KR101235560B1

KR101235560B1 - 유전자 치료용 코딩 서열의 발현에 적합한 발현 벡터

Info

Publication number: KR101235560B1
Application number: KR1020127010809A
Authority: KR
Inventors: 고대경; 이규현; 이현; 윤성태; 조의철
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2008-02-14
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2013-02-25
Also published as: KR20120093903A; US20120282685A1; KR101190594B1; KR101190593B1; CN101952440A; US20120282687A1; CN101952440B; US8309698B2; KR20120050535A; US20120282686A1; US8617875B2; US8628956B2; WO2009102085A1; KR101190591B1; KR20100130605A; US20110045584A1; US8569051B2; KR20120050534A

Abstract

본 발명은 인간의 간조직에서 원하는 유전자를 지속적으로 고발현시킬 수 있는, 프로모터, 인핸서, 인트론, 비해독 말단영역(untranslated region, UTR) 및 유전자좌 제어영역(locus control region, LCR)의 전사 조절 부위들의 새로운 조합을 포함하는 유전자 치료용 발현 벡터에 관한 것으로, 본 발명에 따른 전사 조절 부위를 포함하는 발현 벡터는 간조직 특이적인 유전자의 안정적이면서 지속적인 발현을 가능하게 하여 혈전증, 혈우병, 항암치료 등에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

유전자 치료용 코딩 서열의 발현에 적합한 발현 벡터{EXPRESSION VECTOR SUITABLE FOR EXPRESSION OF A CODING SEQUENCE FOR GENE THERAPY}

본 발명은 유전자 치료(gene therapy)용 발현 벡터에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 인간의 간조직에서 목적하는 유전자를 지속적으로 고발현시킬 수 있는, 프로모터, 인핸서, 인트론, 비해독 말단영역(untranslated region, UTR) 및 유전자좌 제어영역(locus control region, LCR)의 전사 조절 부위들(cis-regulatory elements 또는 cis-acting elements)의 새로운 조합을 포함하는 유전자 치료용 발현 벡터에 관한 것이다.

간은 혈액의 저장과 당의 전환, 각종 사이토카인의 분비기관일 뿐만 아니라 생체 제어를 담당하는 주요 유전자의 발현 기관으로서 유전질환, 심혈관 질환, 대사성 질환, 혈액질환, 암 등 각종 질환이 간-유래 단백질과 밀접하게 관련되어 있다. 전염성 간염 등의 다양한 간 특이적 질환이 유전자 치료의 대상이 되는 모델 질환으로서 오랜 기간 연구되어 왔다.

간세포는 한 번 생성되면 긴 수명(lifespan)을 갖고 유지되는 특성을 가지고 있으며, 대다수 바이러스 유전자 전달체의 수용체를 가지고 있다. 더욱이, 간은 혈류와 연결되어 있어 치료제의 접근이 비교적 용이하므로, 유전자 치료의 중요한 목적 기관으로 간주되고 있다.

간에서 발현되는 유전자의 결손으로 인한 질환 중 하나인 혈우병은 X염색체에 존재하는 혈액응고 제8인자 (FVIII, f8) 및 제9인자 (FIX, f9) 유전자의 이상에 기인하는 퇴행성 출혈 질환이다. 변이 또는 결손이 된 유전자에 따라 A형 (혈액응고 제8인자의 이상)과 B형 (혈액응고 제9인자의 이상)으로 분류된다. 이들 질환의 치료제의 경우, 혈액응고 제8인자 및 제9인자의 정상 혈중 농도 (각각 100-200 ng/㎖ 및 5 ㎍/㎖)의 1-5％ 이상 평생 지속적으로 발현시킬 수 있을 때 치료 효과를 기대할 수 있다.

B형 혈우병 유전자 치료에 관한 지금까지의 연구 결과에 따르면, 인간 혈액응고 제9인자 (hFIX) 유전자가 도입된 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터를 B형 혈우병 생쥐 모델에 도입하여 최고 1500-1800 ng/ml의 hFIX 단백질 발현을 유도한 바가 있다 (Snyder, R. O., Nat . Med ., 5: 64-70 (1999); Manno, C. S., Nat . Med ., 12: 342-347, (2006)). 혈우병 개의 모델에서는 최고 730 ng/ml의 hFIX 단백질의 발현을 확인한 바 있다 (Arruda, V. R., Blood , 105: 3458-3464 (2005)). 그러나, 동물 실험에 사용된 발현 벡터와 동등한 발현 효율을 가진 유전자 전달체를 인간을 대상으로 한 임상시험에 사용했을 때 혈액응고 제9인자 단백질의 혈중 농도는 최대 185 ng/ml로 이는 임상적 치료의 임계치인 500 ng/ml에 못 미치는 수치이며, 그나마 일시적인 발현에 그치고 있는 실정이다 (Kay, M. A., Nat . Genet ., 24: 257-261 (2000); Manno, C. S., Nat . Med ., 12: 342-347 (2006)). 이러한 경향은 A형 혈우병 치료 연구에서도 유사하게 나타나고 있다.

지금까지의 임상시험 결과를 토대로 했을 때, 혈우병과 같은 유전질환의 치료를 위해서는 치료 유전자를 간과 같은 특정 조직에서 장기간 동안 고발현시킬 수 있는 우수한 조직 선택적 발현 벡터의 개발이 선결되어야 한다. 더불어 벡터 자체에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응 해소, 발현된 정상 단백질에 대한 인체의 면역내성 유도 등이 매우 중요한 인자로 여겨지고 있다. 정상 혈액응고 제8인자 및 제9인자 유전자의 발현이 임상적 치료치에 도달하기 위한 해결책으로서, 보다 고농도의 바이러스를 주입하거나, 생체 내에서 일어나는 면역반응을 억제하여 단백질의 고발현을 기대하는 방법이 있으나, 근본적으로는 발현 벡터의 개량을 통한 유전자 발현 효율의 향상이 선행되어야 한다.

간조직 특이적 발현이 중요한 또 다른 예로서, 간에서만 생성되는 리포단백질(a)를 들 수 있다. 리포단백질 (a)는 저밀도 리포단백질 (low density lipoprotein, LDL)의 주요 단백질 성분인 아포 B-100에 당단백질인 아포리포단백질(a)가 공유적으로 결합하여 형성된다 (Fless, G. M., J. Biol . Chem ., 261: 8712-8717 (1986)). 아포리포단백질 (a)는 생체내에서 콜레스테롤 운반을 담당하는데, 혈장에서의 리포단백질 (a) 농도 증가는 동맥경화(arteriosclerosis) 및 심장질환의 주된 위험인자로 보고되고 있다 (Armstrong, V.W. 등, Arteriosclerosis, 62: 249-257 (1986); Assmann, G., Am. J. Cardiol., 77: 1179-1184 (1996)). 아포리포단백질 (a)는 플라스미노젠 크링글 IV 및 V 와 유사한 두 종류의 크링글 영역과 비활성의 유사 단백질분해효소 (protease-like) 영역을 포함한다. 크링글 구조의 단백질들은 종양의 신생 혈관 형성과 이동을 억제함으로써 암세포의 증식과 전이를 차단하는 활성이 있는 것으로 널리 알려져 있다 (Folkman J., N Eng J Med, 285: 1182-1186 (1971); Falkman J, Klag sbrun M., Science,235: 442-447 (1987); Scapaticci FA., J Clin Oncol.,20: 3906-3927 (2002)). 최근에, 본 발명자들과 다른 연구자들이 아포리포단백질 (a)의 크링글 도메인들도 상당한 항신생혈관형성 활성에 따른 항암, 항전이효과를 가진다는 사실을 밝혀낸 바 있다 (Sculter V 등, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21: 433-438 (2001); Trieu UN and Uckun FM., Biochem Biophys Res Commun., 257: 714-718 (1999); Kim JS 등, J. Biol Chem., 278: 29000-29008 (2003); Yu HK 등, Cancer Res., 64: 7092-7098 (2004); Kim JS 등, Biochem Biophys Res Commun., 313: 534-540 (2004); Lee K 등, Hepatology, 43: 1063-1073 (2006)).

항전이 및 항암치료에 있어서도 질환 부위에 선택적으로 작용할 수 있는 표적치료가 효과적이라는 것이 최근 널리 인식되고 있다. 이에 따라 항신생혈관형성 억제제를 이용하는 항암치료, 구체적으로는, 간암 및 간전이암의 효과적인 유전자 치료를 위하여 간조직 특이적이면서 지속적으로 유전자 발현을 가능하게 할 수 있는 벡터를 개발하는 것이 중요하다.

상술한 바에서 알 수 있듯이, 효율적인 유전자 치료를 위해서는, 조직 특이적이고 지속적인 유전자의 발현이 요구되며, 이를 위해 유전자 발현 벡터의 다양한 개선이 필요하다. 이는 발현 벡터를 구성하는 전사 조절 부위들(cis-regulatory elements 또는 cis-acting elements)의 개량에 의해서 달성될 수 있다.

통상적인 전사 조절 부위들로는 프로모터 (promoter), 인핸서 (enhancer), 인트론 (intron), 비해독 말단영역 (untranslated region), 유전자좌 제어영역 (locus control region) 등이 존재한다.

유전자 치료에 있어서 간조직 특이적인 발현을 위한 발현 벡터를 제조하기 위해서는, 글루코네오제네시스(gluconeogenesis) 효소인 포스포에놀피루베이트 카복시키나제(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK) (Yang, Y. W., J. 등, Gene Med, 5(5): 417-424 (2003)). 알파1-안티트립신 프로테아제, 알부민, 혈액응고 제7인자 (Coagulation factor VII), 유기 음이온 전달 단백질 (Organic Anion-Transporting Polypeptide-C), B형 간염바이러스의 코어(Kramer, M. G., 등, Mol . Ther., 7(3): 375-385 (2003)). 갑상선호르몬-결합 글로불린(Wang, L., 등, Proc . Natl. Acad . Sci ., 96: 3906-3910 (1999)) 등의 프로모터와, 알부민(Kang, Y., 등, Blood, 106(5): 1552-1558 (2005)), 페닐알라닌 하이드록실라제 (Phenylalanine hydroxylase), 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 단백질(Wang, L., 등, Mol . Ther ., 1(2): 154-158 (2000)) 등의 인핸서가 주로 사용되고 있다.

혈액응고 제7인자 프로모터는 대략 500 bp의 크기로, 간세포에 풍부한 간세포 핵인자 (hepatocyte nuclear factor-4, HNF-4)에 의존적으로 타조직에 비해 10배 이상의 간 특이적인 발현을 나타낸다. 대부분의 전사인자들은 혈액응고 제7인자 프로모터의 3' 말단부위의 약 300 bp 부위에 집중적으로 결합하는 것으로 보고되고 있다(Greenberg, D., 등, Proc . Natl . Acad . Sci ., 92: 12347-12351 (1995)). 501 bp의 혈액응고 제7인자 프로모터에서 5' 말단으로부터 315 bp를 결절(truncated)시키는 경우에는 프로모터의 간세포 특이적인 활성이 30％ 가량 증가하고, 210 bp를 결절시킨 경우에는 오히려 프로모터 활성이 20-30％ 정도 감소하는 것으로 보고되어 있다(Pollak, W. S., 등, J. Biol . Chem ., 271(3): 1738-1747 (1996)).

유기 음이온 전달단백질 (organic anion-transporting polypeptide, OATP) 프로모터는 대략 900 bp의 크기로, 간세포에 풍부한 HNF-1α에 의존적으로 최소 3배 이상의 간 특이적인 발현을 나타내고 있으며, 3' 말단의 약 440 bp 부위에 대부분의 전사인자들이 결합하는 것으로 보고되어 있다 (Jung, D., 등, J. Biol . Chem, 276: 37206-37214 (2001)).

프로모터의 활성은 인핸서에 의해 증가될 수 있다. 페닐알라닌 하이드록실라제(phenylalanine hydroxylase, PAH)의 인핸서는 PAH 유전자의 5' 말단 상부의 -3.5 kb에 위치하며, 약 230 bp 크기로 HNF-1 결합부위를 지니고 있다. PAH 인핸서는 간조직에서 HNF-1 전사효소 의존적으로 결합된 프로모터의 활성을 4배 이상 증가시키는 것으로 보고되어 있다 (Lei, X. D., 등, Proc . Natl . Acad . Sci ., 95: 1500-1504 (1998)).

알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 단백질 (alpha 1-microglobulin/bikunin precursor, AMBP) 인핸서는 AMBP 유전자의 5' 말단 상부의 -2945 내지 -2539 부위에 이르는 약 400 bp 크기를 가진다. 주로 HNF-1, 2, 3, 4의 결합부위로 구성되어 있으며, 인핸서의 주된 활성부위는 -2802 내지 -2659 부위로 알려져 있다.(Route, P., 등, Biochem . J., 334: 577-584 (1998)). 일반적으로, AMBP 인핸서는 프로모터 활성을 2 내지 3배 정도 증가시키는 것으로 보고되어 있다.

유전자의 5'말단과 3'말단에는 비해독 말단영역(untranslated region, UTR)이 존재한다. 비해독 말단영역은 mRNA의 구조적 안정화에 기여한다 (Holcik, M., Liebhaber S. A., Proc Natl Acad Sci USA ., 94: 5410-2414 (1997); Chkheidze, A. N., 등 Mol Cell Biol ., 19: 4572-4581 (1999)). 3' UTR에 존재하는 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal) 서열 또한 mRNA의 구조적 안정화에 크게 기여하는 것으로 보고되어 있다 (Kolev, N. G., 등, Genes Dev ., 19: 2583-2592 (2005)).

진핵생물의 유전자는 단백질로 해독되는 엑손 영역과 그 엑손을 분단하고 있는 비해독 서열인 인트론으로 구성된다. DNA로부터 1차 전사된 mRNA 전구체는 스프라이싱에 의해 인트론이 절단되어 성숙 mRNA가 된다. 인트론의 구조는 GT(U)로 시작되는 스플라이싱 공여체와 AG로 끝나는 스플라이싱 수용체로 이루어진다. 또한 인트론의 3' 말단에는 폴리피리미딘 영역(polypyrimidine tract)과 스플라이싱 인자, snRNP가 결합하는 분기점 서열 (branch sequence), 3배수 구아닌 반복서열(G-triple motif) 등이 존재하고 있는데, 이 부위는 스플라이세오솜(spliceosome) 이라는 RNA와 인트론 절단효소의 복합체를 형성하는데 중요한 역할을 한다(Pagani, F., 등, Nat . Rev . Genet ., 5: 389-396 (2004)).

인트론은 유전자 치료에 있어서 프로모터, 인핸서 등과 함께 유전자의 안정적이고 강력한 발현을 위한 전사 조절 부위의 하나로 적용될 수 있다. 인트론은 유전자의 발현 효율 향상 및 전사인자의 결합을 통한 전사효율의 향상에 관여하며 (Liu, K., 등, Pros . Natl . Acad . Sci ., 92: 7724-7728 (1995); LeBlanc, S. E., 등, J. Biol . Chem ., (2005)). 전사 후의 단백질 해독 효율 향상에도 관여한다 (Moore, M. J., Cell, 108: 431-434 (2002)). 실제로 인간 혈액응고 제9인자(hFIX)의 1번 인트론은 hFIX 단백질의 발현 증가에 기여함이 보고되어 있다 (Kurachi, S., 등, J. Biol . Chem ., 270: 5276-5281 (1995)).

항 혈액 응고 단백질인 안티트롬빈(antithrombin), 플라스미노젠(plasminogen)과 혈액응고 인자인 프로트롬빈(prothrombin)은 간에서 다량 발현한다. 이들 단백질의 결핍에 의한 혈전증 또는 혈우병 환자 유전자의 인트론 영역을 분석한 결과, 다양한 과오돌연변이(missense mutation)와 넌센스 돌연변이(nonsense mutation)가 관찰되었다. 이는 이들 단백질의 인트론이 간조직에 있어서의 유전자의 발현에 중요한 역할을 하고 있음을 보여준다(Jochmans, K., 등, Blood, 84: 3742-3748 (1994)).

