KR101220017B1 - 개선된 관능성을 갖는 콩 조성물 및 생산 방법 - Google Patents
개선된 관능성을 갖는 콩 조성물 및 생산 방법Info
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Abstract
본 발명은 개선된 관능성을 갖는 대두육 조성물과 개선된 관능성을 지닌 대두를 확인하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 개선된 관능성을 갖는 콩 조성물을 생산하는 방법과 이러한 특성을 지닌 콩을 생산하는 식물을 작출하는 방법을 제공한다.
Description
본 출원은 2004년 7월 9일자로 출원된 미국 가특허 출원번호 60/521,846의 우선권을 주장하고, 그 전체는 특히 참고문헌으로 본원에 통합된다.
1. 발명의 분야
본 발명은 영양과 식품과학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 감소된 냄새(odor)와 같은 개선된 관능성(organoleptic properties)을 갖는 콩 조성물 및 이들의 사용 방법 및 생산 방법에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
대두(soybean)는 인간에게 건강 편익을 제공하는 고품질의 단백질을 제공한다(Hermansen 등, 2003; Bazzano 등, 2001; Food and Drug Administration, 1999). 대두로 콩 식품을 제조하기 위한 요구는 지난 삼십 년간 기대했던 것만큼 늘어나지는 않았다(Wolfe와 Cowan, 1975 및 SoySource, The United Soybean Board, 1999). 이것은 부분적으로 콩 생산물과 연관된 원하지 않는 냄새 때문이다(McLeod와 Ames, 1988 및 Freese, 1999). 원하지 않는 대두 냄새는 통상적으로 "콩비린내(beany)"로서 설명된다. 대두에 콩비린내 특징을 부여하는 성분은 대두에서 발견되는 여러 성분의 효소 작용과 다양한 기작으로부터 야기되는 그들의 추가적인 산화로부터 유래된 많은 휘발성 지방산, 지방족 카보닐, 아민, 알코올, 알데히드 및 푸란을 포함한다(Wolfe와 Cowan, 1975; Sessa와 Rackis, 1977).
Kobayashi 등(1995)은, 요리되지 않은 두유 냄새의 주된 요인은 (트랜스, 트랜스)-2,4-노나디에날, (트랜스, 트랜스)-2,4-데카디에날, 헥사날, 2-펜틸 푸란, 1-옥텐-3-온, 트랜스-2-노네날 및 (트랜스, 시스)-2,4-노나디에날이라고 결론지었다. 열 처리된 두유로부터 추출된 매우 강한 냄새는 (트랜스, 트랜스)-2,4-데카디에날 및 n-헥사날로 확인되었다(Feng, Cornell University Ph.D. Dissertation, 2000). (트랜스, 트랜스)-2,4-데카디에날의 생성은 실온에서 느린 속도로 일어나지만(Frankel, 1988), 이 반응은 뜨거운 조건에서 콩을 가공처리하는 동안의 열분해 때문에 증가된다(Lin, 2003). 냄새에 대한 다른 요인은 (2,4-데카디에날로부터 생성된) (트랜스)-4,5-에폭시-(E)-2-데세날, (트랜스, 시스)-2,6-노나디에날, (트랜스)-2-노네날, (트랜스, 트랜스)-2,4-노나디에날, 2,4-노나디에날, 말톨, 바닐린 및 β-다마세논이었다. 후각계기측정법(olfactometry)에 의해 검출되는데 요구되는 최소 헤드스페이스 체적으로 결정된 두유에서 가장 강한 냄새가 나는 물질(odorant)은 헥사날, 아세트알데히드, 메탄티올, 디메틸 트리설피드 및 2-펜틸 푸란이었다(Boatright, 2002).
콩 단백질 분리물(isolate)에서 가장 강한 냄새가 나는 물질은 디메틸 트리설피드, (트랜스, 트랜스)-2,4-데카디에날, 2-펜틸 피리딘, (트랜스, 트랜스)-2,4-노나디에날, 헥사날, 아세토페논 및 1-옥텐-3-온으로 확인되었다(Boatright와 Lei, 1999). 메탄티올 및 디메틸트리설피드의 생성 기작은 지질 산화에 의하여 형성된 자유 라디칼(Lei와 Boatright, 2003) 및 시스테인 합성효소와 같은 효소의 생성물(Boatright, 2003, poster 45C-26, IFT annual meeting, Chicago)과 연관된다.
2-펜틸 피리딘의 생성은 실온에서 2,4-데카디에날과 암모니아 사이의 자발적인 반응으로부터 일어난다. 유리 아미노산인 아르기닌, 리신, 아스파라긴 및 글루타민은 아마도 콩 단백질 가공공정 동안 암모니아를 제공하므로써 2-펜틸 피리딘 형성을 증가시킨다(Zhou와 Boatright, 2000; Kim 등, 1996). 또한, 유리 아미노산은 다른 원하지 않는 생성물을 형성할 수 있다. 아스파라긴과 글루코오스의 고온 노출은 아크릴아미드의 생성으로 결과된다(Jung 등, 2003). 조리 온도에 노출된 아르기닌은 변이원(mutagen)을 형성할 수 있다(Knize 등, 1994). 유리 아르기닌은 β-콘글리시닌 및 글리시닌 양쪽 모두가 결핍된 대두에서 풍부하다(Takahashi 등, 2003).
한번 형성된 냄새는, 그들이 단백질과 연관되어 있기 때문에, 콩 성분으로부터 제거되기가 어렵다(Franzen과 Kinsella, 1974). 콩 식품에 첨가되는 천연 향의 품질은, 몇 가지의 냄새가 콩 단백질과 결합하기 때문에 또한 불쾌하게 변한다. 카보닐 화합물과 2-펜틸 피리딘은 β-콘글리시닌 부분보다 글리시닌 부분에 더 큰 친화력으로 결합된다(Zhou 등, 2002; O'Keefe 등, 1991). 오일 바디(oil body) 관련 단백질과 극성 지질의 추출은 콩 단백질 분리물과 관련된 상당한 정도의 냄새를 감소시킨다(Somoto 등, 1998).
단백질-단백질 상호작용에 의해 생성된 질감(texture)은 코에서의 냄새 농도 보다 맛 강도에서 더 효능을 가질 수 있다(Weel 등, 2002). 콩 단백질들은 불용성의 응집체와 선명치 않은 미감(mouthfeel)을 형성하므로써 콩 음료들의 불량한 관능성에 기여할 수 있다. 주된 콩 단백질 가운데, 글리시닌은 pH와 Ca+2 유도 불용화에 대해 더 민감하고(Yuan, 2002), β-콘글리시닌에 비해 낮은 비율의 글리시닌을 포함하는 대두는 가용성 콩 단백질 성분을 만드는데 유용하다(미국특허 6,171,640). 또한, 지질 산화 반응은 단백질 용해도에 영향을 준다. 산화 방지제는 단백질의 산화로 유도된 자유 라디칼을 제한하고, 가용성 단백질의 수율 개선을 위하여 콩 단백질 분리물 제조 동안 첨가 가능하다(미국특허 5,777,080). 다소의 펩티드는 산화방지제 화합물을 형성시키기 위하여 공정 동안 폴리사카라이드와 반응할 수 있다(Matsumura, 2003).
색깔은 신선도와 맛의 인식에 영향을 끼친다(Joshi, 2000). 지질 산화로부터 생성된 저량의 환원당과 알데히드는 메일라드의 갈색반응(Maillard's browning reaction)에 의한 단백질의 아미노산기와의 가열 반응으로 갈색 색소(pigment)를 형성한다(Kwok 등, 1999). 고함량의 알데히드를 지닌 두유는 열공정 후에는 더 진하고, 덜 어필하는 색깔을 나타낼 수 있다. 한편, 두유공정처리 동안 지질 산화반응은 두유의 노란색을 탈색시킨다(Obata와 Matsuura, 1997).
대두는 알코올 추출, 효소처리, 단백질 응유(curd) 세척, 단백질의 한외여과(ultrafiltration)에 의하여, 또는 플래쉬 증발의 사용으로 지질과 다른 성분을 추출함으로써 맛을 개선시켜 정제된다. 이들 공정은 콩 단백질 성분의 비용에 추가 되고, 전형적으로 생물학적 이용성이 있는 건강에 좋은 성분의 양을 더 낮춘다(예를 들면, 섬유질, 올리고사카라이드, 이소플라본, 폴리불포화 지방산, 토코페롤, 인지질, 생물학적 활성이 있는 펩티드). 콩 단백질 성분의 관능성을 개선시키기 위해 사용된 공정처리 접근방법은 콩 단백질들에 결합된 냄새에 의하여, 그리고 냄새 생성을 촉진하는 조건(pH8~10)에 의하여 효과가 제한된다. 리폭시게나아제(lipoxygenase) 1, 2 및 3의 1/3이 결핍된 대두는 돌연변이 육종을 사용하여 만들어 졌고, 콩비린내의 생성이 감소되었다(Hajika 등, 1991). 3가지의 리폭시게나아제가 결핍된 대두로부터 만든 두유와 콩가루의 아로마 분석은 더 낮은 양의 몇 가지 냄새를 포함하지만, 3가지 모두의 리폭시게나아제를 포함하는 어버이 대두 계통보다도 더 많은 양의 1-옥텐-3-올을 포함하는 것으로 밝혀졌다(Hao 등, 2002). 유사한 수준의 2,4-데카디에날은 3가지의 리폭시게나아제가 결핍된 하나의 대두와 두 가지의 다른 대두 계통으로부터 만든 탈지된 가루와 콩 단백질 분리물에서 발견되었다(Boatright 등, 1998). 리폭시게나아제가 결핍된 대두로부터 제조된 콩 식품은 대조군 대두로부터 만든 식품과 비교시에 맛이 개선되었다(Wilson 등, 1996). 3가지의 리폭시게나아제가 결핍된 대두로부터 제조된 두유는 대조군보다도 맛이 더 쓰고, 특히 종자 저장 15개월 후에는 더 쓰지만, 이 차이는 당을 첨가시킴으로써 제거될 것으로 기대되었다(Torres-Penaranda와 Reitmeirer, 2001).
유전자변형(transgenic modification)이 폴리불포화지방산(미국특허 5,981,781), 리폭시게나아제(미국특허출원 20030074693) 및/또는 하이드로퍼옥사이드 리아제(미국특허 6,444,874)의 수준을 감소시킴으로써 콩의 맛을 개선시키기 위 해 제안되었다. 10% 미만의 폴리불포화지방산과 75% 이상의 올레인 지방산을 포함하는 대두는 더 높은 폴리불포화지방산을 가진 프라이용 기름과 비교시에 맛이 덜한 프라이용 기름을 얻는다(Warner 등, 2001).
폴리포스페이트와 같은 화합물(미국특허 6,355,296)은 불쾌한 냄새를 제한하고, 단백질 용해도를 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 갈산(gallic acid)(PCT WO 01/06866) 또는 알데히드 옥시다아제(Maheshwari 등, 1997)와 같은 다른 첨가제도 냄새 제거를 위해 사용할 수 있다.
콩의 맛과 색깔 속성에 대한 자연적인 유전학적 변화의 효과에 관한 정보는 거의 없다. 16 대두종에 대한 티오바비튜릭산(thiobarbituric acid) 수는 지질 산화의 측정으로 결정되었고, 대두의 비타민 E 함량과는 관련이 없음을 발견하였다(Dehuja와 Madaan, 2004). 3가지의 대두종으로부터 만든 콩가루와 콩 단백질 분리물 내의 2-펜틸피리딘과 2,4-데카디에날의 양이 결정되었다(Zhou와 Boatright, 1999). 대두로부터 녹색안료인 클로로필의 제거시 건조 상태의 영향이 연구되었다(Salete 등, 2003; Sinnecker 등, 2002).
지난 10년 동안, 과학자들은 리폭시게나아제가 결핍된 대두로부터 제조된 기름은 개선된 산화 안정성을 갖지 않았음을 보여주었다. 리폭시게나아제가 존재하지 않는 대두로부터 생산된 대두 단백질은 여전히 상당한 수준의 콩비린내를 포함하였다(Maheshwari 등, 1997).
두유 또는 콩 단백질 성분을 만드는 첫 단계는 대두를 탈피(dehull)시켜서 대두육(soybean meat)을 만드는 것이다. 또한, 배축(hypocotyls)은 떡 잎(cotyledons)으로부터 분리될 수 있다. 대듀육은 탈피된 대두로 정의되고, 떡잎을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 대두육을 제조하는 방법은, 예를 들면 미국특허 5,727,689에 설명되어 있다. 탈피를 위한 한 가지 방법은, 제한을 하지 않지만, 역류의 롤러 또는 크랙킹 밀사이로 종자를 이동시키고, 경량의 껍질을 흡인하여, 대두육을 남기는 것을 포함한다. 대두육은 두유를 만들기 위하여 물에 침지되거나, 또는 플레이크로 만들 수 있고, 원하는 바에 따라서, 탈지된 콩가루, 콩 단백질 농축물, 콩 단백질 분리물 및 정제된 단백질 분액을 만드는 데 있어서 첫 단계로서 헥산을 사용하여 추출될 수 있다.
