화하기 위해 사용되는 이미지 시스템의 확대에 따라 달라지는 실제 미립자의 치수와 상이할 수 있다. 또한, 이미지 시스템의 다른 요소 구조는 직경에도 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 불완전한 렌즈, 광학 조리개로부터의 회절, 광학 필터 왜곡, 및 이미지 시스템의 다수의 다른 소자는 이미지화된 픽셀의 치수에 영향을 미칠 수 있고 또한 일부 경우에는 왜곡시킬 수도 있다(이미지화된 픽셀의 스미어(smear)로 불림). 일부 경우에는, 이미지 렌즈의 포인트 스프레드 함수(PSF)(또는 모듈레이션 전달 함수(MTF)로서 정량화됨)가 왜곡에 대한 주요 공헌자가 될 수 있다.
두 피크 픽셀에 대응하는 픽셀 중 어느 한 세트가 거부될 수 있을지라도, 낮은 형광값을 갖는 피크 픽셀에 대응하는 픽셀 세트를 거부하는 것이 바람직하며, 그 이유는 픽셀 세트의 특성이 추가로 이미지 처리하는 동안 다른 픽셀 세트에 대하여 덜 구별될 수 있기 때문이다. 일부 경우, 본 발명의 방법은 추가로 이미지 처리하기에 충분한지 여부를 측정하기 위해 나머지 픽셀 세트를 계속 평가할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 픽셀 세트 사이에서 광학 매개변수의 강도 변화율이 미립자 덩어리 또는 단일 미립자를 나타내는지 여부를 측정하기 위해 블록 74로 계속 이어질 수 있다. 일반적으로, 각각의 미립자에 대해 정확하고 뚜렷한 정보를 얻는데 따르는 어려움 때문에 미립자 덩어리를 거부하는 것이 바람직하다. 또 다른 실시예에서, 블록 72에서 거부하기 위해 두 세트의 픽셀을 선택하는 것은 픽셀 세트 중에서 광학 매개변수의 강도 변화율을 연산함으로써 결정될 수 있다. 특 히, 피크 픽셀 사이의 거리가 미리 정해진 임계값보다 작다는 것을 측정하였을 때, 어느 세트를 거부할지를 나타내는 지표로서 각각의 픽셀 세트에 대해 광학 매개변수의 강도 변화율이 연산될 수 있다. 픽셀 세트 사이에서 강도 변화율을 연산하는 다른 방법들은 블록 76 내지 블록 78 및 블록 80 내지 블록 82에 각각 기재되어 있고, 아래에서 보다 구체적으로 설명할 것이다.
미립자 거부 방법은 블록 72 및 블록 74의 조합 또는 순차적인 프로세스를 포함할 수 있기 때문에, 각 프로세서 사이의 연결 가능성을 나타내기 위해 도 3의 흐름도는 블록 72와 블록 74 사이의 점선을 포함한다. 그러나, 이러한 연결은 선택적이다. 특히, 일부 실시예에서, 이와 연계하여 블록 72 및 블록 74는 수행되지 않을 수 있고, 따라서 블록 72 및 블록 74 사이의 화살표는 생략될 수 있다. 다른 실시예에서, 블록 74 및 블록 72의 프로세스는 반대로 될 수 있고, 이와 같이 본 문서에 기재된 방법은 블록 78 및/또는 블록 82와 블록 70 사이의 연결을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 블록 70 및 블록 72는 이 방법에서 생략할 수 있다. 또는, 블록 74(및 블록 76 내지 블록 82에 기재된 프로세스를 수행하기 위한 예시적인 절차)는 이 방법에서 생략될 수 있다. 또 다른 경우에, 본 발명의 방법은 블록 62에 이어지는 이미지 프로세스의 경로를 선택하여 도 3에 도시된 것처럼 블록 70 및 블록 74 중 어느 하나에 도달하게 되도록 구성될 수 있다.
블록 74를 참고하여, 블록 62에서 측정되는 위치 중 적어도 하나를 둘러싸는 다수의 픽셀 사이에서 광학 매개변수의 강도 비율이 연산될 수 있다. 상술한 것처럼, 이 비율은 추가로 이미지 데이터를 처리하기 위해 미립자를 거절하기 위해서 또는 미립자를 수용하기 위해 수용될 수 있다. 보다 구체적으로, 이 비율은 미립자의 방출 특성의 공간 구배의 측정값(즉, 형광 방출 레벨의 분포)이 될 수 있고, 이 공간 구배는 대상 미립자가 이웃하는 미립자와 어떻게 격리되어 있는지를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 블록 74의 프로세스는 블록 76 및 블록 78에 기재된 단계의 시퀀스 뒤에 일어나게 된다. 특히, 본 발명의 방법은 블록 62에서 측정된 위치를 둘러싸는 미리 정해진 반경 내에 배치된 픽셀 세트에 대한 광학 매개변수의 강도 비율을 연산하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 미리 정해진 반경은 측정된 위치에 의해 표시되는 미립자의 투영된 직경과 거의 같을 수 있다. 다른 경우에, 미리 정해진 반경은 측정된 위치에 의해 표현되는 이미지화된 미립자의 투영된 직경 보다 더 크거나 작을 수 있다.
광학 매개변수의 강도 변화율이 연산된 후에, 본 발명의 방법은 블록 78로 이어질 수 있고, 여기에서 강도 비율을 미리 정해진 임계값과 비교함으로써 추가 이미지 데이터 처리를 위해 픽셀 세트가 수용될 수 있거나 거부될 수 있다. 일부 실시예에서, 블록 78은 강도 변화율이 미리 정해진 임계값보다 크거나 같다는 것을 연산하자마자 추가로 처리하기 위해 픽셀 세트를 수용하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 광학 매개변수의 비교적 높은 강도 변화율은 픽셀 세트 내의 단일 미립자를 나타낼 수 있고, 이는 추가로 이미지 처리함에 있어서 바람직할 수 있다. 이러한 프로세스에 더하여, 블록 78은 강도 변화율이 미리 정해진 임계값보다 작다는 것을 연산하자마자 추가로 처리하기 위한 픽셀 세트를 거부하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 비교적 낮은 광학 매개변수의 강도 변화율은 픽셀 세트 내 미립자 덩어리를 나타낼 수 있고, 이는 추가로 이미지 처리함에 있어서는 바람직하지 않을 수 있다.
픽셀 세트 내에서 광학 매개변수의 강도 변화율을 연산하는 다른 방법은 도 3의 블록 80 및 블록 82에 기재되어 있다. 특히, 본 발명의 방법은 부가적으로 또는 다른 방안으로 블록 62에서 측정된 위치 중 하나를 둘러싸는 미리 정해진 상이한 반경 내에 각각 배열된 뚜렷한 두 픽셀 세트에 대한 광학 매개변수의 값을 합하기 위해 블록 80으로 루트가 형성될 수 있다. 반경은 검출기를 가로질러 펼쳐진 미립자의 픽셀 배열과 일치하도록 조절될 수 있고, 이는 보통 이미지 렌즈의 포인트 스프레드 함수(PSF)(또는 모듈레이션 전달 함수(MTF)로 양이 측정됨)와, 이미지 하위 시스템의 초점면에 대한 미립자의 위치, 및 미립자 자체의 크기에 따라 달라진다는 점에 유의하여야 한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 하나의 미리 정해진 반경은 대략 이미지 내의 하나의 미립자의 투영된 직경과 거의 동일한 것이 바람직하고, 다른 미리 정해진 반경은 이미지 내의 하나의 미립자의 투영된 직경보다 대략 1.5배 더 큰 것이 바람직하다. 그러나, 다른 반경과 반경의 다른 비율을 사용할 수도 있다. 또한, 하나의 반경 내에서 픽셀에 대해 백그라운드 신호의 값을 빼면, 백그라운드 신호도 또한 다른 반경 내의 픽셀에 대한 값으로부터 뺄 수 있다는 것을 유의하여야 한다.