유전자좌 제어영역(locus control region, LCR)은 사람, 쥐, 토끼, 염소 등을 포함하는 적어도 36종의 서로 다른 포유류에서 동정되어 왔다. LCR은 물리적으로 DNA 분해효소 I(DNase I)에 민감한 부분을 가지고 있는 염기서열로서, 조직 특이적인 전사 인자들이 결합하는 부위이다. 사람 베타글로빈 LCR이 기능적으로 잘 알려져 있다 (Harju S. 등, Exp . Biol . Med . 227: 683-700 (2002)).

간세포 조절영역(hepatocyte control region, HCR)은 간 특이적 유전자 발현을 증가시키는 능력을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 아포리포단백질 E(ApoE) 유전자의 하류부위에서 발견되었으며 간 특이적 전사인자가 결합하면서 DNase I에 대해 과민감성을 나타내는 부분을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. HCR은 ApoE 유전자의 간 특이적인 발현을 위한 LCR로 작용한다. 이러한 ApoE HCR은 HNF3α, HNF4, GATA-1, C/EBP, TF-LF2, Alu-family와 같은 여러 인자들이 HCR 내 특정 부위에 결합함으로써 활성화된다. 이 중에서도 HNF3α의 결합부위이면서 DNase I에 대해 과민감성을 나타내는 부위에는 TGTTTGC로 구성되는 모티프가 존재하는데, 첫 번째 G와 두 번째 T 사이가 DNase I에 의해 절단된다(Dang Q., 등, J. Biol . Chem . 270: 22577-22585 (1995)). 실제로 간에서 많이 발현되는 사람 혈액응고 제9인자에 대한 동물 실험에서 유전자 치료를 위한 발현 벡터에 ApoE HCR을 도입한 예가 있다(Miao C. H., ef al ., Mol . Ther . 1: 522-532, 2000).

이러한 모티프를 포함하고 있는 인간 ApoE 유전자의 HCR과 비슷한 서열을 가지는 것으로는, 인간의 경우 아포리포단백질 A-I, 아포리포단백질 B, 트랜스페린, 알파-피토단백질, 알파1-안티트립신 등이 있고, 마우스의 경우에는 알파-피토단백질과 알부민 등이 있다 (Dang Q., 등, J. Biol . Chem . 270: 22577-22585 (1995)).

본 발명의 목적은 간조직 특이적인 유전자의 지속적이면서 고발현을 위한 전사 조절 부위로 이용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 간조직 특이적인 유전자의 지속적이면서 고발현을 위한 발현 벡터를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 목적에 따라, 또한 본 발명은 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호: 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 목적에 따라, 또한 본 발명은 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 목적에 따라, 또한 본 발명은 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 코딩 서열 및 상기 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 전사 조절 부위를 포함하는 발현 벡터에 있어서, 상기 전사 조절 부위는 1) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드; 2) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호: 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 3) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 4) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 5) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 6) 서역번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 7) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 또는 8) 서열번호: 42로 개재된 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 또한 본 발명은 코딩 서열 및 상기 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 전사 조절 부위를 포함하는 발현 벡터에 있어서, 상기 전사 조절 부위는 임의의 프로모터에, 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드; 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드; 또는 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 따른 전사 조절 부위들은 적절한 조합에 의해 원하는 코딩 서열이 간조직 특이적으로 발현할 수 있도록 하면서, mRNA의 안정화에 기여하여 코딩 서열의 발현효율 향상 및 지속적인 발현을 유도할 수 있다. 이러한 전사 조절 부위를 포함하는 발현 벡터는 간조직에서 원하는 코딩 서열의 안정적이면서 지속적인 발현을 가능하게 하여 혈전증, 혈우병, 및 항암치료 등에 다양하게 적용될 수 있다.

본 발명의 상기 및 다른 목적과 특징들은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이며, 각 도면은 다음을 나타낸다:
도 1a: 혈액응고 제7인자 프로모터가 삽입된 pCR-FVII Pro 플라스미드, 유기음이온 전달단백질 프로모터가 삽입된 pCR-OATP-C Pro 플라스미드, 및 알파-안티트립신 프로모터 및 인핸서가 삽입된 pCR-AAT Enh/Pro 플라스미드의 개열 지도;
도 1b: 혈액응고 제7인자 프로모터, 혈액응고 제7인자 결절 프로모터, 및 유기 음이온 전달단백질 프로모터가 각각 삽입된 mRLuc 루시퍼라제 유전자의 발현 벡터 pmRL-FVII Pro, pmRL-FVII△ Pro, pmRL-OATP-C Pro 의 개열 지도;
도 2a: 혈액응고 제7인자 프로모터와 유기 음이온 전달단백질 프로모터의 혈관내 피세포주(HUVEC), 간암세포주(Huh-7), 신장세포주(HEK293), 폐암세포주(A549), 및 자궁경부암세포주(HeLa)에서의 발현효율을 나타내는 히스토그램;
도 2b: 혈액응고 제7인자 프로모터와 혈액응고 제7인자 결절 프로모터가 도입된 루시퍼라제 발현 벡터의 개략적인 모식도 및 이들 프로모터간의 발현효율 차이를 보여주는 히스토그램;
도 2c: CMV 프로모터 대비 혈액응고 제7인자 결절 프로모터(FVII△), 유기 음이온 전달단백질 프로모터(OATP-C), B형 간염바이러스 코아 단백질 프로모터(HBcP), 엔도글린 프로모터(Endoglin), 세포간 부착 물질 프로모터(ICAM2), 및 타이로신 키나아제수용체 프로모터(Tie2)의 발현효율을 보여주는 히스토그램;
도 3a: 페닐알라닌 하이드록실라제 인핸서와 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 단백질 인핸서가 각각 삽입된 pCR-PAH enh 및 pCR-AMBP enh 플라스미드의 개열 지도;
도 3b: 혈액응고 제7인자 결절 프로모터가 삽입된 pmRL-FVII△ Pro 발현 벡터와 유기 음이온 전달단백질 프로모터가 삽입된 pmRL-OATP-C Pro 발현 벡터 각각에 페닐알라닌 하이드록실라제 인핸서 및 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 단백질 인핸서 중 하나 이상이 삽입된 pmRL-PF, pmRL-AF, pmRL-PAF, pmRL-PO, pmRL-AO, 및 pmRL-PAO 발현 벡터의 개열 지도;
도 4a: 페닐알라닌 하이드록실라제 인핸서 및 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 단백질 인핸서와 FVII△, OATP-C, Tie-2, ICAM2 프로모터의 조합에 따른 시험관내(in vitro) 폐암세포주(A549), 자궁경부암세포주(HeLa), 및 간암세포주(Huh-7)에서의 루시퍼라제의 발현정도를 보여주는 히스토그램;
도 4b: 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 단백질 인핸서와 혈액응고 제7인자 결절프로모터가 조합된 경우에 신장세포주(HEK293), 폐암세포주(A549), 자궁경부암세포주(HeLa), 간세포주(Huh-7, Hep3B) 및 혈관내피세포주(HUVEC)에서 CMV 프로모터 대비루시퍼라제 발현효율 및 간세포주 특이성을 보여주는 히스토그램;
도 4c: 페닐알라닌 하이드록실라제 인핸서, 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 단백질 인핸서, CMV 인핸서 및 SV40 인핸서와 상기 도 4a에서 기재된 프로모터가 조합된 발현 벡터를 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 in vivo jetPEI의 혼합하여 꼬리정맥을 통해 마우스의 생체내로 도입시킨 후 간조직에서의 CMV 프로모터 대비 루시퍼라제 발현효율을 보여주는 히스토그램;
도 5: 비해독 말단영역을 포함하지 않는 혈액응고 제9인자 hFIX 및 비해독 말단영역을 포함하는 혈액응고 제9인자 hFIXUTR 플라스미드의 모식도 ((a)), 및 상기의 hFIXUTR에 다양한 형태의 인트론이 삽입된 플라스미드들의 개략적인 모식도((b), (c) 및 (d)) (SD, 스플라이싱 공여체; SA, 스플라이싱 수용체; (G)₃, 3배수 구아닌 모티프; BS, 분기점서열);
도 6a: 서로 다른 인트론이 도입된 CMV-hFIXUTR-Syn1int 및 CMV-hFIXUTR-Syn2int 발현 벡터들과, 대조군으로서 CMV-hFIX 및 CMV-hFIXUTR 발현 벡터들을 생쥐의 꼬리정맥에 주입한 다음 얻어진 혈장에서 ELISA에 의해 hFIX 단백질의 양을 측정한 결과;
도 6b: CMV-hFIXUTR-Syn1int 발현 벡터를 포함하는 재조합 아데노 부속바이러스의 감염성 입자(infectious particles, IP) 1x10⁹를 면역 결핍 생쥐에 주사한 다음 매주 얻어진 혈장에서 ELISA에 의해 hFIX 단백질의 양을 측정한 결과;
도 7a: TK 프로모터에 의해 조절되는 RLuc 루시퍼라제 유전자에 인트론이 삽입된 루시퍼라제 발현 벡터의 구조를 나타내는 개략적인 모식도;
도 7b: 도 7a의 발현 벡터를 간세포주(Hep3B), 신장세포주(HEK293), 및 폐세포주(A549)에 형질도입시킨 후 측정된 루시퍼라제의 발현정도를 보여주는 히스토그램;
도 8a: 도 7b의 발현 벡터를 폐세포주(A549)에 형질도입하여 얻어진 세포에서 추출된 총 RNA를 이용하여 역전사 PCR을 수행한 후 측정된 RLuc 및 β-액틴의 mRNA의 발현정도를 보여주는 결과;
도 8b: 도 8a에서 측정된 RLuc과 β-액틴의 mRNA의 밴드 세기를 측정한 다음 β-액틴에 의해 평준화시킨 RLuc mRNA의 발현정도를 보여주는 히스토그램;
도 9a: 서로 다른 형태의 안티트롬빈 인트론이 도입된 CMV-hFIXUTR-Syn1AT, CMV-hFIXUTR-Syn2AT, CMV-hFIXUTR-NA, CMV-hFIXUTR-△NAL, CMV-hFIXUTR-△NAS 발현 벡터와, 대조군으로서 0.3kb의 FIX 인트론을 포함하는 통상적인 CMV-hFIXUTR-0.3kbFIXint (CMV-hFIXm2) 발현 벡터를 생쥐의 꼬리정맥에 주입한 다음 얻어진 혈장에서 ELISA에 의해 hFIX 단백질의 양을 측정한 결과를 보여주는 히스토그램;
도 9b: CMV-hFIX, CMV-hFIXUTR, 및 CMV-hFIXUTR-△NAL 발현 벡터가 형질도입된 신장세포주(HEK293T)에서 hFIX 단백질의 발현정도를 보여주는 웨스턴 블롯 분석결과;
도 10: 알파-피토단백질, 알파1-안티트립신, 및 알부민 유전자의 5' 말단 측면 부위(end flanking region)에서, 아포리포단백질 E 유전자의 유전자좌 제어영역에서 발견된 TGTTTGC 모티프와 유사하거나 동일한 모티프의 분포도를 보여주는 개략적인 모식도;
도 11a: 아포리포단백질 E 유전자의 간세포 제어영역으로 알려진 HCR 및 TGTTTGC 모티프가 결절된 최소구조 간세포 제어영역으로 정의된 HCRm이 각각 삽입된 pCR-HCR 및 pCR-HCRm 플라스미드, 및 알파피토단백질, 알파1-안티트립신, 및 알부민의 TGTTTGC 모티프를 각각 포함하는 pCR-AAT7800lcr, pCR-AAT108lcr, pCR-AFP3800lcr, 및 pCR-E6lcr 플라스미드의 개열 지도;
도 11b: 아포리포단백질 E 유전자의 최소구조 간세포 제어영역인 HCRm에 알파 1-안티트립신 유전자의 인핸서 및 프로모터를 조합하여 pBluescript II 벡터에 삽입한 pBS-HCRm-AATenh/pro (HmA)와 아포리포단백질 E 유전자의 간세포 제어영역인 HCR과 알파1-안티트립신 프로모터를 조합하여 pBluescript II 벡터에 삽입한 pBS-HCR-AATpro (HA) 플라스미드의 개열 지도;
도 12a: PAH 인핸서와 혈액응고 제7인자 결절 프로모터 FVII△의 조합물(PF) 및 인트론 Syn1PLA를 포함하는 hFIX 발현 벡터에, 서로 다른 유전자좌 제어영역 HCR, HCRm, AFP3800, AAT7800, AAT108, 및 E6를 각각 도입하여 얻어진 발현 벡터들의 개략적인 모식도;
도 12b: 도 12a의 발현 벡터들 및 대조군으로서 CMV-hFIXUTR-Syn1PLA 발현 벡터를 생쥐의 꼬리정맥에 주입한 다음 얻어진 혈장에서 ELISA에 의해 hFIX 단백질의 양을 측정한 결과;
도 13a: PAH 인핸서와 FVII△ 프로모터의 조합물(PF) 또는 PAH 인핸서 및 AMBP 인핸서와 FVII△ 프로모터의 조합물 (PAF), NAL 인트론, 및 AAT108 유전자좌 제어영역으로 구성되는 발현 벡터들, HmA(HCRm-AAT enh/pro)-hFIXUTR-△NAL 발현 벡터, 및 HA(HCR-AATpro)-hFIXUTR-1.4kbFIXint 발현 벡터의 개략적인 모식도;
도 13b: 도 13a의 AAT108-PF-hFIXUTR-△NAL, AAT108-PAF-hFIXUTR-△NAL, 및 HmA(HCRm-AATenh/pro)-hFIXUTR-△NAL 발현 벡터들, 및 대조군으로서 CMV-hFIXUTR-△NAL 발현 벡터를 B형 혈우병 생쥐의 꼬리정맥에 주입한 다음 얻어진 혈장에서 ELISA에 의해 hFIX 단백질의 양을 측정한 결과;
도 13c 및 13d: 도 13b에서 얻어진 혈장을 이용하여 활성 부분적 트롬보플라스틴 시간(Activated partial thromboplastin time; APTT)법에 의해 측정된 혈액응고 활성 및 혈액응고 시간;
도 14a 및 14b: AAT108-PF-hFIXUTR-△NAL 및 AAT108-PAF-hFIXUTR-△NAL 발현 벡터들과, 대조군으로서 통상적인 HA-hFIXUTR-1.4kbFIXint 및 CMV-hFIXUTR-1.4kbFIXint 발현 벡터들을 포함하는 재조합 아데노 부속바이러스 감염입자 2X10⁹를 B형 혈우병 생쥐의 간정맥에 주입한 다음 얻어진 혈장에서 ELISA에 의해 검출된 hFIX 단백질의 농도 및 APTT법에 의해 측정된 혈액응고 활성의 결과;
도 15a: 유전자좌 제어영역인 HCR, HCRm, AFP3800, AAT7800, AAT108, 및 E6를 PF-LK68-△NAL-UTR에 도입시켜 얻어진 발현 벡터의 개열 지도;
도 15b: AAT108-PF/PAF-LK68 발현 벡터의 개열 지도, 및 상기 플라스미드에 혈액응고 제9인자의 UTR이 도입된 AAT108-PF/PAF-LK68-UTR 발현 벡터의 개열 지도, △NAL 인트론 및 혈액응고 제9인자의 UTR이 도입된 AAT108-PF/PAF-LK68-△NAL-UTR 발현 벡터의 개열 지도;
도 16a: 다양한 유전자좌 제어영역 HCR, HCRm, AFP3800, AAT7800, AAT108, 및 E6를 PF-LK68-△NAL-UTR에 도입시켜 얻어진 발현 벡터를 생쥐의 꼬리정맥에 주입한 다음 얻어진 혈장에서 ELISA에 의해 LK68 단백질의 양을 측정한 결과;
도 16b: UTR 또는 UTR과 인트론 △NAL을 AAT108-PF/PAF-LK68에 도입시켜 얻어진 발현 벡터를 생쥐의 꼬리정맥에 주입한 다음 얻어진 혈장에서 ELISA에 의한 LK68 단백질의 양을 측정한 결과;
도 17a: LK68 유전자에 비해독 말단영역과 인트론이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 비증식 아데노바이러스를 세포당 다양한 감염비율별로 감염시킨 신장세포주(HEK293)와 배양 배지에서의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과; 및
도 17b: 도 17a의 웨스턴 블롯 분석에서 얻어진 밴드의 세기를 측정하여 비해독 말단영역과 인트론의 유전자 발현에 미치는 영향력을 보여주는 히스토그램.