본 발명은 2,4-데카디에날, 헥사날, 헥사놀 및 1-옥텐-3-올로서 확인된 주요한 냄새 화합물의 생성을 억제하는 대두육의 성능을 결정하기 위한 새로운 방법을 제공한다. 이들 화합물은 광범위한 여러 가지 타입의 산화 반응의 지시자로서 선택된다. 헥사날과 헥사놀은 하이드로퍼옥사이드 리아제와 알코올 탈수소효소에 의해 (지방산의 9번 및 12번 탄소 위치상의 퍼옥사이드) 화합물을 포함하는 하이드로퍼옥사이드의 분해로부터 얻어진다. 2,4-데카디에날은 하이드로퍼옥사이드 리아제와 관련되는 것으로 알려지지 않은 리폭시게나아제 경로의 분해 산물이다. 1-옥텐-3-올은 리놀레산의 10번 탄소 위치상에 형성된 하이드로퍼옥사이드에 대한 하이드로퍼옥사이드 리아제의 작용으로 형성된다. 이러한 화합물은 추가적인 공정에 의해 더 반응하여 더 강한 냄새를 생성할 수 있다. 예를 들어, 2,4-데카디에날은 2-펜틸 피리딘의 형성에 관련되고, 1-옥텐-3-올은 1-옥텐-3-온의 생성에 관련된다.
발명의 개요
하나의 측면에서, 본 발명은 리폭시게나아제 1, 2 및 3을 포함하는 대두로부터 생산된 대두육 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 전체 지방산의 백분율로서 10% 이상의 리놀레산을 포함하고, 온화한 수용성 조건 하에서 산화반응 후에 g 당 2,4-데카디에날, 헥사날 및 헥사놀의 총량을 20㎍ 미만으로 포함한다. 상기 조성물은 리폭시게나아제 또는 이의 어떠한 조합을 포함할 수도 있고, 또는 포함하지 않을 수도 있으며, 불활성화된 리폭시게나아제를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 이 조성물은 리폭시게나아제-2를 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 조성물은 2,4-데카디에날, 헥사날 및 헥사놀의 총량을 약 15㎍ 미만 또는 약 18㎍ 미만으로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 2,4-데카디에날, 헥사날 및 헥사놀의 총량을 약 6~약 20㎍, 약 10~약 20㎍ 또는 약 12~18㎍으로 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 전체 지방산의 백분율로서 약 3% 미만 및 약 1~4%, 또는 약 2~4%의 범위를 포함하는 4% 미만의 리놀레산을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 그램 당 1800㎍ 미만의 유리 아르기닌 및/또는 그램 당 350㎍ 미만의 유리 아스파라긴을 포함하는, 그램 당 2000㎍ 미만의 유리 아르기닌 및/또는 그램 당 400㎍의 유리 아스파라긴을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 이러한 조성물은 그램 당 약 500~2000㎍, 약 1200~1800㎍ 및 약 1000~2000㎍의 유리 아르기닌을 포함하는, 그램 당 약 300~2000㎍의 유리 아르기닌을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 조성물은 그램 당 약 100~400㎍, 100~350㎍, 200~400㎍, 300~400㎍ 및 200~400㎍의 유리 아스파라긴을 포함하는, 그램 당 약 50~약 400㎍의 유리 아스파라긴을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명에 의하여 제공되는 조성물은 CIE-L*a*b* 시스템으로 측정하였을 때, 30 미만의 b* 값 및 80 이상의 L* 값으로 측정되는 색깔을 가지고, 상기 L*은 밝기를 나타내고, b*는 청색(-)에서 황색(+) 축 상의 색깔을 나타낸다. 어떠한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 약 18~30, 약 20~30, 약 25~30 및 약 25 미만의 b* 값으로 측정된 색깔을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 조성물은 약 80~100, 약 80~90 및 약 90 이상의 L* 값을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 조성물은 온화한 수용성 조건 하에서 산화반응 후, 약 6㎍ 미만, 약 5㎍ 미만, 약 1.3~약 8㎍, 약 2~약 8㎍ 및 약 4~약 8㎍을 포함하는, 그램 당 8㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하여 제공된 조성물은 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지고, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 가질 수 있다. 이러한 조성물은 단백질의 40% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지는 것으로 정의될 수 있고, 또한, 약 30~약 60%, 약 40~60%, 약 35~55% 및 약 30~약 50%의 β-콘글리시닌 함량을 가지는 것으로 더 정의될 수 있다. 이러한 조성물은 약 20%, 15% 및 10% 미만의 글리시닌 함량을 갖는 것으로 정의될 수 있고, 단백질의 약 0~25%, 5~20%, 1~25% 및 약 10~25%를 글리시닌으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 관점에서, 대두육 조성물은 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지고, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 가지고, 그램 당 5,000㎍ 미만의 유리 아르기닌 및 그램 당 900㎍ 미만의 아스파라긴을 갖는 것으로 제공된다. 어떤 구체예에서, 이러한 조성물은 그램 당 약 300~5,000㎍, 그램 당 약 1,000~5,000㎍, 그램 당 약 3,000~5,000㎍, 그램 당 약 1,000~4,000㎍ 및 그램 당 약 500~2,000㎍의 유리 아르기닌을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 이러한 조성물은 그램 당 400㎍ 미만의 아스파라긴, 그램 당 약 50~400㎍, 그램 당 약 100~400㎍, 그램 당 약 100~700㎍ 및 그램 당 약 200~900㎍의 유리 아스파라긴을 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 조성물은 그램 당 2,000㎍ 미만의 유리 아르기닌 및 그램 당 400㎍ 미만의 아스파라긴을 가진다.
다른 구체예에서, 제공된 조성물은 온화한 수용성 조건 하에서 산화반응 후에, 그램 당 약 3㎍ 미만, 약 1.3~3㎍, 약 1.3~4㎍ 및 약 2~4㎍을 포함하는, 그램 당 4㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 약 3~14%, 약 5~14%, 약 1.5~12%, 약 3~12% 및 약 7~14%를 포함하는, 총 지방산의 1~14%의 리놀렌산 농도를 가진다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 약 10~50%, 약 10~40%, 약 15~60%, 약 20~50% 및 약 20~60%를 포함하는, 총 지방산의 10~60%의 리놀렌산 농도를 가진다.
어떤 구체예들에서, 본 발명에 의해 제공된 대두육은 하나 이상의 리폭시게나아제의 결핍으로 정의될 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 대두육 조성물은 리폭시게나아제-2의 결핍으로 정의될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 리폭시게나아제-1, 리폭시게나아제-2 및/또는 리폭시게나아제-3 중 2종 또는 3종의 리폭시게나아제 부재를 포함하는, 리폭시게나아제-1, 리폭시게나아제-2 및/또는 리폭시게나아제-3 중 어떤 조합이 부재이다. 또한, 본 발명의 조성물은 CIE-L*a*b* 시스템으로 측정하였을 때, 30 미만의 b* 값 및 80 이상의 L* 값으로 측정되는 색깔을 가지고, 상기 L*은 밝기를 나타내고, b*는 청색(-)에서 황색(+) 축 상의 색깔을 나타낸다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명에 의해 제공된 조성물은 단백질의 그램 당 67~69mg의 리신을 포함할 수 있고, 단백질 그램 당 72~80mg의 아르기닌을 포함할 수 있고, 그리고/또는 단백질 그램 당 28~30mg의 히스티딘을 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서는, 본 발명은 2,4-데카디에날, 헥사놀, 헥사날 및 1-옥텐-3-올로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 농도를 결정하는 것을 포함하는, 냄새를 생성하는 특징이 있는 대두의 분석 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 상기 방법은 약 1중량부의 대두 종자 가루와 약 4중량부의 물의 혼합물을 약 1~약 40분 범위의 기간 동안 인큐베이트하고, 헥사날, 헥사놀 및 데카디에날에 대한 중수소화 표준을 사용하여 2,4-데카디에날, 헥사놀, 헥사날 및 1-옥텐-3-올로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 및 이들의 혼합물의 양을 정량하는 것을 포함하는 화합물의 수준을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 대두 종자 가루는 탈피된 대두로부터 제조될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 제1 및 제2의 대두종(soybean variety)으로부터의 한 가지 이상의 대두육 내의 2,4-데카디에날, 헥사놀, 헥사날, 1-옥텐-3-올로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물 및 이들의 어떠한 조합물의 수준을 측정하고, 낮은 수준의 화합물을 갖는 종자를 생산하는 종을 선택하는 것을 포함하는 감소된 냄새 생성 특성을 갖는 대두 및 대두육을 생산하는 대두종을 획득하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 자손을 생산하기 위하여 선택된 종의 식물과 다른 식물을 교배하고, 자손으로부터 하나 이상의 대두 또는 대두육 내의 2,4-데카디에날, 헥사놀, 헥사날, 1-옥텐-3-온으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 및 이들의 어떠한 조합물의 수준을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 약 1~약 40분 범위 내의 기간 동안에 대두 종자 가루 약 1부와 물 약 4부의 혼합물을 인큐베이트시켜서 측정되어 졌을 때 종자 그램 당 5㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 포함하는 종을 선택하고, 상기 1-옥텐-3-올을 측정하는 것을 포함하는 균류 오염에 저항하는 대두종을 선택하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점에서는, 본 발명은 ATCC 기탁번호 PTA-6197로 기탁된 대표 종자인 0119149로 명명된 대두 식물의 종자를 제공한다. 나아가, 본 발명은 대두 식물 0119149 또는 이런 종자 성장에 의해 생산된 이들의 일부를 제공한다. 본 발명의 이러한 식물은 형질전환유전자(transgene)을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 대두 식물 0119149로부터 유래된 대두 식물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 종자 시료가 ATCC 기탁번호 PTA-6197로 기탁된, 대두 식물 0119149의 식물과 제2의 대두 식물을 교배하여 대두 식물 0119149로부터 유래된 자손 식물을 만들고;
(b) 순차적인 세대의 자손 식물의 종자를 생산하기 위하여 상기 자손 식물 간 또는 상기 자손 식물과 제2의 식물을 교배시키고;
(c) 상기 종자로부터 순차적인 세대의 자손 식물을 성장시키고, 순차적인 세대의 자손 식물 간 또는 순차적인 세대의 자손 식물과 제2의 식물을 교배시키고; 그리고
(d) 대두 식물 0119149로부터 유래된 근교(inbred) 대두 식물을 생산하기 위하여 추가적인 3~10세대 동안 상기 단계 (b)와 (c)를 반복한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 개선된 관능성을 갖는 대두(즉, 개선된 맛, 색, 냄새와 구감(mouth feel) 특성을 갖는 대두)를 제공한다. 또한, 대두의 관능성을 향상시키기 위하여 밝은 색을 가진 대두가 제공된다. 대두의 관능성을 개선시키기 위하여 소량의 유리 아르기닌과 아스파라긴을 갖는 대두가 제공된다. 다른 구체예에 있어서, 감소된 수준의 리놀레산과 리놀렌산을 갖는 대두가 관능성 개선을 위해 제공된다.
하나의 구체예에 있어서, 본 발명에 의해 제공되는 대두 식물은 하나 이상의 형질전환유전자를 포함할 수 있다. 예로는 제초제 저항성을 지닌 식물을 생산하는 제초제 저항성을 부여하는 유전자 및 곤충 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다.
본 발명에 따르면, 리폭시게나아제 1, 2 및 3과 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자의 그램 당 총 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날, 헥사날, 헥사놀을 생산하는, 전체 지방산의 백분율로서 약 10% 이상의 리놀레산을 포함하는 대두 종자가 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 전체 지방산의 백분율로서 약 4% 미만의 리놀렌 지방산과 약 10% 이상의 리놀레산을 가지고, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자 그램 당 총 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날, 헥사날, 헥사놀을 생산하는, 리폭시게나아제를 함유하는 대두가 제공된다. 또한, 동일한 대두는 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자 그램 당 8㎍ 미만의 1-옥텐-3올을 생성할 수 있다.
또 다른 본 발명의 관점에 따르면, 본 발명은 건조 종자 중량 그램 당 약 2000㎍ 미만의 유리 아르기닌과 약 400㎍ 미만의 유리 아스파라긴을 가지고, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 대두 그램 당 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날, 헥사날 및 헥사놀을 생성하는 대두를 제공한다. 또한, 동일한 종자는 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 콩 종자 그램 당 8㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 30 미만의 "b* 값"으로 측정된 황색을 가지고, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 대두 그램 당 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날, 헥사날 및 헥사놀을 생성하는 대두가 제공된다. 또한, 동일한 종자는 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자의 그램 당 8㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 대두 그램 당 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날, 헥사날 및 헥사놀을 생성하는, 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지고, 그리고/또는 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 가지는 대두가 제공된다. 또한, 동일한 종자는 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자 그램 당 8㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 생성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 대두 그램 당 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날, 헥사날 및 헥사놀을 생성하는, 5,000㎍ 미만의 유리 아르기닌, 900㎍ 미만의 유리 아스파라긴 및 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지고, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 가지는 것을 포함하는 대두가 제공된다. 또한, 동일한 종자는 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자 그램 당 8㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 총 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지고, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 가지는 제1의 대두 종자와 리폭시게나아제 1, 2 및 3과 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 대두 그램 당 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날, 헥사날 및 헥사놀을 생성하는, 총 지방산의 백분율로서 10% 이상의 리놀레산을 포함하는 제2의 대두 종자를 교배하는 것으로부터 얻어지는 대두가 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 약 1~40분의 범위의 기간 동안 대두 종자 가루 약 1부와 물 약 4부의 혼합물을 인큐베이트하고, 2,4-데카디에날, 헥사날, 헥사놀 및 1-옥텐-3-올로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 및 이들의 2, 3 또는 4종의 혼합물의 양을 헥사날, 헥사놀 및 데카디에날에 대한 중수소화 표준을 사용하여 정량하는 것을 포함하는 대두 종자종의 냄새 생성 특성을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 실온에서 약 1~약 40분 범위의 기간 동안 대두 가루 또는 탈피된 대두 가루 약 1부와 물 약 4부의 혼합물을 인큐베이트하고, 헥사날, 헥사놀 및 데카디에날에 대한 중수소화 표준을 사용하여 2,4-데카디에날, 헥사날, 헥사놀 및 1-옥텐-3-올의 양을 정량하고, 이 결과에 기초하여 육종 군으로부터 종자를 선택하는 것을 포함하는 대두 육종 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 예를 들어 제초제 저항성을 부여하는 제초제 저항성 유전자 또는 곤충 저항성을 부여하는 살충제 유전자와 같은 형질전환유전자를 포함하는 대두가 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 대두 그램 당 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날, 헥사날 및 헥사놀을 생성하는, 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지고, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 가지는 대두를 포함하는 인간 소비를 위한 가공된 음식이 제공된다.