광학 매개변수의 값을 합한 후에, 각각의 반경에 대응하는 합계값의 비율을 연산할 수 있다. 특히, 더 작은 반경을 이용하여 얻은 합계값은 더 크 반경을 이용하여 얻은 합계값으로 나누어질 수 있고, 그 반대로도 나누어질 수 있다. 어느 경우든, 블록 82에 기재된 것처럼 추가 이미지 데이터 처리에 대해 픽셀 세트를 수용 하거나 거부하기 위해 비율이 사용될 수 있다. 특히, 블록 82는 비율이 미리 정해진 임계값이하의 양 만큼 세트와 상이하다는 것을 측정하였을 때 추가로 평가하기 위한 픽셀 세트를 수용하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 블록 83은 비율이 미리 정해진 임계값 보다 더 큰 양 만큼 세트와 상이하다는 것을 측정하였을 때 추가로 평가하기 위한 픽셀 세트를 거부하는 것을 포함할 수 있다.
임계값의 측정은 여러가지 요인에 따라 달라지는데, 이 요인은 블록 80에 기재된 프로세스를 처리하도록 선택된 반경과, 이미지화될 미립자의 크기와, 이미지 내의 미립자의 스미어와, 사용되는 이미지 시스템의 세팅을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 블록 83에서 픽셀 세트를 수용하고 거부하기 위한 미리 정해진 임계값은 상이한 애플리케이션 사이에서 크게 달라질 수 있다. 그러나, 일반적인 가이드라인은, 더 작은 반경 외부의 픽셀로부터 기여되는 것이 거의 없기 때문에 1에 가까운 비율이 추가로 처리하기 위해 바람직한 픽셀 세트를 나타낼 수 있다는 것이다. 즉, 이웃하는 미립자로부터 나오는 선택적인 매개변수의 영향은 최소가 되고, 따라서 해당 광학 매개변수의 값의 에러는 비교적 작을 것이다. 또는, 만일 이 비율이 1 보다 크게 작다면, 이웃하는 밝은 미립자는 해당 미립자의 광학 매개변수 값에 영향을 미치게 될 것이라는 것이다. 이러한 경우, 해당 미립자는 버려질 수 있고, 아니면 통합 반경이 적절하지 않게 선택될 수 있다. 이런식으로, 해당 미립자에 대한 이미지 데이터가 버려지기 전에, 위에서 설명한 통합이 상이한 반경에 의해 수행된다.
이러한 추가 통합을 수행하는 알고리즘은 일부 고정된 비율(예를 들어 1.5x) 로 각각의 비드에 대해 외부 직경에 내부 직경을 설정하고 그 결과를 저장하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 예상되는 비드의 투영보다 1.5배가 되는 정도로, 내부 직경은 예상되는 비드의 투영보다 약간 더 크다. 그 후, 내부 직경 및 외부 직경은 각각의 비드에 대해 약간(이전과 동일한 비율을 유지함) 감소할 수 있다. 이어서, 대부분의 비율이 변경되었는지 여부를 보기 위해 비율의 수집이 비교될 수 있다. 대부분의 비율이 변경되지 않았다면, 내부 직경은 너무 크고, 에너지는 내부 원 외부에서 외부 원으로 획득되지 않고, 따라서, 내부 직경 및 외부 직경은 각각의 비드에 대해 다시 감소될 필요가 없다. 즉, 비율 일부가 변경되었다면, 일부 에너지가 외부 원으로 이동하고 있다는 것을 나타낼 것이다.
프로세스는 비율의 마지막 직경의 수집으로부터의 변화 분포에 기초하여 여러번 반복될 수 있다. 예를 들어, 만일 동시에 일어나는 미립자의 퍼센트를 알면(따라서 버려져야함), 그 퍼센트는 반복을 종결시키기 위해 요구되는 비율 퍼센트와 동일하게 될 수 있다. 동시에 일어나는 미립자의 퍼센트에 대한 추정은 일반적으로 생산 라인과 별로도 과거의 데이터로부터 또는 다른 방법으로 테스트 이미지를 시각적으로 조사함으로써 시스템이 어떻게 작동하는지를 아는 것으로부터 끄집어낼 수 있다. 동시에 일어나는 미립자의 퍼센트를 모르면, 나타나는 퍼센트의 단계별 변화의 "히스토리"가 반복을 종결시키는 지표가 될 수 있고, 이 변화는 감소하는 내부 직경에 의해 변하기도 하고 일정하게 유지되기도 한다. 예를 들어, 비율의 5%가 한번 감소로 변하고, 그 다음에는 10%가 변하고, 또 10%가 다시 변하고, 네번째에는 12%가 변한다. 이러한 예에서, 10%는 버려야하는 미립자의 수일 수 있 다. 12%의 퍼센트에 도달하면, 내부 원은 너무 작게 되어버릴 수 있어서, 더 작은 단일의 우수한 비드를 차단하게 된다. 이와 같이, 이전의 직경이 중단 포인트로서 사용되어야 한다. 퍼센트의 더 선명한 경향이 나타나는지 여부를 알 수 있도록 이러한 프로세스 단계 모두는 상이한 내부/외부 직경 비율로 반복될 수 있다. 이와 같은 경우에, 프로세스는 알고리즘 내에 "외부 루프"를 포함할 수 있고, 여기에서 더 큰 비율로 먼저 시작한 후, 오리지널 비율 보다 더 작아질 때까지 비율을 휙 지나가면서 진행한다(선택적으로 이미 연산되었기 때문에 오리지널 비율을 건너뜀).
위에서 설명한 것처럼, 이미지 데이터 처리를 위해 본 문서에 기재된 방법은 인터-이미지 정렬(inter-image alignment) 프로세스를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 문서에 기재된 인터-이미지 정렬의 프로세스는 이미지 내 백그라운드 신호의 레벨을 측정한 후 및/또는 이미지 내의 미립자를 발견한 후 수행될 수 있다. 일부 경우에, 인터-이미지 정렬의 프로세스는 도 2에 기재된 백그라운드 신호 측정의 방법 이후 및/또는 도 3의 미립자 발경 방법 이후에 구체적으로 수행될 수 있다. 그러나, 다른 실시예에서, 본 문서에 기재된 인터-이미지 정렬 프로세스는 백그라운드 신호 측정 및/또는 미립자 발견 프로세스와 별개로 수행될 수 있다. 어떤 경우든, 인터-이미지 정렬 프로세스는 장치가 조립된 후에 공장에서 수행될 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로서, 특히 공장으로부터 선적된 후에 시스템의 요소가 변경되는 경우에, 인터-이미지 정렬 프로세스는 현장에서 수행될 수 있다.
일반적으로, 각각 상술한 광학 필터에 연결될 수 있는 둘 이상의 검출기를 이용하여 미립자의 다수의 이미지를 획득한 경우에, 또는 필터 그 자체는 이미지에 영향을 미칠 수 있기 때문에 하나의 카메라로 찍은 이미지들 사이에서 교환가능한 광학 필터로 대체될 수 있는 경우에, 인터-이미지 정렬이 수행될 수 있다. 형광의 상이한 레벨이 측정되어 미립자를 분류하는데 사용될 수 있도록, 일반적으로 상이한 파장으로 다수의 이미지를 촬영한다. 그러나, 이미지 하위시스템 하드웨어의 기계적인 오차 때문에, 각각의 다수의 이미지 내의 미립자에 대응하는 스팟은 다수 이미지의 복합물로 절대적으로 정렬될 수 없을 것이다. 이렇게 스팟을 잘못 등록하게되면 이미지화된 모든 채널에서 미립자의 위치를 관련시키는 성능을 저해할 수 있다. 그러나, 스팟을 보다 잘 정렬할 수 있도록 본 문서에 기재된 인터-이미지 정렬 기술을 이용하여 이미지-이미지 등록은 수정될 수 있다. 아래에 설명하는 것처럼, 인터-이미지 정렬에 의한 정정 프로세스는 x 및/또는 y 방향으로 이미지 좌표를 간단하게 이동시키는 것이 될 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로서, 인터-이미지 정렬 프로세스는 하나 이상의 다수의 이미지를 회전시키는 것을 포함할 수 있다.
