CN102628041B

CN102628041B - 适于表达用于基因治疗的编码序列的表达载体

Info

Publication number: CN102628041B
Application number: CN 201210084499
Authority: CN
Inventors: 高垡经; 李圭铉; 李贤�; 尹成泰; 赵义哲
Original assignee: Mogam Biotechnology Research Institute
Current assignee: Mogam Biotechnology Research Institute
Priority date: 2008-02-14
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2028-02-14
Also published as: CN102628041A

Abstract

提供了用于基因治疗的表达载体，其含有转录调控元件的新组合，包括启动子、增强子、内含子、非翻译区(UTR)和基因座控制区(LCR)。所述表达载体能够持续表达肝组织特异性基因，因而能有效地用于治疗血栓形成、血友病、肝癌等等。

Description

适于表达用于基因治疗的编码序列的表达载体

本申请是申请号为200880126705.0的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/KR2008/000870的中国国家阶段申请。

技术领域

本发明涉及用于基因治疗的表达载体，更特别地涉及包含转录调控元件(顺式调控元件或者反式作用元件)新组合的用于基因治疗的表达载体，其包括启动子、增强子、内含子、非翻译区(UTR)和基因座控制区(locuscontrol region，LCR)，所述载体能够支持靶基因在肝中以高水平持续表达。

背景技术

肝的功能包括血液储存、糖转换和分泌多种细胞因子，以及表达影响许多疾病(如遗传的、心血管的、代谢的、血液的和癌性疾病)的基因。已将多种肝特异性疾病(如感染性肝炎)作为基因治疗的靶标进行了研究。

肝细胞在形成后拥有很长的寿命，具有大多数病毒基因转运蛋白的受体而且直接与血流相连，使其易于接触药物，因此肝被认为是基因治疗的重要候选器官。

血友病是一种由位于X染色体上的因子VIII(FVIII、f8)或因子IX(FIX、f9)基因的缺陷所引起的退行性出血疾病，依据突变或缺失的基因将其分成血友病A(FVIII缺陷)或B(FIX缺陷)。对用于治疗血友病A或B的药物，只有当FVIII或FIX以其正常血液浓度的1-5％(分别为100-200ng/ml和500ng/ml)或更高水平持续表达时，治疗效果才是可预期的。

在最近的血友病B基因治疗研究中，已报道的是，将带有人FIX(hFIX)基因的腺相关病毒(AAV)引入血友病B小鼠模型中导致hFIX蛋白以高达1,500-1,800ng/ml的水平表达(Snyder，R.O.，Nat.Med.，5：64-70(1999)；Manno，C.S.，Nat.Med.，12：342-347(2006))，而在血友病B的狗模型中以高达730ng/ml的水平表达hFIX蛋白(Arruda，V.R.，Blood，105：3458-3464(2005))。然而，当将这种在动物模型中高效表达的载体临床应用于人患者时，FIX的血液浓度仅为185ng/ml或更低，这低于有效临床治疗的阈值(500ng/ml)，另外的难题是在人受试者中的hFIX表达水平不是持续的而是瞬时的(Kay，M.A.，Nat.Genet.，24：257-261(2000)；Manno，C.S.，Nat.Med.，12：342-347(2006))。在血友病A的治疗模型中发现了与上述相似的趋势。

针对遗传疾病(如血友病)治疗的临床试验结果表明，首要条件是开发能够保持在特定组织(如肝组织)中持续高水平表达治疗基因的高效组织特异性表达载体。此外，逃脱针对载体的体液及细胞免疫应答以及诱导对所表达蛋白的免疫耐受被认为是成功的基因治疗的关键因素。例如，为了将正常FVIII或FIX的表达水平提高到有效用于成功的临床治疗的阈值，还必须考虑的是，注射高剂量的带有FVIII或FIX基因的病毒并且抑制体内的免疫应答。然而为使这种方法获得成功，首先要通过改进表达载体来提高基因表达的效率。

仅在肝中产生的脂蛋白(a)是用于肝组织特异性表达载体开发的另一个重要靶标。脂蛋白(a)是通过载脂蛋白(a)(一种糖蛋白)与apo B-100(低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白质组分)结合而形成的(Fless，G.M.，J.Biol.Chem.，261：8712-8717(1986))。载脂蛋白(a)负责胆固醇的体内转运，已报道血浆中脂蛋白(a)浓度的提高是动脉硬化和心脏病的主要风险因子(Armstrong，V.W.等，Arteriosclerosis，62：249-257(1986)；Assmann，G.，Am.J.Cardiol.，77：1179-1184(1996))。载脂蛋白(a)含有与纤维蛋白溶酶原kringle IV和V相似的两类kringle结构域，以及无活性的蛋白酶样结构域。众所周知的是，具有kringle结构的蛋白质可抑制肿瘤的新血管形成及转移(Folkman J.，N Eng J Med，285：1182-1186(1971)；Falkman J，Klagsbrun M.，Science，235：442-447(1987)；Scapaticci FA.，J Clin Oncol.，20：3906-3927(2002))。最近，本发明人及其他研究者发现，载脂蛋白(a)的kringle结构域由于其显著的抗血管发生活性而具有抗癌和抗转移活性(Sculter V等，ArteriosclerThromb Vasc Biol，21：433-438(2001)；Trieu UN和Uckun FM.，Biochem Biophys Res Commun.，257：714-718(1999)；Kim JS等，J.BiolChem.，278：29000-29008(2003)；Yu HK等，Cancer Res.，64：7092-7098(2004)；Kim JS等，Biochem Biophys Res Commun.，313：534-540(2004)；Lee K等，Hepatology，43：1063-1073(2006))。

在抗转移和抗癌治疗中，公认的是，选择性作用在患病位点上的治疗方式会更有效。因此，开发用于抗癌治疗(例如用于对肝癌或者转移肝肿瘤的有效基因治疗)的能组织特异性地持续进行基因表达的载体非常重要。

如上所述，持续的组织特异性基因表达是有效基因治疗的关键，这需要开发新的改良表达载体。这可通过改进这种表达载体的转录调控元件(顺式调控元件或反式作用元件)来实现。

常用转录调控元件的实例包括启动子、增强子、内含子、非编码区、基因座控制区等等。

在这种肝组织特异性表达的表达载体中所使用的是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK，为糖原异生酶)(Yang，Y.W.，J.等，Gene Med.，5(5)：417-424(2003))、α1-抗胰蛋白酶、白蛋白、FVII、有机阴离子转运多肽C(OATP-C)、乙型肝炎病毒核心蛋白(Kramer，M.G.，等，Mol.Ther.，7(3)：375-385(2003))和甲状腺素结合球蛋白(Wang，L.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，96：3906-3910(1999))的启动子；以及白蛋白(Kang，Y.，等，Blood，106(5)：1552-1558(2005))、苯丙氨酸羟化酶(PAH)和α1-微球蛋白/尿抑胰酶素(bikunin)前体(AMBP)(Wang，L.，等.，Mol.Ther.，1(2)：154-158(2000))的增强子。

由于与肝中所富含的HNF-4(肝细胞核因子-4)结合，FVII启动子(大小约为500bp)在肝中的转录活化水平是其他组织中的10倍或更高。已报道的是，大多数转录因子主要结合在FVII启动子3’端的300bp片段上(Greenberg，D.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：12347-12351(1995))。当截短FVII启动子(大小为501bp)5’端的315bp片段时，启动子的肝特异性活性提高约30％，但当截短210bp片段时活性降低大约20-30％(Pollak，W.S.，等，J.Biol.Chem.，271(3)：1738-1747(1996))。

由于与肝中所富含的HNF-1α结合，有机阴离子转运多肽C(OATP-C)的启动子(大小约为900bp)在肝中的转录活化水平是其他组织中的3倍或更高。已报道的是，大多数转录因子结合在启动子3’端的440bp片段上(Jung，D.，等，J.Biol.Chem.，276：37206-37214(2001))。

可通过增强子的作用增强启动子的活性。苯丙氨酸羟化酶(PAH)增强子(大小约为230bp，并具有HNF-1结合位点)位于PAH基因5’端上游-3.5kb。已报道的是，由于存在肝富含的HNF-1的结合位点，PAH增强子使其所结合的启动子的活性提高为4倍或更高(Lei，X.D.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，95：1500-1504(1998))。

AMBP(α1-微球蛋白/尿抑胰酶素前体)增强子大小约为400bp，其从AMBP基因5’端的-2945bp延伸到-2539bp。它主要包括HNF-1、2、3和4的结合位点，它的主要活性区域对应于其-2802到-2659bp的片段(Route，P.，等，Biochem.J.，334：577-584(1998))。已报道的是，AMBP增强子一般使启动子活性提高为两倍或三倍。

位于基因5’和3’端的非翻译区(UTR)负责基因mRNA的结构稳定(Holcik，M.，Liebhaber S.A.，Proc Natl Acad Sci USA.，94：2410-2414(1997)；Chkheidze，A.N.，等，Mol Cell Biol.，19：4572-4581(1999))。已报道的是，3’UTR中的多腺苷酸化信号序列也明显有助于mRNA的结构稳定(Kolev，N.G.，等，Genes Dev.，19：2583-2592(2005))。

真核基因包括外显子(被翻译成蛋白质)和内含子(在外显子之间的非翻译序列)。通过剪接去除这些内含子，使由DNA首先转录得到的mRNA前体转变为成熟的mRNA。这些内含子包括以GT(U)开始的剪接供体和以AG结尾的剪接受体。此外，出现在内含子3’端的是多聚嘧啶片段、剪接因子、snRNP结合分支序列、三鸟嘌呤重复序列(3重G基序)等，它们在形成剪接体(RNA与内含子剪接酶的复合物)的过程中起关键作用(Pagani，F.，等，Nat.Rev.Genet.，5：389-396(2004))。

当与启动子和增强子组合时，内含子可作为用于持续高效基因表达的转录调控元件。内含子通过与转录因子结合而参与提高基因表达效率和转录效率(Liu，K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：7724-7728(1995)；LeBlanc，S.E.，等，J.Biol.Chem.，(2005))，还参与提高转录后的蛋白质翻译效率(Moore，M.J.，Cell，108：431-434(2002))。已报道的是，hFIX的内含子1引起hFIX蛋白表达的增加(Kurachi，S.，等，J.Biol.Chem.，270：5276-5281(1995)).