바람직한 구체예의 설명
본 발명은 개선된 관능성을 가진 콩 조성물, 대두 및 대두 종자 파생물(derivatives)을 제공하고, 상기 콩 조성물, 대두 및 대두 종자 파생물을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 콩 조성물은 개선된 맛, 색, 냄새 및 구감 특성을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 조성물을 생산하는 방법 및 대두종이 2,4-데카디에날, 헥사날, 헥사놀 및 1-옥텐-3올로서 확인된 주요 냄새를 생성하는 능력을 결정하는 방법 및 육종군으로부터 종자를 선별하기 위한 앞의 결과의 사용을 제공한다. 본 발명에 있어서, 산화 조건은, 물에 고체 입자를 분산시키기 위하여 약 0.5부의 콩가루가 물 2㎖와 혼합될 때 또는 1부의 콩가루가 물 4부와 혼합될 때 15~40℃로 다양할 수 있는 실온에서 약 1~40분 동안 산화 반응이 발생하는 것을 가능하게 하는 조건일 수 있다. 농축된 부유물은 효소, 기질, 자유 라디칼, 자유 라디칼 포집 화합물, 효소 저해제 및 다른 인자가 생성된 냄새의 양에 영향을 주는 것을 가능하게 한다.
본 발명은 총 지방산의 백분율로서 4% 미만의 리놀렌 지방산 및/또는 10% 이상의 리놀레산을 가지고, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자 그램 당 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날(CH3(CH2)4CHCHCHCHCHO, CAS NO. 25152-84-5)+헥사날(CH3(CH2)4CHO, CAS NO. 66-25-1)+헥사놀(CH3(CH2)5OH, CAS NO. 111-27-3)을 생산하는, 리폭시게나아제를 포함하는 대두 및 이들로부터 유래된 조성물을 제공한다. 또한, 동일한 대두가 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자 또는 탈피된 콩가루 그램 당 8㎍ 미만의 1-옥텐-3-올(CH3(CH2)4CHOHCHCH2, CAS NO. 3391-86-4)을 생산할 수 있다. 화합물 2,4-데카디에날, 헥사놀, 헥사날 및 1-옥텐-3-올과 이들의 조합물은 대두의 냄새 생성을 정량하는데 사용된다. 냄새은 이들 나열된 화합물로 제한되지는 않는다. 다른 감지가능한 알데히드, 케톤 및 알코올이 본 발명의 방법을 사용하여 냄새 생성의 척도로서 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 예는 제한되지는 않지만, 프로파날, 펜테날, 펜타날, 헥세날, 펜테놀, 헵타날, 헵테날, 벤즈알데히드, 헥사디에날, 헵타디에날, 헵타놀, 옥테놀, 옥테날, 노나날, 옥타디에논, 2-펜틸 푸란, 펜타날, 2,3-디메틸, 노네날, 말톨, 데세날 및 2-운데세날을 포함한다. 본 발명에 관하여, 용어 "리폭시게나아제"는 불포화 지방산을 산소로 산화시켜 퍼옥사이드를 생성하는 것을 촉매하는 효소를 나타낸다. 또한, 용어 "리폭시게나아제" (EC. 1.13.11.12)는 당분야에서 리폭시다아제 및 디옥시게나아제로서 언급된다. 리폭시게나아제 1, 2 및 3의 하나, 둘 또는 셋이 결핍된 대두로부터의 두유와 콩 단백질 성분의 냄새는 다른 연구자들에 의해 평가되었다. 고 올레 대두는 4% 미만의 리놀레산을 포함한다. 이러한 특성을 갖는 대두의 몇 가지는 본 발명의 검정법을 사용하여 마쇄된 대두 그램 당 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀을 생산할 수 있고, 몇 가지는 이 범위에 일치하지 못할 것이다. 매우 낮은 수준의 냄새를 생성하는 리폭시게나아제 1, 2 및 3를 함유하는 대두를 창출하는 것이 가능하고, 리폭시게나아제가 없는 대두가 높은 수준의 무냄새를 나타낼 수 있다는 것이 본 발명에 의하여 발견되었다. 냄새 생성 특징에 대하여 이전에 스크리닝되지 않은 고 β-콘글리시닌 조성물에 추가하여, 본 발명은 특히 리폭시게나아제 1, 2 및 3과 10% 이상의 리놀레산을 갖는 신규한 대두 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 리놀레 지방산(18:2 n-6)과 리놀렌산(18:3 n-6)은 둘 또는 셋의 시스 이중결합을 갖는 폴리불포화 지방산이다. 리폭시게나제 부재 대두 또는 고 올레 대두의 자손으로부터 적은 냄새 생성 계통을 선별하기 위한 본 발명의 방법은 본 발명의 범위 내이다.
1-옥텐-3-올의 냄새는 리놀레산의 10번 탄소 위치상에 하이드로퍼옥사이드를 갖는 지방산의 절단 생성물이다. 껍질의 제거는 실질적으로 대두 조성물의 1-옥텐-3-올 생성 특성을 감소시킨다는 사실이 본 발명에서 발견되었다. 균류의 리폭시게나아제와 하이드로퍼옥사이드 리아제는 각각 10-하이드로퍼옥사이드와 1-옥텐-3-올을 생성한다(Wurzenberger와 Grosch, 1984; Husson 등, 1998). 더 소량의 1-옥텐-3-올을 생성하는 대두는 포몹시스(Phomopsis)와 같은 균류에 의한 콩 껍질의 오염을 막아주고(Minor 등, 1995), 그리고/또는 균류의 리폭시게나아제를 저해하는 성분을 포함한다는 것이 본 발명에서 추론된다.
대두 생성물의 관능성은 글리시닌과 β-콘글리시닌의 함량에 의존한다. 글리시닌은 냄새를 더 보유하려는 경향이 있고, 대두 생성물의 감각적 품질에 악영향을 끼치는 불용성 입자를 생성하려는 경향이 있다. 본 발명은 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지고, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 갖는 대두를 제공하고, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 곱게 간 종자 그램 당 총 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀을 생산할 것이다. 또한, 동일한 종자가 유사한조건에서 곱게 간 종자 그램 당 8㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 생산할 수 있다. 본 발명에 따르면, β-콘글리시닌은 분자량 150~200kDa을 갖는 단백질 삼합체를 나타낸다. β-콘글리시닌의 3개의 주요한 서브유니트는 α'(72kDa), α(68kDa) 및 β(52kDa)이다. α'과 α 서브유니트는 두 공유결합으로 연결된 카보하이드레이트 성분을 포함하고, 베타-소단위는 하나의 공유결합으로 연결된 카보하이드레이트 성분을 포함한다. β-콘글리시닌과 다른 주요한 저장 단백질인 글리시닌의 구조와 특징의 리뷰는 Utsumi 등(1997)에 의해 주어진다. 전통적인 품종개량법을 사용하여 β-콘글리시닌의 α 대 α' 서브유니트의 비율을 변화시키기 위해서는 "Moshidou Gong 503"과 같은 공개된 배원질(germplasm)을 사용할 수 있다. 이 출원에서 용어 β-콘글리시닌은 이러한 서브유니트 변이체를 포함하는 의미이다. 5000㎍/g 미만의 유리 아르기닌과 900㎍/g 미만의 유리 아스파라긴을 포함하는 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지고, 그리고/또는 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 갖는 본 발명의 종자가 제공된다. 용어 "유리(free)"는 대두 또는 대두 종자에 존재하는 다른 분자와 결합되지 않은 아미노산을 나타내고, 4℃에서 오버나이트로 5%의 트리클로로아세트산(TCA) 수용액에 의해 추출 및 용해될 수 있다. 고품질의 대두육, 두유, 콩가루, 콩 단백질 농축물 및 콩 단백질 분리물을 생산하기 위한 저 수준의 유리 아미노산을 포함하는 대두를 선별하는 것의 가치에 대하여는 이전에 언급된 바 없다.
본 발명에 따라 제조된 콩 성분과 식품의 색깔은 알데히드가 아민과 반응하여 갈색 안료를 만들기 때문에 생성된 알데히드(예, 헥사날과 2,4-데카디에날) 수준을 감소시킴으로써 개선될 수 있다. 또한, 지질 산화 생성물의 감소된 수준은 최종 생성물의 색이 덜 희게 되는 황색 안료의 산화적 표백을 제한시킬 수도 있다. 잠재적인 저 표백 문제는 낮은 수준의 황색 안료를 포함하는 대두를 선택하는 본 발명에 의해 해결된다. 본 발명은 30 미만의 "b*값"으로 측정된 황색을 갖고, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자의 그램 당 총 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀을 생성하는 대두 조성물을 제공한다. 대두 종자의 색을 설명하기 위하여 본 발명에서 사용된 것으로, "b*"값은 CIE-L*a*b* 색 스케일을 나타내고(CIE, Colorimetry, Publication 15.2, Second Edition, Vienna(1986) using Colorflex Procedure), 대두와 대두 가루의 청색(음수) 대 황색(양수)에 관련되고, 유사하게 "L*"값은 CIE-L*a*b*색 스케일 상에서 대두 또는 대두 가루의 밝음을 나타낸다. 본 발명의 하나의 구체예에서 대두 또는 대두 가루는 80보다 큰 L*값을 가질 것이다.
바람직한 야생형 대두, 상업용 품종 또는 이들의 잡종은 전래의 식물 육종 방법에 의해 본 발명의 표현형을 나타내는 냄새가 적은 종자를 갖는 대두 식물로 교배시켜서 냄새가 적은 특성과 다른 바람직한 특성(예를 들어, 수율, 고 β-콘글리시닌 조성물, 제초제 저항성)을 포함하는 종자를 창출해낼 수 있다. 냄새가 적은 특성과 다른 원하는 표현형을 나타내는 잡종 자손이 선별된다. 본 발명에 따라 사용된 육종법은, 예를 들어 Knowles와 Briggs (1967)에서 설명된 방법과 당분야에서 공지된 어떤 방법을 포함한다. 신규한 대두종을 개발하고 선별하기 위한 특별한 방법은 미국특허 6,653,534에 개시되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 대두 조성물로부터 제조된 인간 소비를 위한 가공된 식품을 제공한다. 인간 소비를 위한 가공된 식품의 예는 본 발명의 탈피된 콩가루 조성물로부터 제조될 수 있다. 이들 파생물의 예는, 한정되지는 않지만, 바(bar), 음료 및 육류와 육류 대체물, 콩 야구르트, 치즈 대체제, 영양상의 보충물을 포함한다.
다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예를 예시하기 위해 포함되어 있다. 당업자들은 다음의 본 실시예에서 공개된 기술은 본 발명이 용이하게 실시되도록 하기 위하여 본 발명의 발명자들에 의하여 개발된 기술이라는 것을 이해하여야 하고, 따라서 그것의 실시를 위한 바람직한 태양을 구성하는 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 본 발명의 공개의 견지에서 당업자는 공개된 특별한 구체예에서 다양한 변화가 만들어질 수 있고, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어남이 없이 동일 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 관련되는 특정 시약이 동일 또는 유사한 결과가 달성되는 한도에서 본원에서 설명된 시약을 대체할 수 있을 것이다. 당업자에게 자명한 모든 이러한 유사한 치환 및 수식은 첨부된 특허청구범위로 특정되는 것과 같이 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내인 것으로 간주된다.
실시예
1
재료 및 방법
본 실시예는 본 발명의 분석방법을 설명한다. 이 분석방법의 목적은 상이한 대두 계통의 냄새 생성 특성을 결정하는 것이다. 이 방법은 첫 번째로 시작된 냄새생성에 의해 선택된 냄새을 결정한다. 종자를 미세하게 가루로 마쇄하고, 물을 사용하여 효소를 활성화시켜서 냄새가 나게 한다. 생성 속도에 관한 연구는 실온에서 냄새 생성은 약 20분 후에 거의 완전히 되었음을 보여주었다(표 1). 이 시간은 상 이한 대두 계통의 냄새 화합물의 성공적인 정량과 냄새 생성 특성의 평가에 중요하다. 20분 후, 헥사날, 헥사놀 및 2,4-데카디에날의 중수소화 대체물을 내부 표준으로 제공하기 위하여 첨가하였다. 반응은 소듐 설페이트의 첨가에 의하여 정지되었고, 알데히드, 알코올 및 케톤을 추출하기 위하여 10% 메탄올:에테르를 즉시 첨가하였다. 이 방법은 열거된 화합물에 제한되는 것은 아니다. 모든 다른 감지가능한 알데히드, 케톤 및 알코올을 정량할 수 있지만, 중수소화 대체물을 사용한 상기 3종의 경우만큼 정확성을 보이지는 않는다.
표 1: 냄새 성분의 형성에 있어서, 대두 가루를 물과 혼합(가루 0.5g, 물 2㎖, 즉 1:4 비)시킨 후 시간에 따른 효과. 4종의 상이한 대두 계통(A-4, A-5, A-10 및 A-14)에 대한 현탁액의 pH는 약 6.3이었다.
175개 시료에서 이러한 성분을 결정하기 위한 분석은 24시간이 걸렸다. 이는 기체 크로마토그래피/질량분석을 사용하는 추출 및 결정을 포함한다. 분석을 위한 시료의 크기는 전형적으로 0.5g이지만, 0.2~0.7g의 범위일 수 있다. 습윤중량을 기초로 한 냄새 농도의 범위는 0.2~120㎍/g이었다.
