MX2007000382A

MX2007000382A - Composiciones de soya que tienen propiedades organolepticas mejoradas y metodos de generacion.

Info

Publication number: MX2007000382A
Application number: MX2007000382A
Authority: MX
Inventors: Neal A Bringe; Robert G Orth
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2004-07-09
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2007-03-26
Also published as: CN103461115A; AU2005265311A1; EP1765092A1; AR049715A1; BRPI0513067B1; RU2375917C2; KR101220017B1; US20060021090A1; EP1765092B1; NZ552434A; CA2572761A1; CN101123887B; WO2006010049A1; JP5396021B2; US7704540B2; NZ585893A; AU2005265311B2; JP2008505647A; UA97941C2; RU2007104935A

Abstract

La presente invencion provee composiciones de carne de soya con propiedades organolepticas mejoradas y metodos para identificar granos de soya con cualidades organolepticas mejoradas; la invencion tambien provee metodos para producir composiciones de soya con propiedades organolepticas mejoradas y para crear plantas que produzcan granos de soya con tales caracteristicas.

Description

COMPOSICIONES DE SOYA QUE TIENEN PROPIEDADES ORGANOLÉPTICAS MEJORADAS Y MÉTODOS DE GENERACIÓN Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Patente E.U.A. No. se serie 60/521 ,846 presentada el 9 de julio de 2004, cuyo texto completo se incorpora específicamente aquí como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de las ciencias de la nutrición y de la alimentación. En particular, la invención se relaciona con composiciones de soya con propiedades organolépticas mejoradas, como menos olor, y métodos para e! uso y la producción de esas composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los frijoles de soya proveen proteínas de alta calidad beneficiosas para la salud humana (Hermansen et al., 2003; Bazzano et al., 2001 ; Food y Drug Administrelación n, 1999). La demanda de soya para hacer alimentos no ha aumentado tanto como se esperaba en las ultimas tres décadas (Wolfe y Cowan, 1975 y SoySource, The United Soybean Board 1999). Esto se debe, en parte, al olor indeseable que acompaña a los productos de soya ( cLeod y Ames, 1988 y Freese, 1999). El olor indeseable de la soya se describe comúnmente como "olor a frijoles". Los componentes que imparten esas características a la soya incluyen muchos ácidos grasos, carbonilos alifáticos, aminas, alcoholes, aldehidos y furanos derivados de la acción de enzimas sobre varios compuestos hallados en la soya y su posterior oxidación causada por varios mecanismos (Wolfe y Cowan, 1975; Sessa y Rackis, 1977). Kobayashi et al. (1995) llegaron a la conclusión de que los mayores contribuyentes al olor de la leche de soya no cocida eran (trans, trans)-2,4-nonadienal, (trans, trans)-2,4-decadienal, hexanal, 2-pentil furano, 1-octen-3-ona, (trans)-2-nonenal, y (trans, cis)-2,4-nonadienal. Los olores más fuertes extraídos de la leche de soya térmicamente tratada se identificaron como (trans, trans)-2,4 decadienal y n-hexanal (Feng, Cornell University Ph.D. Dissertation, 2000). La formación de (trans, trans)-2,4 decadienal tiene lugar lentamente a temperatura ambiente (Frankel, 1988), pero esta reacción se acelera con la degradación térmica durante el procesamiento de la soya en condiciones calientes (Lin, 2003). Otros contribuyentes a esos olores fueron (trans)-4,5-epoxi-(E)-2-decenal (formado de 2,4 decadienal), (trans, cis)-2,6-nonadienal, (trans)-2-nonenal, (trans, trans)-2,4-nonadienal, 2,4 nonadienal, maltol, vainilina y ß-damascenona. Los agentes odorantes más poderosos en la leche de soya determinados por el volumen mínimo de "headspace" (el espacio entre la superficie del producto envasado y la tapa del envase) requerido para una detección olfatométrica fueron hexanal, acetaldehído, metanotiol, dimetil trisulfuro, y 2-pentiI furano (Boatright, 2002).