본 발명에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

본 발명에서, "발현 벡터(expression vector)"는 코딩 서열과 프로모터를 반드시 포함하는 하나 이상의 전사 조절 부위들이 작동 가능하게 연결된 집합체(발현체, expression cassette), 또는 상기의 집합체를 포함하는 벡터를 의미한다.

"코딩 서열 (coding sequence)"은 특정 아미노산 또는 기능적인 RNA를 암호화하는 DNA 서열을 의미한다.

"전사 조절 부위 (cis-regulatory element 또는 cis-acting element)"는 코딩 서열의 상류(upstream), 내부 (within), 또는 하류 (downstream)에 위치하는 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 전사(transcription) 및 나아가 전사된 RNA의 가공(processing), 안정성 및 후속적인 번역(trnaslation)을 조절하는 부위이다. 전사 조절 부위는 프로모터 (promoter), 인핸서 (enhancer), 인트론 (intron), 5' 및 3' 비해독 말단 영역 (untranslated region, UTR), 및 유전자좌 제어영역(locus control region, LCR)을 포함한다.

"프로모터 (promoter)" 및 "인핸서 (enhancer)"는 코딩 서열의 RNA로의 전사과정을 유도하는 부위로서, 통상적으로 프로모터는 중합효소와 전사인자들이 결합하는 부위를, 인핸서는 중합효소의 활성요소들이 결합하는 부위를 일컫는다.

"비해독 말단영역 (untranslated region, UTR)"은 코딩 서열의 3' 말단과 5' 말단에 존재하는 서열로서 전사 종결 부위인 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal) 서열 등을 포함한다.

"인트론 (intron)"은 전사 후 단백질로 해독되는 엑손 영역을 분단하고 있는 비해독 염기서열로서, 전사된 mRNA 전구체는 스플라이싱에 의해 비해독 영역인 인트론이 제거되어 성숙 mRNA로 전환된다. 본 발명에서 "인트론"은 스플라이싱 공여체와 수용체, 3배수 구아닌 모티프, 및/또는 분기점 서열을 포함하는 의미로도 사용된다.

"유전자좌 제어영역 (locus control region, LCR)"은 DNA 분해효소 I에 민감한 부분을 가지고 있는 염기서열로서, 코딩 서열의 복제가 전반적으로 상승효과를 나타내도록 하는 조직 특이적인 전사인자들이 결합하는 영역이다.

"작동가능하게 연결된"은 단일 핵산 분획상의 핵산 서열들 중 어느 하나의 서열이 나머지 서열에 의해 영향을 받도록 제휴(association)되어 있음을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있도록 상기 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상술한 바에서 알 수 있듯이, 효율적인 유전자 치료를 위해서는, 특정 조직 또는 세포에서 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있어야 하고, 유전자 치료를 위해 도입되는 유전자는 지속적으로 발현되어 병원성 유전자를 대체할 수 있는 능력을 유지하여야 한다. 이러한 조직 특이적이고 지속적인 유전자의 발현을 위해서는 유전자 발현 벡터의 다양한 개선이 필요하며, 이는 발현 벡터를 구성하는 전사 조절 부위의 개량에 의해 달성될 수 있다.

이에, 본 발명은 서열번호: 41의 혈액응고 제7인자 (FVII) 프로모터의 504 bp(양말단 XhoI 및 BamHI 제한효소부위 제외)에서 5'말단으로 부터 207 bp를 제거하여 얻어진, 서열번호: 42의 혈액응고 제7인자 결절(truncated) (FVII△) 프로모터를 제공한다. 본 발명의 FVII△ 프로모터는 결절되지 않은 FVII 프로모터에 비해 그 활성이 2.5배 정도 증가하는 것으로 나타났다.

본 발명의 FVII△ 프로모터는 서열번호: 44의 페닐알라닌 하이드록실라제 (phenylalanine hydroxylase, PAH) 인핸서 및 서열번호: 45의 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 단백질 (alpha 1-microglobulin/bikunin precursor, AMBP) 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인핸서와 조합될 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 인트론을 제공한다.

서열번호: 46, 47 및 48의 인트론들은 각각 인간 안티트롬빈, 플라스미노젠, 및 프로트롬빈의 1번 인트론으로부터 유래하고, 서열번호: 49, 50 및 51의 인트론들은, 공통적으로 스플라이싱 공여서열, 인간 알파 글로빈 2번 인트론에서 유래하는 3배수 구아닌 반복서열(G-triple motif), 인간 플라스미노젠의 분기점 서열(branch sequence) 및 보편적 스플라이싱 수용서열을 포함하면서 각각 인간 안티트롬빈, 플라스미노젠, 및 프로트롬빈의 1번 인트론으로 구성된 합성 인트론이다. 서열번호: 52, 53 및 54는 각각 서열번호: 49, 50 및 51의 서열들에서 3배수 구아닌 반복서열과 분기점서열을 포함하지 않은 합성 인트론이다. 서열번호: 55의 인트론은 안티트롬빈의 전장(full-length) 1번 인트론에서 유래하고, 서열번호: 56 및 57은 서열번호: 55의 인트론으로부터 결절시켜 얻어진 서열들로서, 서열번호: 57의 인트론이 본발명의 발현벡터의 구성요소로서 가장 바람직하다 .

본 발명은 또한, 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자좌 제어영역을 제공한다.

서열번호: 58, 59, 60 및 61은 각각 인간 알파1-안티트립신 유전자의 -108 bp 부위, 인간 알파1-안티트립신의 -7.8 kb 부위, 인간 알파-피토단백질 -3.8 kb 부위, 및 인간 알부민 유전자의 -6 kb 부위에 위치하는 유전자좌 제어영역으로서, 서열번호: 58의 유전자좌 제어영역이 본 발명의 발현 벡터의 구성요소로서 가장 바람직하다.

본 발명에서 언급된 서열들과 실질적으로 동일하고 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 실질적으로 동일하고 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드란 공지된 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해서 또는 조사에 의해서 적절히 배열되었을 때 두 개의 폴리뉴클레오타이드가 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 더욱 바람직하게는 적어도 90％, 가장 바람직하게는 적어도 95％의 서열 상동성을 공유하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한, 코딩 서열 및 상기 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 전사 조절 부위를 포함하는 발현 벡터에 있어서, 상기 전사 조절 부위는 1) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드; 2) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호: 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 3) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 4) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 5) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 6) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 7) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드; 또는 8) 서열번호: 42로 기재된 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 코딩 서열 및 상기 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 전사 조절 부위를 포함하는 발현 벡터에 있어서, 상기 전사 조절 부위는 임의의 프로모터에, 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드; 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드; 또는 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 58 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 발현 벡터는 코딩 서열의 5' 및 3' 말단 각각에 서열번호: 62 및 63으로 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열들을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 서열번호: 62 및 63으로 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열들은 혈액응고 제9인자 유전자의 5' 및 3' 비해독 말단영역으로부터 유래한다.

상기 코딩 서열은 알부민, α-페토프로테인 (α-fetoprotein), α-글루코시다제 (α-glucosidase), α1-안티트립신 (α1-antitrypsin), 안티트롬빈 (antithrombin), 리포프로테인 (lipoproteins), 세룰로플라즈민 (ceruloplasmin), 혈액응고 제7인자 단백질, 혈액응고 제8인자 단백질, 혈액응고 제9인자 단백질, 에리트로포이에틴 (erythropoietin), 피브리노겐 (fibrinogen), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 합토글로빈 (haptoglobin), IGF-1, 인슐린, 플라즈미노겐 (plasminogen), 프로트롬빈 (prothrombin) 및 트랜스페린 (transferrin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 특이적인 단백질을 코딩하는 서열일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 발현 벡터내에 도입되는 코딩 서열은 프로모터, 인핸서, 인트론, 비해독 말단영역, 및 유전자좌 제어영역과 작동가능하게 연결되어지고 이들에 의해 제어될 수 있도록 배열된다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 전사 조절 부위들은 적절한 조합에 의해 원하는 코딩 서열이 간조직 특이적으로 발현할 수 있도록 하면서, mRNA의 안정화에 기여하여 코딩 서열의 발현효율 향상 및 지속적인 발현을 유도할 수 있다. 이러한 전사 조절 부위를 포함하는 발현 벡터는 간조직에서 원하는 코딩 서열의 안정적이면서 지속적인 발현을 가능하게 하여 혈전증, 혈우병, 및 항암치료 등에 다양하게 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 간조직 특이적인 발현 프로모터와 인핸서의 동정 및 활성 분석

＜단계 1＞ 간조직 특이적인 발현 프로모터의 동정 및 활성분석

인간 간세포주(Chang cells)의 세포 용해액으로부터 디엔이지 조직 키트(DNeasy Tissue Kit, Qiagen)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 혈액응고 제7인자(FVII) 프로모터를 동정하기 위해, 상기의 지놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호: 1 및 2의 프라이머세트와 DNA 폴리머라제(Ex-Taq, Takara)를 이용하여 PCR을 수행하여 서열번호: 41로 표시되는 FVII 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 구체적으로는, DNA 가닥 분리를 위하여 94℃에서 5분간 주형을 변성(denaturation)시키고, 이후 94℃에서 30초간 변성, 56℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 연장(extension)의 과정을 30회 반복한 다음, 72℃에서 3분간 추가 연장하는 방식으로 증폭하였다. PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 겔 추출을 통하여 정제한 다음, pCR2.1-TOPO 플라스미드 벡터에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호: 41로 기재된 FVII 프로모터의 존재를 확인하였으며, 이를 포함하는 플라스미드를 pCR-FVII Pro로 명명하였다. 또한, 유기 음이온 전달단백질 (organic anion-transporting polypeptide, OATP) 프로모터에 대한 프라이머 세트 (서열번호: 3 및 4) 및 알파-안티트립신 (AAT) 프로모터에 대한 프라이머 세트(서열번호: 5 및 6)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 pCR2.1-TOPO 플라스미드 벡터에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호: 43으로 기재된 OATP-C 프로모터와 알파-안티트립신 (AAT) 프로모터의 존재를 확인하였으며, 이를 포함하는 플라스미드 pCR-OATP-C pro와 pCR-AAT enh/pro를 각각 제작하였다. pCR-FVII pro, pCR-OATP-C pro 및 pCR-AAT enh/pro의 개열 지도가 도 1a에 도시되어 있다.

레닐라 루시퍼라제 발현벡터(Renilla luciferase expression vector)인 phRL-null 벡터(Promega)의 SV40 late poly(A)를 인간 성장호르몬의 poly(A)로 대체하고 불필요한 T7 프로모터와 인트론 부위를 제거하여 pmRL-null 벡터를 제작하였다. pmRL-null 벡터를 BglII 제한 효소로 절단하고, 새우 알칼라인 포스파타아제를 처리하였다.

pCR-FVII pro와 pCR-OATP-C pro 플라스미드를 BamHI으로 절단하고, 절단된 DNA 단편을 겔 추출을 통해 정제하여 앞서 준비된 pmRL-null 벡터에 삽입하였다. 각각의 플라스미드는 제한효소를 이용한 개열 지도를 통하여 목적하는 DNA 단편이 존재함을 확인하였으며, 이들을 각각 pmRL-FVII 및 pmRL-OATP-C로 명명하였다.

한편, EcoRI 제한효소 부위를 이용하여 pmRL-FVII 내부의 FVII 프로모터의 5' 말단 200 bp 정도를 결절시킨 다음 재접합하여 서열번호: 42로 기재된 FVII 결절 (FVII△) 프로모터가 삽입된 벡터 pmRL-FVII△을 제작하였다.

벡터 pmRL-FVII, pmRL-OATP-C 및 pmRL-FVII△의 개열 지도가 도 1b에 도시되어 있다.

인간 간세포주(Huh-7, HepG2, Hep3B)와, 대조군 세포주로서 신장세포주(HEK293), 폐세포주(A549), 및 자궁세포주(HeLa)에서 상기와 같이 제작된 pmRL-FVII, pmRL-FVII△ 및 pmRL-OATP-C 각각에 대한 루시퍼라제 발현정도를 측정하였다. 구체적으로, 폴리에틸렌이민(PEI) 시약(Polyplus, IllKirch, France)을 이용하여 6-웰 플레이트에 70 내지 80％ 정도 배양된 상기 세포들에 각각 2 ㎍의 pmRL-FVII, pmRL-FVII△ 및 pmRL-OATP-C 플라스미드 및 1 ㎍의 pcDNA-lacZ 플라스미드를 형질감염시킨 다음, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포를 수거한 다음, 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 배지를 분리하고, 세포를 100 ㎕의 용해액 (25 mM의 Tris-phosphate, pH 7.8, 2 mM의 DTT(Dithiothreitol), 2 mM의 1,2-diaminocyclohexane N,N,N,N'-tetra acetic acid, 10％의 glycerol, 1％의 Triton^? X-100)에 재현탁시킨 다음, 냉동과 해동을 3회 반복하여 세포를 완전히 용해시켰다. 10,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 얻어진 상층액에 대해 형질감염 비율을 보정하기 위해 갈락토시다제 분석(galactosidase assay)과 브래드포드 분석(Bradford assay)을 수행하였고, 프로모터의 활성을 측정하기 위해 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 그 결과가 도 2a에 도시되어 있다.

도 2a에 도시된 바에 따르면, FVII 프로모터와 OATP-C 프로모터는 간세포주 Huh-7에서 특이적으로 유전자 발현을 유도하는 것을 알 수 있다.

FVII△ 프로모터는 결절시키지 않은 FVII 프로모터에 비해 Huh-7 세포에서 그 활성이 2.5배 향상되는 결과를 보여주었다 (도 2b 참조).

본 발명에 따른 FVII△ 프로모터는 통상적인 CMV 프로모터에 비해 Huh-7 세포에서 1.4％ 수준의 발현효율을 나타내었고 간조직 이외의 조직에서 유래한 세포주에서는 평균적으로 0.07％ 수준의 발현효율을 나타내었지만, 본 발명의 FVII△ 프로모터는 CMV 프로모터와 달리 간 조직에 대한 특이성이 다른 조직에 비해 20배 정도 높은 것으로 나타났다 (도 2c 참조). 따라서, FVII△ 프로모터는 간조직 특이성에는 변화를 주지 않으면서 발현 효율만을 높임으로서 간조직에서 선택적으로 작동하는 발현 벡터 구축에 적합한 프로모터임을 알 수 있다. 도 2c에서, (-)는 음성 대조군(프로모터의 부재)을 나타내고, ICAM2는 세포간 부착물질의 프로모터를 나타내며, Tie2는 타이로신 키나제 수용체의 프로모터를 나타내고, Endoglin은 엔도글린의 프로모터를 나타내며, HBcP는 B형간염바이러스 코아 단백질의 프로모터를 나타낸다.

＜단계 2＞ 인핸서의 동정

페닐알라닌 하이드록실라제(phenylalanine hydroxylase, PAH)의 인핸서를 동정하기 위해, 단계 1에 기재된 지놈 DNA를 주형으로 하여 PAH 인핸서의 프라이머 세트(서열번호: 7 및 8)와 DNA 폴리머라제 (Ex-Taq, Takara)를 이용하여 PCR을 수행하여 서열번호: 44로 기재된 PAH 인핸서를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. PCR 산물을 겔 추출을 통하여 정제한 다음, pCR2.1-TOPO 폴라스미드 벡터에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호: 44로 기재된 목적하는 PAH 인핸서의 존재를 확인하였으며, 이를 pCR-PAHenh로 명명하였다. 또한, 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 단백질(alpha 1-microglobulin/bikunin precursor, AMBP) 인핸서에 대한 프라이머 세트(서열번호: 9 및 10)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 서열번호: 45로 기재된 AMBP 인핸서를 포함하는 pCR-AMBPenh를 제작하였다. pCR-PAHenh 및 pCR-AMBPenh 플라스미드의 개열 지도가 도 3a에 도시되어 있다.