抗凝血蛋白(如抗凝血酶和纤维蛋白溶酶原)和凝血因子(如凝血酶原)都在肝中表达。通过分析这些蛋白为缺陷型的血栓形成或血友病患者的基因内含子，发现了多种错义突变和/或无义突变，这提示这些蛋白质的内含子对肝中的基因表达起关键作用(Jochmans，K.，等，Blood，84：3742-3748(1994))。

已发现在至少36种哺乳动物(包括人、大鼠、兔、山羊等等)中存在基因座控制区(LCR)。LCR是含有DNase I敏感区(其对转录因子具有组织特异性)的核苷酸序列。人β-珠蛋白LCR的功能是众所周知的(Harju S.等，Exp.Biol.Med.227：683-700(2002))。

肝细胞控制区(hepatocyte control region，HCR)因其增强肝特异性基因表达的能力而众所周知，该区发现于载脂蛋白E(ApoE)基因的下游。HCR具有与肝特异性转录因子结合的DNase I敏感区域。HCR作为ApoE基因的肝特异性表达的LCR。ApoE HCR具有在与多种因子(如HNF3α、HNF4、GATA-1、C/EBP、TF-LF2和Alu家族)结合时被活化的位点。在这些位点中，表现出DNase I超敏感性的HNF3α结合位点具有TGTTTGC基序，DNase I可切开第一个G和第二个T之间的连接(Dang Q.，等，J.Biol.Chem.270：22577-22585(1995))。事实上，已报道了向表达载体中引入ApoE HCR导致动物模型中hFIX表达提高(Miao C.H.，等.，Mol.Ther.1：522-532(2000))。

已报道了具有与人ApoE基因的HCR(包含TGTTTGC基序)、人的载脂蛋白A-I、载脂蛋白B、转铁蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶等、以及小鼠中的甲胎蛋白、白蛋白等相似的序列的蛋白(Dang Q.，等.，J.Biol.Chem.270：22577-22585(1995))。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供可用作转录调控元件的多核苷酸，所述转录调控元件用于以高水平持续表达肝组织特异性基因。

本发明的另一目的是提供用于以高水平持续表达肝组织特异性基因的表达载体。

根据本发明的一个方面，提供具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸。

根据本发明的另一方面，提供多核苷酸，其包含：具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸以及与SEQ ID NO：42之多核苷酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ ID NO：44和45之核苷酸序列的多核苷酸。

根据本发明的另一方面，提供多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸。

根据本发明的另一方面，提供多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸。

根据本发明的另一方面，提供表达载体，其包含转录调控元件和与所述转录调控元件有效连接并受其控制的编码序列，其中所述转录调控元件包括：

1)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸；

2)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸以及与SEQ ID NO：42之多核苷酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ IDNO：44和45之核苷酸序列的多核苷酸；

3)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸以及与SEQ ID NO：42之多核苷酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ IDNO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸；

4)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸以及与SEQ ID NO：42之多核苷酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ IDNO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸；

5)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO：44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接；

6)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO：44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接；

7)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接；或者

8)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO：44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；选自具有SEQ ID NO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接。

根据本发明的另一方面，提供表达载体，其包含转录调控元件和与所述转录调控元件有效连接并受其控制的编码序列，所述转录调控元件包含启动子和与所述启动子有效连接的多核苷酸，所述多核苷酸选自：选自具有SEQ ID NO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；选自具有SEQ ID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及与选自具有SEQ ID NO：58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷酸有效连接的选自具有SEQ ID NO：46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷酸。

附图说明

通过对本发明的下述描述结合下述附图，本发明上述的和其他的目的和特征将变得显而易见，所述附图分别显示：

图1A：包含FVII启动子的pCR-FVII Pro质粒、包含有机阴离子转运多肽C(OATP-C)启动子的pCR-OATP-C Pro质粒和包含α-抗胰蛋白酶(AAT)启动子/增强子的pCR-AAT Enh/Pro质粒的示意图；

图1B：mRLuc萤光素酶表达载体pmRL-FVII Pro、pmRL-FVIIΔPro和pmRL-OATP-C Pro的示意图，其分别含有FVII启动子、截短的FVII(FVIIΔ)启动子和OATP-C启动子；

图2A：直方图，其显示FVII启动子和OATP-C启动子在人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)、人肝细胞癌细胞系(Huh-7)、人肾细胞系(HEK293)、人肺腺癌上皮细胞系(A549)和人宫颈癌细胞系(HeLa)中的表达效率；

图2B：含有FVII启动子和FVIIΔ启动子的萤光素酶表达盒的示意图，以及比较所述启动子表达效率的直方图；

图2C：直方图，其通过与CMV启动子比较的方式显示FVIIΔ启动子、OATP-C启动子、乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcP)启动子、内皮糖蛋白(Endoglin)启动子、细胞粘附分子(ICAM2)启动子和酪氨酸激酶受体(Tie2)启动子的表达效率；

图3A：pCR-PAH enh和pCR-AMBP enh质粒的示意图，其分别含有苯丙氨酸羟化酶(PAH)增强子和α1-微球蛋白/尿抑胰酶素前体(AMBP)增强子；

图3B：pmRL-PF、pmRL-AF、pmRL-PAF、pmRL-PO、pmRL-AO和pmRL-PAO表达载体的示意图，其通过向含有FVIIΔ启动子的pmRL-FVIIΔPro表达载体或者含有OATP-C启动子的pmRL-OATP-CPro表达载体中插入选自PAH增强子和AMBP增强子中的至少一种构建而成；

图4A：直方图，其显示根据PAH增强子和AMBP增强子与FVIIΔ、OATP-C、Tie-2和ICAM2启动子组合方式的不同，在A549、HeLa和Huh-7中的体外萤光素酶表达水平；

图4B：直方图，其通过与CMV启动子比较的方式显示当AMBP增强子与FVII启动子组合时在HEK293、A549、HeLa、Huh-7、人肝癌细胞系(Hep3B)和HUVEC中萤光素酶表达效率；

图4C：直方图，其显示在将每种表达载体与聚乙烯亚胺(PEI)或体内jetPEI的混合物注射入小鼠尾静脉之后，带有表达盒的表达载体在肝组织中的萤光素酶表达效率，所述表达盒含有PAH增强子、AMBP增强子、CMV增强子和SV40增强子以及图4A中显示的启动子；

图5：不含有UTR的hFIX表达质粒(FIX)和含有UTR的hFIX表达质粒(FIXUTR)((a))以及含有多种内含子的FIXUTR质粒((b)、(c)和(d))的示意图(SD，剪接供体；SA，剪接受体；(G)₃，三鸟嘌呤基序；BS，分支序列)；

图6A：ELISA结果，其显示从小鼠中获得的血浆样品中的hFIX蛋白表达水平，所述小鼠通过尾静脉注射了带有CMV-hFIXUTR-Syn1int、CMV-hFIXUTR-Syn2int、CMV-hFIX和CMV-hFIXUTR表达盒的表达载体；

图6B：ELISA结果，其显示在每周从免疫缺陷型小鼠获得的血浆样品中的hFIX蛋白表达水平，所述小鼠中注射了带有CMV-hFIXUTR-Synlint表达盒的重组腺相关病毒的1×10⁹个感染性颗粒(IP)；

图7A：萤光素酶表达盒的示意图，所述表达盒在受TK启动子控制的RLuc萤光素酶基因中含有内含子；

图7B：直方图，其显示在用带有表达盒(其含有图7A中多种内含子)的表达载体转染的Hep3B、HEK293和A549细胞中的萤光素酶表达水平；

图8A：逆转录PCR(RT-PCR)结果，其显示在总RNA(从用图7B表达载体转染的A549细胞中提取)中RLuc和β-肌动蛋白的mRNA表达水平；

图8B：直方图，其显示用β-肌动蛋白对图8A中所获得的RLuc和β-肌动蛋白mRNA条带强度进行归一化的RLuc mRNA表达水平；

图9A：ELISA结果，其显示从小鼠中获得的血浆样品中的hFIX蛋白表达水平，所述小鼠通过尾静脉注射了带有CMV-hFIXUTR-Syn1AT、CMV-hFIXUTR-Syn2AT、CMV-hFIXUTR-NA、CMV-hFIXUTR-ΔNAL、CMV-hFIXUTR-ΔNAS表达盒以及作为对照带有CMV-hFIXUTR-0.3kbFIXint(CMV-hFIXm2)表达盒(含0.3kb FIX内含子)的表达载体；

图9B：Western印迹分析结果，其显示在用带有CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR和CMV-hFIXUTR-ΔNAL表达盒的表达载体转染的HEK293T中的hFIX蛋白表达水平；

图10：示意图，其显示甲胎蛋白、AAT和白蛋白基因的5’端侧翼区中，与在Apo E基因的LCR中所发现TGTTTGC基序相同或相似的基序的分布；

图11A：pCR-HCR和pCR-HCRm质粒(分别含有HCR(已知为Apo E基因的肝细胞控制区)和HCRm(已知为截短TGTTTGC基序的最小HCR结构))以及pCR-AAT7800lcr/pCR-AAT108lcr、pCR-AFP3800lcr和pCR-E6lcr质粒(分别含有甲胎蛋白、AAT和白蛋白的TGTTTGC基序)的示意图；