Los odorantes más fuertes en aislados de proteína de soya se identificaron como dimetil trisulfuro, (trans, trans)-2,4-decadienal, 2-pentil piridina, (trans, trans)-2,4,-nonadienal, hexanal, acetofenona y 1-octen-3-ona (Boatright y Lei, 1999). El mecanismo de formación de metanotiol y dimetil trisulfuro involucra radicales libres formados por oxidación lípida (Lei y Boatright, 2003) y productos de enzimas como la cisteína sintasa (Boatright, 2003, poster 45C-26, IFT reunión anual, Chicago). La formación de 2-pentil piridina ocurre de una reacción espontánea entre 2,4 decadienai y amoniaco a temperatura ambiente. Los amino ácidos libres arginina, lisina, asparagina y glutamina aumentan la formación de 2-pentil piridina probablemente dando amoniaco durante el procesamiento de las proteínas de la soya (Zhou y Boatright, 2000; Kim et al., 1996). Amino ácidos libres pueden también formar otros productos indeseables. La exposición a altas temperaturas de la asparagina y glucosa resulta en la formación de acrilamida (Jung et. al., 2003). La arginina expuesta a temperaturas de cocción puede formar mutantes (Knize et. al., 1994). La arginina libre se enriqueció en soya carente de ß-conglicininas y glicininas (Takatienehi et. al., 2003). Una vez formados, los olores son difíciles de remover de ingredientes de soya porque se asocian con proteínas (Franzen y Kinsella, 1974). La calidad de sabores naturales agregados a alimentos de soya también se altera desfavorablemente porque algunos de los olores se ligan a la proteína de la soya. Compuestos de carbonilos y 2-pentil piridina se ligaron con mayor afinidad a fracciones de glicina que a fracciones de ß-conglicinina (Zhou et al., 2002; O'Keefe et al., 1991 ). La extracción de proteínas asociadas con la fracción oleosa y lípídos polares reduce significativamente la cantidad de olores asociados con el aislado de proteínas de soya (Samoto et al., 1998). Las texturas creadas por interacciones proteína-proteína pueden tener más efecto sobre la intensidad del sabor que sobre la concentración de olor en la nariz (Weel et al., 2002). Las proteínas de la soya pueden contribuir a la baja calidad organoléptica de las bebidas de soya al formar agregados ¡nsolubles y una sensación como de tiza en ia boca (Skarra y Miller, 2002). Entre las principales proteínas de soya, las glicininas son más sensibles al pH y a la insolubilización inducida por Ca+2 (Yuan, 2002), y las soyas que contienen una baja proporción de glicininas a ß-conglicininas son útiles para crear ingredientes de soya solubles (Patente de E.U.A. 6,171 ,640). Las reacciones de oxidación lípida también influyen sobre la solubilidad de las proteínas. Se pueden agregar antioxidantes durante la fabricación de aislados de proteína de soya para limitar la oxidación inducida por radicales libres y mejorar el rendimiento de proteínas solubles (Patente de E.U.A. 5,777,080). Algunos péptidos pueden reaccionar durante el procesamiento con polisacáridos para formar compuestos antioxidantes (Matsumura, 2003). El color influye sobre las percepciones de frescura y sabor (Joshi, 2000). Cantidades bajas de azúcares reductores y aldehidos formados de la oxidación de lípidos reaccionan con grupos amino de proteínas al calentarlos para formar pigmentos marrones según la reacción de "oscurecimiento" de Maillard (Kwok et al., 1999). La leche de soya con un contenido más alto de aldehidos tendrá un color más oscuro y menos atractivo luego de procesarla. Por otro lado, la oxidación de lípidos durante el procesamiento de la leche de soya descolora pigmentos amarillos en la leche de soya (Obata y Matsuura, 1997). La soya se refina para mejorar el sabor mediante la extracción de lípidos y otros componentes, ya sea por extracción con alcohol, tratamientos enzimáticos, lavado de sueros de proteínas, ultra filtración de proteínas y o el uso de vaporización instantánea (flash vaporization). Estos procesos aumentan los costos de los ingredientes de proteína de soya y, típicamente, disminuyen las cantidades de componentes saludables biodisponibles (por ejemplo fibra, oligosacáridos, isoflavonas, ácidos grasos poliinsaturados, íocoferoles, fosfolípidos, pépíidos bioactivos). Enfoques desde el procesamiento para mejorar las propiedades organolépticas de ingredientes de proteínas de soya están limitados en efectividad por olores ligados a proteínas de soya y por condiciones que promueven la formación de olores (pH 8-10). Se crearon soyas que carecen de una a tres de las lipoxigenasas 1 , 2, y 3 usando mutaciones de cultivos para reducir la formación de olores a frijol (Hajika et al., 1991). El análisis de aromas de leche de soya y harina de soya a partir de soyas carentes de las tres lipoxigenasas halló que contenían menores cantidades de varios olores y mayores cantidades de 1-octen-3-ol que la línea progenitora que contenía las tres lipoxigenasas (Hao et al., 2002). Niveles similares de 2,4 decadienal fueron hallados en harina de soya y en aislados de proteína de soya hechos con soya que carecía de tres lipoxigenasas y en dos otras líneas de soya (Boatright et al., 1998). Los alimentos preparados con soya que no tenía lipoxigenasas tuvieron mejor sabor en comparación con alimentos hechos con soya de control (Wilson, 1996). La leche de soya preparada con soya que no tenía tres lipoxigenasas fueron percibidas como más amargas que el control, especialmente después de 15 meses de almacenamiento, pero esta diferencia se esperaba que se eliminase agregando azúcar (Torres-Peñaranda y Reitmeírer, 2001 ). Las modificaciones transgénicas se proponen para mejorar el sabor de los granos de soya reduciendo los niveles de ácidos grasos poliinsaturados (Patente de E.U.A. 5,981 ,781 ), lipoxigenasas (Solicitud de Patente de E.U.A. 20030074693) y o hidroperóxido liasas (Patente de E.U.A. 6,444,874). Soyas que contienen menos de 10% de ácidos grasos poliinsaturados y más de 75% de ácidos grasos oleicos dan un aceite de freír menos notorio al gusto que aceites de freír con más ácidos grasos poliinsaturados (Warner et al., 2001). Se pueden usar químicos como polifosfatos (Patente de E.U.A. 6,355,296) para limitar la producción de sabores desagradables y mejorar la solubilidad de proteínas. Se pueden usar otros aditivos, como ácido gálico (PCT WO 01/06866) o aldehido oxidasa (Maheshwari et al., 1997) para remover olores.