플라스미드 pCR-PAHenh와 pCR-AMBPenh를 SpeI과 XbaI으로 절단하여 PAH와 AMBP 인핸서를 분리한 다음, 겔 추출을 통해 정제하였다. PAH와 AMBP 인핸서 각각을 단계 1에서 제작된 pmRL-FVII△과 pmRL-OATP-C 벡터의 SpeI 위치로 삽입하였다. PAH 인핸서가 삽입된 벡터 pmRL-FVII△ 및 pmRL-OATP-C를 각각 pmRL-PF 및 pmRL-PO로 명명하였다. AMBP 인핸서가 삽입된 벡터 pmRL-FVII△ 및 pmRL-OATP-C를 각각 pmRL-AF 및 pmRL-AO로 명명하였다. SpeI과 XbaI을 이용하여 pmRL-PF로부터 추출된 PAH 인핸서를 pmRL-AF의 SpeI 위치 및 pmRL-AO의 SpeI 위치에 삽입하여 얻어진 벡터를 각각 pmRL-PAF 및 pmRL-PAO로 명명하였다. pmRL-PF, pmRL-PO, pmRL-AF, pmRL-AO, pmRL-PAF 및 pmRL-PAO 벡터의 개열 지도가 도3b에 도시되어 있다.

조직특이성을 제공하지는 않지만 프로모터의 활성을 향상시킬 것으로 예상되는 CMV 및 SV40 인핸서를 OATP-C 및 FVII 프로모터의 상류에 상기와 동일한 방법으로 삽입하였다.

＜단계 3＞ 프로모터와 인핸서의 조합에 따른 활성 평가

＜3-1＞: 시험관내 ( In vitro ) 시험

단계 2에서 제작된 인핸서와 프로모터가 조합된 여러 벡터들을 이용하여 인간 간세포주(Huh-7)와 대조군 세포주로서 사용된 폐세포주(A549), 자궁세포주(HeLa)에서의 유전자 발현효율을 단계 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과가 도 4a에 도시되어 있다.

도 4a에 도시된 바와 같이, PAH 인핸서와 FVII△ 프로모터가 조합된 벡터의 경우, 간세포주 Huh-7에서의 특이성이 평균 28.4배로 측정되었으며, 이는 PAH 인핸서에 의해 FVII△ 프로모터의 조직특이성이 1.42배 향상되었음을 보여준다. AMBP 인핸서에 의한 FVII△ 프로모터의 조직특이성은 213.7배 이상 향상되었으며, 이는 AMBP 인핸서에 의한 OATP-C 프로모터의 조직특이성 향상정도 (65.6배)에 비해 약 3배 정도 높은 결과이다. 상기 결과는 인핸서의 도입으로 FVII△ 프로모터의 간세포주 선택성이 크게 향상될 수 있음을 보여준다.

AMBP 인핸서와 FVII△ 프로모터로 제작한 발현 벡터의 CMV 프로모터 대비활성을 측정하기 위해, 인간 간세포주(Huh-7, Hep3B)와 대조군 세포주로서 사용된 신장세포주(HEK293), 폐세포주(A549), 자궁세포주(HeLa), 및 혈관내피세포주(HUVEC)에서 루시퍼라제 발현 정도를 측정하였다. 그 결과가 도 4b에 도시되어 있다.

도 4b에 도시된 바와 같이, 간세포주에서, AMBP 인핸서와 FVII△ 프로모터로 제작한 발현 벡터는 CMV 프로모터 대비 8.7％ 수준의 발현효율을 보였으며, 간세포주 이외의 대조군 세포주에서는 CMV 프로모터 대비 평균 0.14％ 수준의 발현효율을 나타내었다. 이는 AMBP 인핸서와 FVII△ 프로모터로 제작한 발현 벡터의 간조직에 대한 발현 특이성이 다른 조직에 비해 62배 정도 높은 것을 알 수 있다.

＜3-2＞ 생체내 ( In vivo ) 시험

생체내 간에서의 발현효율을 측정하기 위해, 단계 2에서 얻어진 인핸서와 프로모터가 삽입된 pmRL 플라스미드들을 폴리에틸렌이민(PEI) (Polyplus, Illkirch, France) 혹은 In vivo jetPEI(Polyplus, Illkirch, France)과의 복합체 형태로 생쥐의 꼬리 정맥에 주사하였다. 이틀 후에 생쥐로부터 간을 추출하여 루시퍼라제 발현 정도를 측정하였다.

구체적으로는, 각각 40 ㎍의 pmRL-PO, -PF, -AO 및 -AF 플라스미드와 10 ㎍의 pcDNA-LacZ 플라스미드를 5％ 글루코스 용액에서 PEI 또는 In vivo jetPEI와 복합체를 형성하여 생후 6주령 된 생쥐의 꼬리 정맥에 주입하였다. 이틀 후에 부검하여 간, 신장, 심장, 비장, 및 폐를 추출하여 PBS 용액에서 호모제나이저를 이용하여 조직을 균질화시켰다. 이후, 균질화된 조직용액 500 ㎕에 2배 농축된 세포 용해액(50 mM의 Tris-phosphate, pH7.8, 4 mM의 DTT(Dithiothreitol), 4 mM의 1,2-diaminocyclohexane N,N,N,N'-tetra acetic acid, 20％의 glycerol, 2％의 Triton^? X-100)을 500 ㎕ 넣어준 다음 냉동과 해동을 3회 반복하여 조직세포를 완전히 용해시켰다. 10,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 분리된 상층액에 대해 형질감염 비율을 보정하기 위해 갈락토시다제 분석과 브래드포드 분석을 수행하였고, 프로모터의 활성을 측정하기 위해 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 그 결과가 도 4c에 도시되어 있다.

도 4c에 도시된 바와 같이, FVII△ 프로모터/PAH 인핸서 및 PEI의 혼합물이 주입된 간세포주에서는, CMV 프로모터의 14％ 수준의 발현 효율을 보여주었고, 이는 시험관내 분석결과에 비해 최소 14배 이상 높은 결과이다. FVII△ 프로모터/AMBP 인핸서와 PEI의 혼합물이 주입된 간세포주에서는 CMV 프로모터의 80％ 수준의 발현 효율을 보여주었으며, 이는 시험관내 분석결과에 비해 10배 이상 높은 결과이다.

In vivo jetPEI가 주입된 경우에는 PEI가 주입된 경우보다 더 높은 발현효율을 보여주었다. 구체적으로, OATP-C 프로모터/PAH 인핸서와 in vivo jetPEI의 혼합물이 주입된 간세포주에서는 CMV 프로모터의 38％ 수준의 발현 효율을 보여주었고, FVII△ 프로모터/PAH 인핸서화 in vivo jetPEI의 혼합물이 주입된 간세포주에서는 CMV 프로모터의 80％ 수준의 발현 효율을 보여주었다. FVII△ 프로모터/AMBP 인핸서와 in vivo jetPEI의 혼합물이 주입된 간세포주에서는 CMV 프로모터와 거의 동등한 수준의 발현효율을 보여주었다. 이러한 결과는 시험관내에서보다 실제 생체조직내에서 본 발명에 따른 프로모터와 인핸서의 활성이 보다 우수함을 보여준다.

실시예 2: 인간 혈액응고 제9인자의 비해독 말단영역과 간 특이적인 발현 유전자의 인트론의 동정 및 이들의 도입에 따른 유전자 발현효율 분석

＜단계 1＞ 인간 혈액응고 제9인자( FIX )의 비해독 말단영역( untranslated region, UTR )의 동정 및 이를 포함하는 발현벡터의 제작

호모제나이저를 이용하여 균질화시킨 인간 간조직 1g으로부터 RNA 추출 키트(Pharmacia Biotech)를 이용하여 1.2 mg의 총 RNA를 추출하였다. 이 RNA를 주형으로 M-MuLV 역전사효소 및 올리고-dT17 프라이머(Takara)를 사용하여 단일가닥 DNA를 합성하고, DNA 폴리머라제 I(Takara)에 의해 이중가닥 cDNA를 합성하였다.

유전자의 발현효율에 대한 FIX UTR의 효능을 평가하기 위해, 상기의 cDNA를 주형으로 하여, FIX(Genbank accession No: NM000133)의 염기서열로부터 설계된 서열번호: 11 및 12의 프라이머 세트와 Ex-Taq을 이용하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. DNA 가닥 분리를 위하여 94℃에서 5분간 주형을 변성시키고, 이후 94℃에서 1분간 변성, 56℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분 30초간 연장의 과정을 30회 반복한 다음, 72℃에서 3분간 추가 연장을 수행하는 방법으로 증폭하여, 서열번호: 62및 63으로 기재된 5'UTR 및 3'UTR을 포함하는 FIX cDNA를 합성하였다.

대조군으로서, 서열번호: 13 및 14의 프라이머 세트를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 UTR을 포함하지 않은 FIX cDNA를 합성하였다.

증폭된 DNA 단편을 각각 제한효소 NotI 및 SalI으로 절단하고 겔 추출을 통하여 정제한 다음, pBluescript SK(+) 벡터의 NotI 및 SalI 영역에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 목적하는 UTR을 포함한 FIX 및 UTR을 포함하지 않은 FIX의 존재를 확인하였으며, 이를 pBS-hFIXUTR 및 pBS-hFIX로 각각 명명하였다(도 5의 (a) 참조).

＜단계 2＞ 간 특이적인 발현 유전자들의 인트론 동정 및 이를 포함하는 발현벡터의 제작

＜2-1＞ pCR - int 의 제작

먼저, 인간 안티트롬빈, 플라스미노젠, 및 프로트롬빈의 1번 인트론의 5'측 약 300 bp를 포함하는 단편을 PCR에 의해 합성하였다.

구체적으로는, 실시예 1의 단계 1에 기재된 지놈 DNA를 주형으로 하여 인간 안티트롬빈 인트론의 프라이머 세트(서열번호: 15 및 16), 인간 플라스미노젠 인트론의 프라이머 세트(서열번호: 17 및 18), 및 인간 프로트롬빈 인트론의 프라이머 세트(서열번호 19 및 20)를 이용하여 다음과 같은 조건으로 각각 PCR을 수행하였다. DNA 가닥 분리를 위하여 94℃에서 5분간 주형을 변성시키고, 이후 94℃에서 1분간 변성, 60℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분 30초간 연장의 과정을 30회 반복한 다음, 72℃에서 3분간 추가 연장을 수행하는 방법으로 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 겔 추출을 통해 정제한 다음 pCR2.1-TOPO 벡터에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여, 서열번호: 46, 47 및 48의 목적하는 인트론들의 존재를 확인하고, 이들을 각각 pCR-ATint, pCR-PLAint, 및 pCR-PTint로 명명하였다.

한편, Kurachi S.에 의해 보고된 바 있는 FIX의 1번 인트론을 동정하기 위해, FIX의 1번 인트론의 프라이머 세트(서열번호: 21 및 22)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 산물을 pCR2.1-TOPO 벡터에 삽입하였다. 결과적인 플라스미드 벡터를 제한효소 PvuI 또는 ScaI으로 절단한 다음 자가 접합시켰다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 목적하는 서로 다른 크기의 FIX 인트론의 존재를 확인하고, 이를 pCR-1.4kbFIXint 및 pCR-0.3kbFIXint으로 각각 명명하였다.

＜2-2＞ pBS - FIX - Syn1int 의 제작

상기 단계 ＜2-1＞에서 제작된 pCR-ATint, pCR-PLAint, 및 PCR-PTint의 인트론 단편 각각을 FIX의 1번 엑손과 2번 엑손 사이에 삽입하였다.

구체적으로는, FIX 5'UTR에 대한 서열번호: 11의 센스 프라이머와, 보편적 스플라이싱 공여서열 GTAA 및 인간 알파 글로빈 2번 인트론에서 유래하는 3배수 구아닌 반복서열(G-triple motif)에 대한 서열번호: 23의 안티센스 프라이머를 이용하여 FIX 5'UTR, 1번 엑손, 스플라이싱 공여체, 및 인간 알파 글로빈 3배수 구아닌 반복서열(G-triple motif)을 포함하는 DNA단편을 단계 ＜2-1＞에 기재된 것과 동일한 조건하에 PCR을 수행하여 증폭하였다. 또한 인간 플라스미노젠의 분기점 서열(branch sequeuce)과 보편적 스플라이싱 수용서열 TCGA에 대한 서열번호: 24의 센스 프라이머와 FIX 3'UTR에 대한 서열번호: 12의 안티센스 프라이머를 이용하여 분기점 서열, 스플라이싱 수용체, FIX 2번 내지 8번 엑손, 및 3'UTR을 포함하는 DNA 단편을 상기와 동일한 조건으로 증폭하였다. PCR 산물을 겔 추출을 통해 정제한 다음 pCR2.1-TOPO 벡터에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 목적하는 DNA 단편들의 존재를 확인하였고, 각각을 pCR-5'hFIX 및 pCR-3'hFIX로 명명하였다.

pCR-5'hFIX는 제한효소 NotI과 NdeI, pCR-3'hFIX는 NdeI과 SalI으로 절단한 다음 pBluescript의 NotI 및 SalI 영역에 동시에 삽입하였다. 다시 이를 NdeI으로 절단하고, 단계 ＜2-1＞의 pCR-ATint, pCR-PLAint, 및 pCR-PTint를 NdeI으로 절단하여 얻어진 단편을 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호: 49, 50 및 51로 기재된 목적하는 인트론의 존재를 확인하였고, 이 플라스미드를 각각 pBS-hFIXUTR-Syn1AT, pBS-hFIXUTR-Syn1PLA, 및 pBS-hFIXUTR-Syn1PT로 명명하였다. 이들 플라스미드의 개략적인 모식도가 도 5의 (b)에 도시되어 있다.

＜2-3＞ pBS - FIX - Syn2int 의 제작

단계 ＜2-2＞에서 얻어진 pBS-FIXUTR-Syn1PLA의 스플라이싱 공여체와 수용체에 인접하는 XhoI, AatII 제한효소 부위를 이용하여 XhoI, AatII로 절단한 다음, 단계 ＜2-1＞의 pCR-ATint, pCR-PLAint, pCR-PTint, pCR-1.4kbFIXint, 및 pCR-0.3kbFIXint 를 XhoI, AatII로 처리하여 얻어진 단편을 각각 삽입하였다. 3배수 구아닌 반복서열과 분기점서열을 포함하지 않는 이 플라스미드에서 제한효소를 이용한 개열 지도 분석을 통하여 서열번호: 52, 53 및 54로 기재된 Syn2AT, Syn2PLA, Syn2PT 인트론 및 1.4kbFIXint, 0.3kbFIXint 인트론의 존재를 확인하였으며, 이를 각각 pBS-hFIXUTR-Syn2AT, pBS-hFIXUTR-Syn2PLA, pBS-hFIXUTR-Syn2PT, pBS-hFIXUTR-1.4kbFIXint (hFIXm1), 및 pBS-hFIXUTR-0.3kbFIXint (hFIXm2)로 명명하였다. 이들 플라스미드의 개략적인 모식도가 도 5의 (c)에 도시되어 있다.

＜2-4＞ 안티트롬빈의 전장( full - length ) 1번 인트론의 동정과 단축형( shortened ) 안티트롬빈 인트론의 제작

안티트롬빈의 1번 인트론의 전체 서열을 포함하는 단편을 서열번호: 15 및 25로 기재된 프라이머 세트를 이용하여 단계 ＜2-1＞에서와 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 증폭시켰다. PCR 산물로서 얻어진 약 2.3kb의 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터에 삽입하고, 이를 pCR-NAint으로 명명하였다. 다시 이 플라스미드를 XhoI, AatII로 처리하여 얻어진 단편을 단계 ＜2-3＞과 동일한 방법으로 pBS-hFIXUTR에 삽입하여, 서열번호: 55로 기재된 목적하는 인트론을 포함하는 pBS-hFIXUTR-NA를 제작하였다.

pBS-hFIXUTR-NA에 삽입된 인트론을 킬로-서열 제거 키트(Kilo-Sequence Deletion Kit,Takara)를 이용하여 PvuII 부위부터 결절시켰다. 구체적으로는, pBS-FIXUTR-NA을 PvuII로 절단한 후, 엑소뉴클레아제 III로 DNA를 15초, 30초, 4초, 1분 동안 25℃에서 분해시킨 다음, Mung Bean 뉴클레아제와 클레노우 효소를 이용하여 말단을 평활화시켜 DNA 단편을 자가 접합시킨 다음 대장균에 형질전환시켰다. 형질전환체를 암피실린 플레이트에서 배양시킨 다음 단일 콜로니를 선별하여, 각 콜로니로부터 유래하는 플라스미드의 인트론 크기를 제한효소를 이용하여 전기영동으로 확인하였다. 적당한 크기의 인트론을 포함하는 플라스미드를 정제하고 염기서열 분석을 통하여 서열번호: 56으로 기재된 811 bp의 인트론을 포함하는 플라스미드 pBS-hFIXUTR-△NAL과 서열번호: 57로 기재된 640 bp의 인트론을 포함하는 플라스미드 PBS-hFIXUTR-△NAS를 제작하였다. 플라스미드 pBS-hFIXUTR-NA, pBS-hFIXUTR-△NAL 및 pBS-hFIXUTR-△NAS의 개략적인 모식도가 도 5의 (d)에 도시되어 있다.