图11B：pBS-HCRm-AATenh/pro(HmA)质粒(通过向pBluescriptII载体中插入HCRm、AAT增强子和AAT启动子构建而成)和pBS-HCR-AATpro(HA)质粒(通过向pBluescript II载体中插入HCR和AAT启动子构建而成)的示意图；

图12A：表达盒的示意图，其通过向含有PAH增强子、FVIIΔ启动子和内含子Syn1PLA的hFIX表达盒中引入多种LCR(HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108和E6)而获得；

图12B：ELISA结果，其显示从小鼠中获得的血浆样品中hFIX蛋白表达水平，所述小鼠通过尾静脉注射了带有图12A表达盒的表达载体和CMV-hFIXUTR-Syn1PLA表达载体；

图13A：示意图，其显示含有PAH增强子与FVIIΔ启动子(PF)的组合或者PAH增强子、AMBP增强子与FVIIΔ启动子(PAF)的组合、NAL内含子以及AAT108LCR的表达盒；HmA(HCRm-AATenh/pro)-hFIXUTR-ΔNAL表达盒；以及HA(HCR-AATpro)-hFIXUTR-1.4kbFIXint表达盒；

图13B：ELISA结果，其显示从小鼠中获得的血浆样品中hFIX蛋白表达水平，所述小鼠通过尾静脉注射了带有图13A表达盒的表达载体以及CMV-hFIXUTR-ΔNAL表达载体；

图13C和13D：使用图13B中获得的血浆样品，通过活化部分凝血活酶时间(activated partialthromboplastin time，APTT)方法所测得的凝血时间和活性；

图14A和14B：分别显示从血友病B小鼠中获得的血浆样品中的hFIX蛋白表达水平(通过ELISA测量)和凝血活性(通过APTT方法测量)的结果，所述小鼠通过门静脉施用了带有AAT108-PF-hFIXUTR-ΔNAL和AAT108-PAF-hFIXUTR-ΔNAL表达盒以及作为对照带有普通HA-hFIXUTR-1.4kbFIXint和CMV-hFIXUTR-1.4kbFIXint表达盒的重组腺相关病毒的2×10⁹个传染性颗粒(IP)；

图15A：表达载体的示意图，其通过向PF-LK68-ΔNAL-UTR表达盒中引入多种LCR(HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108和E6)构建而成；

图15B：AAT108-PF/PAF-LK68表达载体、AAT108-PF/PAF-LK68-UTR表达载体和AAT108-PF/PAF-LK68-ΔNAL-UTR表达载体的示意图；

图16A：显示从小鼠中获得的血浆样品中LK68蛋白表达水平的ELISA结果，所述小鼠通过尾静脉注射了带有引入多种LCR(HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108和E6)的PF-LK68-ΔNAL-UTR表达盒的表达载体；

图16B：显示从小鼠中获得的血浆样品中LK68蛋白表达水平的ELISA结果，所述小鼠通过尾静脉注射了带有已引入UTR或UTR和内含子ΔNAL的AAT108-PF/PAF-LK68表达盒的表达载体；

图17A：在HEK293细胞及其培养基中LK68蛋白表达水平的Western印迹分析结果，所述细胞用带有CMV-LK68和CMV-LK68-ΔNAL-UTR表达盒的复制缺陷型腺病毒以不同的感染复数比率(MOI)进行了转染；以及

图17B：从图17A的Western印迹分析结果中获得的条带强度的直方图，以显示UTR和内含子对基因表达的影响。

具体实施方式

除非另行定义，否则本文中所用的科技术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同意义。此外，本文中所提到的所有文件均通过参考以其整体并入本文。

本文中所用的术语“表达载体”旨在理解为集合体(表达盒或构建体)或包含该集合体的载体，所述集合体包含编码序列、启动子，并任选地包含与编码序列有效连接的一个或多个转录调控元件。

本文中所用的术语“编码序列”指编码氨基酸或者功能性RNA的DNA序列。

本文中所用的术语“转录调控元件(顺式调节元件或顺式作用元件)”指位于编码序列上游、内部或下游的核苷酸序列，其控制RNA转录，以及所转录RNA的加工、稳定性和随后的翻译。转录调控元件包括启动子、增强子、内含子、5’和3’非翻译区(UTR)和基因座控制区(LCR)。

本文中所用的术语“启动子”和“增强子”是将编码序列转录成RNA所需的DNA序列代表片段。通常，启动子是指与聚合酶和转录因子结合的DNA区段，增强子是指与聚合酶活化结构域结合的DNA区段。

本文中所用的术语“非翻译区(UTR)”是位于编码序列3’端和5’端的序列，其包含作为转录终止区的多腺嘌呤化信号等。

本文中所用的术语“内含子”是位于外显子(转录后被翻译为蛋白质)之间的非翻译核苷酸序列。在通过剪接移除内含子后，转录的mRNA前体转变为成熟mRNA。本文中所用的术语“内含子”也旨在理解为剪接供体、剪接受体、三鸟嘌呤重复序列(三重G基序)和/或分支序列。

本文中所用的术语“基因座控制区(LCR)”指具有DNase I敏感性位点的核苷酸序列。组织特异性的转录因子结合于LCR。

本文中所用的术语“有效连接”指一个或多个核酸序列与单个核酸片段偶联，以影响所述单个片段的功能。例如，启动子与编码序列有效连接以增强所述编码序列的表达。

在下文中对本发明进行详细描述。

如前所述，对有效的基因疗法，应当在特定组织或细胞中以持续方式特异性表达靶标基因，以使靶标基因替代致病基因。为实现组织特异性持续基因表达，需要包含改进的转录调控元件的表达载体。

因此，本发明提供截短的FVII(FVIIΔ)启动子，其具有如SEQ IDNO：42所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列通过从SEQ ID NO：41之核苷酸序列中缺失XhoI(5’端)和BamHI(3’端)限制性位点而截去504bp FVII启动子的5’端上游207bp片段而产生。下述实施例显示所述FVIIΔ启动子具有的活性是未截短FVII启动子的2.5倍或更高。

FVIIΔ启动子可与合适的增强子(例如选自具有如前所述SEQ IDNO：44中核苷酸序列的PAH增强子和具有如前所述SEQ ID NO：45中核苷酸序列的AMBP增强子中的至少一种)组合。

本发明也提供内含子，其选自具有如前所述SEQ ID NO：46到57中核苷酸序列的多核苷酸。

SEQ ID NO：46、47和48的内含子分别由截短人抗凝血酶、纤维蛋白溶酶原和凝血酶原的内含子1而产生。SEQ ID NO：49、50和51的内含子是合成的内含子，其分别包含SEQ ID NO：46、47和48之核苷酸序列，并共有剪接受体序列、来源于人α-珠蛋白内含子2的三鸟嘌呤重复序列(三重G基序)、人纤维蛋白溶酶原的分支序列以及共有的剪接受体序列。SEQ ID NO：52、53和54的内含子是合成的内含子，其分别缺少SEQ ID NO：49、50和51之核苷酸序列的三重G基序和分支序列。SEQ ID NO：55的内含子是合成内含子，其包含抗凝血酶的全长内含子1、剪接供体序列和共有的剪接受体序列；SEQ ID NO：56和57的内含子是合成的内含子，其由截短SEQ ID NO：55之核苷酸序列而产生。在上述内含子中，更优选SEQ ID NO：57的内含子。

本发明还提供基因座控制区(LCR)，其选自具有如SEQ ID NO：58到61所示核苷酸序列的多核苷酸。

SEQ ID NO：58、59、60和61的LCR分别位于人α1-抗胰蛋白酶基因上游-108bp和-7.8kb处、人甲胎蛋白上游-3.8kb处和人白蛋白基因上游-6kb处，其中优选SEQ ID NO：58的LCR。

与本发明中所提到的序列基本相同且功能相似的多核苷酸也在本发明的范围之内。术语“基本相同且功能相似的多核苷酸”指某一多核苷酸与另一多核苷酸至少有70％、优选80％、更优选90％、最优选95％的同一性，其中所述同一性由计算机算法或软件所确定。

本发明还提供表达载体，其包含转录调控元件和与所述转录调控元件有效连接并受其控制的编码序列，其中所述转录调控元件包括：

1)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸；

本发明还提供表达载体，其包含转录调控元件和与所述转录调控元件有效连接并受其调控的编码序列，所述转录调控元件包含启动子和与所述启动子有效连接的多核苷酸，所述多核苷酸选自：选自具有SEQ IDNO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；选自具有SEQ ID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及与选自具有SEQ ID NO：58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷酸有效连接的选自具有SEQ ID NO：46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷酸。

优选地，表达载体还可包含在编码序列5’和3’端具有SEQ ID NO：62和63之核苷酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO：62和63的核苷酸序列可来自FIX基因的5’和3’UTR。

编码序列可选自编码肝特异性蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包括但不限于白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血浆铜蓝蛋白、FVII、FVIII、FIX、红细胞生成素、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、触珠蛋白、IGF-1、胰岛素、纤维蛋白溶酶原、凝血酶原和转铁蛋白。

编码序列与启动子、增强子、内含子、UTR和LCR有效且可控地连接。

如上所述，本发明转录调控元件的适当组合能够实现靶标编码序列的肝组织特异性表达，并有助于mRNA稳定，因此使编码序列的表达被提高。包含上述转录调控元件的各种组合的表达盒或载体能够使靶标编码序列在肝组织中以高水平持续表达，因此可广泛应用于血栓形成、血友病、肝癌等的治疗。