Hay poca información publicada sobre los efectos de variaciones genéticas naturales sobre el sabor y el color de soyas. Se determinó el número de ácidos tiobarbitúricos en 16 variedades de soya como medida de oxidación de lípidos y no se encontró relación con el contenido de vitamina E de las soyas (Dahuja y Madaan, 2004). Se determinaron las cantidades de 2-pentil piridina y 2,4 decadienal en harina de soya y aislado de proteína de soya de tres variedades (Zhou y Boatright, 1999). Se estudiaron los efectos de las condiciones del secado sobre la remoción del pigmento verde, clorofila, de los frijoles (Sálete et al., 2003; Sinneckeret al., 2002). En décadas pasadas los científicos demostraron que los aceites obtenidos de la soya que no tenía lipoxigenasas no tenían estabilidad oxidativa mejorada. Las proteínas producidas de soyas sin lipoxigenasa seguían conteniendo niveles significativos de gusto a frijoles (Maheshwari et al., 1997). La primera etapa para hacer leche de soya o ingredientes de proteínas de soya es sacarles la cutícula (usamos el término "pelar" y, a veces, "descuticular") a los frijoles para hacer carnes de soya. Los hipocotiles pueden también separarse de los cotiledones. Carnes de soya se definen como granos de soya pelados y pueden o no incluir los cotiledones. Un método para preparar carnes se describe, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. 5,727,689. Un método para pelar incluye, entre otras cosas, hacer pasar las semillas entre rodillos a contra-corriente o un molino quebrantador y aspirar los recubrimientos livianos dejando las carnes. Las carnes pueden remojarse en agua para producir leche de soya o pueden hacerse copos o escamas y extraerlos con hexano en la primera etapa para hacer harina de soya desgrasada, concentrados de proteínas de soya, aislados de proteínas de soya y fracciones proteínicas purificadas según se desee. Esta invención provee un nuevo método para determinar la capacidad de las carnes de soya para resistir la producción de compuestos olorosos clave identificados como 2,4 decadienal, hexanal, hexanol y 1-octen-3-ol. Estos compuestos se eligieron como indicadores de la extensión de diferentes tipos de reacciones de oxidación. Hexanal y hexanol resultan de la fractura de compuestos que contienen hidroperóxido (peróxidos en las posiciones de los carbonos 9 y 12 de ácidos grasos) realizada por hidroperóxido liasas y alcohol dehidrogenasas. 2,4 decadienal es un producto de degradación del sendero de la lipoxigenasa que no se sabe que involucre hidroperóxido liasas. 1-octen-3-ol se forma por la acción de hidroperóxido liasas sobre hidroperóxidos formados sobre la posición del carbono 10 del ácido linoleico. Estos compuestos pueden reaccionar más con un procesamiento adicional para formar olores más potentes. Por ejemplo, el 2,4 decadienal esta involucrado en la formación de 2-pentil piridina y el 1-octen-3-ol está involucrado en la formación de 1-octen-3-ona.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención provee una composición de carne de soya producida a partir de semillas de soya que comprende lipoxigenasas 1 , 2 y 3, y la composición comprende más de 10% de ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales y menos de 20 µg del total de 2,4 decadienal más hexanal más hexanol por gramo después de oxidación bajo condiciones acuosas de oxidación suaves. La composición puede comprender o no las lipoxigenasas, o cualquier combinación de las misma y puede comprender lipoxigenasa desactivada. En una modalidad, la composición comprende lipoxigenasa-2. En algunas modalidades, una composición presentada por la invención puede comprender menos de alrededor de 15 µg o menos de aproximadamente 18 µg del total de 2,4 decadiena! más hexanal más hexanol. En otras modalidades, la composición puede comprender alrededor de 6 µg - alrededor de 20 µg, alrededor de 10 µg - 20 µg o alrededor de 12-18 µg del total de 2,4 decadienal más hexanal más hexanol. En otras modalidades, la composición puede comprender menos de 4% ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales, incluyendo menos de aproximadamente 3% y de alrededor de 1 %-4% o de alrededor de 2% a alrededor de 4%. En otra modalidad, una composición de la invención puede comprender menos de 2000 µg por gramo de arginina libre y/o menos de 400 µg de asparagina libre por gramo, incluyendo menos de alrededor de 1800 µg por gramo de arginina libre y/o menos de alrededor de 350 µg de asparagina libre por gramo. Tal composición, en algunas modalidades, puede comprender alrededor de 300 µg - 2000 µg por gramo arginina libre, incluyendo alrededor de 500-2000, alrededor de 1200-1800 y alrededor de 1000-2000 µg por gramo de arginina libre. Una composición provista por la invención puede, además, en ciertas modalidades, comprender desde alrededor de 50 µg a alrededor de 400 µg de asparagina libre por gramo, incluyendo alrededor de 100-400, 100-350, 200-400, 300-400 y 250-400 µg de asparagina libre por gramo . En todavía otra modalidad, las composiciones provistas por la invención pueden tener un color medido como valor b* de menos de 30 y un valor L* superior a 80, como se monitoreó con el Sistema CIE-L*a*b* donde L* indica claridad de color y b* indica un tono en un eje azul (-) a amarillo (+). En algunas modalidades, una composición de ¡a invención puede comprender un color medido como valor b* de alrededor de 18-30, alrededor de 20-30, alrededor de 25-30 y menos de alrededor de 25. En otras modalidades, una composición provista por la invención puede comprender un valor L* de alrededor de 80-100, alrededor de 80-90 y superior a alrededor de 90. En ciertas modalidades, una composición provista por la invención puede comprender menos de 8 µg de 1-octen-3-ol por gramo luego de una oxidación bajo condiciones suaves de oxidación acuosa, incluyendo menos de alrededor de 6 µg, menos de alrededor de 5 µg, de alrededor de 1.3 a alrededor de 8 µg, de alrededor de 2 a alrededor de 8 µg, y de alrededor de 4 a alrededor de 8 µg. Una composición provista por la invención puede también tener más que 30% de la proteína como ß-conglicinina y puede tener menos de 25% de la proteína como glicinina. Tal composición puede definirse también como teniendo más que alrededor de 40% de la proteína como ß-conglicinina y teniendo un contenido de ß-conglicinina de alrededor de 30%-a alrededor de 60%, de alrededor de 40% a alrededor de 60%, de alrededor de 35% a alrededor de 55%, de alrededor de 30% a alrededor de 50% de la proteína. Tal composición puede también definirse como teniendo un contenido de glicinina de menos de alrededor de 20%, 15% y 10%, puede comprender de alrededor de 0%-25%, 5%-20%, 1 %-25%, y alrededor de 10-25% de la proteína como glicinina. En otro aspecto de la invención, se presenta una composición de carne de soya que tiene más que 30% de la proteína como ß-conglicinina y menos de 25% de la proteína como glicinina, menos de 