＜단계 3＞ FIX 의 발현에 미치는 UTR 및 인트론의 효능 분석

상기 단계 1 및 단계 2에서 제작된 pBS-hFIX, pBS-hFIXUTR, pBS-hFIXUTR-Syn1int(AT, PLA, PT), 및 pBS-hFIXUTR-Syn2int (AT, PLA, PT, 1.4kbFIXint, 0.3kbFIXint)를 각각 NotI과 S alI으로 절단한 후 CMV 프로모터와 소 poly(A) 서열을 가지는 아데노 부속 바이러스 벡터 pTRUF6에 삽입하여, hFIX 발현 벡터 CMV-hFIX, CMV-hFIXUTR, CMV-hFIXUTR-Syn1int (AT, PLA, PT), 및 CMV-hFIXUTR-Syn2int(AT, PLA, PT, 1.4kbFIXint, 0.3kbFIXint)를 제작하였다.

이들 발현 벡터 각각의 플라스미드 DNA 25 ㎍을 C57BL/6 생쥐의 꼬리 정맥에 주입하고, 다음 날 채취한 혈액을 하기의 ELISA 분석에 사용하였다.

인간 FIX (hFIX) 항체(Affinity Biologicals)로 피복된 96-웰 플레이트에, 앞서 얻어진 혈장을 HBS-BSA-EDTA-T20 (0.1M HEPES-0.1M NaCl-1％ BSA-10mM EDTA-0.1％ Tween-20) 완충액을 이용하여 100배 희석하여 첨가하였다. 실온에서 90분간 배양하고 PBS-0.1％ Tween-20으로 세척한 다음 퍼옥시다아제로 표지된 2차 항체로 90분간 실온에서 배양하였다. PBS-0.1％ Tween-20으로 다시 세척한 다음 O-페닐디아민, H₂O₂가 용해된 기질 완충액을 가하여 5분간 배양하고 2.5M H₂SO₄로 반응을 정지시켰다. 흡광기(Spectra Shell Microplate Reader, STL Spectra, Milan, Italy)를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정한 다음 표준농도에 따른 표준흡광도를 도시한 표준곡선에 의해 각 시료의 hFIX 농도를 계산하였다. 그 결과가 도 6a에 도시되어 있다.

도 6a를 살펴보면, 주입 후 다음 날, CMV-hFIXUTR에 의해 유도된 hFIX 단백질의 혈중농도는 약 910 ng/ml로서, UTR을 포함하지 않은 CMV-hFIX에 의해 유도된 단백질의 농도 (540 ng/ml) 보다 약 1.7배 높았으며, 이는 UTR이 hFIX의 유전자 발현에 기여하고 있음을 시사한다.

CMV-hFIXUTR-Syn1PLA는 CMV-hFIXUTR에 비해 최대 1.6배의 hFIX 단백질을 유도하였고 (1480 ng/ml 대비 910 ng/ml), CMV-hFIXUTR-Syn2AT은 CMV-hFIXUTR보다 최대 2.4배 높은 hFIX 단백질을 유도하였다(2170 ng/ml 대비 910 ng/ml). 이것으로부터 인트론이 hFIX 유전자의 발현과 단백질의 초기 유도에 관여하고 있음을 알 수 있다.

한편, 상기의 발현 벡터 CMV-hFIX, CMV-hFIXUTR, 및 CMV-hFIXUTR-Syn1int (AT, PLA, PT)를 이용하여, 재조합 아데노 부속바이러스 rAAV-CMV-hFIX, rAAV-CMV-hFIXUTR, rAAV-CMV-hFIXUTR-Syn1int (AT, PLA, PT)를 제조하였다. 구체적으로는, 500 ml 스피너 플라스크에 저칼슘(low calcium) DMEM 배지(0.1 mM Ca⁺⁺, 0.1％ PL-68, 1％ FBS)를 이용하여 1x10⁶ 세포/ml의 농도로 조정된 HEK293T 세포 200 ml를 준비하였다. 각각의 발현 벡터 33 ㎍, 아데노바이러스 헬퍼플라스미드 pDG 167 ㎍, 10 μM PEI 650 ㎕로 조성된 DNA-PEI 혼합액을 상기의 세포에 접종하고 5％ CO₂ 항온기에서 30 rpm으로 6시간 동안 현탁 배양한 다음 100㎍ 덱스트란설페이트-저칼슘 DMEM 배지로 배지 교환하였다. 48시간 배양 후, 세포를 수거하여 냉동과 해동을 3회 반복한 후, 원심분리에 의해 얻어진 상층액을 이오딕사놀-농도구배 (iodixanol gradient) 초원심분리법에 의해 정제하였다. (Zolotukhin, S. 등, Gene Ther ., 6: 973-985 (1999)). 상기의 방법으로 얻어진 1x10⁹ 의 감염성 바이러스 입자 (infectious particles, IP)를 면역 결핍 생쥐 (누드 마우스)의 꼬리정맥에 주입하고, 2주 후부터 매주 혈액을 채취하여 상기와 동일한 방법으로 ELISA를 수행하였다. 그 결과가 도 6b에 도시되어 있다.

도 6b에 나타낸 바와 같이, 바이러스를 주입한지 14주 후에, 인트론이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 바이러스는 인트론이 없는 발현 벡터를 포함하는 바이러스에 비해 10 내지 20배의 hFIX 단백질을 발현시켰다. 구체적으로, CMV-hFIXUTR-Syn1AT를 함유하는 바이러스에 의한 hFIX 단백질 농도는 19,996 pg/ml인데 반해, CMV-hFIXUTR을 함유하는 바이러스에 의한 hFIX 단백질 농도는 2,024 pg/ml였다. 이는 본 발명에 따른 인트론이 유전자의 발현 증가에 중요한 기능을 하고 있음을 알 수 있다.

＜단계 4＞ 인트론에 의한 루시퍼라제 유전자의 발현효율 및 mRNA 의 안정성 평가

＜4-1＞ TK 프로모터에 의해 조절되는 루시퍼라제 발현 벡터로의 인트론 도입

pRL-TK 발현 벡터(promega)를 HindIII/NheI으로 절단하여 SV40 인트론을 제거한 다음 평활화하고 재접합하였다. 인트론이 제거된 벡터는 pRL-△int, 인트론이 제거되기 이전의 벡터는 pRL-SV40으로 명명하였다.

상기 단계 2의 ＜2-2＞와 ＜2-3＞에서 얻어진 pBS-hFIXUTR-Syn1AT, pBS-hFIXUTR-Syn1PLA, 및 pBS-hFIXUTR-0.3kbFIXint를 XhoI/AatII로 절단한 다음 평활화 하였다. 이렇게 얻어진 단편을 상기의 발현 벡터 pRL-△int에 삽입하였다. 결과적인 벡터를 각각 pRL-Syn1AT, pRL-Syn1PLA, 및 pRL-hFIXm2로 명명하였다 (도 7a 참조).

＜4-2＞ 인트론에 의한 루시퍼라제의 발현정도 분석

상기에서 제작된 루시퍼라제 발현 벡터 2 ㎍을 β-갈락토시다제 발현벡터 1㎍과 함께 PEI(polyplus)와 복합체를 형성하여 이를 실시예 1의 단계 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 간세포주(Hep3B), 신장세포주(HEK293), 및 폐세포주(A549)에 각각 주입하였다. 48시간 후에 회수된 세포로부터 실시예 1의 단계 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 루시퍼라제의 발현정도를 측정하였다. 그 결과가 도 7b에 도시되어 있다.

도 7b에 나타낸 바와 같이, 인트론이 도입된 발현 벡터는 인트론을 포함하지 않은 발현 벡터보다 최대 200배 이상 활성이 증가하는 것을 알 수 있다 (Hep3B 간세포주에서의 Syn1AT의 경우). 특히 Syn1AT 인트론은 단계 3에 기재된 바와 같이 FIX의 발현 유도뿐만 아니라 루시퍼라제의 활성 유도에도 크게 기여하고 있음을 알 수 있다.

＜4-3＞ 인트론에 의한 mRNA 의 발현 안정성 분석

상기 ＜4-1＞에 기재된 루시퍼라제 발현 벡터를 ＜4-2＞에 기재된 것과 동일한 방법으로 A549 폐세포주에 형질도입하고 48시간 후에 세포를 회수하였다. FastPure RNA 키트(Takara)를 이용하여 각각의 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 각각의 RNA 500 ng을 주형으로 하여 AMV RTase(Takara)를 이용하여 단일가닥 DNA 산물을 제작하였다. 다시 이를 주형으로 하여 루시퍼라제 검출용 프라이머와 β-액틴 검출용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과가 도 8a 및 8b에 도시되어 있다.

도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, pRL-Syn1AT 벡터에 의해 유도된 RLuc mRNA의 양은 pRL-△int 벡터에 의해 유도된 RLuc mRNA의 양보다 1.7배 높은 것으로 나타났다. 이는 인트론에 의한 mRNA의 보다 안정적인 유지가 유전자의 발현 증가와 관련되어 있는 것으로 추정된다.

＜단계 5＞ FIX 의 발현에 미치는 안티트롬빈 인트론의 효능 분석

서로 다른 형태의 안티트롬빈 인트론이 hFIX 단백질의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기 단계 2의 ＜2-4＞에서 제작된 pBS-hFIXUTR-NA, pBS-hFIXUTR-△NAL, 및 pBS-hFIXUTR-NAS을 이용하여 단계 3에 기재된 것과 동일한 방법으로 아데노 부속 바이러스 벡터 pTRUF6에 삽입하여, 발현 벡터 CMV-hFIXUTR-NA, CMV-hFIXUTR-△NAL, 및 CMV-hFIXUTR-△NAS를 제작하였다. CMV-hFIX, CMV-hFIXUTR, CMV-hFIXUTR-0.3kbFIXint (CMV-hFIXm2), CMV-hFIXUTR-Syn1AT, CMV-hFIXUTR-Syn2AT, CMV-hFIXUTR-△NA, CMV-hFIXUTR-△NAL, 및 CMV-hFIXUTR-△NAS 발현 벡터의 플라스미드 DNA를 상기 단계 3과 동일한 방법으로 생쥐의 꼬리정맥에 주입하고 ELISA에 의해 혈중 hFIX 농도를 측정하였다. 그 결과가 도 9a에 도시되어 있다.

도 9a에 나타낸 바와 같이, 서로 다른 형태의 안티트롬빈 인트론이 삽입된 발현 벡터들은 hFIX 단백질 농도 측면에서 CMV-hFIXUTR보다 1.7배 내지 3.5배 높은 것으로 나타났다 (1730 내지 3540 ng/ml 대비 1000 ng/ml), 특히, CMV-hFIXUTR-△NAL는, 기존에 확립된 CMV-hFIXm2 보다 약 1.7배 높은 발현 효율을 보여주었다 (2010 ng/ml 대비 1000 ng/ml). 이에 따라, △NAL는 hFIX의 과발현을 위해 가장 적절한 인트론인 것으로 추정된다.

한편, 인트론 △NAL이 시험관내(in vitro)에서 hFIX 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해, CMV-hFIX, CMV-hFIXUTR, 및 CMV-hFIXUTR-△NAL 발현 벡터를 HEK293T 신장세포주에 형질도입하였다. 형질도입 후, 2일째에 세포와 배지를 취해 세포를 분해한 다음 hFIX 항체를 이용하여 전기영동을 수행하여 hFIX 단백질을 검출하였다. 그 결과가 도 9b에 도시되어 있다.

도 9b에 나타낸 바와 같이, CMV-hFIXUTR-△NAL은 CMV-hFIX, CMV-hFIXUTR 대비 1.55 배의 증가된 발현을 유도하였다.

실시예 3: 유전자의 지속적 발현을 위한 유전자좌 제어영역의 동정 및 이들의 도입에 따른 유전자 발현효율 분석

＜단계 1＞ 간 특이적인 유전자좌 제어영역( locus control region )의 동정 및 이를 포함하는 플라스미드 벡터의 제작

간조직에서만 발현되는 알파1-안티트립신, 알파-피토단백질 및 알부민 유전자의 하류에서 TGTTTGC의 분포 위치를 분석하였다. 그 결과가 도 10에 도시되어 있다.

도 10에 도시된 바와 같이, 알파1-안티트립신 운전자의 -7.8kb에 위치하는 부위에는 7개의 TGTTTGC 모티프가 정방향으로 6개, 역방향으로 한개가 분포하고 있으며, -108 bp 위치에는 정방향으로 한 개가 분포하고 있다. 알파-피토단백질의 경우에는 -3.8 kb 부위에 정방향으로 2개, 역방향으로 한 개의 TGTTTGC 모티프가 분포되어 있으며, 알부민 유전자의 경우에는 -6 kb 부위에 역방향으로 한 개가 분포되어 있다. 이밖에도 알파1-안티트립신 유전자의 -800 bp 위치, 알파-피토단백질 유전자의 -1.5 kb와 -500 bp 위치, 알부민 유전자의 -10 kb, -3.5 kb, -2,6 kb 위치에 TCTTTGC 모티프가 밀집되어 있음을 확인하였다. 이 중에서 알파1-안티트립신 유전자의 -7.8 kb와 -108 bp 부위, 알파-피토단백질 유전자의 -3.8 kb 부위, 알부민 유전자의 -6 kb 부위를 동정하였다.

구체적으로는, 알파1-안티트립신 유전자의 -108 bp 부위에 위치하는 유전자좌 제어영역을 동정하기 위해, 실시예 1의 단계 1에 기재된 지능 DNA를 주형으로 하여 서열번호: 26 및 27의 프라이머 세트 및 DNA 폴리머라제(Ex-Taq, Takara)를 이용하여 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 겔 추출을 통해 정제한 다음 pCR2.1-TOPO 벡터에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호: 58로 기재된 목적하는 알파1-안티트립신의 유전자좌 제어영역의 존재를 확인하였고, 이를 pCR-AAT108lcr로 명명하였다.

마찬가지로, 인간 알파1-안티트립신의 -7.8 kb 부위, 인간 알파-피토단백질 -3.8 kb 부위, 인간 알부민 유전자의 -6 kb 부위에 위치하는 유전자좌 제어영역은, 각각 서열번호: 28 및 29의 프라이머 세트, 서열번호: 30 및 31의 프라이머 세트 및 서열번호: 32 및 33의 프라이머 세트를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 PCR 산물을 pCR2.1-TOPO 벡터에 각각 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호: 59, 60 및 61로 기재된 목적하는 유전자좌 제어영역의 존재를 확인하였고, 각각 pCR-AAT7800lcr, pCR-AFP3800lcr, 및 pCR-E6lcr로 명명하였다.

한편, Dang Q.에 의해 보고된 바 있는 인간의 아포리포단백질 E (ApoE) 유전자의 간 제어영역 HCR 및 최소 구조 HCRm을 동정하기 위해, 서열번호: 34 및 35의 프라이머 세트와 서열번호: 34 및 36의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하고 결과적인 PCR 산물을 pCR2.1-TOPO 벡터에 각각 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 목적하는 인간의 ApoE 유전자의 간 제어영역의 존재를 확인하였고, 이를 각각 pCR-ApoEHCR 및 pCR-ApoEHCRm으로 명명하였다.

이들 플라스미드의 개열 지도가 도 11a에 도시되어 있다.

나아가, 최소구조 간 제어영역인 HCRm에 알파1-안티트립신 유전자의 인핸서 및 프로모터를 조합하여 pBluescript II 벡터에 삽입된 pBS-HCRm-AATenh/pro (HmA)와 ApoE 유전자의 간 제어영역인 HCR과 알파1-안티트립신 유전자의 프로모터를 조합하여 pBluescript II 벡터에 삽입된 pBS-HCR-AATpro (HA)플라스미드를 제작하였다. 이들 플라스미드의 개열 지도가 도 11b에 도시되어 있다.