下述实施例旨在举例说明本发明而不限制其范围。

实施例1：肝组织特异性表达启动子和增强子的分离和活性分析

<步骤1>肝组织特异性表达启动子的分离和活性分析

使用DNeasy Tissue Kit(Qiagen)从人肝细胞系(Chang细胞)的细胞裂解物中提取基因组DNA。为了分离FVII启动子，使用作为模板的基因组DNA、SEQ ID NO：1和2的引物组和DNA聚合酶(Ex-Taq、Takara)进行PCR，以获得具有SEQ ID NO：41之核苷酸序列的DNA片段。具体地，PCR按照如下条件进行：首先在94℃变性5分钟；94℃变性30秒、56℃退火30秒和72℃延伸1分钟的30个循环；72℃最终延伸3分钟。将PCR产物通过凝胶提取进行纯化，并插入到pCR2.1-TOPO质粒载体中。具有SEQ ID NO：41之核苷酸序列的FVII启动子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。含有FVII启动子的质粒命名为“pCR-FVII pro”。此外，如前文所述进行PCR(但使用OATP-C启动子的引物组(SEQ ID NO：3和4)和AAT启动子的引物组(SEQ ID NO：5和6)之外，将PCR产物插入到pCR2.1-TOPO质粒载体中。OATP-C启动子(具有SEQ ID NO：43之核苷酸序列)和AAT启动子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。含有OATP-C启动子和AAT启动子的质粒分别命名为“pCR-OATP-C pro”和“pCR-AAT enh/pro”。pCR-FVII pro、pCR-OATP-C pro和pCR-AATenh/pro的示意图显示于图1A中。

将表达Renilla萤光素酶的phRL-null载体(Promega)中的SV40晚期poly(A)替换成人生长激素的poly(A)，并且从其中去除T7启动子和内含子，以构建pmRL-null载体。将所述pmRL-null载体用限制性酶BglII进行消化并用虾碱性磷酸酶进行处理。

用BamHI消化pCR-FVII pro和pCR-OATP-C pro质粒。所得到的DNA片段通过凝胶提取进行纯化，并插入到预先制备好的pmRL-null载体中。通过限制性酶切图谱在每个质粒载体中鉴定所需DNA片段。所述质粒载体命名为“pmRL-FVII Pro”和“pmRL-OATP-C Pro”。

同时，用EcoRI限制性酶截掉pmRL-FVII Pro中FVII启动子5’端约200bp的片段，然后通过连接来构建带有截短FVII(FVIIΔ)启动子(具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列)的pmRL-FVIIΔPro质粒。

pmRL-FVII Pro、pmRL-OATP-C Pro和pmRL-FVIIΔPro的示意图显示于图1B中。

在人肝细胞系(Huh-7、HepG2、Hep3B)、肾细胞系(HEK293)、肺癌细胞系(A549)和宫颈癌细胞系(HeLa)中测量pmRL-FVII Pro、pmRL-FVIIΔPro和pmRL-OATP-C Pro的萤光素酶表达水平。具体地，用聚乙烯亚胺(PEI)试剂(Polyplus，Illkirch，France)在六孔板的每一个孔中培养细胞，以达到70到80％的汇合。将培养的细胞用2μg的pmRL-FVII Pro、pmRL-FVIIΔPro和pmRL-OATP-C Pro质粒中每一种和pcDNA-lacZ质粒1μg进行转染，并于37℃培养24小时。对细胞进行收集，并以3,000rpm离心5分钟以分离细胞和培养基。在100μl裂解缓冲液(25mM Tris-磷酸、pH 7.8、2mM DTT(二硫苏糖醇)、2mM 1，2-二氨基环己烷N，N，N，N′-四乙酸、10％甘油、1％

X-100)中重悬细胞，然后冻融(3次)以完全裂解细胞。细胞裂解物以10,000rpm离心1分钟。对所得上清液进行半乳糖苷酶测定和Bradford测定，以使转染效率归一化，启动子活性通过萤光素酶活性分析进行测定。结果显示于图2A中。

如图2A中所示，FVII启动子和OATP-C启动子在肝细胞系Huh-7中诱导更高水平的萤光素酶表达。

在Huh-7细胞中，FVIIΔ启动子表现出的活性为FVII启动子的2.5倍(见图2B)。

在Huh-7细胞中，FVIIΔ启动子表现出的表达效率为CMV启动子的1.4％，在来源于肝组织之外的其他组织的细胞系中平均为CMV启动子表达效率的0.07％。然而，与CMV启动子不同，FVIIΔ启动子对肝组织的特异性是其他组织的20倍(见图2C)。这一结果显示，FVIIΔ启动子提高靶标基因的表达效率而对肝组织特异性无不利影响，因此其适用于在肝组织中选择性作用的表达载体。在图2C，(-)代表阴性对照(缺少启动子)，ICAM2代表细胞内粘附分子的启动子，Tie2代表酪氨酸激酶受体的启动子，内皮糖蛋白代表内皮糖蛋白的启动子，HBcP代表乙型肝炎核心蛋白启动子。

<步骤2>分离增强子

为了分离PAH增强子，如<步骤1>所述进行PCR，但使用PAH增强子的引物组(SEQ ID NO：7和8)。将PCR产物通过凝胶提取进行纯化，并插入到pCR2.1-TOPO质粒载体中。具有SEQ ID NO：44之核苷酸序列的PAH增强子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒命名为“pCR-PAHenh”。此外，重复上述步骤，但使用AMBP增强子的引物组(SEQ ID NO：9和10)，以构建带有AMBP增强子(具有SEQ ID NO：45之核苷酸序列)的pCR-AMBPenh质粒。pCR-PAHenh和pCR-AMBPenh质粒的示意图显示于图3A中。

将PAH和AMBP增强子通过用SpeI和XbaI消化pCR-PAHenh和pCR-AMBPenh质粒加以分离，通过凝胶提取进行纯化，并插入到<步骤1>中所制备的pmRL-FVIIΔPro和pmRL-OATP-C Pro载体的SpeI位点。与PAH增强子组合的pmRL-FVIIΔPro和pmRL-OATP-C Pro分别命名为“pmRL-PF”和“pmRL-PO”。与AMBP增强子组合的pmRL-FVIIΔPro和pmRL-OATP-C Pro分别命名为“pmRL-AF”和“pmRL-AO”。使用SpeI和XbaI从pmRL-PF中提取PAH增强子，并将其插入到pmRL-AF和pmRL-AO的SpeI位点。所得的载体命名为“pmRL-PAF”和“pmRL-PAO”。pmRL-PF、pmRL-PO、pmRL-AF、pmRL-AO、pmRL-PAF和pmRL-PAO载体的示意图显示于图3B中。

根据上述步骤，向OATP-C和FVlI启动子的上游插入能以非组织特异性的方式增强启动子活性的CMV和SV40增强子。<步骤3>根据启动子与增强子的组合分析靶标基因的表达效率

<3-1>体外测试

在人肝细胞系(Huh-7)和对照细胞系(即人肺细胞系(A549)和人宫颈癌细胞系(HeLa))中，以与<步骤1>中相同的方式测量<步骤2>中所构建的载体的基因表达效率。结果显示于图4A中。

如图4A中所示，带有PAH增强子和FVIIΔ启动子的载体在肝细胞系Huh-7中的特异性平均为其他细胞系的28.4倍。这显示PAH增强子使FVIIΔ启动子的组织特异性提高了1.42倍。AMBP增强子使FVIIΔ启动子的组织特异性提高了213.7倍或更多，这大约是由AMBP增强子引起的OATP-C启动子组织特异性提高(65.6倍)的3倍。上述结果显示，增强子可显著提高FVIIΔ启动子的肝选择性。

为了测量AMBP增强子和FVIIΔ启动子控制下的表达载体相对于CMV启动子控制下的表达载体的活性，在人肝细胞系(Huh-7、Hep3B)和对照细胞系(即肾细胞系(HEK293)、肺癌细胞系(A549)、宫颈癌细胞系(HeLa)和血管内皮细胞系(HUVEC))中测量了萤光素酶的表达水平。结果显示于图4B中。

如图4B中所示，在肝细胞系中，含有AMBP增强子和FVIIΔ启动子的表达载体表现出的萤光素酶表达效率为含有CMV启动子的表达载体的8.7％；在其他细胞系中，其平均为含有CMV启动子的表达载体的萤光素酶表达效率的0.14％。这显示含有AMBP增强子和FVIIΔ启动子的表达载体的肝组织特异性约为其他组织的62倍高。

<3-2>体内测试

为了测量在肝中的体内基因表达效率，向小鼠尾静脉中注射<步骤2>的pmRL质粒与聚乙烯亚胺(PEI)(Polyplus，Illkirch，France)或体内jetPEI(Polyplus，Illkirch，France)的每种复合物。两天后，从所述小鼠中取出肝，并测量萤光素酶表达水平。

具体而言，在5％葡萄糖溶液中将40μg的pmRL-PO、pmRL-PF、pmRL-AO和pmRL-AF质粒中每一种和pcDNA-LacZ质粒10μg以与PEI或体内jetPEI的复合物的形式注射入小鼠(六周龄)尾静脉中。两天后，将肝、肾、心脏、脾和肺组织从小鼠中分离，并在PBS溶液中用匀浆器进行匀浆。然后，将500μl所得组织溶液与500μl2×裂解缓冲液(50mM Tris-磷酸、pH 7.8、4mM DTT(二硫苏糖醇)、4mM 1，2-二氨基环己烷N，N，N，N′-四乙酸、20％甘油、2％

X-100)混合，其后进行冻融(3次)以完全裂解细胞。细胞裂解物以10,000rpm离心1分钟。所得上清进行半乳糖苷酶测定和Bradford测定以使转染效率归一化，基因表达效率通过萤光素酶活性测定进行测量。结果显示于图4C中。