대두육 시료 준비: 모든 종자 또는 대두육을 시료로서 수집하였다. 시료로부 터 약 6~12개의 무작위로 선택된 종자 또는 동일한 양의 대두육 조각을 볼 밀에서 1분 동안 약 1200rpm으로 마쇄하여 미세한 가루로 만들었다. 종자를 마쇄하기 위한 볼 밀은 미국특허공보 2003/0146313 A1에 설명되어 있다. 종자 또는 대두육의 갯수는 마쇄의 결과로 대두 가루 약 0.5~1.0g을 얻을 수 있는 갯수로 결정되었다. 새롭게 마쇄된 대두 가루를 다음의 분석에 사용하였다.
대두 가루의 추출: 새롭게 마쇄된 대두 가루를 주요 냄새의 추출을 위하여 사용하였다. 콩가루 약 0.5g(0.48~0.52g)을 뚜껑이 있는 20㎖ 바이알(vial)(VWR TraceCleanTM clear borosilicate Teflon lined closure vials)에 넣었다. 탈 이온수(2㎖)를 캡을 원위치에 놓기 전에 바이알 내의 가루에 첨가하였다. 바이알의 내용물을 약 30초 동안 볼텍스 혼합기(vortex mixer)로 혼합시켜 모든 대두 가루가 바이알 내에서 적절히 수화되도록 하였다. 수화된 대두 가루를 20분간 실온(22℃)에서 물에서 인큐베이트하는 것으로 본 발명에서 정의된 온화한 수성 조건 하에서 인큐베이트하였다. 20분 후, 무수황산나트륨 11±0.3g을 바이알에 첨가한 다음에 바이알 내로 10% 메탄올:에테르 용액 10㎖를 첨가했다. 표준 대체물(헥사날, 헥사놀 및 데카디에날에 대한 중수소화 대체물의 혼합물) 스파이킹 용액 30㎕를 다시 뚜껑을 닫기 전에 바이알 내로 더 첨가하고, 회전하는 진탕기에서 30~40분간 ~200rpm으로 진탕시켰다. 다음의 분석을 위하여, 30~40분 후, 오토샘플러 바이알(Autosampler vial for 7683 HP Autosampler. VWR)에 메탄올:에테르 추출물 1㎖를 넣었다.
대두 가루 추출물의 분석: 메탄올:에테르 추출 매질 내의 대두 가루 추출물을 Agilent 7683 시리즈 오토샘플러와 LECO Chrom TOF Software(LECO Corpotation, St. Joseph, Michigan 49085)를 가진 비행질량 분석기(Flight mass spectrometer)가 장착된 기체 크로마토그래피 Agilent 6890(395 Agilent Technologies, Palo Alto, CA 94306)에서 더 분석하였다. 또한, 가스 크로마토그래피에는 필름 두께 0.4이상과 ID 0.18mm를 지닌 10m DB-WAX 또는 DB1071 기체 크로마토그래피 컬럼(Agilent Technologies)이 장착되었다. 메탄올(메탄올은 EM Science 메탄올 정제 및 트랩 등급임)을 VWR(VWR International West Chester, PA 19380)으로부터 구했고; 에틸 에테르(에틸 에테르 무수물)는 Mallinckrodt(Mallinckrodt, Hazelwood, MO 63042)로부터 구했다. 85% 트랜스(15% 시스) 2,4-데카디에날, 98% 헥사날, 99% 헥사놀, 98% 1-옥텐-3-올, 99% 2-운데카논, 97% 2-노네날 및 99% 2,4-노나디에날은 시그마-알드리치사(Saint Louis MO 63103)로부터 구입하였다. 중수소화된 D12 헥사날, D13 헥사놀 및 D2 2,4-데카디에날은 Lin 등(1999)에 의해 설명된 바에 따라 직접 만들었다. 시료의 분석을 위하여, 시료 1㎖를 기체 크로마토그래피 장치의 주입구를 통해 주입하였다. 크로마토그래피에서 시료를 분석하기 위해 사용된 파라미터는 다음과 같다: 크로마토그래프 파라미터 컬럼: DB-WAX 또는 DB1071 capillary 10m×18mm, 0.4mm Film Injection Volume: 1㎕ Injection Liner: Split/Splitless liner.
온도 프로그램: 최초 1분 동안 55℃, 40℃/분으로 40℃에서 175℃, 0분 유 지, 35℃/분으로 175℃에서 240℃, 0분 유지, 내부온도: 220℃, 주입방법: 최초 1.5분 동안 8psi로 스플릿 없이 펄스, 스플릿 비: 20:1, 캐리어 가스: 헬륨 1.8㎖/분의 일정흐름.
LECO 비행시간 파라미터 온도 인터페이스: 250℃ 소스 온도: 200℃, 질량분석기 소스 온도: 150℃, 스캔 파라미터: 초당 약 50스캔에서 50~250m/z.
분석의 품질 조절: 시료의 각 배치(batch)에 대하여, 블랭크와 스파이크를 동시에 실시했다. 스파이크는 분석되어질 시료들 중의 하나를 두 개 부분으로 쪼개서 실시했다. 시료는 가능한 한 균일한 것이어야 한다. 제2부분은 공지된 양의 헥사날, 1-옥텐-3-올 및 데카디에날로 스파이크 되었다. 이 첨가는 위에서 설명된 바와 같은 추출방법에서 중수소화 화합물의 첨가시점에 수행되었다. 스파이크된 화합물 및 스파이크 되지 않은 화합물의 농도는 다음 식에 의한 회수율 %로 결정하였다:
여기에서
Cs= 스파이크된 시료의 농도, ㎍/습윤 중량 그램
Co= 스파이크 되지 않은 시료의 농도, ㎍/습윤 중량 그램
Wts= 스파이크된 시료의 중량, 그램
Xs= 시료 내로 스파이크된 마이크로그램
블랭크는 콩 가루의 첨가 없이 상기 추출 과정을 따랐다.
분석의 정확성 및 정밀도: 정확성 및 정밀도는 균일한 콩 가루 시료로 실시하고, 공지된 수준의 3가지 화합물인 헥사날, 1-옥텐-3-올 및 2.4-데카디에날을 가진 시료를 스파이킹하므로써 결정하였다. 또한 스파이크 되지 않은 시료를 스파이크된 화합물 회수량을 결정하기 위해 분석하였다. 상이한 스파이크 수준들은 기술적인 오차에 기인한 기초를 결정하기 위하여 표준첨가방법으로 사용가능하다. 표준편차에 따르는 평균치를 결정하였다. 평균치는 상기 방법의 정확성을 평가하기 위해 첨가된 물질의 공지된 수준과 비교하였다. 표준편차는 측정의 정밀도를 제공한다. 이 접근법은, 균일한 콩 가루를 만들기 위한 40종이 넘는 종자를 마쇄하여 종자 가변성을 평균으로 산출하였기 때문에, 분석적 가변성만을 측정한다는 것을 이해하는 것이 중요하다는 것에 주목하라. 더 큰 가변성이 종자 대 종자의 변화 때문에 실질적인 결정에 대하여 일어날 수도 있다. 헥사날에 대한 회수율%는 83.8%였다. 1-옥텐-3-올에 대한 회수율%는 93.6%였다. 2,4-데카디에날에 대한 회수율%는 99.3%였다. 스파이크 접근법에 기초한 경우, 헥사날이 가장 낮은 정확도를 보였다. 이는 헥사날의 휘발성 때문일 것으로 믿어지고, 이 방법은 헥사날에 대한 회수율이 낮다는 사실 때문일 것으로 믿어진다. 옥텐-3-올과 2,4-데카디에날은 스파이크법을 사용하여 더 높은 정도의 정확도를 갖는다. 회수율의 상대적인 표준편차 %로서 표시된 정밀도는 헥사날과 옥텐-3-올에 대하여 5%였다. 2,4-데카디에날에 대한 회수율 값의 상대적 표준편차 %로서 측정된 정밀도는 1.1%였다. 시료 크기는 이 균일한 시료에 대하여 0.2~0.9g의 범위에서 별다른 영향이 없는 것으로 관찰되었지만, 이는 시료에 따라서는 문제가 될 수도 있다. 이는 테스트 되지 않았다. 따라서, 시료 크기는 문제가 되지 않는 것으로 확인될 때까지 또는 상기 방법이 조절될 때까지 약 0.5g이어야만 했다.
모든 화합물에 대한 검출 범위는 0.5~25마이크로그램이다. 표준 곡선에 표준치들을 더 첨가함으로써 범위를 넓힐 수가 있다.
실시예2
적은 냄새를 생성하는 대두의 확인 및 선별
강한 냄새를 대조군 대두(Vinton 81), 리폭시게나아제 2가 결핍된 대두(QT-1) 및 리폭시게나아제 1, 2 및 3이 결핍된 대두(IA2025)로부터 만들어진 두유에서 정량하였다. 두유를 약 8시간 동안 25℃ 온도에서 1:5 비의 물(1g 중량:물 5㎖)에 원하는 깨끗한 종자를 침지시켜 각 대두종으로부터 만들었다. 침지수를 버린 후, 원래 중량의 2배인 대두를 계량하고, 5분 동안 신선한 증류수(2×대두의 건조 중량)와 혼합시켰다. 추가의 증류수(7×대두의 건조 중량)를 20℃에서 약 2분간 혼합시켜서 슬러리를 만들었다. 슬러리를 수조(water bath)에서 20분간 95~98℃에서 끓게 하고, 거칠게 짠 올이 성긴 얇은 무명(원래 치즈를 짜는데 쓰임)을 통해 여과시키고, 가능한 많은 두유가 짜내어지도록 손으로 압착해 짜냈다. 두유는 미생물에 의한 오염을 줄이기 위해 10분간 85~90℃로 수조에서 끓게 하여 파스퇴르살균처리하고, 다음 분석을 위해 냄새를 추출하기 전에 4℃로 저장했다.
냄새는 두유 시료들로부터 추출됐다. 두유를 적어도 30분 동안 FreonTM 113 0.67부분(portion)으로 추출했다. FreonTM 113 추출물을 제거 후, 수층을 에틸 아세 테이트 0.67부분으로 더 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 수거한 후, 수층을 버렸다. FreonTM과 에틸 아세테이트 양쪽 모두를 황산마그네슘을 통해 여과시켜서 가능한 한 많은 양의 물을 제거시키고, Buchi 0.1 회전식 증발기를 사용하여 1㎖로 농축시켰다. 프레온 추출물을 48kPa 하에서 증발시키고, 에틸아세테이트를 86kPa 하에서 증발시켰다.
두유에서 생성된 강한 냄새를 GC-01factometry(Acree T. E, Analytical Chem. 69:170A-175A, 1997)를 사용해 정량했다. GC-01factometry는 냄새탐지포트를 지닌 기체 크로마토그래피로서, 냄새를 내는 물질로서의 화합물의 강도는 공기 흐름 또는 퍼프(puff)에서 냄새를 내는 물질들에 대한 인간의 반응의 측정으로써 측정되었다. 실리카 모세관 컬럼(필름 두께=0.33㎛)과 결합된 12m×0.32mm의 교차결합된 메틸 실리콘으로 장치된 Hewlett Packard 6890 기체 크로마토그래피를 CharmAnalysisTM(Acree, T. E.; Bamard, J; Cunningham D. G.; Food Chem. 14, 273~286, 1984)을 위하여 사용하였다. 용출물은 캐리어 가스로서 헬륨(2㎖/분)과 메이크업 가스로서 질소(약 30㎖/분)로 이루어졌다. 용출물은 50~75% 사이로 습윤화된 99% 실험실 공기인 냄새 나는 공기(20ℓ/분)와 혼합되고, 10mm 직경의 실릴화된 파이렉스 관을 통하여 냄새탐지기를 통과하였다. GCMS 오븐을 6℃/분으로 초기 온도 35℃로부터 225℃에 이르기까지 3분 동안 오븐온도를 올리도록 프로그램되었다. 두유를 CharmAnalysisTM하는 상세한 방법은 Yu-Wen Feng에 의한 the faculty of Graduate School of Cornell University에 제출된 박사논문에서 알 수 있다.
리폭시게나아제 2가 결핍된 대두(IA2025와 QT-1)는 대조군보다도 낮은 수준의 헥사날을 생성했다(표 2). 3종의 리폭시게나아제 모두가 결핍된 대두(IA2025)는 2,4-데카디에날과 1-옥텐-3-온을 가장 높은 수준으로 생성하였으나, 리폭시게나아제 2가 결핍된 대두(QT-1)는 5종의 강한 냄새 모두가 가장 낮은 수준이었다(표 2). 상기 결과로부터 리폭시게나아제 2 이외의 미지의 구성요인들이 대두의 지질 산화반응을 조절하는데 관여한다는 것이 명백하게 되었다. 대두종 QT-1은 리폭시게나아제 2를 포함하거나 또는 포함하지 않는 상업적으로 낮은 냄새 대두종을 창출하는데 유용한 종으로 확인되었다. 실시예 1의 방법을 QT-1과 적은 양의 2,4-데카디에날, 헥사날, 헥사놀 및 1-옥텐-3-올을 생산하는 다른 대두 계통의 자손을 동정하기 위하여 발전시켰다.
표 2: 3종의 대두로부터 제조된 두유에 존재하는 냄새의 Charm 값. 몬산토 소유 계열은 3종의 리폭시게나아제가 존재하지 않는 것(IA2025)과 tofu 대두(Vintou 81)보다도 적은 수준의 이취를 생성하였다.
표 3은 본 발명을 설명하기 위한 자손을 개발하기 위하여 사용된 대두 교배를 설명한다. 식물 육종의 표준 방법이 이러한 계통을 작출하기 위하여 사용되었다.