도 4는 인터-이미지 정렬 프로세스에 대한 일련의 단계를 예시적으로 나타내는 흐름도이다. 도 4의 블록 90에 도시된 것처럼, 프로세스는 관련된 형광물질을 갖는 미립자의 다수의 이미지에 대한 데이터를 획득하는 것을 포함할 수 있고, 여기에서 각각의 다수의 이미지는 상이한 파장 대역에 대응한다. 일부 경우, 데이터는 직접 이미지 시스템으로부터 획득할 수 있지만, 다른 경우에, 데이터는 저장 매체로부터 획득할 수 있다. 어느 경우든, 데이터는 위에서 설명한 것처럼 상이한 파장으로 찍은 다수의 이미지를 나타낼 수 있다. 사용가능한 예시적인 파장은 상이한 컬러 채널에 대응할 수 있으며, 이는 예를 들어 분류 채널 1에 대해서는 빨강으로, 분류 채널 2에 대해서는 녹색으로, 리포터 채널에 대해서는 파랑으로 하는 것처럼 할 수 있고 단 이에 제한되는 것은 아니다. 위에서 더 설명한 것에 더하여, 각각의 컬러 채널을 수용하기 위해, 본 문서에 기재된 방법에 사용되는 미립자는 모든 파장에서 방출하도록 또는 해당하는 모든 파장 대역에서 방출하도록 특별히 염색될 수 있다. 구체적으로, 다수의 이미지 내에서 분류 신호와 리포터 신호를 모두 측정하기 위해, 본 문서에 기재된 인터-이미지 정렬 프로세스는 특별히 염색된 미립자를 이용하여 수행될 수 있고, 이는 분류 파장 또는 파장 대역에서뿐만 아니라 리포터 파장 또는 파장 대역에서도 형광을 방출할 수 있다.
다수의 이미지에 대한 데이터를 획득한 후에, 본 발명의 방법은 블록 92로 이어질 수 있고, 이는 다수 이미지의 복합 이미지를 생성하게 된다. 일반적으로, 복합 이미지는 다수의 이미지가 서로에 대해 중첩된 단일 이미지이다. 상술한 바와 같이, 이미지 하위시스템 하드웨어의 기계적인 오차 때문에, 각각의 다수 이미지 내에서 미립자에 대응하는 스팟은 다수의 이미지의 복합물로 절대적으로 정렬되지 않을 수 있다. 이와 같이, 인터-이미지 정렬이 필요할 수 있다. 특히, 다수의 이미지 각각 내부에 있는 미립자에 대응하는 스팟이 블록 94에 기재된 계속되는 복합 이미지 내에 수렴하도록, 본 발명의 방법은 다수 이미지 중 적어도 하나의 이미지의 좌표를 조정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 하나("기준 이미지"로 부를 수 있음)를 제외한 모든 다수의 이미지의 좌표값을 조정할 수 있다. 또는, 소수의 다수 이미지의 좌표값을 조정할 수 있다. 이 방법에서, 기준 이미지를 제외한 이미지의 좌표값은 인터-이미지 정렬 프로세스에 대해 조정될 수 있다. 일부 경우, 리포터 염료에 의해 방출되는 빛의 파장 또는 파장 대역에서 획득하는 이미지를 기준 이미지로 지정할 수 있다. 다른 실시예에서, 분류 염료에 의해 방출되는 빛의 파장 또는 파장 대역에서 획득하는 이미지를 기준 이미지로 지정할 수도 있다.
도 4에 도시되어 있고 위에서 설명한 것처럼, 좌표를 조정하는 것은 일부 경우 블록 96에서처럼 x 및/또는 y 방향으로 이미지 좌표의 직교 오프셋을 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로서, 좌표의 조정은 블록 98에 기재된 다수 이미지 중 하나 이상을 회전시키는 것을 포함할 수 있다. 블록 96 및 블록 98은 점선으로 표시되어 있고, 프로세스 중 어느 하나 또는 둘 다가 이미지 좌표의 조정을 위해 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
직교 이송의 프로세스에서, x 또는 y 차원에서 양의 정수 또는 음의 정수 이동 오프셋은 좌표값의 조정을 위해 측정될 수 있다. 각각의 오프셋은 하나 이상의 비기준 이미지의 좌표계에 더해질 수 있고, 다수의 이미지로 새로운 복합 이미지를 생성할 수 있고, 일부는 새로운 좌표를 갖는다. 일반적으로, 복합 이미지 내에서 정렬하는 것을 더 개선하는 것이 불가능할 때까지 직교 이동의 정정 단계를 수행할 수 있다. 직교 이동에 의해 추가로 개선하는 것이 불가능하다는 것이 측정되면, 프로세스에 의해 조정된 좌표를 갖는 각각의 비기준 이미지에 대한 x 이동 값 및 y 이동 값이 미립자를 추가로 이미지화하기 위해 저장될 수 있다. 이러한 값에 대해서 테이블과 같은 적절한 데이터 구조가 적절할 것이다.
상술한 것처럼, 좌표값의 조정은 부가적으로 또는 대안으로서 하나 이상의 비기준 이미지의 좌표를 회전하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 이동을 정정함으로써 이미지가 충분히 정렬되지 않으면 회전 프로세스를 이용할 수 있다. 다른 실시예에서, 회전 프로세스는 직교 이동 프로세스 이전에, 또는 그 대신에, 또는 함께 수행될 수 있다. 또 다른 경우에, 회전 프로세스는 직교 이동 프로세스와 함께 동시에 수행될 수 있다. 특히, 하나 이상의 비기준 이미지는 회전될 수 있고, 하나 이상의 다른 비기준 이미지는 이미지 좌표의 조정을 위해 직교 오프셋으로 이동될 수 있다. 다른 실시예에서, 각각의 비기준 이미지의 좌표는 회전될 수도 있고 직교 오프셋이 수행될 수도 있다. 어떤 경우에, 인터-이미지 정렬 프로세스를 위해 사용될 수 있는 직교 오프셋의 범위는 일부 실시예에서 +/-10 픽셀이 될 수 있고, 회전 오프셋의 범위는 +/-2도가 될 수 있다. 그러나, 좌표를 조정하는 방법 중 어느 하나 또는 둘 다에 대해 더 많은 또는 더 적은 양의 오프셋이 이용될 수 있다.
이미지 회전이 이미지 좌표의 직교 좌표에 대해 통합되는 방법과 관계없이, 회전 프로세스는 일반적으로 이미지의 x 및 y 차원의 중앙점(xorigin 및 yorigin으로 표시함) 근처가 되도록 기준점(즉, 회전 중심)을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 소스 이미지(즉, 회전될 비기준 이미지)와 동일한 차원으로 새로운 빈 이미지 버퍼가 생성될 수 있다. 소스 이미지 내의 각 픽셀에 대하여, 회전 중심으로부터 나오는 현재의 벡터를 측정할 수 있다. 특히, 해당 픽셀로부터 이미지의 회전 중심까지의 거리는 [(x-xorigin)2+(y-yorigin)2]의 제곱근으로부터 측정될 수 있고, x와 y는 픽셀의 좌표이다. 또한, 현재 벡터의 각도는 xdistance로 나눈 ydistance의 아크탄젠트값과 4분 면 마다 각도를 조절하기 위해 아크탄젠트값으로부터 4분면에 의존하는 변경자를 더하거나 빼는 것으로부터 측정될 수 있다. 이 경우, ydistance는 yorigin과 대상 픽셀 사이의 y축을 따라 형성된 거리이고, xdistance는 xorigin과 대상 픽셀 사이의 x축을 따라 형성된 거리이다.