5,000 µg por gramo de arginina libre, y menos de 900 µg por gramo de asparagina libre. Tal composición puede comprender, en ciertas modalidades, de alrededor de 300 - 5,000 µg por gramo, de alrededor de 1 ,000 - 5,000 µg por gramo, de alrededor de 3,000 - 5,000 µg por gramo, de alrededor de 1 ,000 - 4,000 µg por gramo, y de alrededor de 500 - 2,000 µg por gramo de arginina libre. Tal composición puede comprender, en ciertas modalidades, menos de 400 µg por gramo de asparagina libre, de alrededor de 50 - 400 µg por gramo, de alrededor de 100 - 400 µg por gramo, de alrededor de 100 - 700 µg por gramo, y de alrededor de 200 - 900 µg por gramo de asparagina libre. En una modalidad, la composición tiene menos de 2,000 µg por gramo de arginina libre y menos de 400 µg por gramo de asparagina libre. En otra modalidad, la composición presentada comprende menos de 4 µg por gramo de 1-octen-3-ol luego de una oxidación bajo condiciones de oxidación acuosa suaves, incluyendo menos de alrededor de 3 µg, de alrededor de 1.3 µg -3 µg, de alrededor de 1.3 µg - 4 µg y de alrededor de 2 µg - 4 µg por gramo. En unas modalidades más aun, la composición tiene una concentración de ácido linoleico de entre 1 % y 14% de los ácidos grasos totales, incluyendo alrededor de 3-14%, alrededor de 5-14%, alrededor de 1.5%-12%, alrededor de 3-12% y alrededor de 7-14%. En todavía otra modalidad, la composición tiene una concentración de ácido linoleico entre 10% y 60% de los ácidos grasos totales, incluyendo entre alrededor de 10% y 50%, entre alrededor de 10% y 40%, entre alrededor de 15% y 60%, entre alrededor de 20% y 50%, y entre alrededor de 20% y 60%. En ciertas modalidades, una composición de carne de soya provista por la invención puede definirse como carente de una o más lipoxigenasas. En una modalidad, una composición de carne de soya provista por la invención puede definirse como carente de lipoxigenasa-2. En otras modalidades, cualquier combinación de lipoxigenasa-1 , lipoxigenasa-2 y/o lipoxigenasa-3 están ausentes, incluyendo cualesquiera dos o todas las tres de estas lipoxigenasas. Una composición de la invención también puede definirse como teniendo un color caracterizado por un valor b* de menos de 30 y un valor L* mayor que 80 monitoreado por el Sistema CIE-L*a*b* donde L* indica claro y b* indica un tono en el eje de azul (-) a amarillo (+). En todavía otra modalidad, una composición provista por la invención puede comprender 67-69 mg lisina por gramo de proteína, puede comprender 72-80 mg arginina por gramo de proteína y/o puede comprender 28-30 mg de histidina por gramo de proteína. En otro aspecto más, la invención provee un método de analizar las propiedades que producen olor de una soya que comprende determinar el nivel de por lo menos un compuesto elegido del grupo consistente de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, y 1-octen-3-ol. En una modalidad, el método puede comprender determinar el nivel del compuesto, comprende incubar una mezcla de alrededor de 1 parte de harina de soya y alrededor de 4 partes de agua por un periodo en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 40 minutos y cuantificar cantidades de por lo menos un compuesto elegido del grupo consistente de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal y 1-octen-3-ol y combinaciones de los mismos usando patrones deuteriados de hexanal, hexanol y decadienal. La harina de semillas de soya se puede hacer a partir de frijoles de soya pelados. En otro aspecto más, la invención provee un método de obtener una variedad de soya que da semillas y carnes de soya con propiedades disminuidas de producir olores, comprendiendo ese método la medición del nivel de por lo menos un compuesto elegido del grupo consistente de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, 1-octen-3-ol y cualquier combinación de los mismos en una semilla de soya o carnes de soya de primera y segunda variedades de soya, y elegir la variedad que produzca semillas con el menor nivel del compuesto. El método puede comprender, además, cruzar una planta de la variedad seleccionada con una planta diferente para producir una progenie y medir el nivel de por lo menos un compuesto elegido del grupo consistente de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, 1-octen-3-ol y cualquier combinación de los mismos en una o más soyas o carnes de soya de la progenie. En todavía otro aspecto, la invención provee un método para seleccionar una variedad de soya que resista la contaminación fungosa que contiene menos de 5 µg 1-octen-3-oi por gramo de semilla incubando una mezcla de alrededor de 1 parte de harina de semillas de soya y alrededor de 4 partes de agua por un periodo en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 40 minutos y midiendo el 1-octen-3-ol. En todavía otro aspecto, la invención provee una semilla de la planta designada 0119149, semillas representativas de la cual se han depositado bajo el Acceso ATCC No. PTA-6197. La invención además provee una planta de soya 0119149 o partes de la misma producida cultivando la semilla. Tal planta de la invención puede comprender un transgen. En otras modalidades más, la invención provee un método de producir una planta de soya derivada de la planta 0119149, comprendiendo el método las etapas de: (a) preparar una progenie derivada de la planta 0119149 por medio de cruzar una planta 0119149 con una segunda planta de soya, en la cual una muestra de las semillas de la planta 0 19149 estaba depositada bajo el Acceso ATCC No. PTA-6197; (b) cruzar la planta de la progenie consigo misma o con una segunda planta para producir una semilla de una planta descendiente de una generación siguiente; (c) cultivar una planta de progenie de una generación subsiguiente a partir de la semilla y cruza de la planta de progenie de una generación subsiguiente consigo misma o con una segunda planta; y (d) repetir las etapas (b) y (c) por 3-10 generaciones más para producir una planta de soya híbrida estable derivada de la planta 0119149. En todavía otro aspecto, la invención provee semillas de soya con propiedades organolépticas mejoradas (es decir semillas de soya con sabor, color, olor y paladar (sensación en la boca) mejorados) luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. También se proveen semillas de soya con color más claro para mejorar las propiedades organolépticas de las semillas de soya. También se proveen semillas de soya con bajas cantidades de arginina libre y asparagina para mejorar las propiedades organolépticas de las semillas de soya. En otra modalidad, se proveen semillas de soya con niveles reducidos de ácidos linoleico y linolénicos para mejorar las propiedades organolépticas. Una planta de soya proporcionada por la invención puede comprender, en una modalidad, uno o más transgenes. Ejemplos incluyen un gen que confiere a las plantas resistencia a herbicidas y un gen que producirá plantas con resistencia a insectos.