＜단계 2＞ 유전자좌 제어영역의 도입에 따른 유전자의 발현효율 분석

상기 단계 1에서 동정된 유전자작 제어영역이 프로모터, 인핸서, 인트론과 조합되었을 때 FIX 유전자의 발현효율에 미치는 영향을 분석하였다.

구체적으로, 단계 1에서 제작된 pCR-AAT108lcr, pCR-AAT7800cr, pCR-AFP3800lcr, pCR-E6lcr, pCR-HCR, 및 pCR-HCRm을 HindIII/EcoRV으로 절단한 다음, 실시예 1의 단계 2에서 제작된 pBS-PF를 HindIII/EcoRI(후에 평활화 함)으로 절단한 영역에 삽입하여 pBS-AAT108-PF, pBS-AAT7800-PF, pBS-AFP3800-PF, pBS-E6-PF, pBS-HCR-PF, 및 pBS-HCRm-PF를 각각 제작하였다. 각각의 플라스미드를 다시 KpnI과 NotI으로 절단한 후, 이를 상기 실시예 2의 단계 5에 기재된 pBS-CMV-hFIXUTR-Syn1PLA의 KpnI/NotI 영역에 삽입하여 pBS-AAT108-PF-hFIXUTR-Syn1PLA, pBS-AAT7800-PF-hFIXUTR-Syn1PLA, pBS-AFP3800-PF-hFIXUTR-Syn1PLA, pBS-E6-PF-hFIXUTR-Syu1PLA, pBS-HCR-PF-hFIXUTR-Syn1PLA, 및 pBS-HCRm-PF-hFIXUTR-Syn1PLA를 제작하였다. 이들 플라스미드의 개략적인 모식도가 도 12a에 도시되어 있다.

상기의 플라스미드를 KpnI과 SalI으로 처리하고, 다시 이를 아데노 부속 바이러스 벡터 pTRUF6의 KpnI/SalI 영역에 삽입하여, 발현 벡터 AAT108-PF-hFIXUTR-Syn1PLA, AAT7800-PF-hFIXUTR-Syn1PLA, AFP3800-PF-hFIXUTS- Syn1PLA, E6-PF-hFIXUTR-Syn1PLA, HCR-PF-hFIXUTR-Syn1PLA, 및 HCRm-PF-hFIXUTR-Syn1PLA를 제작하였다. 상기 발현 벡터의 플라스미드 DNA를 실시예 2의 단계 3에 기재된 것과 동일한 방법으로 생쥐의 꼬리정맥에 주입하고 ELISA를 통해 hFIX 단백질의 발현 정도를 분석하였다. 그 결과가 도 12b에 도시되어 있다.

도 12b에 나타낸 바와 같이, 주입 후 이틀 후에 유전자좌 제어영역을 포함하는 발현 벡터들은 대조군인 CMV-hFIXUTR-Syn1PLA 대비 최고 7배의 hFIX 발현 효율을 보여주었다(AAT7800-PF-hFIXUTR-Syn1PLA 7640 ng/ml 대비 CMV-hFIXUTR-Syn1PLA 1090 ng/ml). 특히 AAT108-PF-hFIXUTR-Syn1PLA는 주입 후 4주째까지 390 ng/ml의 hFIX를 꾸준히 발현하고 있었으며 대조군 유전자좌 제어영역을 포함하는 HCR-PF-FIX-Syn1PLA에 의한 hFIX 발현 정도(250 ng/ml)를 최고 1.6배 초과하는 것으로 나타났다. 이에, hFIX의 지속적인 발현을 위해 AAT108이 가장 적절한 유전자좌 제어영역임을 알 수 있다.

실시예 4: 본 발명의 발현 벡터를 이용한 B형 혈우병의 치료 효능 평가

실시예 1의 단계 2에서 제작된 pBS-PAF를 이용하여 실시예 3의 단계 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 발현 벡터 AAT108-PAF-hFIXUTR-Syn1PLA를 제작하였다. 또한, 실시예 2의 ＜2-4＞에서 제작된 pBS-CMV-hFIXUTR-△NAL를 NotI과 SalI으로 처리하고, 이를 실시예 3의 단계 2에서 제작된 AAT108-PF-hFIXUTR-Syn1PLA와 AAT108-PAF-hFIXUTR-Syn1PLA의 NotI/SalI 영역에 삽입하여, 발현 벡터 AAT108-PF-hFIXUTR-△NAL과 AAT108-PAF-hFIXUTR-△NAL을 제작하였다.

한편, 실시예 1의 단계 1에 기재된 pCR-AAT enh/pro를 SpeI(후에 평활화 함)/NotI으로 절단한 후, 실시예 3의 단계 2에 기재된 pCR-HCRm의 EcoRV/NotI으로 절단한 영역에 삽입하여 pCR-HCRm-AATenh/pro (HmA)를 제작하였다. 이를 KpnI과 NotI으로 절단한 다음, 실시예 2의 단계 5에서 제작한 CMV-hFIXUTR-△NAL의 KpnI과 NotI 영역에 삽입하여, 발현 벡터 HmA-hFIXUTR-NAL를 제작하였다.

실시예 1의 단계 1에 기재된 pCR-AAT enh/pro를 BglII(후에 평활화 함)/NotI으로 절단한 다음, 실시예 3의 단계 2에 기재된 pCR-HCR의 EcoRV/NotI으로 절단한 영역에 삽입하여 pBS-HCR-AATpro (HA)를 제작하였다. 이를 KpnI/NotI으로 절단한 후, 실시예 2의 단계 3에 기재된 CMV-hFIXUTR-1.4kbFIXint의 KpnI/NotI 영역에 삽입하여, 발현 벡터 HA-hFIXUTR-1.4kbFIXint를 제작하였다.

이렇게 제작된 발현 벡터들의 개략적인 모식도가 도 13a에 도시되어 있다.

상기의 AAT108-PF-hFIXUTR-△NAL, AAT108-PAF-hFIXUTR-△NAL, 및 HmA-hFIXUTR-△NAL과 실시예 2의 단계 5에서 제작된 CMV-hFIXUTR-△NAL 발현 벡터의 플라스미드 DNA 25 ㎍을 B형 혈우병 생쥐의 꼬리정맥에 주입하여 ELISA에 의한 hFIX 단백질 농도 및 혈액응고 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 13b에 도시된 바에 따르면, AAT108-PAF-hFIXUTR-△NAL은, HmA-hFIXUTR-△NAL에 비해, 주입 후 1일째 9.8％, 2일째 30.6％, 7일째 82％, 2주째 108％, 9주째 208％의 발현 효율을 보여주었다. 한편, AAT108-PF-hFIXUTR-△NAL은, HmA-hFIXUTR-△NAL에 비해, 주입 후 1일째 9.0％, 2일째 19.2％, 7일째 41.9％, 2주째 56.9％, 9주째 73.0％의 발현 효율을 나타내었다.

혈액 응고 활성 측정은 활성 부분적 트롬보플라스틴 시간(Activated partial thromboplastin time; APTT)법에 기초하여 다음과 같이 수행되었다. FIX 결여 혈장과 10배로 희석된 생쥐 유래 혈장, 활성화 액틴을 각각 50 ㎕씩 혼합하여 37℃에서 3분간 반응시켰다. 여기에 CaCl₂를 첨가하여 혈액 응고 측정기 KC10A(Amelung)을 이용하여 시료가 응고되는 시간을 측정하였다. 실험에 사용된 정상 생쥐의 혈액 응고 시간은 약 44초였으며, B형 혈우병 생쥐의 혈액 응고 시간은 약 65초로 측정되었다. 도 13c에 도시된 바와 같이, 상기의 hFIX 발현 벡터가 주입된 B형 혈우병 쥐는 주입 후 3일째까지 정상 수준의 80％ 내외의 혈액 응고 시간을 보여주었다. 그러나 주입 후 7일째 이후에는, CMV-hFIXUTR-△NAL 주입 생쥐의 혈액 응고 시간은 주입 이전 수준으로 돌아갔으나, AAT108-PF-hFIXUTR-△NAL, AAT108-PAF-hFIXUTR-△NAL 주입 생쥐의 혈액 응고 시간은 50 내지 60초로서 B형 혈우병 생쥐의 혈액 응고 시간을 개선하는 것을 알 수 있다.

또한, 표준활성 대 표준응고시간을 나타내는 표준곡선에 의해 각 시료의 응고 활성을 계산하였다. 그 결과, 도 13d에 도시된 바와 같이, AAT108-PF-hFIXUTR-△NAL, AAT108-PAF-hFIXUTR-△NAL을 주입한 B형 혈우병 생쥐는 주입 후 8주째 정상 생쥐 대비 34.1％, 29.3％의 혈액응고 활성을 각각 보여주는 것으로 나타났다. 특히, AAT108-PAF-hFIXUTR-△NAL는 생쥐에 주입된 후 8주째 정상 생쥐 대비 31.9％의 응고활성을 나타내는 것을 알 수 있다.

한편, 상기 HA-hFIXUTR-1.4kbFIXint, AAT108-PF-hFIXUTR-△NAL, AAT108-PAF-hFIXUTR-△NAL 및 실시예 2의 단계 3에서 제작된 CMV-hFIXUTR-1.4kb17IXint 발현 벡터를 포함하는 아데노 부속 바이러스를 이용하여 제작한 재조합 아데노 부속 바이러스 2x10⁹ IP를 B형 혈우병 생쥐의 간정맥에 주입하고 상기와 동일한 방법으로 ELISA를 이용한 hFIX의 농도 및 혈액 응고 활성을 측정하였다. 그 결과가 도 14a 및 14b에 도시되어 있다.

도 14a에 도시된 바에 따르면, AA7108-PF-hFIXUTR-△NAL 함유 바이러스는 최고 2379 ng/ml, AAT108-PAF-hFIXUTR-△NAL 함유 바이러스는 최고 1431 ng/ml의 hFIX 단백질을 유도하였다. 반면에, 대조군으로서 사용된 기존의 CMV-hFIXUTR-1.4kbFIXint과 HA-hFIXUTR-1.4kbFIXint를 함유하는 바이러스에 의해 발현된 hFIX는 최고 1542 ng/ml, 380 ng/ml으로 나타났다. 특히, AAT108-PF-hFIXUTR-△NAL를 함유하는 바이러스는 주입 후 68주까지 혈중농도 500 ng/ml 이상의 hFIX 발현을 유도하였으며, 이는 본 발명에 따른 유전자좌 제어영역을 포함하는 발현 벡터는 장기간의 유전자 발현을 요구하는 유전자 치료에 적합함을 알 수 있다.

도 14b에 도시된 바와 같이, 혈액응고 활성 측정을 통해서도 AAT108-PF-hFIXUTR-△NAL을 함유하는 바이러스가 주입된 생쥐에서 주입 후 7 주째까지 정상생쥐 대비 59.1％의 응고 활성을 유도하는 것을 알 수 있다.

상기의 결과로 볼 때, 본 발명에서 고안된 발현 시스템은 혈우병 치료에 있어서 필요한 안정하고 지속적인 유전자의 발현에 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 5: 항 혈관신생 단백질 아포리포단백질 (a)의 크링글 ( kringle ) 도메 인 KIV9 - KIV10 - KV ( LK68 ) 유전자를 포함하는 간 특이적인 발현 벡터의 제조 및 LK68 단백질의 발현효율 평가

LK68 발현 벡터에 △NAL 인트론과 혈액응고 제9인자의 비해독 말단영역을 도입하기 위해, 서열번호: 37과 서열번호: 38의 프라이머 세트, 서열번호: 39와 서열번호: 40의 프라이머 세트, 및 Ex-Taq을 사용하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. DNA 가닥 분리를 위하여 94℃에서 5분간 주형을 변성시키고, 이후 94℃에서 1분간 변성, 60℃에서 1분간 어닐링, DNA 72℃에서 1분간 연장의 과정을 30회 반복한 다음, 72℃에서 3분간 추가연장을 수행하여, 혈액응고 제9인자 5'UTR-신호서열 단편과 LK68-혈액응고 제9인자 3'UTR 단편을 각각 합성하였다. 실시예 2의 ＜2-4＞에서 제작된 pBS-hFIXUTR-△NAL 벡터에 제한효소 NotI, XhoI을 이용하여 5'UTR-신호서열 단편을, 제한효소 AatII, SalI을 이용하여 LK68-3'UTR 단편을 각각 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 목적하는 DNA 단편들의 존재를 확인하였고, 이를 pBS-LK68-△NAL-FUTR 로 명명하였다. 상기 제작된 pBS-LK68-△NAL-FUTS 플라스미드를 NotI, SalI 제한효소 처리하여 얻어진 LK68-△NAL-FUTR 단편을, 실시예 4에서 제작된 AAT108-PF-hFIXUTR-NAL NotI/SalI영역에 삽입하여 AAT108-PF-LK68-△NAL-FUTR를 제작하였고, 이와 동일한 방법으로 발현 벡터 E6-PF-LK68-△NAL-FUTR, AAT7800-PF-LK68-△NAL-FUTR, AFP3800-PF-LK68-△NAL-FUTR, HCRm-PF-LK68-△NAL-FUTR, HCR-PF-LK68-△NAL-FUTR과 PF-LK68-△NAL-FUTR를 제작하였다. 이들 발현 벡터의 개열 지도가 도 15a에 도시되어 있다.

이들 발현 벡터를 상기 실시예 2의 단계 3에 기재된 것과 동일한 방법으로 생쥐의 꼬리정맥에 주입하였다. 플라스미드가 주입된 생쥐로부터 혈액을 채취하고 ELISA를 통해 LK68 단백질의 발현 양을 측정하였다.

그 결과, 도 16a에 도시된 바와 같이, LCR 중에서 AAT108의 발현효율이 가장 우수한 것으로 나타났다. 특히, AAT108-PF-LK68-△NAL-FUTR의 경우, PF-LK68-△NAL-FUTR에 비해, 주입후 1일째 158.4％, 2일째 104.8％, 7일째 155.8％, 2주째 160.2％, 3주째 162.7％, 4주째 144.1％의 발현 효율을 나타내었다.

이외에, 상기와 동일한 방법으로 AAT108-PF-LK68, AAT108-PF-LK68-FUTR, AAT108-PF-LK68-△NAL-FUTR, AAT108-PAF-LK68, AAT108-PAF-LK68-FUTR, AAT108-PAF-LK68-△NAL-FUTR 발현 벡터를 제작하였다. 이들 발현 벡터의 개열 지도가 도 15b에 도시되어 있다.

그 결과, 도 16b에 도시된 바와 같이, AAT108-PF-LK68-FUTR과 AAT108-PF-LK68-△NAL-FUTR의 경우, AAT108-PF-LK68 대비, 주입후 1일째 197.7％와 425.4％, 2일째 478.6％와 891.2％, 7일째 233.2％와 319.3％, 2주째 203.0％와 253.7％, 3주째 113.8％와 243.3％, 4주째 170.4％와 277.6％의 발현 효율을 나타내었다. AAT108-PAF-LK68-FUTR과 AAT108-PAF-LK68-△NAL-FUTR의 경우에도, AAT108-PAF-LK68에 비해, 주입후 1일째 147.0％와 344.6％, 2일째 351.0％와 824.5％, 7일째 220.2％와 260.3％, 2주째 140.8％와 203.0％, 3주째 146.5％와 288.4％, 4주째 177.8％와 323.8％의 발현 효율을 나타내었다.

이러한 결과로부터 인트론과 비해독 말단영역이 존재하는 경우 그렇지 않은 경우에 비해서 발현효율이 높고, 지속적으로 발현이 유지되는 것을 알 수 있다.