앞서 언급한 연산에 이어, 일정한 사용자 정의 "조절" 각도는 픽셀을 회전시키는 각도를 측정하기 위해 현재 픽셀의 벡터에 더해질 수 있다. 픽셀의 새로운 위치(예를 들어 x 및 y 좌표)는 아래의 식으로 측정될 수 있다:
새로운 x 좌표 = [(x-xorigin)2+(y-yorigin)2]의 제곱근 * cos(회전각) + xorigin + xtranslation(적용할 수 있는 경우) + 0.5 (1)
새로운 y 좌표 = [(x-xorigin)2+(y-yorigin)2]의 제곱근 * sin(회전각) + yorigin + ytranslation(적용할 수 있는 경우) + 0.5 (1)
고려되는 픽셀의 값은 새로운 x 및 y 좌표에서 빈 이미지 버퍼 픽셀에 복사될 수 있다. 회전하기 위한 비기준 이미지가 처리된 후에, 새로운 복합 허위-컬러 이미지가 재생될 수 있다. 일반적으로, 회전 프로세스에 대해 위에서 설명한 단계들이 각각의 비기준 이미지를 가로질러 컬러 편차를 최소화하기 위해 반복될 수 있다. 최종 회전값은 이어지는 이미지를 위한 조절 테이블과 같은 적당한 데이터 구조로 각각의 비기준 이미지에 대해 저장될 수 있다.
일반적으로, 블록 94에 기재된 상술한 좌표 조정을 반복하는 것은 다수의 상이한 매개변수를 참고하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 좌표 조정의 반복은 복합 이미지의 스팟 중에서 컬러 편차의 양과, 복합 이미지의 스팟에 대응하는 픽셀 사이의 강도의 평균 제곱 차이 또는 총 에러, 및/또는 복합 이미지 내의 스팟 위치의 평균 제곱 차이 또는 총 에러에 따라 달라질 수 있다. 이러한 각각의 기술의 윤곽이 도 4의 블록 100 내지 블록 128에 나타나 있고, 아래에서 보다 구체적으로 설명될 것이다.
특히, 이어지는 복합 이미지 내 스팟 사이의 컬러 편차량이 이전의 복합 이미지와 비교하여 감소되도록 블록 100은 다수의 이미지 중 적어도 하나의 좌표를 수정하기 위해 오프셋을 알고리즘적으로(즉, 알고리즘에 의해) 측정하는 프로세스를 포함한다. 복합 이미지 내 컬러 편차는 일반적으로 다수의 이미지 중 적어도 하나에서 잘못 정렬될 때 발생한다. 예를 들어, 각각의 다수의 이미지에 대해 빨강 채널, 녹색 채널, 파랑 채널이 사용되는 실시예에서, 복합 이미지 내 미립자에 대응하는 스팟의 수렴된 컬러는 흰색이 될 것이다. 그러나, 다수 이미지의 정렬 변화에 의하면, 빨강 채널, 녹색 채널 및 파랑 채널 중 하나 이상의 채널에 대응하는 각각의 이미지 상의 스팟이 서로에 대해 오프셋될 수 있다. 그 결과, 복합 이미지 내 각각의 컬러는 흰색 스팟의 엣지를 넘어 뻗어나갈 수 있고, 따라서 그 스팟에서의 컬러 변화를 유발시킨다. 복합 이미지 내에 흰색 스팟이 형성되는 것은 빨강 채널, 녹색 채널, 그리고 파랑 채널에 의해 생성된 이미지를 조합한 결과이지만, 본 문서에서 설명하는 방법은 이러한 채널로 이미지를 만들어 내는 것에 반드시 한정 되는 것은 아니다. 특히, 다수의 상이한 컬러 채널에 의해 다수의 이미지가 여럿 형성될 수 있고, 따라서 본 문서에 기재된 방법은 세 개의 이미지 또는 빨강, 녹색, 파랑의 컬러 채널을 형성하는 것에 한정되는 것은 아니다.
도 4의 블록 102에 기재되어 있고 위에서 설명한 것처럼, 이미지를 잘못 정렬하는 것은 미리 정해진 오프셋만큼 다수의 이미지 중 하나 이상의 이미지의 좌표를 조절함으로써 감소될 수 있다. 이러한 미리 정해진 오프셋은 블록 96 및 블록 98을 참고로 위에서 설명한 것처럼 직교 오프셋 및/또는 회전 오프셋을 포함할 수 있다. 블록 102에 이어서, 미리 정해진 오프셋을 포함하는 다수의 이미지의 상이한 복합 이미지가 블록 104에서처럼 생성될 수 있다. 이 방법은 블록 106으로 이어지며, 여기에서 새롭게 생성된 복합 이미지의 스팟 사이의 컬러 편차가 측정된다. 결정 블록 108에서와 같이, 컬러 편차가 특정 오프셋 양에 대해 미리 정해진 에러 허용치 보다 더 큰(또는 동일한) 실시예에서 블록 100 내지 블록 106이 반복될 수 있다. 즉, 컬러 편차가 미리 정해진 에러 허용치 보다 작은(또는 동일한) 실시예에서 인터-이미지 정렬 방법은 블록 110에서 종결될 수 있다. 일반적으로 블록 108에 대해 설정된 미리 정해진 에러의 허용치는 복합 이미지에 필요한 정확도뿐만 아니라 오프셋양에 따라 달라질 수 있고, 따라서 애플리케이션마다 다를 것이다.
복합 이미지 내 스팟의 위치 및/또는 픽셀 강도의 평균 제곱 차이 또는 총 에러에 기초하여 좌표를 조정하는 것을 반복하는 기술이 도 4의 블록 112 내지 블록 128에 기재되어 있다. 특히, 두 기술은 블록 112에서 시작할 수 있고, 여기에서 i는 1로 설정되어 있다. 블록 114에 기재된 것처럼 다수의 이미지 중 적어도 하나 의 이미지의 좌표를 조절하도록 여러 미리 정해진 오프셋 중 제1 오프셋을 참조하기 위해 이렇게 지정된다. 일부 실시예에서, 프로세스가 반복되는 미리 정해진 오프셋을 선택하는 것은 매개 변수에 특정될 수 있고, 이 매개변수에 의해 복합 이미지 내의 정렬이 측정된다(즉, 복합 이미지 내 스팟의 위치 또는 픽셀 강도의 평균 제겁 차이 또는 총 에러에 의해). 다른 실시예에서, 미리 정해진 오프셋을 선택하는 것은 사용된 기술과 상관없다. 어느 경우든, 프로세스는 블록 116으로 이어져서 미리 정해진 오프셋을 포함하는 다수의 이미지의 상이한 복합 이미지를 생성할 수 있다. 그 후, 이 기술에 특정된 프로세스가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 블록 118로 이어져서, 블록 116에서 생성된 복합 이미지의 픽셀 사이에서 강도의 평균 제곱 차이 또는 총 에러를 측정할 수 있다. 또는, 이 방법은 블록 120으로 이어져서, 블록 116에 생성된 복합 이미지 내 스팟의 위치의 평균 제곱 차이 또는 총 에러를 측정할 수 있다.
어느 경우든, i가 n과 같은지 여부와 관련하여 블록 122에서 측정이 이루어질 수 있고, n은 미리 정해진 오프셋의 수이며 이 오프셋에 의해 다수의 이미지의 좌표를 조절하게 된다. i가 n과 같지 않은 경우, 이 방법은 블록 124로 이어져서 i의 값을 하나씩 증가시키게 되고 블록 114 내지 블록 120에 표시된 프로세스가 반복될 수 있다. i가 n과 동일한 것이 측정되면, 본 발명의 방법은 블록 126으로 진행될 수 있고, 여기에서 상이한 복합 이미지 각각에 대한 평균 제곱 차이 또는 총 에러의 연산값이 평가된다. 특히, 각각의 상이한 복합 이미지에 대한 평균 제곱 차이 또는 총 에러의 연산된 값은 복합 이미지에 대한 최소 에러가 되는 오프셋(즉, 이동 및/또는 회전) 값을 식별하기 위해 평가될 수 있다. 식별된 오프셋 값은 좌표가 블록 128에 표시된 것처럼 조절된 각각의 비기준 이미지에 대해 저장될 수 있다. 테이블과 같은 어떤 적절한 데이터 구조는 이러한 값에 적합할 것이다. 상술한 두 가지 실시예에서, 식별된 오프셋 값은 이어지는 이미지가 진행되는 동안 생성된 분류 이미지의 좌표 시스템에 적용될 수 있다. 특히, 분류 이미지는 상술한 방정식을 이용하여 이동되거나 회전되어 직접 새로운 이미지 버퍼 내로 들어갈 수 있고, 또한 오리지널 분류 이미지 버퍼는 버려질 수 있다.