De acuerdo con la invención, se proveen semillas de soya que contienen lipoxigenasas 1 , 2 y 3 y más que alrededor de 10% ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales que produce menos de 20 µg del total de 2,4 decadienal más hexanal más hexanol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves . De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proveen semillas de soya conteniendo lipoxigenasas con menos de alrededor de 4% ácido graso linolenico y más que alrededor de 10 % ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales y dando menos de 20 µg del total de 2,4-decadienal más hexanal más hexanol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas de soya pueden también producir menos de 8 µg de 1-octen-3-ol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, la invención también provee semillas de soya con menos de alrededor de 2000 µg de arginina libre y menos de alrededor de 400 µg asparagina libre por gramo de semilla seca y produciendo menos de alrededor de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas molidas-luego-de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas pueden también producir menos de 8 µg de 1-octen-3-ol por gramo de semillas molidas de soya luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proveen semillas de soya que tienen color amarillo medido como valor "b*" de menos de 30 y que producen menos de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas pueden también producir menos de 8 µg de 1-octen-3-ol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves.

De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se proveen semillas de soya que tienen más que 30% de la proteína como ß-conglicinina y/o menos de 25% de la proteína como glicininas que producen menos de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas de soya molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas pueden también producir menos de 8 µg 1-octen-3-ol por gramo semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. De acuerdo con la presente invención, se proveen semillas de soya que comprenden menos de 5,000 µg arginina libre, menos de 900 µg asparagina libre y más que 30% de la proteína como ß-conglicinina y menos de 25% de la proteína como glicininas que produce menos de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, -hexanal-y-hexanol por gramo de semillas de soya molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas pueden también producir menos de 8 µg 1-octen-3-ol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proveen semillas de soya resultantes de una cruza de una primera semilla de soya que tiene más que 30% de la proíeína total como ß-conglicinina y menos de 25% de la proteína como glicininas y una segunda semilla de soya que produce menos de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas de soya molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proveen semillas de soya resultantes de una cruza de una primera semilla que tiene menos de 4% de ácido graso linolenico y más que 10% ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales y una segunda semilla de soya conteniendo lipoxigenasas 1 , 2 y 3 y más que 10% de ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales produciendo menos de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas de soya molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves . De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se presenta un método para analizar las propiedades de producir olores de variedades de semillas de soya que comprende incubar una mezcla de alrededor de 1 parte de harina de semillas de soya y alrededor de 4 partes de agua por un periodo en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 40 minutos y cuantificar cantidades de por lo menos un compuesto elegido del grupo consistente de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, y 1-octen-3-ol y combinaciones de dos, tres o cuatro de ellos usando patrones deuteriados de hexanal, hexanol y decadienal.