실시예 6: 세포내에서 비해독 말단영역 및 인트론에 의한 항 혈관신생 단백질 아포리포단백질 (a)의 크링글 ( kringle ) 도메인 KIV9 - KIV10 - KV ( LK68 )의 발현효율 평가

상기 실시예 5에 기재된 AAT108-PF-LK68과 AAT108-PF-LK68-△NAL-FUTR 벡터를 NotI, SalI으로 처리하여 얻어진 LK68과 LK68-△NAL-FUTR 단편을 아데노바이러스 셔틀벡터인 pENTR2B(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 삽입하여 pENTR-LK68과 pENTR-LK68-△NAL-FUTR를 제작하였다. Clonase™(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 상기의 셔틀벡터와 pAd/CMV/V5-DEST(Invitrogen, Carlsbad, CA) 목적벡터를 시험관내에서 상동 재조합 반응을 통해 pAd-CMV-LK68과 pAd-CMV-LK68-△NAL-FUTR를 제작하였다. pAd-CMV-LK68과 pAd-CMV-LK68-△NAL-FUTR을 PacI 제한효소로 선형화시킨 다음, HEK 293 신장 세포주에 형질감염시켜 CMV-LK68와 CMV-LK68-△NAL-FUTR을 포함하는 복제불능 아데노바이러스 rAd-LK68 및 rAd-LK68_UN을 제작하였다. rAd-LK68및 rAd-LK68_UN을 각각 HEK 293 신장세포주에 감염시켜 LK68 단백질의 발현 양을 측정하였다.

HEK 293 신장세포주에 감염시킬 때 세포하나 당 바이러스의 수(MOI)를 0.1, 0.5, 2, 10의 4 종류로 각각 실험을 수행하였다. 아데노바이러스 감염 후 2일째에 세포와 배지를 각각 취하였다. 항-LK68 항체를 이용한 전기영동에 의해 LK68 단백질의 발현량을 측정하였다. 그 결과가 도 17a 및 17b에 도시되어 있다.

도 17a 및 17b에 도시된 바와 같이, MOI 0.1, 0.5, 2에서는 LK68 단백질의 발현량이 적거나 비슷하게 확인이 되었고, MOI 10에서는 rAd-LK68_UN의 LK68 발현양이 rAd-LK68에 비해 세포내에서는 420％, 배지내에서는 242％로 각각 증가하였다.

이러한 결과는 비해독 말단영역과 인트론이 존재하는 경우 그렇지 않은 경우에 비해서 세포에서의 발현 효율이 높은 것을 알 수 있다.

본 발명을 상기의 구체적인 실시예와 관련하여 기술하였지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에서 당 분야의 숙련자가 본 발명을 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있다.