표 3: 본 발명의 대두 및 방법을 설명하기 위하여 사용된 자손을 개발하기 위하여 사용된 대두 교배.
실시예
3
본 발명에 의하여 선별된 대두 계통에서 적은 냄새 생성, 낮은 색도, 적은 유리 아미노산 특성의
년별
및 위치별 일관성의 관찰
색 평가를 위하여 모든 종자를 시료로서 수집하였다. 시료로부터 선택된 원하는 수의 종자를 Mega-Grinder에서 1200rpm으로 1분간 마쇄하여, 미세한 대두 가루를 만들었다. 종자를 마쇄하기 위한 Mega-Grinder는 미국특허공보 2003/0146313 A1에 설명되어 있다. 새롭게 마쇄된 대두 가루를 다음의 분석을 위하여 사용하였다.
Hunter Labs에 의해 만들어진 ColorFlex Spectrocolorimeter Model 45/0 색측정 시스템(Hunter Associates Lab. Inc, Reston VA, USA)을 제조자에 의해 시사된 표준작동방법에 의해 대두 가루의 색 측정을 위하여 사용하였다. 색은 ColorFlex 과정을 사용하여 CIE-L*a*b* 색 스케일(CIE, Colorimetry, Publication 15.2, Second Edition, Vienna, 1986)로 측정하였다. 프랑스어로 Commission Internationale de l'Eclairage의 약어 CIE인 International Commission on Illumination은 과학과 조명 예술에 관련된 모든 문제에 관하여 회원국 간의 정보 교환과 국제적인 협력에 헌신하는 기구이다. L* 값은 대두 가루의 밝기에 관한 것인 반면에 b* 값은 대두 가루의 청색(음수) 내지 황색(양수)에 관한 것이다. 상이한 계통으로부터 만들어진 대두 가루의 색도는 표 4와 표 5에 설명되어 있다.
유리 아미노산: 마쇄 되지 않은 시료를 온도/습도가 조절된 안전한(APHIS 인증) 곳에 저장했다. 시료들을 CAT Mega-Grinder를 사용해 마쇄하여 콩 가루를 만들고, 종자 저장소에서 4℃로 저장했다. 콩 가루를 4℃에서 5% TCA로 오버나이트로 추출하고, 원심분리한 다음에 추출물을 -80℃에서 저장했다. 추출물을 여과하고, 필요하다면 희석시키고, OPA 방법에 의해 유리 아미노산을 분석했다. OPA 방법은 C18 역상 HPLC 컬럼에 주입하기 전에 시료들을 유도하기 위해 o-프탈디알데히드(OPA)를 사용한다. 유도된 일차 아미노산은 R-기에 의해 효율적으로 분리되고, 민감한 형광계에 의해 정량적으로 검출된다. 이 방법에 대한 상대적인 표준편차는 ~3%이다.
리폭시게나아제 활성: 시료들을 Mega-Grinder를 사용하여 가루로 만들었다. 각각의 새롭게 마쇄된 시료를 3회 평량하고(5mg±1), 2㎖ 96웰 추출 플레이트의 특정 웰에 넣었다. 시료들은 0.1M K2HPO4(pH 7.0 또는 pH 9)로 실온에서 1시간 동안 추출했다. 원심분리 후, 얻어진 상등액은 분광광도계를 사용하여 리놀레산(기질)의 소비를 측정하기 위해 사용하였고, 다음으로 Bio Rad Protein Dye를 사용하여 시료당 총 단백질을 결정하였다. 리폭시게나아제 유니트는 1분간의 반응 동안에 230nm 에서의 흡광도 변화를 사용하고, 흡광계수(ε=23,000M-1cm-1)를 사용하여 계산하였다. 반응 동안에 소비된 기질의 농도는 각각의 값을 식 A=εbC에 대입시켜서 계산하였다. 리폭시게나아제 1유니트는 분당 그리고 총 추출 단백질 mg 당 소비된 기질의 ㎛oles로 정의하였다. pH 7.0 또는 pH 9.0에서 제조된 시약 용액을 사용하여 이 검정은 각각의 리폭시게나아제 2 및 리폭시게나아제 3 또는 리폭시게나아제 1의 수준(효소의 유니트)을 측정가능하다. 리폭시게나아제 유니트 결과는 리폭시게나아제 2와 3의 활성에 대해서는 LOX 유니트 pH 7.0으로 주어지고, 리폭시게나아제 1의 활성에 대해서는 LOX 유니트 9.0으로 주어진다.
결 과: 대두 냄새 특징은 다수의 위치(표 4)에서 다년(표 4 및 표 5)간 성장시 존속되었다. 냄새 분석(실시예 1에서 설명됨)에서 낮은 수준의 헥사날, 헥사놀, 2,4-데카디에날 및 1-옥텐-3-올을 생성하는 대두 계통은 고 수준으로 생성하는 계통과는 일관되게 상이했다(표 4). 표 4에서, 대두 계통은 생성한 헥사날, 헥사놀, 2,4-데카디에날의 총 수준의 순서에 따라 분류되었다. 예를 들어, 표의 상부에서 계통 A-1은, 65.74±21.97㎍/g의 3종의 냄새를 생성하는 표의 하부에 있는 A-18과 비교하여, 18.21±4.21㎍/g의 3종의 냄새를 생성하였다. 동일 교배(예를 들어, 교배 A)로부터의 대두에 의해 생성된 헥사날 및 헥사놀의 총 양은 생성된 2,4-데카디에날의 양(표 6, R2=0.85)과 상호관계가 있었으며, 이는 유전적 변화와 조성의 변화에 의한 비슷한 메카니즘과 조절을 시사한다. 생성된 1-옥텐-3-올의 수준은 헥사날, 헥사놀 및 2,4-데카디에날(표 6, R2=0.01)과는 독립적이었고, 이는 형성과 조절의 상이한 메카니즘을 시사한다. 낮은 수준의 1-옥텐-3-올을 생성하는 2~3 위치에서 성장된 대두 계통은 고 수준의 1-옥텐-3-올을 생성하는 계통과는 일관되게 상이하였다. 예를 들면, 계통 A-18은 4.70±0.88㎍/g의 1-옥텐-3-올을 생성하였고, 계통 A-12는 14.67±2.37㎍/g의 1-옥텐-3-올을 생성하였다. 누구든지 저 수준의 1-옥텐-3-올과 저 수준의 2,4-데카디에날, 헥사날 및 헥사놀을 생성하는 유전학적 조성물의 조합을 갖는 계통을 선별할 수 있다(예를 들어, 계통 A-6).
표 4 A 및 B: 표 3에서 나타난 바와 같은 교배 A, B, C, D 및 E의 자손으로부터 만들어진 마쇄된 대두에 의하여 생성된 색 및 냄새. 값은 2002년에 2 또는 3위치(Ames, Iowa; Oxford, Indiana; Gladbrook, Iowa)에서 성장한 각 계통에 대한 평균과 표준편차(Stdev)이다. 열거된 교배 B의 자손은 총 지방산 중 2.9±0.4%의 낮은 리놀렌산을 가진다. 모든 계통은 황색 배꼽(hilum)을 나타낸다. 마쇄된 대두는 8%의 수분 함량을 가진다. 색도는 L*(밝음), a*(적녹색) 및 b*(황청색)이다.
표 5 A 및 B: 2001년에 성장한 교배 A, B, C, D 및 E의 자손과 상품 대두(대조군)로부터 만들어진 대두 가루의 특징. 마쇄된 대두의 수분 함량은 7%이었다. 계통의 순서는 표 4와 동일하다. 열거된 계통 B는 낮은 리놀렌산(총 지방산 중 2.9±0.4%)을 가진다. 하나 이상의 리폭시게나아제를 결핍한 2종의 자손과 3종의 리폭시게나아제 모두를 함유하는 다른 종을 L1, L2 및 L3로 명명하였다. 리폭시게나아제 활성은 기질 mg 당 소비된 기질의 마이크로몰의 단위를 가진다. 색도는 L*(밝음), a*(적녹색) 및 b*(황청색)이다.
표 6: 2001년 및 2002년에 수확된 대두 자손으로부터 생성된 냄새 간의 R2 값에 의하여 결정된 선형 관계. 선형 감소는 표 4 및 5에서의 데이터로부터 계산되었다. 약어: H+H=헥사날+헥사놀; D=2,4-데카디에날; O=1-옥텐-3-올; DHH=2,4-데카 디에날+헥사날+헥사놀.
본 발명의 방법과 대두를 사용하여 낮은 냄새 생성률과 낮은 색도를 갖는 종을 우수하게 수확하는 것을 개발하는 것이 처음으로 가능하게 되었다. 예를 들면, 계통 A-1, A-4 및 A-6은 상업적 대조 기준의 90, 90.5 및 104%를 수확하였다.
pH 7 및 pH 9에서 리폭시게나아제 활성과 수화된 대두 가루로부터의 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀의 생성 사이에서의 관계는 전혀 없거나 또는 거의 없다(R2 값 <0.35, 표 7). pH 7 및 pH 9에서 주요한 리폭시게나아제 활성을 나타내는 대두(계통 A-1)는 리폭시게나아제 활성이 결핍된 계통(계통 C-1)과 유사한 냄새 특성을 가진다(표 5). 또한, 리폭시게나아제 1, 2 및 3이 결핍된 상업적으로 이용성이 있는 대두(1999년 수확으로부터의 IA2032)가 리폭시게나아제 활성 및 냄새 생성에 대하여 테스트되었다. pH 7과 pH 9에서 3종의 리폭시게나아제가 결핍된 대두 가루에 대한 리폭시게나아제 활성은 없었지만, 상당한 수준의 헥사날(23.3㎍/g), 헥사놀(14.9㎍/g) 및 2,4-데카디에날(5.8㎍/g)이 본 발명의 냄새 분석에서 형성되었다. 리폭시게나아제 저해제를 사용한 실험 후, 적어도 하나의 다른 리폭시게나아제가 이 대두 조성물에서 활성임을 결론지었다.
엷은 색을 갖는 단백질 성분은 식품산업, 특히 낙농 유형의 생산품에서 가치가 높다. 낮은 색도의 대두가 선택될 수 있는지를 결정하기 위하여, 대두를 2~3 위치에서 성장시켰다. 낮은 색도의 대두는 마쇄된 대두의 b* 값으로부터 결정되는 것과 같이 선별될 수 있다는 것이 발견되었다(높은 b* 값은 더 황색이고, 덜 푸른 것을 나타낸다; 표 4). 예를 들면, 대두 A-2는 22.16±1.39의 b* 값을 갖고, 대두 A-6은 27.35±2.85의 b* 값을 가졌다(표 4). 2001년과 2002년에 성장된 대두 계통의 b* 값 사이에는 상관관계가 존재하였다(R2=0.7, 표 7).
표 7: 2001년도와 2002년도에 수확된 대두 자손으로부터 생성된 냄새, 유리 아미노산 및 색에 대한 R2 값에 의하여 결정되는 선형 관계. 선형 감소는 표 4 및 5에서의 데이터로부터 계산되었다. 2002년도 데이터와의 유리 아미노산 상관관계는 3종의 분리물(outlier)(A-4, B-5 및 B-6) 없이 만들어졌다.
유전적 특질 이외에도 환경적 요인들이 대두의 냄새 생성 특징에 관계있는 조성에 영향을 준다. 환경적인 효과는 2001년과 2002년 두 시즌에 성장된 대두 계통의 냄새 생성 특징을 비교함으로써 명백해졌다. 작출된 계통에 대한 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀의 범위는 2001년에는 12~44㎍/g이었고, 2002년에는 17~65㎍/였다(표 4 및 5). 대두의 1-옥텐-3-올 생산성은 2001년과 2002년에 성장된 동일 계통에 의해 생성된 1-옥텐-3-올 사이에서의 상관관계의 부존재에 의해 입증되는 바와 같이 환경적 요인들에 가장 민감한 것으로 나타났다(R2=0.07, 표 6). 대조적으로, 2001년과 2002년의 대두 계통에 의해 생성된 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀의 수준은 상관관계가 있었다(R2=0.62, 표 6).
대두 계통에서 유리 아르기닌(Arg)과 아스파라긴(Asp)의 양을 결정하였다. 유리 아르기닌과 아스파라긴의 양은 상관관계가 있었고(R2=0.81, 표 7), 전체 아르기닌+아스파라긴은 353~3300㎍/g 범위이었다(2001)(표 5). 대두에서 유리 아르기닌+아스파라긴은 선택된 냄새 또는 성질에는 관계가 없으므로(R2 <0.3, 표 7), 낮은 2,4-데카디에날, 낮은 색도와 낮은 유리 아미노산들의 조합을 갖는 계통을 선택하기 위해 유리아미노산들을 분석할 필요가 있다. 낮은 유리의 아미노산 대두 계통을 선별할 가능성은 서로 다른 두 해에 수확된 계통에서의 유리 아르기닌+아스파라긴 사이의 우수한 상관관계에 의해 지지되었다(R2=0.8, 표 7).
실시예
4
높은 β-
콘글리시닌
조성 및 낮은 유리 아르기닌 및 아스파라긴 조성과 낮은 냄새 생성 특성과 낮은 색도 특성과의 조합
높은 β-콘글리시닌 특성을 갖는 공급원은 글리시닌이 결핍되고, 전체 단백질의 약 55%를 β-콘글리시닌으로 포함하는 돌연변이 대두였다(미국 특허 6,171,640). 리폭시게나아제 검정은 상기 설명된 것과 같은 낮은 냄새 생성 계통을 선별하는데 유용하지 않았다. 상품용 대두에 대한 정상 범위 내의 단백질, 지방 및 아미노산 프로파일을 가지는 대두가 작출되었다.