이미지 좌표 시스템이 정렬된 후 인터-이미지 미립자의 상관관계가 수행될 수 있다. 특히, 이미지 좌표 시스템이 정렬된 후, 하나 이상의 분류 이미지를 하나 이상의 파장 또는 파장 대역에서 획득할 수 있다는 것을 고려하여, 실제 미립자는 위치에 의해 버려질 수 있다. 간단히 말하자면, 만일 미립자가 모든 분류 이미지 전역에 존재하지 않는다면, 추가 프로세스로부터 미립자를 삭제할 수 있다.
한 예에서, 각각의 분류 이미지에 대한 이동/회전 값과 상술한 미립자 발견 방법에 의해 이전에 식별된 각각의 분류 이미지의 미립자 집합을 이용하여, 주어진 반경 내에서 가장 잘 일치하는 미립자를 식별할 수 있다. 가장 잘 맞는 미립자를 식별하는 것은 포개어진 일련의 n 루프를 생성하는 것을 포함할 수 있고, 각각의 미립자 집합을 통해 반복하기 위해 루프의 각 레벨은 분류 이미지를 나타낸다. 가장 깊이 포개어진 레벨에서, 본 발명의 방법은 모든 외부 루프로부터의 미립자의 조절된 좌표가 주어진 반경 내에 있는지 여부를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 각각의 포개는 레벨에서의 좌표는 거리가 측정되기 전에 인터-이미지 정렬에 대해 상 술한 방정식과 정렬 테이블에 따라 이동될 수 있다. 만일 거리가 주어진 반경 보다 작으면, 나중에 가장 안쪽에 있는 레벨에서 다른 짝과 비교하기 위해 가장 안쪽에 있는 루프의 미립자 위치는 임시로 저장될 수 있다. 가장 안쪽의 레벨에서 제2 미립자의 거리가 이전에 발견한 미립자의 거리보다 짧으면, 임시로 저장된 미립자의 위치가 현재의 거리로 대체될 수 있다. 만일 그렇지 않으면, 본 발명의 방법은 다음 미립자에 대해서 계속될 것이다. 가장 바깥에 있는 루프로부터 두번째의 반복이 끝나는 지점에서, 가장 바깥쪽의 위치에 가장 잘 일치하는 임시 위치가 집합에 저장될 수 있다. 만일 외부 루프 미립자에 대해 주어진 반경 내에 일치하는 것이 없다면, 정정 알고리즘의 출력값이 위에서 생성된 집합이기 때문에 이 미립자의 예는 추가로 고려할 사항으로부터 자동으로 제거된다.
전체적인 프로세스의 속도를 높이기 위해, 상술한 것처럼 식별된 일치하는 것이 있다면, 미립자는 각각의 이어지는 루프에서 "이미 사용된" 것으로 식별될 것이고, 따라서 다시 고려하기 위해 처리시간이 연장되지 않는다. 이미지는 또한 다수의 하위섹션으로 분할될 수 있고, 각각의 하위섹션은 처리시간을 줄이기 위해 별도로 관련될 수 있다. 이러한 예에서, 이미지를 섹션으로 분리하는데 드는 시간과 관련하여 루프 반복시의 전체 저장작업에 손실이 발생하지 않도록 하위섹션의 수가 선택된다. 또한, 하위섹션의 경계부에서 비교 성능의 저하가 일어나지 않도록, 영역들은 약간의 중복부분을 가질 수 있다. 또한, 영역들이 중복되면, 중복시 미립자를 복제해야할 가능성을 줄일 수 있도록, 영역들이 중복되는 정도를 선택할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 리포터 형광 방출의 형광 통합을 포함할 수 있다. 리포터 방출 레벨이 일정하지 않고 알려져 있지 않기 때문에, 통합에서 사용되는 리포터 이미지 내에서 픽셀을 식별하기 위해 분류 이미지에 대해 사용된 미립자 발견 기술을 사용하는 것을 불가능하며 필요하지도 않다. 대신에, 분류 이미지 내에서 발견된 미립자의 동일한 x 및 y 좌표에서의 형광을 사용할 수 있다.
이러한 예에서, 인터-이미지 상관관계에 의해 측정된 조절 테이블에서 이동 및 회전값을 사용하는 것은 각각의 발견된 미립자가 리포터 이미지의 적절한 좌표에 맵핑될 수 있다. 각각의 미립자의 출발 위치에 대해, 비조절 기준 분류 이미지로부터의 좌표계를 사용할 수 있다. 리포터에 대해 측정된 이동 x 및 y값 및 회전각은 리포터 이미지 내의 이미지화된 미립자가 이동되어 분류 기준 이미지 내의 미립자의 위치와 동시에 만나게 될 수 있는 될 수 있는 방향을 나타낸다. 그러나, 여기에서 수행되는 변형은 리포터 좌표계로 기준 좌표계를 이동시키는 것을 포함한다. x 및 y 이동값은 단순히 각각의 조절 매개변수의 부호를 뒤집음으로써 "변환"될 수 있다(음의 값이 양의 값이 되고 그 반대도 성립). 비슷하게, 회전각의 부호도 리포터 좌표가 발견되기 전에 반전될 수 있다. 모든 매개변수의 부호가 반전된 후, 인터-이미지 정렬 단계에 대한 상술한 방정식은 통합의 중심을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 주어진 통합 반경 내에 있는 모든 리포터 픽셀의 통합을 측정할 수 있다.
상술한 것처럼, 이미지 데이터 처리에 대하여 본 문서에 기재된 방법은 이미지 평면 정규화 프로세스를 포함할 수 있다. 이상적으로 이미지 시스템은 미립자 사이의 위치 의존 방출 편차를 막기 위해 균일하게 빛을 받는다. 그러나, 실제로, 이미지 필드 상의 각 스팟은 주어진 조명 레벨을 갖고 있다. 또한, 본 시스템 내에서 사용되는 형광 대역 필터 및 이미지 렌즈는 이미지 내 모든 포인트에 대해 동일한 빛의 양을 전송하지 않는다. 이미지 내의 이러한 편차를 보상하기 위해, 정규화 방법 또는 알고리즘이 광학 매개변수의 측정된 값에 가해질 수 있다. 일부 실시예에서, 본 문서에 기재된 이미지 평면 정규화 프로세스는 상술한 특히 도 2 내지 도 4에 기재된 것과 관련된 하나 이상의 프로세스가 수행된 이후에 수행될 수 있다. 그러나, 다른 실시예에서, 본 문서에 기재된 이미지 평면 정규화는 하나 이상의 이러한 프로세스와 독립적으로 실행될 수 있다.