如图4C中所示，在肝组织中，由含有FVIIΔ启动子/PAH增强子的表达载体与PEI的复合物诱导的萤光素酶表达水平等于由CMV启动子诱导的14％，这是萤光素酶表达体外测定的14倍或更高。由FVIIΔ启动子/AMBP增强子诱导的肝特异性萤光素酶表达水平等于由CMV启动子诱导的80％，这是萤光素酶表达体外测定的10倍或更高。

用体内jetPEI代替PEI提高了肝中的基因表达效率。具体地，由含有OATP-C启动子/PAH增强子的表达载体与体内jetPEI的复合物诱导的肝特异性萤光素酶表达水平等于由CMV启动子诱导的约38％，由FVIIΔ启动子/PAH增强子诱导的萤光素酶表达水平等于由CMV启动子诱导的约80％。由FVIIΔ启动子/AMBP增强子和体内jetPEI的复合物诱导的肝特异性萤光素酶表达水平与由CMV启动子诱导的相似。这些结果显示，本发明启动子和增强子的活性在体内优于体外。

实施例2：分离hFIX UTR和肝特异性基因的内含子，并分析UTR和内含子的基因表达效率

<步骤1>鉴定hFIX的UTR并构建包含UTR的表达载体

使用RNA提取试剂盒(Pharmacia Biotech)从1g人肝组织中提取了1.2mg的总RNA，预先用匀浆器对所述组织进行匀浆。使用作为模板的所提取RNA、M-MuLV逆转录酶(Takara)和oligo-dT17引物(Takara)合成单链DNA，使用DNA聚合酶I(Takara)由单链DNA合成双链cDNA。

为了评估FIX UTR对基因表达效率的影响，使用作为模板的cDNA、从FIX核苷酸序列(Genbank登录号NM000133)设计的引物组(SEQ ID NO：11和12)和Ex-Taq进行PCR，以获得具有5’UTR(SEQ ID NO：62)和3’UTR(SEQ ID NO：63)的FIX cDNA。PCR条件如下：首先94℃变性5分钟；94℃变性1分钟、56℃退火1分钟、72℃延伸1分钟的30个循环；最后72℃延伸3分钟。

除了使用SEQ ID NO：13和14的引物组之外，重复上述步骤，以获得不含UTR的FIX cDNA作为对照。

将扩增的DNA片段用限制性酶NotI和SalI进行消化，通过凝胶提取进行纯化，并插入到pBluescript SK(+)载体的NotI和SalI限制性位点。包含所需UTR的FIX和不含UTR的FIX通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述载体分别命名为“pBS-hFIXUTR”和“pBS-hFIX”(见图5(a))。

<步骤2>分离肝特异性基因的内含子并构建包含内含子的表达载体

<2-1>构建pCR-int

首先，进行PCR以获得包含人抗凝血酶、纤维蛋白溶酶原和凝血酶原内含子1中5′端约300bp的片段。

具体而言，使用实施例1<步骤1>中所述的基因组DNA(作为模板)以及人抗凝血酶内含子(SEQ ID NO：15和16)、人纤维蛋白溶酶原内含子(SEQ ID NO：17和18)和人凝血酶原酶内含子(SEQ ID NO：19和20)的引物组在下述条件下进行PCR：首先94℃变性5分钟；94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸2分30秒的30个循环；最后72℃延伸3分钟。将PCR产物通过凝胶提取进行纯化，并插入到pCR2.1-TOPO载体中。SEQ ID NO：46、47和48的内含子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒分别命名为“pCR-ATint”、“pCR-PLAint”和“pCR-PTint”。

进一步地，为了分离Kurachi S所报道的FIX内含子1，重复上述PCR步骤，但使用FIX内含子1的引物组(SEQ ID NO：21和22)，并将所获得的PCR产物插入到pCR2.1-TOPO载体中。所产生的质粒载体用限制性酶PvuI或ScaI进行消化，并进行自连。具有不同大小的FIX内含子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒分别命名为“pCR-1.4kbFIXint”和“pCR-0.3kbFIXint”。

<2-2>构建pBS-FIX-Syn1int

在FIX的外显子1和2之间插入<2-1>中所制备的pCR-ATint、pCR-PLAint和pCR-PTint内含子片段。

具体而言，重复<2-1>的PCR，但使用FIX 5’UTR的有义引物(SEQ ID NO：11)和共有剪接供体序列GTAA和三重G基序(来源于人α-珠蛋白的内含子2)的反义引物(SEQ ID NO：23)，以获得包含FIX的5’UTR和外显子1、剪接供体和人α-珠蛋白三重G基序的DNA片段。进一步地，重复上述PCR，但使用人纤维蛋白溶酶原的分支序列和共有剪接受体序列TCGA的有义引物(SEQ ID NO：24)和FIX3’UTR的反义引物(SEQ ID NO：12)，以获得包含分支序列、剪接受体、外显子2至8和FIX 3’UTR的DNA片段。将PCR产物通过凝胶提取进行纯化，并插入到pCR2.1-TOPO载体中。所需的DNA片段通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒分别命名为“pCR-5’hFIX”和“pCR-3’hFIX”。

将pCR-5’hFIX和pCR-3’hFIX分别用限制性酶NotI和NdeI以及NdeI和SalI进行消化，均插入到pBluescript的NotI和SalI限制性位点。所得质粒用NdeI进行消化，并插入用相同的酶(NdeI)预处理的<2-1>的pCR-ATint、pCR-PLAint和pCR-PTint中。所需的SEQ IDNO：49、50和51内含子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒分别命名为“pBS-hFIXUTR-Syn1AT”“pBS-hFIXUTR-Syn1PLA”和“pBS-hFIXUTR-Syn1PT”。所述质粒的示意图显示于图5(b)中。

<2-3>构建pBS-FIX-Syn2int

将<2-2>的pBS-FIXUTR-Syn1PLA质粒用XhoI和AatII进行消化(针对与剪接供体和受体相邻的XhoI和AatII限制性位点)，并插入用相同的酶(XhoI和AatII)预处理的<2-1>的pCR-ATint、pCR-PLAint、pCR-PTint、pCR-1.4kbFIXint和pCR-0.3kbFIXint中。Syn2AT、Syn2PLA和Syn2PT(SEQ ID NO：52、53和54)的内含子以及1.4kbFIXint和0.3kbFIXint的内含子通过限制性酶切图谱进行鉴定。所述质粒分别命名为“pBS-hFIXUTR-Syn2AT”、“pBS-hFIXUTR-Syn2PLA”、“pBS-hFIXUTR-Syn2PT”、“pBS-hFIXUTR-1.4kbFIXint(hFIXm1)”和“pBS-hFIXUTR-0.3kbFIXint(hFIXm2)”。所述质粒的示意图显示于图5(c)中。

<2-4>分离抗凝血酶全长内含子1并构建缩短的抗凝血酶内含子

重复<2-1>的PCR，但使用SEQ ID NO：15和25的引物组，以扩增包含抗凝血酶全长内含子1的片段。将大约2.3kb的PCR产物插入到pCR2.1-TOPO载体中，其命名为“pCR-NAint”。所得的质粒用XhoI和AatII进行消化，并根据<2-3>的步骤插入到pBS-hFIXUTR中，以获得包含SEQ ID NO：55内含子的pBS-hFIXUTR-NA。

使用Kilo-Sequence Deletion Kit(Takara)从PvuII位点截短在pBS-hFIXUTR-NA中所插入的内含子。具体地，将pBS-FIXUTR-NA用PvuII进行消化，用核酸外切酶III在25℃降解15秒、30秒、45秒和1分钟，用绿豆核酸酶和klenow酶进行末端补平，最后进行自连。将所得的构建体转化到大肠杆菌中。将所得的转化体在氨苄青霉素平板上进行培养并从其中筛选单菌落，来源于所述菌落的质粒中内含子的大小使用限制性酶通过电泳进行鉴定。对带有正确大小内含子的质粒进行纯化和测序，以获得包含SEQ ID NO：56的811bp内含子的质粒pBS-hFIXUTR-ΔNAL以及包含SEQ ID NO：57的640bp内含子的质粒pBS-hFIXUTR-ΔNAS。所述质粒pBS-hFIXUTR-NA、pBS-hFIXUTR-ΔNAL和pBS-hFIXUTR-ΔNAS的示意图显示于图5(d)中。

<步骤3>分析UTR和内含子对FIX表达的影响

将<步骤1>和<步骤2>中所制备的pBS-hFIX、pBS-hFIXUTR、pBS-hFIXUTR-Syn1int(AT、PLA、PT)和pBS-hFIXUTR-Syn2int(AT、PLA、PT、1.4kbFIXint、0.3kbFIXint)质粒用NotI和SalI进行消化，并插入到含有CMV启动子和牛poly(A)的pTRUF6腺相关病毒载体中，以获得hFIX表达载体CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR、CMV-hFIXUTR-Synlint(AT、PLA、PT)和CMV-hFIXUTR-Syn2int(AT、PLA、PT、1.4kbFIXint、0.3kbFIXint)。

将25μg上述表达载体的质粒DNA注射到C57BL/6小鼠尾静脉中。第二天，收集血液样品用于下述ELISA。

将所得血液样品在HBS-BSA-EDTA-T20缓冲液(0.1MHEPES-0.1M NaCl-1％BSA-10mM EDTA-0.1％Tween-20)中稀释100倍。将稀释的血液样品加入到包被了人FIX(hFIX)抗体(AffinityBiologicals)的96孔板中，于室温培养90分钟，用PBS-0.1％Tween-20洗涤，并与过氧化物酶标记的二抗孵育。将平板再次用PBS-0.1％Tween-20进行洗涤，并向其中加入溶有O-苯二胺和H₂O₂的底物缓冲液。将平板孵育5分钟，并用2.5M H₂SO₄终止反应。用分光光度计(Spectra Shell Microplate Reader，STL Spectra，Milan，Italy)在490nm测量吸光度，根据标准吸光度对标准浓度的标准曲线计算样品中的hFIX浓度。结果显示于图6A中。