대두 단백질 서브유니트의 정량: 약 8종의 종자를 Mega Grinder를 사용하여 마쇄하였다(미국특허공보 2003/0146313 A1). 각각의 시료에 대하여, ~30mg의 가루를 45~60분 동안 뉴테이터(nutator) 또는 멀티플레이트 볼텍서(vortexer)에서 0.1M DTT가 존재하는 pH 6.8의 1.0㎖ Laemmli SDS 완충액에서 추출하였다. 튜브를 3~5분 간 원심분리하였다. 상등액 부분을 초원심분리기로 이동시키고, 상기 완충액으로 희석하여 1.2~1.5㎍/㎕의 총 단백질을 얻었다. 시료를 3분간 끓이고, 식히고, 원심분리하였다. 미리 성형된 10~20% 구배 트리스-HCl 표준 겔에 각 시료의 15~20㎍ 단백질을 로딩하였다. 트랙킹 다이(tracking dye)가 겔의 바닥에 도달할 때까지 약 1.2시간 동안 180~200V에서 1× 트리스 글리신-SDS 런 완충액으로 전기영동하였다. 겔을 40% 메탄올/10% 아세트산으로 30~60분 동안 고정시키고, 콜로이드성 쿠마시 블루(coomassie blue) G-250으로 최소 오버나이트 또는 최대 3일간 염색하였다. 백그라운드를 제거하기 위하여 겔을 탈이온수로 탈염색하였다. 상기 겔을 GS 800 Calibrated Densitometer를 사용하여 이미지를 만들었다. 정량을 Bio-Rad Quantity One Software를 사용하여 수행하였다. 소프트웨어를 시료 레인(lane)에서의 각 밴드의 상대적인 질량을 정량하는데 사용하였다. 글리시닌 서브유니트 %와 베타 콘글리시닌 서브유니트 %를 레인에서의 전체 단백질의 상대적 백분율로서 보고하였다.
전체 아미노산 분석: 완전한 프로파일을 얻기 위해 3가지 방법으로 시료를 분석하였다. 트립토판은 수산화나트륨으로 염기 가수분해가 요구되었다. 황을 포함하는 아미노산은 염산으로 가수분해하기 전에 과포름산으로 산화반응이 요구된다. 남아있는 아미노산에 대한 시료 분석은 염산으로 직접적인 산 가수분해를 통하여 이루어졌다. 일단 가수분해되면, 다음으로 각각의 아미노산을 자동화된 아미노산 분석기를 사용하여 정량하였다(AOAC INTERNATIONAL, 2000의 공식적인 분석방법).
회분( Ash ): 시료를 550℃의 전기로에 넣고, 모든 휘발성 유기물을 제거시키기 위해 고열로 태웠다. 남아 있는 비휘발성 물질을 중량분석법으로 정량하고, 회 분 %를 결정하기 위하여 계산하였다. AOAC INTERNATIONAL, (2000)의 공식적인 분석방법.
탄수화물: 총 탄수화물 수준은 새로운 중량으로 얻은 데이타와 다음의 식을 사용하여 차이에 의해 계산하였다: 탄수화물 %=100%-(단백질 %+지방 %+습도 %+회분 %). 미국 농산부(1973).
속실렛 ( Soxhlet ) 추출에 의한 지방: 시료를 정량하고, 모래 또는 황산나트륨을 함유하는 셀룰로오스 팀블(thimble)에 두고, 여분의 습기를 제거시키기 위하여 건조시켰다. 지방을 제거하기 위하여 시료에 펜탄을 떨어뜨렸다. 다음으로, 추출물을 증발, 건조 및 무게를 달았다. AOAC INTERNATIONAL(2000)의 공식적인 분석방법.
습도: 시료를 진공오븐 내에서 약 100℃로 건조시켜서 일정 중량이 되게 하였다. 수분손실량을 결정하고, 습도 %로 전환시켰다.
단백질: 시료 내의 질소성분 화합물을 비등 황산과 수은촉매 화합물의 존재 하에서 환원시켜 암모니아를 만들었다. 산 처리로 알칼리를 만들었다. 암모니아를 증류시키고, 다음으로 표준산으로 적정하였다. 질소 %를 계산하고, 인자 6.25를 사용하여 단백질로 전환시켰다. AOAC INTERNATIONAL(2000)의 공식분석방법. Bradstreet, (1965). Kalthoff와 Sandell (1948).
결 과: 낮은 냄새 생성 특성을 포함하는 대두와의 교배로부터 선별된 높은 β-콘글리시닌 대두 계통군은 헥사날, 헥사놀, 2,4-데카디에날 및 1-옥텐-3-올의 생성에 의해 측정된 바와 같은 다양한 종류의 냄새 생성 특징을 나타내었다(표 8). 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지고, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 갖는 표 8의 대두와 비교하여, 상품용 대두는 단백질의 약 22%를 β-콘글리시닌으로 가지고, 약 38%를 글리시닌으로 포함하였다. 대두는 실시예 1의 냄새 평가에서 헥사날+헥사놀과 2,4-데카디에날의 총 양이 20㎍/g 미만으로 생성된 전체 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지는 것으로 작출되었고, 또한 낮은 수준의 유리 아스파라긴과 유리 아르기닌을 포함한다(표 8). 예를 들면, 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀의 전체량이 20㎍/g 미만이고, 유리 아르기닌+유리 아스파라긴의 전체량이 마쇄된 대두 그램 당 360~2,840㎍ 사이로 생성된, 20종의 높은 β-콘글리시닌 계통을 본 발명에 의하여 작출하였다(표 8). 이들 계통의 유리 아스파라긴은 마쇄된 대두 그램 당 35~1,000㎍ 사이이고, 이 계통의 유리 아르기닌은 마쇄된 대두 그램 당 500~2400㎍ 사이였다.
표 8 A 및 B: 미국에서 수확된 높은 β-콘글리시닌 대두 자손의 특징. 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 가지고, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 가지는 대두는 실시예 1의 냄새 측정에서 대두 가루 그램 당 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀을 생성하는 것으로 작출되었다.
표 8A
표 8B
리폭시게나아제 활성은 높은 β-콘글리시닌 대두 시료들에 대해 상당히 다양하였다. pH 7과 pH 9에서 리폭시게나제 활성과 동일한 대두 가루로부터 생성된 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀의 전체량 사이의 관계는 없었다(R2 값 <0.02).
추가적인 실험은, 30% 이상의 β-콘글리시닌과 25% 미만의 글리시닌을 갖는 대두는 상품용 대두의 범위 내에 속하는 낮은 색이나 아미노산 조성을 갖는 것으로 선택될 수 있다는 것을 보여주기 위하여 수행되었다. 또한, Roundup Ready® 특징을 포함하는 4종의 높은 β-콘글리시닌 대두를 선별하여, 3개 지역에서 상업용 체크의 평균치와 동일하거나, 더 좋은 결과를 얻었다. 이러한 대두는 약 22의 평균 b* 값과 약 85의 평균 L* 값으로 설명된 낮은 색 특성을 갖는다(표 9). 아미노산 조성(표 9)은 International Life Science Institute Crop Composition Database(Version 1.0, 2004년 3월 22일)에서 발간된 상품용 대두(표 10)에 대한 범위 내에 들었다. 3종의 높은 β-콘글리시닌 대두 계통(표 9)의 평균 아미노산 조성은 ILSI 데이타베이스에서의 평균 대두 조성물과 비교되었다(표 10). 높은 β-콘글리시닌 계통의 4종의 아미노산(아르기닌, 리신, 히스티딘 및 세린)은 상품용 대두의 평균 조성과 10~15% 사이에서 상이하지만, 여전히 상품용 대두 조성의 범위 내에 속한다.
또한, 높은 β-콘글리시닌 대두의 관능성은 낮은 리놀렌산, 중급 올레산 대두와의 교배로 더 향상될 것으로 기대된다. 낮은 리놀렌산, 중간 수준의 올레산 대두는 전통적인 육종법을 사용하여 몬산토에서 작출되었고, 총 지방산 함량 중 약 2%의 리놀렌산, 약 25%의 리놀레산 및 약 59%의 올레산을 포함한다.
표 9: 2003년도에 세 위치에서 성장한 대두의 조성, 색 및 냄새 특성. 모두는 Roundup Ready® 특징 및 진한 배꼽을 가졌다.
표 10: 3종의 높은 β-콘글리시닌 대두의 평균 조성과 International Life Science Institute Crop Composition Database(Version 1.0)의 평균 대두 조성의 비교. 데이터를 얻기 위하여 사용된 선별 기준: 곡물 유형, 대두-글리신 맥스(Glycine max), 조직 형태: 종자, 경작년도, 모든 국가, 모든 주. 약어: FW=대두 가루 중량. DW=건조 중량.
실시예
5
본 발명에 따라 선별된 대두와 상품용 대두의 냄새 및 색 특성의 비교
본 발명의 대두의 냄새 및 색 특징과 비교를 위하여 상품용 대두의 냄새 및 색 특징을 결정하였다. 냄새 평가에서 어떤 대두는 17.5㎍/g 미만의 헥사날+헥사놀 을 생성하였고, 어떤 대두는 11㎍/g 미만의 2,4-데카디에날을 생성하였다(표 11). 그러나, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자 그램 당 20㎍ 미만의 4-데카디에날+헥사날+헥사놀을 생성하는 상품용 대두는 없었다. 두 시즌에서 20㎍/g 미만의 헥사날+헥사놀+2,4-데카디에날을 생성하는 본 발명의 리폭시게나아제를 함유하는 4계통을 작출하였다(표 4, 5). 예를 들면, 2001년과 2002년도 수확으로부터의 계통 A-1은 헥사날+헥사놀+2,4-데카디에날의 합을 각각 18.0과 18.2㎍/g으로 생성하였다(표 4, 5). 헥사날+헥사놀 및 2,4-데카디에날의 전체량이 20㎍/g 미만을 갖도록 생성된 20종 이상의 높은 β-콘글리시닌 계통을 본 발명에 의하여 작출하였다(표 8). 예를 들면, 1종의 높은 β-콘글리시닌 대두는 헥사날+헥사놀을 9.7㎍/g으로 생성하였고, 2,4-데카디에날을 3.2㎍/g으로 생성하였다(표 8).
상품용 대두의 색은 넓은 범위를 가졌다. 예를 들면, b* 값이 27~34의 범위였다(표 11). 본 발명의 대두 계통은 22만큼 낮은 b* 값으로 연장되는 것을 발견하였다(표 4, 표 9).
표 11A 및 B: 수확된 상품용 대두의 색 및 냄새 생성 특징
표 11A: 냄새
표 11B: 색
실시예
6
낮은 냄새 생성 특성과 낮은 리놀렌산 조성 특성을 조합시키기 위한 가능성의 설명
이 실시예는 낮은 냄새 생성 특성과 낮은 리놀렌산 조성 특성을 조합시키는 것이 가능한가를 보여주고, 냄새의 생성시에 탈피 콩의 효과를 더 조사한다. 리놀렌산인 대두 지방산의 백분율은 정상적으로 약 8%이다. 전통적인 육종법을 사용하여, 6% 미만의 리놀렌산과 낮은 냄새 생성 특징을 포함하는 대두를 작출하는 것이 가능하였다(표 12).
1-옥텐-3-올의 생성은 냄새 분석에서 측정된 다른 휘발성 화합물의 생성과는 독립적이다. 하나의 가설은 대두 표면의 균류 효소가 측정에서 1-옥텐-3-올의 신속한 형성의 원인이라는 것이다. 종자를 가루로 마쇄하기 전에 탈피시키는 것은 냄새 분석에서 균류 효소의 수준을 감소시킬 것이라는 것이 이유이다. 모든 대두는 냄새 측정에 사용되는 가루를 얻기 위하여 일반적으로 마쇄된다. 조심스럽게 탈피된 6종의 적은 냄새, 적은 리놀렌산 대두 계통을 사용하여 재시험을 수행하였다. 탈피된 종자로부터 생성된 1-옥텐-3-올의 양은 전체 종자의 약 절반이며, 이는 꼬투리부분에서 균류와 균류 효소와 같은 성분이 1-옥텐-3-올 생성에 기여한다는 가설을 뒷받침한다(표 13). 리폭시게나아제가 없는 대두는 자주 더 고 수준의 1-옥텐-3-올을 생성한다(표 3). 리폭시게나아제는 곰팡이의 성장을 억제시키는 역할을 할 수 있으므로, 리폭시게나아제의 부재시에 곰팡이 감염은 더 많은 균류 효소들과 1-옥텐-3-올의 생성을 더 크게 할 수 있다고 결론 지을 수 있다. 본 발명의 선별에 의해 확인된 리폭시게나아제를 포함하는 적은 냄새의 대두는 더 많은 냄새를 가지는 대두 보다 더 낮은 1-옥텐-3-올 범위를 갖는 경향이 있다(예를 들어, 표 12).
표 12 A1 내지 A4: 적은 리놀렌산 대두 계통의 색 및 냄새 생성 특징. 색도는 L*(밝음), a*(적녹색) 및 b*(황청색)이다.
표 13: 냄새 분석에서 1-옥텐-3-올의 형성은 콩 가루를 만들기 전에 대두가 탈피된 경우 감소되었다.