<110> MOGAM BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE <120> EXPRESSION VECTOR SUITABLE FOR EXPRESSION OF A CODING SEQUENCE FOR GENE THERAPY <130> FPL/201204-0158 <160> 63 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor VII pro XhoI sense primer <400> 1 ccgctcgagc ccggcacttc tcagtga 27 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor VII pro BamHI antisense primer <400> 2 cgggatccgc tgcccctgcc tgttga 26 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OATP-C pro XhoI sense primer <400> 3 ccgctcgaga taactgtggc acagaca 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OATP-C pro BamHI antisense primer <400> 4 cgggatccta gaatcctaca gcaact 26 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT pro sense primer <400> 5 ttccctggtc tgaatgtgtg tgctgga 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT pro antisense primer <400> 6 actgtcccag gtcagtggtg gtgcctg 27 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAH enh EcoRI sense primer <400> 7 ggaattcaag agaagggtca tgtag 25 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAH enh XhoI antisense primer <400> 8 ccgctcgaga ggtggggaac atgtcac 27 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMBP enh EcoRI sense primer <400> 9 ggaattccaa ttcccatgga ctct 24 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMBP enh XhoI antisense primer <400> 10 ccgctcgagc aagggcatgg tccagat 27 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Not I linker human FIX 5'UTR sense primer <400> 11 ccgcggccgc accactttca caatc 25 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal I linker human FIX 3'UTR antisense primer <400> 12 tagtcgacaa aaagcaatga tcatac 26 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human FIX sense primer <400> 13 ccgcggccgc cgcggatgca gcgcg 25 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human FIX antisense primer <400> 14 tagtcgacat cgattaagtg agctttg 27 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Antithrombin intron 1 sense primer <400> 15 ggtgagcttt ccccttgcct gcc 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Antithrombin intron 1 antisense primer <400> 16 caaaggtcac tgggatttgg gtg 23 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Plasminogen intron 1 sense primer <400> 17 tagttttttt aaattataag aatt 24 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Plasminogen intron 1 antisense primer <400> 18 tggtgagaga acggaatata ttc 23 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Prothrombin intron 1 sense primer <400> 19 gtgcttgcag gctggaacag gctg 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Prothrombin intron 1 antisense primer <400> 20 gggtcatgga acagcgacct cagg 24 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human FIX intron 1 antisense primer <400> 21 gtttgtttcc ttttttaaaa tac 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human FIX intron 1 antisense primer <400> 22 ctgaaatgta aaagaataat tc 22 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xho I linker synthetic splicing donor antisense primer <400> 23 gtaagtttct cgagggccgg gagcgatctg ggtcgagggg 40 <210> 24 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aat II linker synthetic splicing acceptor sense primer <400> 24 ctgaaaggga aaagaatgac gtcgccaaga tagtcagtaa atcaatgtta gta 53 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Full-length human antithrombin intron 1 antisense primer <400> 25 gaattcgccc ttcaagacgt caag 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT108 sense primer <400> 26 cgactcagat cccagccagt ggac 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT108 antisense primer <400> 27 gtatttaagc agtggatcca gagg 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT7800 sense primer <400> 28 gggatgttag tgtgtgtatg caca 24 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT7800 antisense primer <400> 29 atgatttcca ttctacttaa actg 24 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP3800 sense primer <400> 30 taaccaacca cccaatccaa caaac 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP3800 antisense primer <400> 31 agacaagcaa taaagaggag ctttg 25 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E6 sense primer <400> 32 agctttctga acagccaaac agag 24 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E6 antisense primer <400> 33 aactgaccct tgtaaataac tgtt 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE HCR, HCRm sense primer <400> 34 ccagggatgg agagaaagag atga 24 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE HCR antisense primer <400> 35 cagctacttg ggaggctgag gcag 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE HCRm antisense primer <400> 36 ccctctcaca ctacctaaac cacg 24 <210> 37 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Not I linker 5'FU-signal peptide sense primer <400> 37 gcggccgcac cactttcaca atctgctagc aaaggttatg gagacag 47 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xho I linker signal peptide-NAL antisense primer <400> 38 ctcgagaaac ttacgtcacc agtggaacct ggaac 35 <210> 39 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAL-LK sense primer <400> 39 gacgtcattc ttttcccttt caggcggccc agccggccaa aag 43 <210> 40 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LK-3'FU antisense primer <400> 40 gtcgacaaaa agcaatgatc atagaatgta tatattcaaa tctaacaaaa gatgggaaag 60 tgattagtta gtgagaggcc ctgttaattt tcaattccaa tgaattaacc ttggaaatcc 120 atctttcact cgagttactt gtcatcg 147 <210> 41 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor VII promoter <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> XhoI site <220> <221> misc_feature <222> (511)..(516) <223> BamHI site <400> 41 ctcgagcccg gcacttctca gtgaggctct gtggctcacc taagaaacca gcctcccttg 60 caggcaacgc ctagctggcc tggtctggag gctctcttca aatatttaca tccacaccca 120 agatacggtc ttgagatttg actcgcatga ttgctatggg acaagttttc atctgcagtt 180 taaatctgtt tcccaactta cattaggggt ttggaattct agatcgtatt tgaagtgttg 240 gtgccacaca caccttaaca cctgcacgct ggcaacaaaa ccgtccgctc tgcagcacag 300 ctggggtcac ctgacctttc tcctgtcccc cccacttgag ctcagtggct gggcagcagg 360 ggatgcatgg ccactggcgg ccaggtgcag ctctcagctg gggtgttcag aggacgcctg 420 tgtcctcccc tcccccatcc ctctgtcacc cttggaggca gagaactttg cccgtcagtc 480 ccatggggaa tgtcaacagg caggggcagc ggatcc 516 <210> 42 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor VII truncated promoter <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI site <220> <221> misc_feature <222> (298)..(303) <223> BamHI site <400> 42 gaattctaga tcgtatttga agtgttggtg ccacacacac cttaacacct gcacgctggc 60 aacaaaaccg tccgctctgc agcacagctg gggtcacctg acctttctcc tgtccccccc 120 acttgagctc agtggctggg cagcagggga tgcatggcca ctggcggcca ggtgcagctc 180 tcagctgggg tgttcagagg acgcctgtgt cctcccctcc cccatccctc tgtcaccctt 240 ggaggcagag aactttgccc gtcagtccca tggggaatgt caacaggcag gggcagcgga 300 tcc 303 <210> 43 <211> 989 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OATP-C promoter <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> XhoI site <220> <221> misc_feature <222> (984)..(989) <223> BamHI site <400> 43 ctcgagataa ctgtggcaca gacatcaaat acattttgct gcaaccatat caacaaatgt 60 cccatgaatg ataaggggta accatattct catatatgca tcctcacatt accacatata 120 tatatgtgca tatgtgtata caggtaaaag tgtgtatata tgtatacatg tatgtttgtg 180 tgtatataca tacatatatc ttcacacttt tctgaaatat atatatttat gtgagagaag 240 ggtctgtact ttatttcaga agagagctta atgtccaagg tataattgag agtctaaaat 300 gtttgagtta ttgaattaat taaacttcat ctctactcaa gaaaactttt aactgagtta 360 agctcttcct ttctccacaa gtcaagtcaa taaaaggaaa ctgtgatatt aataattctt 420 tcctgttttg atgtaaagaa tctatcgcat aaagcagtct taattttcat cattcagaaa 480 aatggtcttg cagttaattg ggactctctt attccaggtg gtatctccag tctccataca 540 taccacgtta gaaccatact tatgtaccaa gcaaagaggg tatattttaa tttttaaatg 600 ccaatgtaac ctgtaggcat attttttatt tgtcttaaat tatttcctat ttggaagttt 660 taaatacctg gaataattta ttgtactcat atttttaaag aaaaaaatct tatgccacca 720 acttaattga ataaacaagt aaaagccatt cccaaaagta aggtttactt gttaagatta 780 acaaaaaata atgtgagaat tctgagaaat ataatcttta aatattggca actggagtga 840 actcttaaaa ctactaggtt ttatatgttt gactagagca atgacataat aaggtggtta 900 atcatcactg gacttgtttt caaaaagcca actactttaa gaggaataaa gggtggactt 960 gttgcagttg ctgtaggatt ctaggatcc 989 <210> 44 <211> 249 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAH enhancer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI site <220> <221> misc_feature <222> (244)..(249) <223> XhoI site <400> 44 gaattctgag gaattatgat aaaagagaat gaataaaaaa acaagagaag ggtcatgtag 60 gttttgtttc tgtgccatga actcatggat tatgattaac tcaaccttct gcacatgaag 120 ataaacaaga aagaactgat aaacctgcaa tggttgggta atcttcaact tccaaatcag 180 caaaggtcag ctctaagttt gccaagtaca caacttctca tcttgtgaca tgttccccac 240 ctcctcgag 249 <210> 45 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMBP enhancer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI site <220> <221> misc_feature <222> (411)..(416) <223> XhoI site <400> 45 gaattccaat tcccatggac tcttagaccc ctgggccccc taggagggca gggaccccag 60 agcctccatc ctcccacccc agcagccaga aggggaggag ggggcagcag ctgtctgacc 120 actgttggtc ttgcaacttg tgtccccagg ttaattttta aaaagcagtc aaaagtccaa 180 gtggcccttg gcagcattta ctctctctgt ttgctctggt taataatctc aggagcacaa 240 acattcctgg aggcaggaga agaaatcaac atcctggact tatcctctgg gcctctcccc 300 acccccagga gaggctgtgc aactgaatga acagccctgt ccaagagagg ctaggactgg 360 ggcttctcca cccctgcgcg tctcagcttc ccatctggac catgcccttg ctcgag 416 <210> 46 <211> 427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antithrombin truncated 1st intron <400> 46 ggtgagcttt ccccttgcct gcccctactg ggttttgtga cctccaaagg actcacagga 60 atgacctcca acacctttga gaagaccagg ccctctccct ggtagttaca gtcaaagacc 120 tgtttggaag acgtcatttc aagtgctctc cctcccaccc cacctcttgg ggtaaggcct 180 ttcctaagct accccttggg tccctagcct aagaaacaag ggggatgtca tccctggtgt 240 aaagatgctg tgcaggaagt cagcactcac gggatccagg ggacgctcca aggggaatcc 300 ccagggcctg ccatccatcc gggaagagag caaatgctac ccatgaggac ctcctcactc 360 cctttttgct ctttcttcca ctcagatcca ccccactcca cccccaccca aatcccagtg 420 acctttg 427 <210> 47 <211> 422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen truncated 1st intron <400> 47 tagttttttt aaattataag aattattttt tctcccacaa tgtagtaaaa atacatatgc 60 catggcttta tgtgcaattc atttaatttt tgattcatga aacttccagt tgaaaatctt 120 gtataagatt gaggaattct tcaagaaata agtttaagtt tcctgtgaag attgtcaggg 180 tgctggaatg aatgggcaga gaaaataatg ggtgattttt caaatctaaa tgagtgcacc 240 cacataatgg ccagtctaat tgaaaaagag ccaatgtagc taattatgca aaggacggct 300 aagctctttg cctggttctc agtttgacta atttatatca tctctgttac ggtgtcatgc 360 tcccctcact tgcaagttaa aacagtgaaa tatctctttg aatatattcc gttctctcac 420 ca 422 <210> 48 <211> 361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prothrombin truncated 1st intron <400> 48 gtgcttgcag gctggaacag gctggaggac tggggtgtgg gcccatgggc tggggtctcc 60 tggctggaca gagcacacag agctggcccc taagtaggtc tcagccccag gcggccagct 120 tagggaagaa gtcaggagct cagggctgga aagagaatgg ctgcttctct cttccaatat 180 agggagcagg ctgggggcaa ggggcagtgt aggaggggca cagggggcca catttagcag 240 ccttccaggc cttccaccag cccagactgc ctctctcaga agccagcagg ggagggtggg 300 cttgcttcat gcccccagat ggccaagact gcctgttcct gaggtcgctg ttccatgacc 360 c 361 <210> 49 <211> 524 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Syn1AT intron <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Splicing donor sequence <220> <221> misc_feature <222> (15)..(40) <223> G-triple motif <220> <221> misc_feature <222> (468)..(489) <223> Branch sequence <220> <221> misc_feature <222> (490)..(524) <223> Splicing acceptor sequence <400> 49 gtaagtttct cgagggccgg gagcgatctg ggtcgagggg ggtgagcttt ccccttgcct 60 gcccctactg ggttttgtga cctccaaagg actcacagga atgacctcca acacctttga 120 gaagaccagg ccctctccct ggtagttaca gtcaaagacc tgtttggaag acgtcatttc 180 aagtgctctc cctcccaccc cacctcttgg ggtaaggcct ttcctaagct accccttggg 240 tccctagcct aagaaacaag ggggatgtca tccctggtgt aaagatgctg tgcaggaagt 300 cagcactcac gggatccagg ggacgctcca aggggaatcc ccagggcctg ccatccatcc 360 gggaagagag caaatgctac ccatgaggac ctcctcactc cctttttgct ctttcttcca 420 ctcagatcca ccccactcca cccccaccca aatcccagtg acctttgtac taacattgat 480 ttactgactg actatcttgg cgacgtcatt cttttccctt tcag 524 <210> 50 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Syn1PLA intron <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Splicing donor sequence <220> <221> misc_feature <222> (15)..(40) <223> G-triple motif <220> <221> misc_feature <222> (463)..(484) <223> Branch sequence <220> <221> misc_feature <222> (485)..(507) <223> Splicing acceptor sequence <400> 50 gtaagtttct cgagggccgg gagcgatctg ggtcgagggg tagttttttt aaattataag 60 aattattttt tctcccacaa tgtagtaaaa atacatatgc catggcttta tgtgcaattc 120 atttaatttt tgattcatga aacttccagt tgaaaatctt gtataagatt gaggaattct 180 tcaagaaata agtttaagtt tcctgtgaag attgtcaggg tgctggaatg aatgggcaga 240 gaaaataatg ggtgattttt caaatctaaa tgagtgcacc cacataatgg ccagtctaat 300 tgaaaaagag ccaatgtagc taattatgca aaggacggct aagctctttg cctggttctc 360 agtttgacta atttatatca tctctgttac ggtgtcatgc tcccctcact tgcaagttaa 420 aacagtgaaa tatctctttg aatatattcc gttctctcac catactaaca ttgatttact 480 gactgacgtc attcttttcc ctttcag 507 <210> 51 <211> 458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Syn1PT intron <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Splicing donor sequence <220> <221> misc_feature <222> (15)..(40) <223> G-triple motif <220> <221> misc_feature <222> (402)..(423) <223> Branch sequence <220> <221> misc_feature <222> (424)..(458) <223> Splicing acceptor sequence <400> 51 gtaagtttct cgagggccgg gagcgatctg ggtcgagggg gtgcttgcag gctggaacag 60 gctggaggac tggggtgtgg gcccatgggc tggggtctcc tggctggaca gagcacacag 120 agctggcccc taagtaggtc tcagccccag gcggccagct tagggaagaa gtcaggagct 180 cagggctgga aagagaatgg ctgcttctct cttccaatat agggagcagg ctgggggcaa 240 ggggcagtgt aggaggggca cagggggcca catttagcag ccttccaggc cttccaccag 300 cccagactgc ctctctcaga agccagcagg ggagggtggg cttgcttcat gcccccagat 360 ggccaagact gcctgttcct gaggtcgctg ttccatgacc ctactaacat tgatttactg 420 actgactatc ttggcgacgt cattcttttc cctttcag 458 <210> 52 <211> 464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Syn2AT intron <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Splicing donor sequence <220> <221> misc_feature <222> (442)..(464) <223> Splicing acceptor sequence <400> 52 gtaagtttct cgagggtgag ctttcccctt gcctgcccct actgggtttt gtgacctcca 60 aaggactcac aggaatgacc tccaacacct ttgagaagac caggccctct ccctggtagt 120 tacagtcaaa gacctgtttg gaagacgtca tttcaagtgc tctccctccc accccacctc 180 ttggggtaag gcctttccta agctacccct tgggtcccta gcctaagaaa caagggggat 240 gtcatccctg gtgtaaagat gctgtgcagg aagtcagcac tcacgggatc caggggacgc 300 tccaagggga atccccaggg cctgccatcc atccgggaag agagcaaatg ctacccatga 360 ggacctcctc actccctttt tgctctttct tccactcaga tccaccccac tccaccccca 420 cccaaatccc agtgaccttt ggacgtcatt cttttccctt tcag 464 <210> 53 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Syn2PLA intron <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Splicing donor sequence <220> <221> misc_feature <222> (437)..(459) <223> Splicing acceptor sequence <400> 53 gtaagtttct cgagtagttt ttttaaatta taagaattat tttttctccc acaatgtagt 60 aaaaatacat atgccatggc tttatgtgca attcatttaa tttttgattc atgaaacttc 120 cagttgaaaa tcttgtataa gattgaggaa ttcttcaaga aataagttta agtttcctgt 180 gaagattgtc agggtgctgg aatgaatggg cagagaaaat aatgggtgat ttttcaaatc 240 taaatgagtg cacccacata atggccagtc taattgaaaa agagccaatg tagctaatta 300 tgcaaaggac ggctaagctc tttgcctggt tctcagtttg actaatttat atcatctctg 360 ttacggtgtc atgctcccct cacttgcaag ttaaaacagt gaaatatctc tttgaatata 420 ttccgttctc tcaccagacg tcattctttt ccctttcag 459 <210> 54 <211> 398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Syn2PT intron <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Splicing donor sequence <220> <221> misc_feature <222> (376)..(398) <223> Splicing acceptor sequence <400> 54 gtaagtttct cgaggtgctt gcaggctgga acaggctgga ggactggggt gtgggcccat 60 gggctggggt ctcctggctg gacagagcac acagagctgg cccctaagta ggtctcagcc 120 ccaggcggcc agcttaggga agaagtcagg agctcagggc tggaaagaga atggctgctt 180 ctctcttcca atatagggag caggctgggg gcaaggggca gtgtaggagg ggcacagggg 240 gccacattta gcagccttcc aggccttcca ccagcccaga ctgcctctct cagaagccag 300 caggggaggg tgggcttgct tcatgccccc agatggccaa gactgcctgt tcctgaggtc 360 gctgttccat gacccgacgt cattcttttc cctttcag 398 <210> 55 <211> 2324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA intron <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Splicing donor sequence <220> <221> misc_feature <222> (2302)..(2324) <223> Splicing acceptor sequence <400> 55 gtaagtttct cgagctttcc ccttgcctgc ccctactggg ttttgtgacc tccaaaggac 60 tcacaggaat gacctccaac acctttgaga agaccaggcc ctctccctgg tagttacagt 120 caaagacctg tttggaagac gtcatttcaa gtgctctccc tcccacccca cctcttgggg 180 taaggccttt cctaagctac cccttgggtc cctagcctaa gaaacaaggg ggatgtcatc 240 cctggtgtaa agatgctgtg caggaagtca gcactcacgg gatccagggg acgctccaag 300 gggaatcccc agggcctgcc atccatccgg gaagagagca aatgctaccc atgaggacct 360 cctcactccc tttttgctct ttcttccact cagatccacc ccactccacc cccacccaaa 420 tcccagtgac ctttgactaa agggccaaaa ctgcttcctt ttctcacaat gagagttgtc 480 cctccctcaa tgccacacac actcccttct tcatctgagt tgtcacagga ggctagaaac 540 ggggtggtgg cacaactgtc ttggttttaa tttgtgcttc atagccctcc cagggtcctc 600 tcagcctcaa attgcatttc caaatgtagt ttgaaggaca gagtgggcaa ccgaaggcag 660 tggagatggg aagatgaatg gcagggtcct ctcctctctc tctctgcttc ttcagcctgc 720 cttccacatc tcccttggtg ccgctgcttc tctccggctt tgcacctctg ttcttgaaag 780 ggctgcagaa ctggactcag accacgcaag aaggcaagtc cccctcagct gccccagctt 840 ccagccagcc ccaggcttgc ccaacggacc acgtccgtga atctgcactg ggtgcctgtc 900 tttctctccc aggagaagat gggaagatcc agtacccaca cacagacccc cttgtgtaca 960 cgcaggaacc ataaaccagc tggaggcagc ccctgcccca ccctgtctta tctacaaaaa 1020 atattacaag agactttatc tcttgatttg cttcatcgag tgtcccaact acctcatttt 1080 tttaaaatgt gaaattagct tcatttacct tcattgaatc catgttggcg actattaaaa 1140 attccaggca ataaaaaggg atgagagcct gaactaaagc agtggcaata actggtgaaa 1200 gagtaaaaaa acagaactga ttgactctgg ggtgaactga ttgactctgg ggtttgacta 1260 aatgaggagg agagagggag gaatccaggg tgattctcag gtttctgtac gggattcact 1320 gagcccactc acaggagcag gcctgtgggg gagaattaat taccagttca gtttggtcct 1380 gtttccctga agaacttgta ggagttcctg gtggaactgt ccagcaaata gtcagtctgg 1440 agctcagtgg aagggttagg gctggagcta gagatgtagg aatcttcagc acacagatat 1500 tgccattgtt tttgtttgtt tgtttgtttg ttgttgctgt tttgagacac agtctcactt 1560 tgtcacccag gttggagtgc agtggcacaa tctcagctca ctgcaacctt cgcctcctgg 1620 gttcaagtga ttcttctgcc tcagcctccc tagtagcttg ggactacagg tgtgcgccac 1680 cacacccagc taatttttgt atttttagta gagacagggt ttcaccatgt tgtccaggct 1740 gatctcgaac acccaacctc aagtgatctg catgcctcag cctcccaaag tgctgggatt 1800 acaggcgtga gccaccgcac ccggccagat attgcctttg ctccatccat ttcttcttac 1860 ttctcttgtg ttgctgaaat ctctctgctg catctatcag agtccttccc caaacagttt 1920 ctgtagatgg ctccccctac caccctgact cttcactggg cactaaagcc gattttttag 1980 gcatgcacat tccatgtcac aaacaggaag cttctcattc ttttttctcc cagcgtgggg 2040 aattgagcac ataatactcc aaataaccat cagatgattc taattccaac atgaccacgt 2100 ccaggcaact gaactgtccc ctggcaagaa gtctaggact gaacctgtcc cgggcccctg 2160 tacttggttc aaaggattta gcctttctct tggccacacc aggtgggctg gaatcctctg 2220 ctttactggg gcaaccctgt ggtgggcagt ggggctaggg gttgcagcct agcttaactt 2280 gacgtcttga agggcgaatt cgacgtcatt cttttccctt tcag 2324 <210> 56 <211> 811 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated NAL intron <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Splicing donor sequence <220> <221> misc_feature <222> (789)..(811) <223> Splicing acceptor sequence <400> 56 gtaagtttct cgagctttcc ccttgcctgc ccctactggg ttttgtgacc tccaaaggac 60 tcacaggaat gacctccaac acctttgaga agaccaggcc ctcctgggtt caagtgattc 120 ttctgcctca ccctccctag tagcttggga ctacaggtgt gcgccaccac acccagctaa 180 tttttgtatt tttagtagag acagggtttc accatgttgt ccaggctgat ctcgaacacc 240 caacctcaag tgatctgcat gcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc 300 accgcacccg gccagatatt gcctttgctc catccatttc ttcttacttc tcttgtgttg 360 ctgaaatctc tctgctgcat ctatcagagt ccttccccaa acagtttctg tagatggctc 420 cccctaccac cctgactctt cactgggcac taaagccgat tttttaggca tgcacattcc 480 atgtcacaaa caggaagctt ctcattcttt tttctcccag cgtggggaat tgagcacata 540 atactccaaa taaccatcag atgattctaa ttccaacatg accacgtcca ggcaactgaa 600 ctgtcccctg gcaagaagtc taggactgaa cctgtcccgg gcccctgtac ttggttcaaa 660 ggatttagcc tttctcttgg ccacaccagg tgggctggaa tcctctgctt tactggggca 720 accctgtggt gggcagtggg gctaggggtt gcagcctagc ttaacttgac gtcttgaagg 780 gcgaattcga cgtcattctt ttccctttca g 811 <210> 57 <211> 640 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated NAS intron <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Splicing donor sequence <220> <221> misc_feature <222> (618)..(640) <223> Splicing acceptor sequence <400> 57 gtaagtttct cgagctttcc ccttgcctgc ccctactggg ttttgtgacc tccaaaggac 60 tcgaacaccc aacctcaagt gatctgcatg cctcagcctc ccaaagtgct gggattacag 120 gcgtgagcca ccgcacccgg ccagatattg cctttgctcc atccatttct tcttacttct 180 cttgtgttgc tgaaatctct ctgctgcatc tatcagagtc cttccccaaa cagtttctgt 240 agatggctcc ccctaccacc ctgactcttc actgggcact aaagccgatt ttttaggcat 300 gcacattcca tgtcacaaac aggaagcttc tcattctttt ttctcccagc gtggggaatt 360 gagcacataa tactccaaat aaccatcaga tgattctaat tccaacatga ccacgtccag 420 gcaactgaac tgtcccctgg caagaagtct aggactgaac ctgtcccggg cccctgtact 480 tggttcaaag gatttagcct ttctcttggc cacaccaggt gggctggaat cctctgcttt 540 actggggcaa ccctgtggtg ggcagtgggg ctaggggttg cagcctagct taacttgacg 600 tcttgaaggg cgaattcgac gtcattcttt tccctttcag 640 <210> 58 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT108lcr <400> 58 cgactcagat cccagccagt ggacttagcc cctgtttgct cctccgataa ctggggtgac 60 cttggttaat attcaccagc agcctccccc gttgcccctc tggatccact gcttaaatac 120 120 <210> 59 <211> 410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT7800lcr <400> 59 ggggatgtta gtgtgtgtat gcacatgtgt gcaaactgtt tgtcttcagc accctaagtg 60 ccttgtcctg ccctccctgg taaacctgag ggctccatcc caagagagca gggcacttct 120 ccaagtgtgt cctcagctcc ctgaatccca tccacacagc ttccagtacc tgagcctaag 180 tcgcttcaca gagtcttccc tatctgcttc ccacgtagcc ccgctggaga acagaggtag 240 agggaagagg gcagagaagt ccagaacaca cacgtcctca ttgtttgcta ggagggctga 300 tgttgaccca gcttgtgttt gcccttcttg cccaatgctc tctgaggggg agagccaaac 360 accaggtcct gagaaccagt ttaagtagaa tggaaatcat tgatttttca 410 <210> 60 <211> 569 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP3800lcr <400> 60 taaccaacca cccaatccaa caaacaaaaa atgaaaagaa tctcagaaac agtgagataa 60 gagaaggaat tttctcacaa cccacacgta tagctcaact gctctgaaga agtatatatc 120 taatatttaa cactaacatc atgctaataa tgataataat tactgtcatt ttttaatgtc 180 tataagtacc aggcatttag aagatattat tccatttata tatcaaaata aacttgaggg 240 gatagatcat tttcatgata tatgagaaaa attaaaaatc agattgaatt atttgcctgt 300 catacagcta ataattgacc ataagacaat tacatttaaa ttagtttgaa tctttctaat 360 accaaagttc agtttactgt tccatgttgc ttctgagtgg cttcacagac ttatgaaaaa 420 gtaaacggaa tcagaattac atcaatgcaa aagcattgct gtgaactctg tacttaggac 480 taaactttga gcaataacac atatagattg aggattgttt gctgttagta tacaaactct 540 ggttcaaagc tcctctttat tgcttgtct 569 <210> 61 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin E6lcr <400> 61 agctttctga acagccaaac agagattcca aagttcaggc accaaagttc agaccctaac 60 aattatttac aagggtcag 79 <210> 62 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFIX-5'UTR <400> 62 accactttca caatctgcta gcaaaggtt 29 <210> 63 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFIX-3'UTR <400> 63 tgaaagatgg atttccaagg ttaattcatt ggaattgaaa attaacaggg cctctcacta 60 actaatcact ttcccatctt ttgttagatt tgaatatata cattctatga tcattgcttt 120 tt 122

Claims

서열번호: 52로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
프로모터; 상기 프로모터에 작동가능하게 연결되고 이의 조절하에 있는 코딩 서열; 및 서열번호: 52로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 가지며 상기 코딩서열에 작동가능하게 연결된 인트론을 포함하는 발현 카세트.
제2항에 있어서, 서열번호: 44 및 45로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지며 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 인핸서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제2항에 있어서, 서열번호: 58 내지 61로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지며 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 유전자좌 제어영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제2항에 있어서, 상기 코딩 서열의 5' 및 3' 말단에, 서열번호: 62 및 63의 뉴클레오타이드 서열을 각각 가지며 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 비해독 영역을 각각 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제3항에 있어서, 서열번호: 58 내지 61로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지며 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 유전자좌 제어영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제6항에 있어서, 상기 코딩 서열의 5' 및 3' 말단에, 서열번호: 62 및 63의 뉴클레오타이드 서열을 각각 가지며 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 비해독 영역을 각각 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제3항에 있어서, 상기 코딩 서열의 5' 및 3' 말단에, 서열번호: 62 및 63의 뉴클레오타이드 서열을 각각 가지며 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 비해독 영역을 각각 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제4항에 있어서, 상기 코딩 서열의 5' 및 3' 말단에, 서열번호: 62 및 63의 뉴클레오타이드 서열을 각각 가지며 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 비해독 영역을 각각 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호: 41, 42 및 43으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코딩 서열이 알부민, α-페토단백질 (α-fetoprotein), α-글루코시다제 (α-glucosidase), α1-안티트립신 (α1-antitrypsin), 안티트롬빈 (antithrombin), 리포프로테인 (lipoproteins), 세룰로플라즈민 (ceruloplasmin), 혈액응고 제7인자 단백질, 혈액응고 제8인자 단백질, 혈액응고 제9인자 단백질, 에리트로포이에틴 (erythropoietin), 피브리노겐 (fibrinogen), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 합토글로빈 (haptoglobin), IGF-1, 인슐린, 플라즈미노겐 (plasminogen), 프로트롬빈 (prothrombin) 및 트랜스페린 (transferrin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 간 특이적 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제2항 내지 제9항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터.