도 5는 이미지 평면 정규화 프로세스에 대한 예시적인 일련의 단계를 나타내는 흐름도이다. 도 5의 블록 130에 도시된 것처럼, 프로세스는 제1의 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수 값을 나타내는 제1 세트의 이미지 내에서 하나 이상의 픽셀을 식별하기 위해 관련된 균일한 농도의 형광물질을 갖는 제1 세트의 미립자에 대해서 찍은 제1 세트의 이미지를 분석하는 것을 포함할 수 있다. 제1 세트의 이미지는 단일 이미지 또는 다수의 이미지를 포함하는 특정 수의 이미지를 포함할 수 있다. 다수의 이미지를 채택하는 실시예에서, 제1 세트의 이미지가 상이한 파장의 광원을 이용하여 형성되며, 이 파장으로서 빨강 채널, 녹색 채널, 파랑 채널에 대응하는 파장을 예로 들 수 있는데 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 경우에, 본 발명의 방법은 제1의 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수값을 나타내는 제2 이미지 세트 내에서 하나 이상의 픽셀을 식별하기 위해 관 련된 형광물질의 균일한 농도를 갖는 뚜렷한 제2의 미립자 세트를 찍은 제2 이미지 세트가 분석되는 블록 132를 선택적으로 포함할 수 있다. 제1 이미지 세트와 같이, 제2 이미지 세트는 특정 수의 이미지를 포함할 수 있고, 다수의 이미지를 취하는 경우 다수의 이미지는 상이한 파장의 광원을 이용하여 형성될 수 있다. 일부 실시예에서, 알고 있는 농도를 갖는 다른 미립자 세트에 대해 찍은 제2 이미지 세트를 분석하는 것은 제1 이미지 세트 및 제2 이미지 세트의 각 하위섹션에 대해 다음에 전개되는 통계 중에서 미립자 불균일성 및 노이즈의 영향을 줄이는데 효과적일 수 있다. 특히, 미립자 불균일성 및 노이즈의 영향은 블록 140과 관련하여 아래에서 설명하는 것처럼 제1 세트의 이미지 및 제2 세트의 이미지의 각 하위섹션에 대해 측정된 광학 매개변수값을 이용함으로써 감소될 수 있다.
본 발명의 방법이 제2 세트의 이미지를 분석하는 것을 포함하는지 여부와 상관없이, 본 방법은 블록 134로 진행되어 제1 이미지 세트의 그리고 일부 경우에는 제2 이미지 세트의 각 하위섹션 내에서 블록 130 및 블록 132와 관련하여 설명하는 프로세스에서 식별된 픽셀의 집합을 카테고리화할 수 있다. 특히, 이미지 세트는 하위섹션 배열로 분할될 수 있고, 연속적으로 배열된 픽셀 집합은 이미지 내 위치에 기초하여 하위섹션 내에 배열될 수 있다. 보다 구체적으로, 식별된 각 미립자에 대해, 하위 섹션이 속하는 제1 이미지 세트 및 제2 이미지 세트 내의 하위섹션이 측정될 수 있다. 하위섹션의 배열은 필요한 백그라운드 신호의 명확도, 시스템의 처리능력, 및/또는 분석되는 미립자의 수에 기초하여 특정 수의 행과 열을 포함할 수 있다. 도 5에 더 도시된 것처럼, 본 발명의 방법은 블록 136으로 진행될 수 있 고, 제1 이미지 세트의 그리고 일부 경우에는 제2 이미지 세트의 각각의 하위섹션에 대해, 카테고리화된 픽셀 집합의 광학 매개변수의 레벨을 나타내는 하나의 통계값을 전개한다. 일반적으로, 통계값은 임의의 수인 통계 매개변수로부터 선택될 수 있고, 이 매개변수는 중앙값, 평균, 최빈값, 절사평균을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시예에서는, 중앙값을 측정하는 것이 특히 바람직하다.
도 5의 결정 블록 138에 표시된 것처럼, 본 발명의 방법은 블록 140으로 진행될 수 있고, 여기에서 뚜렷한 두 세트의 미립자에 대한 두 이미지 세트가 분석된다. 블록 140은 제1 이미지 세트와 제2 이미지 세트의 각 하위섹션에 대해 전개된 통계의 평균이 연산된다. 블록 140 이후에 또는 블록 138에서 픽셀 집합을 카테고리화하기 위해 오직 한 세트의 이미지만 분석되는 것을 측정하였을 때, 본 발명의 방법은 블록 142로 진행되어 제1 세트의 이미지 및 제2 세트의 이미지를 형성하기 위해 사용되는 파장에 특정된 행렬 내의 각 하위섹션에 대해 전개된 통계를 저장할 수 있다. 이러한 행렬은 블록 148과 관련하여 아래에서 보다 구체적으로 설명하는 것처럼 관련된 형광물질의 알려지지 않은 농도를 갖는 이미지 미립자에 대해 측정된 광학 매개변수의 표준화된 값을 연산하는데 사용된다.
특히, 본 발명의 방법은 제1의 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수를 나타내는 제3 세트의 이미지 내에서 하나 이상의 픽셀을 식별하기 위해 관련된 형광물질의 알려지지 않은 농도를 갖는 미립자에 대해 찍은 제3 이미지 세트를 분석하도록 블록 144를 포함할 수 있다. 제1 이미지 세트와 같이, 제3 이미지 세트는 특정 수의 이미지를 포함할 수 있고, 다수의 이미지를 취하는 경우 다수의 이미지 는 상이한 파장의 광원을 이용하여 형성될 수 있다. 본 발명의 방법은 블록 146으로 진행될 수 있고, 여기에서 블록 144에서 식별된 픽셀 집합은 제3 이미지 세트의 각 하위섹션으로 카테고리화 된다. 형광물질의 알려지지 않은 농도를 갖는 미립자 사이에서 위치 의존 방출 편차를 보상하기 위해, 측정된 광학 매개변수에 대해 표준화된 값이 연산될 수 있다. 특히, 블록 148은 이미지 내에서 식별된 각각의 픽셀에 대한 광학 매개변수값이 광학 매개변수에 대해 표준화된 값을 얻기 위해 제1 이미지 세트 및 제2 이미지 세트의 대응하는 하위섹션에 대해 전개된 통계값으로 나누어질 수 있다.
일부 실시예에서, 외부 기준에 대하여 최종 교정된 값을 조정하기 위해 각각의 식별된 픽셀에 대한 표준화값에 단일 "교정기(calibrator)" 값이 곱해질 수 있다. 농도를 아는 거의 균일한 미립자 세트에 대하여 상술한 표준화 행렬로부터 교정기 값을 측정할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 제1 이미지 세트 및 제2 이미지 세트 중 하나 또는 모두의 각 하위섹션에 대해 전개된 모든 통계값을 나타내는 통계값을 연산하기 위해 블록 150을 선택적으로 포함할 수 있다(점선으로 경계가 표시됨). 통계값은 특정 수의 통계 매개변수로부터 선택될 수 있고, 이 매개변수는 중앙값, 평균, 최빈값, 절사평균을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시예에서는, 중앙값을 측정하는 것이 매우 바람직할 수 있다. 교정값을 측정하는 것은 블록 152에 표시된 연산된 통계값에 의해 관련된 형광물질의 균일한 농도를 갖는 상이한 미립자 세트와 관련된 광학 매개변수의 레벨과 연관된 미리 정해진 수치값을 나누는 것을 더 포함할 수 있다. 위에서 설명한 것처럼 그리고 도 5의 블록 154에 표시된 것처럼, 외부 기준에 값을 맞추기 위해 알지 못하는 농도를 갖는 미립자의 광학 매개변수에 대해 획득된 표준화된 값을 교정기 값에 곱할 수 있다.
상술한 표준화 및 교정 기술은 모든 이미지 내에 각 픽셀을 표준화하는 것으로 제한되는 것은 아니라는 점에 유의해야 한다. 이보다는, 표준화 및 교정 기술은 이미지 내에 식별된 미립자에 적용될 수 있다. 이러한 프로세스는 픽셀을 표준화하고 교정하는데 특정된 애플리케이션에 대한 계산을 최소화하기 위해 매우 바람직할 수 있다.
상술한 개시내용의 혜택을 받는 당업자라면 본 발명이 컴퓨터 구현 방법, 저장 매체, 및 이미지 데이터 처리 시스템을 제공할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 상술한 설명에 의해 본 발명의 여러가지 특징을 더 변형한 것과 또 다른 실시예는 당업자에게 명확한 것이 될 것이다. 따라서, 상술한 설명내용은 단지 예시적인 것으로 해석되어야하며, 그 목적은 본 발명을 실시하는 일반적인 방법을 당업자에게 알려주려는 것이다. 본 문서에서 설명되고 도시된 본 발명의 형태는 현재로서 가장 바람직한 실시예로 간주되는 것이라는 것을 이해하여야 한다. 요소 및 물질들은 본 문서에 기재된 것에 대해 대체될 수 있고, 부품이나 프로세스는 거꾸로 실시될 수 있고, 본 발명의 특징은 독립적으로 이용될 수 있으며, 이러한 모든 것은 본 발명이 설명하는 내용에 의해 당업자에게 분명한 사항이 될 것이다. 아래의 청구범위에 기술된 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 본 문서에 기재된 요소에 변경을 가할 수 있다.