실시예
7
냄새 생성에 대한
pH
의 효과
본 발명에 의해 제공된 표준냄새분석은 물에 콩가루를 첨가하고, 약 pH 6.3에서 냄새가 생성되는 것과 관련된다. 다음 실험의 목적은 이 조건 하에서 낮은 수준의 냄새를 생성하는 종이 다른 pH 조건 하에서 낮은 수준의 냄새를 생성하는 지를 결정하는 것이었다. 상업적인 대조군 대두의 냄새 생성 특징을 저 수준의 냄새를 생성하는 계통(A-4)과 비교하였다. 계통 A-4는 pH 3.0 및 pH 5.5와 pH 7과 pH 9.2에서 더 낮은 수준의 데카디에날과 헥사날을 생성하였다(표 14). 이러한 데이터는 광범위한 pH 조건에 걸쳐서 저 수준의 냄새를 생성할 대두를 선별하는 방법으로서 완충액 없이 이 분석법의 사용을 지지해준다. 헥사날과 2,4-데카디에날의 가장 높은 농도는 pH 9에서 생성되었고, 상기 pH에서 최소량의 1-옥텐-3-올이 생성되었다(표 14).
표 14: 상품용 대조군 대두 및 적은 냄새 생성 대두(2003년도에 수확된 표 4 및 5의 A-4)로부터 냄새 생성에 대한 pH의 영향. 본 측정에서 사용된 냄새 분석은 콩 가루를 각각의 pH(3.02, 5.45, 7.01 및 9.16)에서 0.1M K2HPO4를 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일하다.
실시예
8
대두 단백질 조성의 두유 침전물에 대한 영향
본 실시예는 본 발명의 개선된 단백질 조성을 갖는 대두로부터 만들어진 두유에서 생성된 더 낮은 수준의 침전물을 설명한다. 음료에서 입자를 느끼는 것을 꺼려하므로, 단백질을 포함하는 침전물은 두유의 관능성에서 부정적 영향을 갖고 있다.
두유 제조. 적은 냄새의 대조군 대두(A-4)와 약 39%의 β-콘글리시닌과 약 13%의 글리시닌을 갖는 대두를 Mega Grinder를 사용하여 마쇄하여 콩가루를 얻었다. 각각의 가루 시료를 50㎖ 일회용 폴리프로필렌 원심관 내의 36.75g의 물(4℃)에 첨가하여, 혼합물 내에서 단백질의 최종농도가 3.3중량%가 되게 하고, 출력제어 셋팅 8에서 15초 동안 소니캐이트하였다. 소니캐이트된 시료를 Eppendorf Centrifuge 5804 R을 사용하여 4℃에서 8,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. (두유) 상등액을 50㎖ 일회용 원심관에 부었다. 각 두유의 일부분(27.25g)을 다른 50㎖ 일회용 원심관에 옮겼다. 상기 시료는 다음의 다양한 수크로오스 첨가를 위하여 2벌로 제조하였다. 수크로오스(0.6987g)를 열처리 전이나 또는 열처리 후에 두유 27.25g에 첨가하였다.
두유시료들을 95℃의 실리콘 오일 조 내의 50㎖ 일회용 폴리프로필렌 원심관에 넣고 5분간 열처리 한 다음, 시료들을 아이스 조로 옮겨 식히고, 30일 동안 냉동 저장하였다. 침전물은 시간 경과에 따라 두유시료에서 생성되었다. 생성된 침전물의 양을 다음과 같이 정량하였다. 원심관 바닥의 침전물을 관들을 전후로 두드려 분산시켰다. 두유 시료를 평량된 원심관 내로 옮기고 최종중량을 기록하였다. 원심관을 Effendorf Centrifuge 5804 R에 넣고, 25℃, 8000rpm으로 2분간 원심분리하였 다. 두유 상등액을 버리고, 남아 있는 침전물의 양을 계산하였다. 침전물의 양은 두유양의 %로서 기록하였다(침전물 %=100×침전물 중량/두유 중량).
결 과 . 대조군 두유는 고 수준의 β-콘글리시닌 두유의 적어도 2배만큼의 침전물을 가졌다(표 15).
표 15: 대두 단백질 조성의 대두 침전물에 대한 영향. A-4는 대조군 대두이다. HBC는 높은 β-콘글리시닌, 낮은 글리시닌 대두이다.
상기 실시예는, 콩이 리폭시게나아제 1, 2 및 3을 포함한 경우라도 적은 수준의 냄새를 생성할 수 있는 특정의 조성물들이 제조되었음을 보여준다. 또한, 개선된 관능성을 갖는 콩을 선택할 수 있는 가능성을 보여주고, 상기 대두는 대두 중의 글리시닌 단백질, 유리 아르기닌과 아스파라긴, 황색 안료 및 폴리불포화지방산의 양과 수성의 마쇄된 가루로 만든 대두 현탁액에 의하여 생성된 2,4-데카디에날, 헥사날, 헥사놀과 1-옥텐-3-올의 냄새의 양을 기초로 하여 선택되었다. 대두 성분과 식품에서 2,4-데카디에날, 헥사날, 헥사놀과 1-옥텐-3-올 및 다른 보다 강한 냄새를 생성하는 대두의 성질을 측정하기 위한 방법을 공개한다. 대두 냄새를 측정하는 이러한 방법에 있어서, 1 대 4의 비로 물에서 대두를 인큐베이트하므로써 2,4-데카디에날이 실온의 현탁액에서 신속하게 생성되고, 매우 낮은 수준의 냄새를 생성하는 리폭시게나아제 1, 2 및 3을 포함하는 대두를 육종하는 것이 가능하다는 것 을 관찰할 수 있었다.
또한, 본 실시예에서는 30% 이상의 β-콘글리시닌과 25% 미만의 글리시닌을 가지고, 정상 또는 낮은 유리 아르기닌 및 유리 아스파라긴을 갖는 내생의 콩 조성물을 만들 수 있음을 보여준다. 저 수준의 냄새와 색 특성은 고 수준의 β-콘글리시닌 조성물과 조합가능하고, 또 다른 조합물은 저 수준 리놀렌산과 중간 수준의 올레산을 포함할 수 있다는 것을 제시한다. 글리시닌은 콩 성분과 식품에서 불용성 단백질원이고, 이는 음료에서 침전물을 만들고, 바람직하지 못한 구감을 만든다. 유리 아르기닌과 아스파라긴은, 2,4-데카디에날과 같은 냄새 화합물과 더 반응하여 2-펜틸 피리딘과 같은 강력한 냄새를 만드는 공정에서 암모니아를 생성할 수 있다. 리놀레산과 리놀렌산은 냄새 생성을 위한 기질인 폴리불포화 지방산이고, 대두에서 이들의 함량을 낮추는 것은 냄새 생성을 더 낮추는데 도움을 줄 것이다. 대두의 안료는 색을 없애는데 공헌하고, 나아가 관능성에 영향을 준다. 높은 β-콘글리시닌, 낮은 유리 아르기닌과 아스파라긴, 적은 냄새와 적은 색 및 적은 폴리불포화 지방산 대두 조성물 전체는 관능성이 우수한 콩 단백질 성분 및 음식을 만들기 위한 본 발명의 가장 가치있는 조성이다. 또한, β-콘글리시닌이 콩 단백질의 콜레스테롤과 중성지방을 낮추는 특성(Duranti 등, 2004) 및 동맥경화의 억제(Adams 등, 2004)와 관련되므로, 이러한 조성물은 콩 단백질 성분과 관련된 건강 특성을 잃게 하지 않을 것이다.
실시예
9
저 수준 냄새 콩 조성물의 추가적인 침전 분석
실시예 8의 연구는 다음의 변화들과 함께 반복실시되었다. 상품용 콩 대조군이 포함되었다(AG3302). 대두를 가루로 만들기 전에 탈피시키고, 가루를 물에 첨가하기 전에 체로 걸렀다. (두유) 상등액을 사전에 무게를 달은 원심관에 옮겼다. 열처리를 하기 전에 수크로오스를 첨가시켜, 최종의 슈크로즈 농도가 2.5%(W/W 기준)가 되게 만들었다. 시료를 냉장고에서 21일 동안 저장하였다. 원심관 내의 두유 침전물의 높이를 측정한 다음에 시료를 8,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 부어 내고, 무게를 재고, 상등액의 pH(모든 시료는 pH=6.7을 가짐)를 결정하고, 펠렛을 포함하는 원심관의 무게를 측정하였다. 습윤 대두 침전물의 중량%를 각각의 시료에 대해 계산하였다(습윤 콩 침전물의 중량 %=100×습윤 콩 침전물/(습윤 콩 침전물의 중량+콩 상등액의 중량).
단백질 침전물 형성을 줄이는데 있어서 HBC와 낮은 냄새 대두의 유용한 영향이 탈피된 대두를 사용하므로써 밝혀졌다(표 16). HBC 두유는 낮은 수준 냄새의 대두 계통과 비교시에 침전물이 2.2배로 감소되었고, 대조군과 비교시에 침전물이 7배 감소되었다. 놀랍게도 대조군과 비교된 낮은 수준 냄새의 대두의 침전물이 3.1배 감소되었다. 낮은 냄새 특성은 자유 라디칼 생성과 단백질 산화반응을 제한시킴으로써 침전물 생성 감소가 가능하다. 따라서, 이것은 높은 β-콘글리시닌과 낮은 냄새 특성을 조합한 최적의 조성물의 더 유리한 특성을 보여준다.
표 16: 대조군 대두 조성물과 비교한 두유 침전물 높이 및 침전물 펠렛 무게에 대한 높은 β-콘글리시닌 및 낮은 냄새 특성의 영향
실시예
9
탈피 대두 가루와 분리된 콩 단백질 성분의 제조
대조군 대두(AG3302)와 총 단백질 중 β-콘글리시닌 30% 이상 및 총 단백질 중 글리시닌 25% 미만 및 유리 아르기닌+아스파라긴 2500㎍/g 미만으로 포함하는 대두(DJB2104GOR, EXP319AP)를 탈피하여 탈피 대두 가루를 만들고, 다음으로 아래의 단계에 따라 분리된 콩 단백질 성분을 만들기 위해 더 가공처리하였다.
표 17: 상이한 대두 계통에서 β-콘글리시닌과 글리시닌의 조성
1. 대두를 실온에서 약 10% 수분으로 조절한다.
2. 크랙킹 밀을 사용하여 대두를 분쇄한다.
3. 아스피레이터(Aspirator)를 사용하여 분쇄된 대두를 탈피시킨다.
4. 쿠커(cooker)를 사용하여 50~60℃에서 분쇄되고, 탈피된 대두를 조절한다.
5. 플레이킹 밀(Flaking Mill)을 사용하여 조절된 대두를 얇은 조각으로 만든다.
6. 헥산으로 대두 플레이크를 추출한다.
7. 탈지된 대두육을 탈용매시켜, 플레이크로 만든다.
8. 플레이크를 마쇄하여 가루로 만든다.
9. 300ℓ 자켓 탱크(jaked tank)에 물을 첨가하고, 온도를 50℃로 조절하고, 40% NaOH를 사용하여 pH 9.0으로 조절한다. 탈지된 대두 가루를 첨가하고, 혼합한다. 물 대 콩 가루 비는 12/1(w/w)이었다. 추출시간은 45분이었다.
10. 가용화된 콩 단백질은 탈슬러지화 디스크 원심분리기(desuludging disk centrifuge)를 사용하여 추출 슬러리로부터 회수하였다(배압(back press): 58~60psi).
11. 투명해진 단백질 용액에 염산(18%)을 첨가하여 pH 4.5로 조절하고, 45℃에서 30분간 반응시켰다.
12. 침전된 단백질을 탈 슬러지화 디스크 원심분리기를 사용하여 회수하였다.
13. 단백질 응유를 산성화된 물(pH 4.55±0.1, 30~35℃)을 사용하여 2회 세척하였다. 세척수 대 충전된 습윤 고체의 비는 6:1(w/w)이었다. 단백질 응유물을 각각 세척한 후, 탈슬러지화 디스크 원심분리기를 사용하여 회수하였다(배압: 58~60psi).
14. 세척된 응유물을 수산화나트륨(30%)과 혼합시켜 pH를 6.8로 조절한 후, 116℃에서 7.5초 동안 열처리를 하였다. 다음으로, pH를 6.8로 조절하였다.
15. 단백질 용액을 45~55℃로 조절하고, 204~215℃의 입구 공기온도와 82~88 ℃의 출구 공기온도를 사용해 분무건조시켰다.
16. 분리된 콩 단백질 성분의 질소 용해도 지수를 결정하였다. 시료 일부를 30℃에서 2시간 동안 교반시켜 물에 현탁시켰다. 다음으로, 적절한 체적의 물로 희석하였다. 시료 추출물 일부를 원심분리하고, 분취량을 단백질에 대하여 분석하였다. 시료의 분리된 부분을 동일한 방법으로 전체 단백질에 대해 분석하였다. 수용성 단백질은 전체 단백질의 백분율로서 계산되었으며, 이는 총 질소의 백분율로서 수용성 질소에 비례하였다.
결 과 : 콩 단백질 분말의 질소 용해도 지수(표 18)는 콩 단백질 성분을 만들기 위하여 사용된 대두에서 β-콘글리시닌의 양에 직접적으로 비례하였다: NSI=1.4716(% β-콘글리시닌)+7.4502; R2=0.9975. 불용성 단백질의 수준 감소는 콩 단백질 성분으로 제조된 식품의 관능성 품질(예를 들어, 더 부드럽고 더 신선한 구감)을 개선시켜준다.
표 18: 질소 용해도 지수
대두로 만든 분리된 콩 단백질 성분의 아미노산 조성은 고 β-콘글리시닌(HBC)의 리신 함량이 대조군 보다 약 6% 높은 것을 제외하고 유사한 아미노산 조성을 갖는다.
표 19: 분리된 콩 단백질 성분의 전체 아미노산 조성.
실시예
10
탈피된 콩가루로부터 배양된 콩 생성물의 제조
상품용 콩(AG3302)으로부터 탈피된 대두 가루를 제조하고, 고 β-콘글리시닌 대두(DJB2104GOR)와 저 냄새 생성 대두 계통(03JBK8-25) 모두를 미국에서 2004년도에 수확하였다.