如图6A中所示，注射后第二天，由CMV-hFIXUTR所诱导的hFIX蛋白的血液浓度约为910ng/ml，是由不含UTR的CMV-hFIX所诱导蛋白(540ng/ml)的约1.7倍。这表明UTR有助于hFIX的表达。

CMV-hFIXUTR-Syn1PLA的hFIX表达水平(1,480ng/ml)高至CMV-hFIXUTR(910ng/ml)的1.6倍，CMV-hFIXUTR-Syn2AT的hFIX表达水平(2,170ng/ml)高至CMV-hFIXUTR(910ng/ml)的2.4倍。这表明该内含子参与hFIX基因表达及最初的hFIX蛋白诱导。

同时，使用表达载体CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR和CMV-hFIXUTR-Syn1int(AT、PLA、PT)产生重组腺相关病毒rAAV-CMV-hFIX、rAAV-CMV-hFIXUTR和rAAV-CMV-hFIXUTR-Syn1int(AT、PLA、PT)。具体地，在500mlSpinner瓶中制备200ml的HEK293T细胞，用低钙DMEM培养基(0.1mM Ca⁺⁺、0.1％PL-68、1％FBS)将所述细胞调整成1×10⁶个细胞/ml的浓度。向细胞中载入包含33μg的表达载体中每一种、167μg的腺病毒辅助质粒pDG和650μl的10μM PEI的DNA-PEI混合物，并将所述细胞在5％CO₂培养箱中以30rpm悬浮培养6小时。然后，将培养基更换成100μg硫酸葡聚糖低钙DMEM。培养48小时后，收集细胞，对其进行冻融(3次)并以2000rpm离心5分钟。所得上清液通过碘克沙醇梯度超速离心法进行纯化(Zolotukhin，S.等，Gene Ther，6：973-985(1999))。将1×10⁹个感染性颗粒(IP)注射到免疫缺陷型裸鼠(Japan SLC Inc)的尾静脉中。两周后，每周收集一次血液样品，并将其用于上文所描述的ELISA。结果显示于图6B中。

如图6B中所示，病毒注射后14周时，包含本发明内含子的病毒的hFIX表达水平是不含内含子的病毒的10到20倍。具体地，带有CMV-hFIXUTR-Syn1AT的病毒的hFIX蛋白浓度为19,996pg/ml，而带有CMV-hFIXUTR的病毒的hFIX蛋白浓度为2,024pg/ml。这表明本发明内含子在增强基因表达方面发挥关键作用。

<步骤4>分析内含子对萤光素酶表达效率及mRNA稳定性的影响

<4-1>向由TK启动子控制的萤光素酶表达载体中引入内含子

将pRL-TK表达载体(promega)用HindIII/NheI消化以去除SV40内含子，其后进行末端补平及自连。内含子截短的pRL-TK载体命名为“pRL-Δint”，含有SV40内含子的pRL-TK载体命名为“pRL-SV40”。

将<2-2>和<2-3>中得到的pBS-hFIXUTR-Syn1AT、pBS-hFIXUTR-Syn1PLA和pBS-hFIXUTR-0.3kbFIXint用XhoI/AatII进行消化及末端补平。将所得片段插入到上述表达载体pRL-Δint。所得载体分别命名为“pRL-Syn1AT”、“pRL-Syn1PLA”和“pRL-hFIXm2”(见图7A)。

<4-2>分析萤光素酶表达效率

如实施例1<步骤1>中所述，将2μg<4-1>的萤光素酶表达载体、1μgβ-半乳糖苷酶表达载体和6μg PEI(polyplus)的复合物注射到肝细胞系(Hep3B)、肾细胞系(HEK293)和肺细胞系(A549)中。48小时后，收集细胞并根据与实施例1<步骤1>中相同的方法测量萤光素酶表达效率。结果显示于图7B中。

如图7B中所示，由含有内含子的表达载体所诱导的萤光素酶表达高达由不含内含子的表达载体所诱导的200倍(Syn1AT在Hep3B肝细胞系中表达的情况)。特别地，Syn1AT表达载体明显有助于萤光素酶活性的诱导以及如<步骤3>中所述的FIX表达的诱导。

<4-3>分析mRNA表达稳定性

根据与<4-2>中相同的方法，将<4-1>的萤光素酶表达载体转染到A549肺细胞系中，48小时后收集细胞。使用FastPure RNA试剂盒(Takara)从所述细胞中提取总RNA。使用500ng每种总RNA(作为模板)和AMV逆转录酶(Takara)制备单链DNA。然后，使用上述单链DNA(作为模板)以及检测萤光素酶和β-肌动蛋白的引物组进行PCR。结果显示于图8A和8B中。

如图8A和8B中所示，由pRL-Syn1AT载体所诱导的RLuc mRNA相对量是由pRL-Δint所诱导的RLuc mRNA的1.7倍。这表明，本发明内含子导致了mRNA的更高稳定性，这种更高的稳定性导致增强的基因表达。

<步骤5>分析抗凝血酶内含子对FIX表达的影响

为了确定抗凝血酶内含子对hFIX蛋白表达的影响，根据与<步骤3>中相同的方法，将<2-4>中所制备的pBS-hFIXUTR-NA、pBS-hFIXUTR-ΔNAL和pBS-hFIXUTR-NAS质粒插入到pTRUF6腺相关病毒中，以获得表达载体CMV-hFIXUTR-NA、CMV-hFIXUTR-ΔNAL和CMV-hFIXUTR-ΔNAS。根据与<步骤3>中相同的方法，将表达载体CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR、CMV-hFIXUTR-0.3kbFIXint(CMV-hFIXm2)、CMV-hFIXUTR-Syn1AT、CMV-hFIXUTR-Syn2AT、CMV-hFIXUTR-ΔNA、CMV-hFIXUTR-ΔNAL和CMV-hFIXUTR-ΔNAS的质粒DNA注射到小鼠尾静脉中，并通过ELISA测量受试者血液hFIX浓度。结果显示于图9A中。

如图9A中所示，含有合成或天然抗凝血酶内含子的表达载体的hFIX蛋白浓度是CMV-hFIXUTR的1.7到3.5倍(1,730到3,540ng/ml对1,000ng/ml)。特别地，CMV-hFIXUTR-ΔNAL表达载体表现出的表达效率是以前所构建的CMV-hFIXm2表达载体的约1.7倍(2,010ng/ml对1,000ng/ml)。这表明ΔNAL内含子非常适于hFIX的过表达。

同时，为了在体外评估内含子ΔNAL对hFIX表达的影响，将表达载体CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR和CMV-hFIXUTR-ΔNAL转染到HEK293T肾细胞系中。转染后两天，收集细胞及培养基并进行裂解。裂解物中hFIX蛋白水平通过使用hFIX抗体的电泳法进行测量，结果显示于图9B中。

如图9B中所示，CMV-hFIXUTR-ΔNAL表达载体诱导的hFIX表达水平是CMV-hFIX和CMV-hFIXUTR表达载体的1.55倍。这一结果表明ΔNAL内含子对于hFIX过表达是很有效的。

实施例3：分离肝特异性LCR并分析LCR的基因表达效率

<步骤1>分离肝特异性LCR并构建包含LCR的质粒载体

在仅表达于肝组织中的α1-抗胰蛋白酶、甲胎蛋白和白蛋白基因的下游分析TGTTTGC基序的位置。结果显示于图10中。

如图10中所示，七个TGTTTGC基序分布在α1-抗胰蛋白酶基因的-7.8kb，六个基序为正向的，一个基序为反向的；还有一个正向的基序位于α1-抗胰蛋白酶基因的-108bp位点。在甲胎蛋白-3.8kb位点，两个TGTTTGC基序以正向分布，一个基序为反向；在白蛋白基因的-6kb位点，一个基序为反向。此外，TGTTTGC基序在α1-抗胰蛋白酶基因-800bp位点、甲胎蛋白基因-1.5kb和-500bp位点以及白蛋白基因-10kb、-3.5kb和-2.6kb位点聚簇。在这些位点中，对α1-抗胰蛋白酶基因-7.8kb和-108bp位点、甲胎蛋白基因的-3.8kb位点和白蛋白基因-6kb位点进行分离。

具体而言，为了分离位于α1-抗胰蛋白酶基因-108bp位点的LCR，使用实施例1<步骤1>的基因组DNA(作为模板)、SEQ ID NO：26和27的引物组和DNA聚合酶(Ex-Taq、Takara)根据与实施例1<步骤1>中相同的方法进行PCR。将PCR产物通过凝胶提取进行纯化，并插入到pCR2.1-TOPO载体中。所需具有SEQ ID NO：58之核苷酸序列的α1-抗胰蛋白酶LCR通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒命名为“pCR-AAT108lcr”。

相似地，重复上述PCR步骤，但使用引物组SEQ ID NO：28和29、SEQ ID NO：30和31以及SEQ ID NO：32和33，以分别扩增位于人α1-抗胰蛋白酶的-7.8kb位点、人甲胎蛋白的-3.8kb位点和人白蛋白基因的-6kb位点的LCR。将PCR产物插入到pCR2.1-TOPO载体中。所需具有SEQ ID NO：59、60和61之核苷酸序列的LCR通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒分别命名为“pCR-AAT7800lcr”、“pCR-AFP3800lcr”和“pCR-E6lcr”。