En todavía otro aspecto, la invención provee un método para seleccionar una variedad de soya que resista la contaminación fungosa que contiene menos de 5 µg 1-octen-3-ol por gramo de semilla incubando una mezcla de alrededor de 1 parte de harina de semillas de soya y alrededor de 4 partes de agua por un periodo en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 40 minutos y midiendo el 1-octen-3-ol. En todavía otro aspecto, la invención provee una semilla de la planta designada 0119149, semillas representativas de la cual se han depositado bajo el Acceso ATCC No. PTA-6197. La invención además provee una planta de soya 01 9149 o partes de la misma producida cultivando la semilla. Tal planta de la invención puede comprender un transgen. En otras modalidades más, la invención provee un método de producir una planta de soya derivada de la planta 0119149, comprendiendo el método las etapas de: (a) preparar una progenie derivada de la planta 0119149 por medio de cruzar una planta 0119149 con una segunda planta de soya, en la cual una muestra de las semillas de la planta 0119149 estaba depositada bajo el Acceso ATCC No. PTA-6197; (b) cruzar la planta de la progenie consigo misma o con una segunda planta para producir una semilla de una planta descendiente de una generación siguiente; (c) cultivar una planta de progenie de una generación subsiguiente a partir de la semilla y cruza de la planta de progenie de una generación subsiguiente consigo misma o con una segunda planta; y (d) repetir las etapas (b) y (c) por 3-10 generaciones más para producir una planta de soya híbrida estable derivada de la planta 0119149. En todavía otro aspecto, la invención provee semillas de soya con propiedades organolépticas mejoradas (es decir semillas de soya con sabor, color, olor y paladar (sensación en la boca) mejorados) luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. También se proveen semillas de soya con color más claro para mejorar las propiedades organolépticas de las semillas de soya. También se proveen semillas de soya con bajas cantidades de arginina libre y asparagina para mejorar las propiedades organolépticas de las semillas de soya. En otra modalidad, se proveen semillas de soya con niveles reducidos de ácidos linoleico y linolénicos para mejorar las propiedades organolépticas.