다음 방법은 대두로부터 만들어진 배양된 제품을 제조하고 테스트하기 위하여 사용된다.
1. 대두를 크랙킹 밀을 사용하여 분쇄한다.
2. 분쇄된 대두 종자를 아스피레이터를 사용하여 탈피한다.
3. 대두육(탈피된 대두)을 1파스 햄머밀과 5파스 핀밀을 통과시켜 제분한다.
4. 탈피된 대두 가루를 화이버 드럼에서 플라스틱 백으로 포장한다.
5. 가루의 단백질 함량을 결정한다.
6. 탈피된 대두 가루(3℃)에 물을 첨가하여 단백질 함량이 3.5%(중량기준)가 되게 하고, 수동 호모게나이저를 사용하여 약 1~2분 동안 혼합시켰다.
7. 대두 가루 현탁액을 판열교환기(plate heat exchanger)에서 데우고, 다음으로 스팀(steam)을 주입시켜 141℃에서 3.5초 동안 현탁액을 처리하고, 약 4℃로 식히기 전에 탈기하였다.
8. 열처리된 현탁액을 여과시켜서 화이버를 제거하면 두유가 제조된다.
9. 낙농 풍미 성분, 당(3%) 및 염(0.2%)을 두유에 첨가하고, 수동 호모게나이저를 사용하여 혼합시켰다.
10. 풍미가 있는 두유를 판열교환기에서 데우고, 다음으로 스팀을 주입시켜 141℃에서 3.5초 동안 현탁액을 처리하고, 약 4℃로 식히기 전에 탈기하고 살균용기에 포장하였다.
11. 각각 2.2% 단백질을 포함하는 두유 시료를 살균된 쿼트 병(quart jar)에 정량하여 넣고, 45~60초 동안 마이크로웨이브에서 데웠다(약 24℃).
12. 당(3.1%), 바닐라 추출물(0.4%) 및 배양된 콩 요구르트(L. Bulgaricus , S. Thermophilus , L. Acidophilus , B. Bifidum , L. Casei , L. Rhamnosus)(8%)를 두유에 첨가하고, 시료들을 혼합하였다.
13. 배양액을 포함하는 두유를 43℃ 인큐베이터에 넣고, 4시간 동안 인큐베이트하고, 제거하여 오버나이트로 냉장보관시켰다(4℃).
14. pH와 점도 측정은 냉장된 시료로 수행되었고, 감각적 평가는 시료 제제를 알지 못하는 3인의 패널에 의해 실시되었다. 점도는 20rmp에서 Spindle #3를 가진 Brookfield 점도계를 사용하여 측정하였다.
결 과 : DJB2104GOR로부터 만든 배양된 제품의 풍미 프로파일은 우수하고, 그 자체가 과일 풍미를 가진 부드러움을 제공할 것이다. 03JBK8-25로부터 만든 제품의 프로파일은 우수하고, 그 자체가 우수한 신 크림 또는 딥(dip) 상품을 제공할 것이다. 고 β-콘글리시닌과 저 냄새 생성 특성의 조합은 우수한 배양 두유제품을 만들 수 있다고 결론지을 수 있다. 고 β-콘글리시닌 단백질 물질의 점도가 낮을수록, 동일한 두께 수준에서 더 높은 단백질 제품을 만드는데 도움을 줄 수 있다.
표 20: 대두 조성 및 냄새 특성
표 21: 배양된 제품의 풍미 프로파일
실시예
11
낮은 냄새와 높은 β-
콘글리시닌의
조합의 설명
이 실시예는 높은 β-콘글리시닌 조성과 함께 낮은 냄새 생성의 조합을 설명한다. 이는 감소된 글리시닌과 증가된 β-콘글리시닌 함량을 포함하는 낮은 냄새의 대두 조성물을 만들기 위한 능력을 설명한다. A와 E 같은 교배형(표 3)은 A3233/B2G2/A1923의 혈통을 갖는 높은 β-콘글리시닌 배원질과 조합된다.
단백질 분석은 다음과 같이 실시되었다: 8종의 대두 종자를 모으고, CAT 메가-글라인더(SOP Asci-01-0002)를 사용하여 마쇄하였다. 가루로 만든 시료들을 4℃에서 저장하였다. 분석을 위하여, 각각으로부터의 ~30mg의 가루의 무게를 재고, 96웰 2㎖ 마이크로타이터 플레이트의 한 웰 내로 넣었다. 단백질을 저항제(reluctant)로서 0.1M 디티오트레이톨(DTT)을 포함하는 1.0㎖ 1×Laemmli SDS 완충액 pH 6.8에서 1시간 동안 진탕과 함께 추출하였다. 원심분리 후, 각 추출물의 부분은 SDS 완충액으로 더 희석하여, 0.2~0.5㎍/㎕의 총 단백질을 얻고, 90~100℃로 10분 동안 가열하고, 식혔다. 각각의 시료에 대하여, 1~2㎍의 전체 단백질을 26레인의 15% T 그래디언트 트리스/HCl 표준 겔 상에 12채널 피펫을 사용하여 로딩하였다. 분자량 표준과 양친 대조군은 각 겔의 2개의 레인에 포함된다. 트랙킹 다이가 ~1.2시간에 겔의 바닥에 도달할 때까지 겔을 전기영동하고, 그 다음에 Colloidal Coomassie Blue G-250으로 오버나이트로 염색시킨 후, 탈이온수에서 탈염시키고, GS800 Calibrated Densitometer를 사용하여 이미지화하였다. 정량은 Bio-Rad Quantity One TM Software를 사용하여 수행하였다. 소프트웨어는 시료 레인에서 각각 밴드의 상대적인 양을 결정하는데 사용하였다. % 글리시닌과 % β-콘글리시닌 단백질 서브유니트 밴드는 레인에서 전체 단백질의 상대적 %로서 보고되어 있다. a5-글리시닌 서브유니트는 정량되지 못하였고, 전체적인 산 글리시닌 값에 포함되지도 않았다. 시료 동일성과 중량은 마스터 LIMSTM을 사용하여 추적하였다.
높은 β-콘글리시닌 특성을 지닌 낮은 냄새 생성의 대두 조성물은 낮은 냄새특성을 갖지 않는 몇 개의 계통과 함께 예시되어있다(표 22). 두 번의 냄새 분석은 표의 첫째 라인에 설명되어있다. 몇 개의 계통은 글리시닌이 결핍되고, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 마쇄된 종자 그램 당 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀의 전체량이 20㎍/g 미만을 지닌 조성물을 생성하는 것으로 설명되어 있다. 생성된 조성물은 다른 특징에 대하여 더 평가될 것이다(예를 들어, 수율, 유리 아미노산, 색도와 지방산 조성).
표 22: 높은 β-콘글리시닌 대두 조성물의 냄새 생성과 단백질 서브유니트 메이크업
ND=검출되지 않음.
기탁 정보
위에 개시되어 있고, 특허청구범위에서 청구하고 있는 몬산토 Technology LLC의 대두 0119149 종자의 기탁은 ATCC(American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110에서 부다페스트 조약하에서 이루어졌다. 또한, 기탁된 계통 0119149는 여기에서 실시예들과 표들에 사용되는 명 칭 "A-4" 및 "03JBK8-25"를 갖는다. 기탁을 위한 ATCC 기탁번호는 PTA-6197이고, 기탁일은 2004년 9월 10일이었다. 기탁은 30년 기간 동안 저장소 내에서 유지되거나 또는 마지막 요청 후 5년 동안 또는 특허의 효과적인 수명을 위해 유지가 될 수 있으며, 더 길어질 수 있고, 그 기간 동안에 필요에 따라서 대체 가능하다.
여기에 개시되고 특허청구된 조성물과 방법들 모두는 본 발명의 개시내용에 비추어 볼 때, 불필요한 실험 없이도 이룰 수 있고, 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법들이 바람직한 구체예에 의하여 설명되었지만, 발명의 개념, 사상과 범위를 벗어나지 않고도 조성물과 방법들과 여기에서 설명된 방법의 단계들에서 또는 단계들의 순서에 변화들이 적용될 수 있다는 점은 당업자들에게 분명할 것이다. 좀 더 상세하게는, 화학적으로 또는 생리학적으로 관련된 어떤 제제는 여기에서 설명된 제제로 대체될 수 있으며, 동일하거나 또는 유사한 결과를 얻을 수 있음은 분명할 것이다. 당업자들에게 분명한 모든 이러한 유사 대체물과 변경들은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 속할 것으로 생각된다.
참고문헌
다음의 참고문헌들은, 여기에 개시된 실시예적 과정 또는 다른 상세한 사항들에 대해 보충적인 과정 또는 다른 상세사항들을 제공하기 위해 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
Claims (36)
- 전체 지방산의 백분율로서 10% 이상의 리놀레산과, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 그램 당 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀의 전체량을 20㎍ 미만으로 포함하는, 리폭시게나아제 1, 2 및 3을 포함하는 대두로부터 생산된 대두육 조성물.
- 제1항에 있어서, 전체 지방산의 백분율로서 4% 미만의 리놀렌산을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제1항에 있어서, 그램 당 2000㎍ 미만의 유리 아르기닌과 그램 당 400㎍ 미만의 유리 아스파라긴을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제1항에 있어서, CIE-L*a*b* 시스템에 의해 모니터 될 때, 30 미만의 b*(청색(-)으로부터 황색(+) 축의 색도) 값과 80 이상의 L*(밝기) 값으로 측정된 색도를 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제1항에 있어서, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 그램 당 4㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제1항에 있어서, 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제1항에 있어서, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제1항에 있어서, 전체 지방산의 10~60% 사이의 농도로 리놀레산을 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 갖고, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 갖고, 그램 당 5000㎍ 미만의 유리 아르기닌, 그램 당 900㎍ 미만의 유리 아스파라긴을 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, 그램 당 2000㎍ 미만의 유리 아르기닌, 그램 당 400㎍ 미만의 유리 아스파라긴을 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 그램 당 4㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 그램 당 총 20㎍ 미 만의 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, 전체 지방산의 1.5~14%의 리놀렌산 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, 전체 지방산의 10~60%의 리놀레산 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 대두육 조성물은 리폭시게나아제-2가 결핍된 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 대두육 조성물은 리폭시게나아제들이 결핍된 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, CIE-L*a*b* 시스템에 의해 모니터 될 때, 30 미만의 b*(청색(-)으로부터 황색(+) 축의 색도) 값과 80 이상의 L*(밝기) 값으로 측정된 색도를 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, 단백질 그램 당 67~69mg의 리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, 단백질 그램 당 72~80mg의 아르기닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제9항에 있어서, 단백질 그램 당 28~30mg의 히스티딘을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 단백질의 30% 이상을 β-콘글리시닌으로 갖고, 단백질의 25% 미만을 글리시닌으로 갖고, 온화한 수성 조건 하에서 산화반응 후, 그램 당 총 20㎍ 미만의 2,4-데카디에날+헥사날+헥사놀을 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 대두육 조성물은 리폭시게나아제-2가 결핍된 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제21항에 있어서, 전체 지방산의 1.5~14%의 리놀렌산 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제21항에 있어서, 전체 지방산의 10~60%의 리놀레산 농도를 갖는 것을 특징 으로 하는 대두육 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 대두육 조성물은 리폭시게나아제들이 결핍된 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 제21항에 있어서, CIE-L*a*b* 시스템에 의해 모니터 될 때, 30 미만의 b*(청색(-)으로부터 황색(+) 축의 색도) 값과 80 이상의 L*(밝기) 값으로 측정된 색도를 갖는 것을 특징으로 하는 대두육 조성물.
- 대두 종자 가루와 물의 혼합물을 인큐베이트하고, 헥사날, 헥사놀 및 데카디에날에 대한 중수소화 표준을 사용하여 2,4-데카디에날, 헥사놀, 헥사날 및 1-옥텐-3-올로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 및 이들의 조합물의 양을 정량하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 2,4-데카디에날, 헥사놀, 헥사날 및 1-옥텐-3-올로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 대두의 냄새 생성 특성을 분석하는 방법.
- 제27항에 있어서, 화합물의 수준 결정은 1중량부의 대두 종자 가루와 4중량부의 물의 혼합물을 1~ 40분 범위의 기간 동안 인큐베이트하고, 헥사날, 헥사놀 및 데카디에날에 대한 중수소화 표준을 사용하여 2,4-데카디에날, 헥사놀, 헥사날 및 1-옥텐-3-올로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 및 이들의 조합물의 양을 정량하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서, 대두 종자 가루는 탈피된 대두로부터 만들어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 및 제2의 대두종으로부터 한 가지 이상의 대두의 2,4-데카디에날, 헥사놀, 헥사날, 1-옥텐-3-올로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물 및 이들의 어떠한 조합물의 수준을 측정하고, 상기 화합물의 낮은 수준을 갖는 종자를 생산하는 종을 선택하는 것을 포함하는 감소된 냄새 생성 특성을 갖는 대두를 생산하는 대두종을 얻기 위한 방법.
- 제30항에 있어서, 자손을 생산하기 위하여 선택된 종의 식물과 다른 식물을 교배하고, 상기 자손으로부터의 하나 이상의 대두 내의 2,4-데카디에날, 헥사놀, 헥사날, 1-옥텐-3-올로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 및 이들의 어떠한 조합물의 수준을 측정하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 1분~ 40분 범위 내의 기간 동안에 대두 종자 가루 1중량부와 물 4중량부의 혼합물을 인큐베이트시켜서 측정되어 졌을 때, 종자 그램 당 5㎍ 미만의 1-옥텐-3-올을 포함하는 종을 선택하고, 상기 1-옥텐-3-올을 측정하는 것을 포함하는 균류 오염에 저항하는 대두종을 선택하는 방법.
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