同时，为了分离Dang Q.所报道的人载脂蛋白E(ApoE)基因的肝细胞控制区(HCR)和最小结构HCR(HCRm)，使用引物组SEQ IDNO：34和35以及SEQ ID NO：34和36进行PCR，并将所得的PCR产物插入pCR2.1-TOPO载体中。人ApoE基因的HCR和HCRm通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒分别命名为“pCR-ApoEHCR”和“pCR-ApoEHCRm”。这些质粒的示意图显示于图11A中。

进一步地，将AAT基因的增强子和启动子与HCRm的组合插入到pBluescript II载体中以构建pBS-HCRm-AATenh/pro(HmA)，将AAT基因的启动子与HCR的组合插入到pBluescript II载体中以构建pBS-HCR-AATpro(HA)。这些质粒的示意图显示于图11B中。

<步骤2>分析LCR的基因表达效率

对<步骤1>中所分离的LCR与启动子、增强子及内含子的组合，对FIX表达效率的影响进行评估。

具体而言，将<步骤1>中所制备的pCR-AAT108lcr、pCR-AAT7800cr、pCR-AFP3800lcr、pCR-E6lcr、pCR-HCR和pCR-HCRm质粒用HindIII/EcoRV进行消化，并插入到实施例1<步骤2>中所制备的pBS-PF的HindIII/EcoRI(稍后补平)限制性位点，以分别获得pBS-AAT108-PF、pBS-AAT7800-PF、pBS-AFP3800-PF、pBS-E6-PF、pBS-HCR-PF和pBS-HCRm-PF。将这些质粒用KpnI和NotI再次进行消化，并插入到实施例2<步骤5>中所制备的pBS-CMV-hFIXUTR-Syn1PLA的KpnI/NotI限制性位点，以获得pBS-AAT108-PF-hFIXUTR-Syn1PLA、pBS-AAT7800-PF-hFIXUTR-Syn1PLA、pBS-AFP3800-PF-hFIXUTR-Syn1PLA、pBS-E6-PF-hFIXUTR-Syn1PLA、pBS-HCR-PF-hFIXUTR-Syn1PLA和pBS-HCRm-PF-hFIXUTR-Syn1PLA。这些质粒的示意图显示于图12A中。

将所述质粒用KpnI和SalI进行消化，并插入到pTRUF6腺相关病毒的KpnI/SalI 限制性位点，以获得表达载体AAT108-PF-hFIXUTR-Syn1PLA、AAT7800-PF-hFIXUTR-Syn1PLA、AFP3800-PF-hFIXUTR-Syn1PLA、E6-PF-hFIXUTR-Syn1PLA、HCR-PF-hFIXUTR-Syn1PLA和HCRm-PF-hFIXUTR-Syn1PLA。将所述表达载体的质粒DNA根据与实施例2<步骤3>中的相同方法注射到小鼠尾静脉中，通过ELISA测定hFIX蛋白的表达水平。结果显示于图12B中。

如图12B中所示，注射两天后，包含LCR的表达载体表现出的hFIX表达水平高达CMV-hFIXUTR-Syn1PLA的7倍(AAT7800-PF-hFIXUTR-Syn1PLA 7,640ng/ml对CMV-hFIXUTR-Syn1PLA 1,090ng/ml)。特别地，直到注射后4周，AAT108-PF-hFIXUTR-Syn1PLA仍持续表达390ng/ml或更高的hFIX，这一表达水平高达HCR-PF-FIX-Syn1PLA(250ng/ml)的1.6倍。该结果表明AAT108内含子非常适于hFIX的持续表达。

实施例4：评估本发明表达载体对血友病B的治疗效果

根据与实施例3<步骤2>中相同的方法，用实施例1<步骤2>中所制备的pBS-PAF构建表达载体AAT108-PAF-hFIXUTR-Syn1PLA。然后，将实施例2<2-4>中所构建的pBS-CMV-hFIXUTR-ΔNAL用NotI和SalI进行消化，并插入到实施例3<步骤2>中所构建的AAT108-PF-hFIXUTR-Syn1PLA和AAT108-PAF-hFIXUTR-Syn1PLA的NotI/SalI限制性位点，以获得AAT108-PF-hFIXUTR-ΔNAL和AAT108-PAF-hFIXUTR-ΔNAL。

同时，将实施例1<步骤1>的pCR-AAT enh/pro用SpeI(稍后补平末端)/NotI进行消化，并插入到实施例3<步骤2>的pCR-HCRm的EcoRV/NotI限制性位点，以获得pCR-HCRm-AATenh/pro表达载体(HmA)。将pCR-HCRm-AATenh/pro(HmA)表达载体用KpnI和NotI进行消化，并插入到实施例2<步骤5>中所构建的CMV-hFIXUTR-ΔNAL的KpnI和NotI限制性位点，以获得HmA-hFIXUTR-NAL表达载体。

将实施例1<步骤1>中所描述的pCR-AAT enh/pro用BglII(稍后补平)/NotI进行消化，并插入到实施例3<步骤2>中所描述的pCR-HCR的EcoRV/NotI限制性位点，以获得pBS-HCR-AATpro(HA)表达载体。将pBS-HCR-AATpro(HA)表达载体用KpnI/NotI进行消化，并插入到实施例2<步骤3>中所描述的CMV-hFIXUTR-1.4kbFIXint的KpnI/NotI限制性位点，以获得HA-hFIXUTR-1.4kbFIXint表达载体。

所述表达载体的示意图显示于图13A中。

将25μg的AAT108-PF-hFIXUTR-ΔNAL、AAT108-PAF-hFIXUTR-ΔNAL、HmA-hFIXUTR-ΔNAL和CMV-hFIXUTR-ΔNAL(实施例2<步骤5>中所制备)表达载体的每一种质粒DNA注射到血友病B小鼠的尾静脉中，并通过ELISA测定hFIX蛋白浓度和凝血活性。

如图13B中所示，相对于由HmA-hFIXUTR-ΔNAL表达载体所诱导的hFIX表达水平，由AAT108-PAF-hFIXUTR-ΔNAL表达载体所诱导的hFIX表达水平在注射后第1天为9.8％，第2天为30.6％、第7天为82％，第2周为108％，第9周为208％。此外，相对于由HmA-hFIXUTR-ΔNAL表达载体所诱导的hFIX表达水平，由AAT108-PF-hFIXUTR-ΔNAL表达载体所诱导的hFIX表达水平在注射后第1天为9％，第2天为19.2％，第7天为41.9％，第2周为56.9％，第9周为73.0％。

用hFIX表达载体注射的血友病B小鼠和正常小鼠的凝血活性通过如下的活化部分凝血活酶时间(APTT)方法进行测定。将FIX缺陷型血浆、10倍稀释的小鼠血浆、活化的肌动蛋白(各50μl)相混合，并在37℃孵育3分钟。向其中加入CaCl₂，用血液凝集检测器KC10A(Amelung)测定样品凝结所消耗的时间。正常小鼠的凝血时间约为44秒，血友病B小鼠约为65秒。如图13C中所示，直到注射后3天，施用了hFIX表达载体的血友病B小鼠才显示出正常凝血时间的约80％。7天后，施用了CMV-hFIXUTR-ΔNAL的小鼠的凝血时间回复到注射前的水平，而施用了AAT108-PF-hFIXUTR-ΔNAL和AAT108-PAF-hFIXUTR-ΔNAL的小鼠表现出凝血时间改善为50到60秒。

进一步地，根据标准活性对标准凝血时间的标准曲线计算所述样品的凝血活性。如图13D中所示，用AAT108-PF-hFIXUTR-ΔNAL和AAT108-PAF-hFIXUTR-ΔNAL表达载体处理的血友病B小鼠的凝血活性在注射后8周分别为正常小鼠的34.1％和29.3％。特别地，用AAT108-PAF-hFIXUTR-ΔNAL表达载体处理的小鼠的凝血活性在注射后8周为正常小鼠的31.9％。

同时，根据与实施例2<步骤3>中相同的方法，将使用HA-hFIXUTR-1.4kbFIXint、AAT108-PF-hFIXUTR-ΔNAL、AAT108-PAF-hFIXUTR-ΔNAL和CMV-hFIXUTR-1.4kbFIXint的2×10⁹IP的重组腺相关病毒注射到血友病B小鼠的门静脉中，并通过如前所述的ELISA和APTT方法测定hFIX蛋白浓度和凝血活性。结果显示于图14A和14B中。

如图14A中所示，带有AAT108-PF-hFIXUTR-ΔNAL的病毒诱导高达2,379ng/ml的hFIX蛋白，带有AAT108-PAF-hFIXUTR-ΔNAL的病毒诱导高达1,431ng/ml的hFIX蛋白。另一方面，对照病毒(即，带有CMV-hFIXUTR-1.4kbFIXint的病毒和带有HA-hFIXUTR-1.4kbFIXint的病毒)所诱导的hFIX表达水平分别为1,542ng/ml和380ng/ml。特别地，含AAT 108-PF-hFIXUTR-ΔNAL的病毒到注射后68周还诱导500ng/ml或更高的hFIX表达。这一结果表明，本发明含有LCR的表达载体适用于需要长期基因表达的基因治疗。