Una planta de soya proporcionada por la invención puede comprender, en una modalidad, uno o más transgenes. Ejemplos incluyen un gen que confiere a las plantas resistencia a herbicidas y un gen que producirá plantas con resistencia a insectos. De acuerdo con la invención, se proveen semillas de soya que contienen lipoxigenasas 1 , 2 y 3 y más que alrededor de 10% ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales que produce menos de 20 µg del total de 2,4 decadienaí más hexanal más hexanol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas-suaves . De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proveen semillas de soya conteniendo lipoxigenasas con menos de alrededor de 4% ácido graso linolenico y más que alrededor de 10 % ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales y dando menos de 20 µg del total de 2,4-decadienal más hexanal más hexanol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas de soya pueden también producir menos de 8 µg de 1-octen-3-ol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, la invención también provee semillas de soya con menos de alrededor de 2000 µg de arginina libre y menos de alrededor de 400 µg asparagina libre por gramo de semilla seca y produciendo menos de alrededor de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas pueden también producir menos de 8 µg de 1-octen-3-ol por gramo de semillas molidas de soya luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proveen semillas de soya que tienen color amarillo medido como valor "b*" de menos de 30 y que producen menos de 20 µg/gm de 2,4-decadienaI, hexanal y hexanol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas pueden también producir menos de 8 µg de-1-oeten-3-ol-por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se proveen semillas de soya que tienen más que 30% de la proteína como ß-conglicinina y/o menos de 25% de la proteína como glicininas que producen menos de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas de soya molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas pueden también producir menos de 8 µg 1- octen-3-ol por gramo semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves.