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  9. 프로세서에 의해 실행될 수 있는 프로그램 명령으로서,
    제1의 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수를 나타내는 이미지 내에서 하나 이상의 픽셀을 식별하기 위해 관련된 형광물질을 갖는 미립자의 이미지를 분석하는 프로그램 명령과;
    하나 이상의 식별된 픽셀 세트 내의 광학 매개변수에 대한 최대값을 각각 나타내는 하나 이상의 식별된 픽셀 세트 내의 위치를 측정하는 프로그램 명령과;
    하나 이상의 위치를 둘러싸는 다수의 픽셀에 대한 광학 매개변수의 강도 변화율을 연산하는 프로그램 명령과;
    연산된 강도변화율에 기초하여 추가로 평가하기 위한 다수의 픽셀을 수용하거나 거부하는 프로그램 명령을 포함하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 다수의 픽셀을 수용하거나 거부하는 프로그램 명령은,
    상기 강도 변화율이 상기 제1의 미리 정해진 임계값과 구별되는 제2의 미리 정해진 임계값 이상이라는 것을 연산하면 추가로 평가하기 위한 다수의 픽셀을 수용하는 단계와;
    상기 강도 변화율이 상기 제2의 미리 정해진 임계값보다 작다는 것을 연산하면 추가로 평가하기 위한 다수의 픽셀을 거부하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 강도 변화율을 연산하는 프로그램 명령은,
    하나 이상의 위치를 둘러싸는 제1의 미리 정해진 반경 내에 배치된 다수의 픽셀로 된 제1 픽셀 세트에 대한 광학 매개변수의 값을 합하는 프로그램 명령과;
    상기 제1의 미리 정해진 반경 보다 반경이 더 크고 하나 이상의 위치를 둘러싸는 제2의 미리 정해진 반경 내에 배치된 다수의 픽셀로 된 제2 픽셀 세트에 대한 광학 매개변수의 값을 합하는 프로그램 명령과;
    상기 제1 픽셀 세트와 상기 제2 픽셀 세트에 대해 각각 연산된 합계값의 비율을 측정하는 프로그램 명령;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제1의 미리 정해진 반경은 상기 이미지 내 하나의 미립자의 투영된 직경과 동일하고, 상기 투영된 직경은 미립자를 이미지화하는데 사용된 시스템의 요소 구조에 기초하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 제2의 미리 정해진 반경은 상기 이미지 내 하나의 미립자의 투영된 직경보다 1.5배 더 크고, 상기 투영된 직경은 미립자를 이미지화하는데 사용된 시스템의 요소 구조에 기초하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 위치를 측정하는 프로그램 명령은 광학 매개변수에 대한 최대값을 각각 나타내는 하나 이상의 식별된 픽셀 세트 중에서 피크 픽셀을 확인하는 프로그램 명령을 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 위치를 측정하는 프로그램 명령은 하나 이상의 식별된 픽셀의 하나 이상의 세트에 대응하는 피크 픽셀 내의 그리고 피크 픽셀을 둘러싸는 제2의 미리 정해진 반경에 의해 포함된 피크 픽셀과 이웃하는 픽셀 내의 광학 매개변수의 값에 기초하여 하나 이상의 식별된 픽셀의 하나 이상의 세트 내의 중심 위치를 연산하는 프로그램 명령을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 위치를 측정하는 프로그램 명령은 중심 위치의 크기가 이미지 내 픽셀 폭의 50% 보다 크다는 것을 측정하였을 때 하나 이상의 식별된 픽셀의 하나 이상의 세트 내의 광학 매개변수에 대한 최대값을 나타내는 위치로서 중심 위치를 할당하는 프로그램 명령을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  17. 제14항에 있어서,
    피크 픽셀 중 두 피크 픽셀 사이의 거리를 연산하는 프로그램 명령과;
    상기 거리가 제2의 미리 정해진 임계값 보다 작다는 것을 연산하였을 때 추가 평가를 위해 두 피크 픽셀 중 하나에 대응하는 픽셀 세트를 거부하는 프로그램 명령;을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  18. 상이한 파장 대역에서 이미지 하위시스템 내에 배치된 미립자를 이미지화하고, 이미지화된 미립자의 방출에 대응하는 데이터를 획득하는, 이미지 하위시스템과;
    각각 상이한 파장 대역에 대응하는 미립자의 다수의 이미지에 대해 획득한 데이터를 저장하고, 상기 다수의 이미지 중 하나로부터 기준 이미지를 선택하고, 또한 각각의 상기 다수의 이미지 내부의 미립자에 대응하는 스팟이 상기 기준 이미지 내 스팟과 정렬되도록 기준 이미지를 제외한 다수의 이미지 중 하나 이상의 이미지의 좌표를 조정하는, 프로세서에 의해 실행될 수 있는 프로그램 명령을 포함하는 저장매체;를 포함하는 이미지 데이터를 획득하여 처리하는 시스템.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 좌표 매개변수를 조정하는 프로그램 명령은 기준 이미지에 대하여 비기준 이미지를 정렬시키기 위하여 좌표의 직교 오프셋 중 하나 이상을 수행하는 프로그램 명령을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 좌표 매개변수를 조정하는 프로그램 명령은 상기 다수의 이미지 중 하나 이상의 이미지의 회전을 수행하는 프로그램 명령을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 상이한 파장 대역은 상이한 방출 파장을 가지는 둘 이상의 LED에 의하여 생성되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 좌표 매개변수를 조정하는 프로그램 명령은,
    미리 정해진 오프셋에 의해 하나 이상의 이미지의 좌표를 조절하는 프로그램 명령과;
    상이한 이미지 내의 스팟에 대응하는 픽셀 사이에서 강도의 평균 제곱 차이 또는 총 에러를 연산하는 프로그램 명령과;
    하나 이상의 이미지의 좌표를 조절하는 단계, 및 미리 정해진 반복 회수로 상이한 미리 정해진 오프셋에 의해 강도의 평균 제곱 차이 또는 총 에러를 연산하는 단계를 반복하는 프로그램 명령과;
    상이하게 조절된 상기 하나 이상의 이미지의 좌표 각각에 대해 강도의 평균 제곱 차이 또는 총 에러의 연산된 값들을 비교하는 프로그램 명령과;
    최소의 강도의 평균 제곱 차이 또는 총 에러를 갖는 이미지 세트에 대응하는 조절된 좌표를 갖는 각각의 이미지에 대한 오프셋 값을 저장하는 프로그램 명령;을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  23. 제18항에 있어서,
    상기 좌표 매개변수를 조정하는 프로그램 명령은,
    미리 정해진 오프셋에 의해 하나 이상의 이미지의 좌표를 조절하는 프로그램 명령과;
    상이한 이미지 내의 스팟 위치 사이의 평균 제곱 차이 또는 총 에러를 연산하는 프로그램 명령과;
    하나 이상의 이미지의 좌표를 조절하는 단계, 및 미리 정해진 반복 회수로 상이한 미리 정해진 오프셋에 의해 스팟 위치의 평균 제곱 차이 또는 총 에러를 연산하는 단계를 반복하는 프로그램 명령과;
    상이하게 조절된 상기 하나 이상의 이미지의 좌표 각각에 대해 스팟 위치의 평균 제곱 차이 또는 총 에러의 연산된 값들을 비교하는 프로그램 명령과;
    최소의 스팟 위치의 평균 제곱 차이 또는 총 에러를 갖는 이미지 세트에 대응하는 조절된 좌표를 갖는 각각의 이미지에 대한 오프셋 값을 저장하는 프로그램 명령;을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  24. 제18항에 있어서,
    상기 저장 매체는, 프로세서에 의해 실행될 수 있는 프로그램 명령으로서,
    이미지 시스템 내에 배치된 미립자를 분류하기 위해 사용되는 하나의 파장 대역에서 이미지화된 미립자가 미립자를 분류하기 위해 사용되는 상이한 파장 대역에서 추가로 이미지화되는지 여부를 측정하는 프로그램 명령과;