如图14B中所示，施用了带有AAT108-PF-hFIXUTR-ΔNAL的rAAV的小鼠到注射后7周表现出正常小鼠凝血活性的59.1％或更高。

上述结果表明，本发明的基因表达系统对于血友病治疗所需的稳定而持续的表达是有效的。

实施例5：构建包含抗血管发生蛋白Apo(a)kringle结构域KIV9-KIV10-KV(LK68)基因的肝特异性表达载体并评估LK68蛋白表达效率

为了向LK68表达载体中引入ΔNAL内含子和FIX UTR，首先使用作为模板的pAAV-LK68(专利号KR10-0681762)、引物组SEQ IDNO：37和38、SEQ ID NO：39和40以及Ex-Taq进行PCR，以获得FIX 5’UTR信号序列片段和LK68-FIX 3’UTR片段。PCR条件如下：首先94℃变性5分钟；94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸1分钟的30个循环；72℃最后延伸3分钟。将所述5’UTR信号序列片段和LK68-3’UTR片段分别插入到实施例2<2-4>中所制备的pBS-hFIXUTR-ΔNAL载体的NotI/XhoI和AatII/SalI限制性位点。所需DNA片段通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定，所述质粒命名为“pBS-LK68-ΔNAL-FUTR”。将通过用限制性酶NotI和SalI处理pBS-LK68-ΔNAL-FUTR质粒所得到的LK68-ΔNAL-FUTR片段插入到实施例4中所制备的AAT108-PF-hFIXUTR-NAL的NotI/SalI限制性位点，以获得表达载体AAT108-PF-LK68-ΔNAL-FUTR。在存在不同LCR或者缺少LCR时重复上述步骤，以获得表达载体E6-PF-LK68-ΔNAL-FUTR、AAT7800-PF-LK68-ΔNAL-FUTR、AFP3800-PF-LK68-ΔNAL-FUTR、HCRm-PF-LK68-ΔNAL-FUTR、HCR-PF-LK68-ΔNAL-FUTR和PF-LK68-ΔNAL-FUTR。所述表达载体的酶切图谱显示于图15A中。

根据与实施例2<步骤3>中相同的方法，将所述表达载体注射到小鼠尾静脉中。从小鼠中收集血液样品，并通过ELISA测量LK68蛋白的表达水平。

如图16A中所示，在不同LCR中，AAT108显示出最高的基因表达效率。特别地，相对于PF-LK68-ΔNAL-FUTR表达载体的LK68表达效率，AAT108-PF-LK68-ΔNAL-FUTR表达载体的LK68表达效率在注射后第1天为158.4％，第2天为104.8％，第7天为155.8％，第2周为160.2％，第3周为162.7％，第4周为144.1％。

进一步地，重复上述步骤以获得包含表达盒AAT108-PF-LK68、AAT108-PF-LK68-FUTR、AAT108-PF-LK68-ΔNAL-FUTR、AAT108-PAF-LK68、AAT108-PAF-LK68-FUTR和AAT108-PAF-LK68-ΔNAL-FUTR的表达载体。所述表达载体的示意图显示于图15B中。

如图16B中所示，相对于AAT108-PF-LK68表达载体的LK68表达效率，AAT108-PF-LK68-FUTR和AAT108-PF-LK68-ΔNAL-FUTR表达载体的LK68表达效率分别在注射后第1天为197.7％和425.4％，第2天为478.6％和891.2％，第7天为233.2％和319.3％，第2周为203.0％和253.7％，第3周为113.8％和243.3％，第4周为170.4％和277.6％。相对于AAT108-PAF-LK68表达载体的LK68表达效率，AAT108-PAF-LK68-FUTR和AAT108-PAF-LK68-ΔNAL-FUTR表达载体的LK68表达效率分别在注射后第1天为147.0％和344.6％，第2天为351.0％和824.5％，第7天为220.2％和260.3％，第2周为140.8％和203.0％，第3周为146.5％和288.4％，第4周为177.8％和323.8％。

这些结果表明，与不存在内含子和UTR的情况相比，基因表达在内含子和/或UTR存在下是持续高水平的。

实施例6：评估细胞内由UTR和内含子引起的抗血管发生蛋白Apo(a)kringle结构域KIV9-KIV10-KV(LK68)的表达效率

将通过用NotI和SalI消化实施例5所述AAT108-PF-LK68和AAT108-PF-LK68-ΔNAL-FUTR 载体所得到的LK68和LK68-ΔNAL-FUTR片段插入到腺病毒穿梭载体pENTR2B(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，以获得pENTR-LK68和pENTR-LK68-ΔNAL-FUTR载体。将这些穿梭载体和靶标载体pAd/CMV/V5-DEST(Invitrogen，Carlsbad，CA)用Clonase^TM(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行体外同源重组，以获得pAd-CMV-LK68和pAd-CMV-LK68-ΔNAL-FUTR载体。将所述pAd-CMV-LK68和pAd-CMV-LK68-ΔNAL-FUTR载体用PacI限制性酶进行线性化，并转染到HEK 293肾细胞系中，以分别获得带有CMV-LK68和CMV-LK68-ΔNAL-FUTR的复制缺陷型腺病毒rAd-LK68和rAd-LK68UN。将所述rAd-LK68和rAd-LK68UN注射到HEK 293肾细胞系中，并测量LK68蛋白的表达水平。

以0.1、0.5、2和10的多种感染复数(MOI)感染HEK 293肾细胞系。在腺病毒感染后2天收集细胞和培养基。使用抗LK68抗体，通过电泳测定LK68蛋白的表达水平。结果显示于图17A和17B中。

如图17A和17B中所示，当MOI为0.1、0.5和2时，LK68蛋白的表达水平很低且相等，然而当MOI为10时，与由rAd-LK68所诱导的相比，由rAd-LK68UN所诱导的LK68蛋白表达水平在细胞内提高了420％，在培养基中提高了242％。

这些结果表明，UTR和内含子存在下细胞和培养基中的基因表达效率都高于缺少UTR和内含子的情况。

尽管通过上述具体实施方案对本发明进行了描述，但应当理解，可以进行多种修改和改变，而仍属于由下述权利要求书所定义的本发明范围。

以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：

项1.具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸。

项2.多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸；以及与所述SEQ ID NO：42之多核苷酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ ID NO：44和45之核苷酸序列的多核苷酸。

项3.多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO：46至57之核苷酸序列的多核苷酸。

项4.多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO：58至61之核苷酸序列的多核苷酸。

项5.表达载体，其包含转录调控元件和与所述转录调控元件有效连接并受其控制的编码序列，其中所述转录调控元件包含：

1)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸；

2)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸，以及与所述SEQID NO：42之多核苷酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ ID NO：44和45之核苷酸序列的多核苷酸；

3)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸，以及与所述SEQID NO：42之多核苷酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ ID NO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸；

4)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸，以及与所述SEQID NO：42之多核苷酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ ID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸；

5)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸，选自具有SEQID NO：44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，以及选自具有SEQ ID NO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效连接；

6)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸，选自具有SEQID NO：44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，以及选自具有SEQ ID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效连接；

7)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸，选自具有SEQID NO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，以及选自具有SEQ ID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效连接；或者

8)具有SEQ ID NO：42之核苷酸序列的多核苷酸，选自具有SEQID NO：44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，选自具有SEQ ID NO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效连接。

项6.表达载体，其包含转录调控元件以及与所述转录调控元件有效连接并受其控制的编码序列，所述转录调控元件包含启动子和与所述启动子有效连接的多核苷酸，所述多核苷酸选自：选自具有SEQ ID NO：46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；选自具有SEQID NO：58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及与选自具有SEQ ID NO：58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷酸有效连接的选自具有SEQ ID NO：46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷酸。

项7.项5或6的表达载体，其中所述编码序列是编码肝特异性蛋白质的序列，所述蛋白质选自：白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血浆铜蓝蛋白、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、红细胞生成素、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、触珠蛋白、IGF-1、胰岛素、纤维蛋白溶酶原、凝血酶原和转铁蛋白。

项8.项5或6的表达载体，其还包含分别位于所述编码序列5′和3′端的具有SEQ ID NO：62和63之核苷酸序列的多核苷酸。

Claims

1.多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO：52所示核苷酸序列。

2.表达盒，其包含：

启动子；

与所述启动子有效连接并受其控制的编码序列；和

与所述编码序列有效连接的内含子，其核苷酸序列为SEQ IDNO：52所示核苷酸序列。

3.权利要求2的表达盒，其还含有与所述编码序列有效连接的至少一个增强子，其核苷酸序列选自SEQ ID NO：44和45所示核苷酸序列。

4.权利要求2的表达盒，其还含有与所述编码序列有效连接的至少一个基因座控制区，其核苷酸序列选自SEQ ID NO：58到61所示核苷酸序列。

5.权利要求2的表达盒，其还含有与所述编码序列有效连接的非翻译区，其核苷酸序列为分别在所述编码序列的5′和3′端的SEQ ID NO：62和63所示的核苷酸序列。

6.权利要求3的表达盒，其还含有与所述编码序列有效连接的至少一个基因座控制区，其核苷酸序列选自SEQ ID NO：58到61所示核苷酸序列。

7.权利要求6的表达盒，其还含有与所述编码序列有效连接的非翻译区，其核苷酸序列为分别在所述编码序列的5′和3′端的SEQ ID NO：62和63所示的核苷酸序列。

8.权利要求3的表达盒，其还含有与所述编码序列有效连接的非翻译区，其核苷酸序列为分别在所述编码序列的5′和3′端的SEQ ID NO：62和63所示的核苷酸序列。

9.权利要求4的表达盒，其还含有与所述编码序列有效连接的非翻译区，其核苷酸序列为分别在所述编码序列的5′和3′端的SEQ ID NO：62和63所示的核苷酸序列。

10.权利要求2至9中任一项的表达盒，其中所述启动子选自核苷酸序列如SEQ ID NO：41、42和43所示的多核苷酸。

11.权利要求2至9中任一项的表达盒，其中所述编码序列是编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质选自：白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血浆铜蓝蛋白、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、红细胞生成素、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、触珠蛋白、IGF-1、胰岛素、纤维蛋白溶酶原、凝血酶原和转铁蛋白。

12.表达载体，其含有权利要求2至9中任一项的表达盒。