    상이한 파장 대역에서 미립자가 이미지화된다고 측정되면 추가로 평가하기 위한 미립자를 수용하는 프로그램 명령과;
    상이한 파장 대역에서 미립자가 이미지화되지 않는다고 측정되면 추가로 평가하기 위한 미립자를 거부하는 프로그램 명령;을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  25. 제1의 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수를 나타내는 제1 이미지 내에서 하나 이상의 픽셀을 식별하도록 관련된 형광물질의 균일한 농도를 갖는 제1 미립자 세트의 제1 이미지를 분석하는 단계와;
    상기 제1 이미지의 각각의 하위섹션 내에서 상기 제1 이미지를 분석하는 단계가 진행되는 동안 식별된 픽셀의 집합을 카테고리화하는 단계와;
    카테고리화된 픽셀 집합에 대한 광학 매개변수의 레벨을 나타내는 통계값을 제1 이미지 내의 각각의 하위섹션에 대해 전개하는 단계와;
    제1의 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수를 타나내는 제2 이미지 내에서 하나 이상의 픽셀을 식별하도록 관련된 형광물질의 알려지지 않은 농도를 갖는 미립자의 제2 이미지를 분석하는 단계와;
    상기 제1 이미지 내의 하위섹션과 크기가 동일한 하위섹션을 갖도록 제2 이미지를 분할하는 단계와;
    상기 제2 이미지의 각 하위섹션 내에서 상기 제2 이미지를 분석하는 단계가 진행되는 동안 식별된 픽셀의 집합을 카테고리화하는 단계와;
    대응하는 제1 이미지 하위섹션에 대해 전개된 통계값에 의해 상기 제2 이미지를 분석하는 단계가 진행되는 동안 식별된 각각의 픽셀에 대한 광학 매개변수 값을 나누어 광학 매개변수에 대해 표준화된 값을 연산하는 단계;를 포함하는, 컴퓨터에서 구현되는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 제1의 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수를 나타내는 제3 이미지 내에서 하나 이상의 픽셀을 식별하기 위해 관련된 형광물질의 균일한 농도를 갖는 미립자의 제3 이미지를 분석하는 단계와;
    상기 제1 이미지 내의 하위섹션과 크기가 동일한 하위섹션을 갖도록 제3 이미지를 분할하는 단계와;
    상기 제3 이미지를 분석하는 단계가 진행되는 동안 식별된 픽셀의 집합을 제3 이미지의 각 하위섹션 내에서 카테고리화 하는 단계와;
    카테고리화된 픽셀의 집합에 대하여 광학 매개변수의 레벨을 나타내는 통계값을 제3 이미지 내에서 각각의 하위섹션에 대해 전개하는 단계와;
    제1 이미지 및 제3 이미지를 형성하기 위해 사용되는 파장에 특정된 행렬 내의 제1 이미지 및 제3 이미지의 각 하위섹션에 대해 전개된 통계값을 저장하는 단계;를 더 포함하고,
    상기 표준화된 값을 연산하는 단계는, 상기 제1 이미지 및 제3 이미지의 대응하는 하위섹션에 대해 전개된 통계값으로 상기 제2 이미지를 분석하는 단계가 진행되는 동안 식별된 각각의 픽셀에 대해 광학 매개변수값을 나누는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터에서 구현되는 방법.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 제2 이미지를 분석하는 단계 이전에, 제1의 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수 값을 나타내는 제3 이미지 내에서 하나 이상의 픽셀을 식별하기 위해 관련된 형광물질의 균일한 농도를 갖는 미립자의 상이한 세트의 제3 이미지를 분석하는 단계와;
    상기 제1 이미지 내의 하위섹션과 동일한 크기를 갖는 하위섹션을 갖도록 상기 제3 이미지를 분할하는 단계와;
    상기 제3 이미지를 분석하는 단계가 진행되는 동안 식별된 픽셀의 집합을 상기 제3 이미지의 각 하위섹션 내에서 카테고리화하는 단계와;
    분류된 픽셀의 집합에 대한 광학 매개변수의 레벨을 나타내는 통계값을 제3 이미지의 각 하위섹션에 대해 전개하는 단계와;
    상기 제1 이미지 및 상기 제3 이미지의 각각의 하위섹션에 대해 전개된 통계값의 평균을 연산하는 단계;를 더 포함하고,
    상기 표준화된 값을 연산하는 단계는, 상기 제1 이미지 및 제3 이미지의 대응하는 하위섹션에 대해 전개된 통계값의 연산된 평균으로 상기 제2 이미지를 분석하는 단계가 진행되는 동안 식별된 각각의 픽셀에 대해 광학 매개변수값을 나누는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터에서 구현되는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    각각의 하위섹션에 대해 전개된 모든 통계값을 나타내는 통계값을 연산하는 단계와;
    교정기 값을 연산하기 위해 연산된 통계값으로 관련된 형광물질의 균일한 농도를 갖는 제1 미립자 세트와 제3 미립자 세트와 관련된 광학 매개변수의 레벨과 연관된 미리 정해진 수치값을 나누는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터에서 구현되는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    표준화된 값에 교정기 값을 곱하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터에서 구현되는 방법.
  30. 제11항에 있어서,
    합계값의 비율을 측정하는 상기 프로그램 명령은 제2 픽셀 세트에 대해 연산된 합계값을 제1 픽셀 세트에 대해 연산된 합계값으로 나누는 프로그램 명령을 포함하고, 다수의 픽셀을 수용하거나 거부하는 상기 프로그램 명령은,
    제1의 미리 정해진 임계값과 상이한 제2의 미리 정해진 임계값 이하의 양만큼 상기 비율이 세트 값과 상이하다는 것을 측정하였을 때 추가로 평가하기 위한 다수의 픽셀을 수용하는 프로그램 명령과;
    상기 비율이 제2의 미리 정해진 임계값 보다 더 큰 양만큼 세트 값과 상이하다는 것을 측정하였을 때 추가로 평가하기 위한 다수의 픽셀을 거부하는 프로그램 명령;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  31. 제11항에 있어서,
    합계값의 비율을 측정하는 상기 프로그램 명령은 상기 제2 픽셀 세트에 대해 연산된 합계값으로 상기 제1 픽셀 세트에 대해 연산된 합계값을 나누는 프로그램 명령을 포함하고, 상기 다수의 픽셀을 수용하거나 거부하는 프로그램 명령은,
    제1의 미리 정해진 임계값과 상이한 제2의 미리 정해진 임계값 이상의 양만큼 상기 비율이 세트 값과 상이하다는 것을 측정하였을 때 추가로 평가하기 위한 다수의 픽셀을 수용하는 프로그램 명령과;
    상기 비율이 제2의 미리 정해진 임계값보다 작은 양만큼 세트 값과 상이하다는 것을 측정하였을 때 추가로 평가하기 위한 다수의 픽셀을 거부하는 프로그램 명령;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터로 판독가능한 저장매체.
  32. 제25항에 있어서,
    상기 제2 이미지는 제2 미립자 세트로 이루어져 있고,
    제1의 미리 정해진 임계값 이상의 광학 매개변수값을 나타내고 상기 제1 이미지와 상이한 파장의 광원을 이용하여 형성되는 제3 이미지 내에서 하나 이상의 픽셀을 식별하기 위해 관련된 형광물질의 균일한 농도를 갖는 제1 미립자 세트의 제3 이미지를 분석하는 단계와;
    상기 제2 미립자 세트의 제4 이미지를 분석하는 단계;를 더 포함하고,
    상기 제4 이미지는 상기 제2 이미지와 상이한 파장의 광원을 이용하여 형성되는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터에서 구현되는 방법.
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