De acuerdo con la presente invención, se proveen semillas de soya que comprenden menos de 5,000 µg arginina libre, menos de 900 µg asparagina libre y más que 30% de la proteína como ß-conglicinina y menos de 25% de la proteína como glicininas que produce menos de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas de soya molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas pueden también producir menos de 8 µg 1-octen-3-ol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proveen semillas de soya resultantes de una cruza de una primera semilla de soya que tiene más que 30% de la proteína total como ß-conglicinina y menos de 25% de la proteína como glicininas y una segunda semilla de soya que produce menos de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas de soya molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proveen semillas de soya resultantes de una cruza de una primera semilla que tiene menos de 4% de ácido graso linolenico y más que 10% ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales y una segunda semilla de soya conteniendo lipoxigenasas 1 , 2 y 3 y más que 10% de ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales produciendo menos de 20 µg/gm de 2,4- decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas de soya molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves . De acuerdo con todavía otro aspecto de ia invención, se presenta un método para analizar las propiedades de producir olores de variedades de semillas de soya que comprende incubar una mezcla de alrededor de 1 parte de harina de semillas de soya y alrededor de 4 partes de agua por un periodo en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 40 minutos y cuantificar cantidades de por lo menos un compuesto elegido del grupo consistente de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, y 1-octen-3-ol y combinaciones de dos, tres o cuatro de ellos usando patrones deuteriados de hexanal, hexanol y decadienal. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se provee un método de producir soya que comprende incubar una mezcla de alrededor de 1 parte de harina de soya o harina de soya descascarada y alrededor de 4 partes de agua por un periodo en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 40 minutos a temperatura ambiente y cuantificar cantidades de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, y 1-octen-3-ol usando patrones deuteriados de hexanal, hexanol y decadienal y seleccionar semillas provenientes de poblaciones de cría basándose en los resultados. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proveen semillas de soya que comprenden un transgen, por ejemplo, un gen resistente a herbicidas que imparta esta resistencia o un gen con resistencia a insectos.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proveen alimentos procesados para consumo humano que comprenden semillas de soya que tienen más que 30% de la proteína como ß-conglicinina y menos de 25% de la proteína como glicininas que producen menos de 20 µg/gm de 2,4-decadienal, hexanal y hexanol por gramo de semillas de soya molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La invención provee composiciones de soya, semillas de soya, y derivados de semillas de soya con propiedades organolépticas mejoradas y métodos para producir los mismos. Las composiciones de soya de la invención proveen sabor, color, olor y paladar mejorados. La invención también provee métodos para producir tales composiciones y métodos de determinar la capacidad de una variedad de soya para producir olores clave identificados como 2,4 decadienal, hexanal, hexanol y 1-octen-3-ol y el uso de los resultados para seleccionar semillas de poblaciones de cría. Se pueden producir condiciones de oxidación de acuerdo con la invención cuando aproximadamente 0.5 g de harina de soya se mezcla con 2 mL de agua o 1 parte de harina de soya se mezcla con 4 partes de agua para dispersar las partículas sólidas en agua y permitir que ocurran las reacciones de oxidación por aproximadamente 1-40 minutos a temperatura ambiente y la temperatura ambiente puede variar de 15° a 40°C. La suspensión concentrada permite que las enzimas, inhibidores de enzimas, sustratos, radicales libres, compuestos atrapadores de radicales libres y otros factores impacten las cantidades de olores producidos. La invención provee semillas de soya que contienen lipoxigenasas y composiciones derivadas de ellas que tienen menos de 4% de ácido graso linolénico y/o más que 10% de ácido linoleico como porcentaje de ácidos grasos totales y produciendo menos de 20 µg de 2,4-decadienal (CH3(CH2)4CHCHCHCHCHO, CAS No. 25152-84-5) más hexanal (CH3(CH2)4CHO, CAS No. 66-25-1) más hexanol (CH3(CH2)5OH, CAS No. 111-27-3) por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas de soya también pueden producir menos de 8 µg de 1-octen-3-ol (CH3(CH2)4CHOHCHCH2, CAS No. 3391-86-4) por gramo de semillas molidas o harina de soya privada de la cutícula (o "pelada") luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Los compuestos 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, y 1-octen-3-ol y sus combinaciones se usaron para cuantificar las propiedades de producir olores de semillas de soya. Los olores no se restringen a estos compuestos que hemos citado. Otros aldehidos, cetonas y alcoholes detectables se pueden usar como medidas de propiedades de producir olores usando el método de la invención. Ejemplos de estos compuestos incluyen, entre otros, Propanal, Pentenal, Pentanal, Exenal, Pentenol, Heptanal, Heptenal, Benzaldehido, Exadienal, Heptadienal, Heptanol, Octenol, Octenal, Nonanal, Octadienona, 2 pentil Furano, Pentanal, 2,3-dimetil, Nonenal, Maltol, Decenal, y 2-Undecenal. De acuerdo con la invención, el término "lipoxigenasa" se refiere a una enzima que cataliza la oxidación de ácidos grasos insaturados con oxígeno para dar peróxidos. Al término "lipoxigenasa" (EC. 1.13.11.12) se lo llama también lipoxidasa y dioxigenasa en el arte. Olores de leche de soya e ingredientes de proteínas de soya de semillas de soya carentes de una, dos o tres de las lipoxigenasas 1 , 2 y 3 fueron determinados por otros investigadores. Existen semillas de soya altamente oleicas con menos de 4% de ácido linoleico. Algunas de las soyas que tienen esos rasgos pueden producir menos de 20 µg del total de 2,4 decadienal más hexanal más hexanol por gramo de semillas de soya molidas usando el ensayo de esta invención y algunas no caerán en ese intervalo. Se descubrió en esta invención que es posible crear semillas de soya que contengan lipoxigenasas 1 , 2 y 3 que produzcan muy bajos niveles de olores y que semillas de soya sin lipoxigenasa pueden producir altos niveles de sabores desagradables. Además de composiciones con alta ß-conglicinina que no fueron previamente tamizadas según propiedades de producir olores, la invención provee en particular nuevas composiciones de soya que tienen lipoxigenasas 1 , 2 y 3 y más que 10% ácido linoleico. El ácido graso linoleico (18:2 n-6) y el ácido graso linolénico (18:3 n-6) son ácidos grasos poliinsaturados con dos o tres cis dobles enlaces de acuerdo con la invención. Los métodos de la invención para seleccionar líneas de baja producción de olores de la progenie de soyas sin lipoxigenasa o soyas altamente oleicas caen dentro del alcance de la invención.

El olor 1-octen-3-oI es un producto de escisión de ácidos grasos que tienen hidroperóxidos en la posición del carbono 10 del ácido linoleico. Se descubrió en esta invención que la remoción del recubrimiento o cutícula de la semilla (hull) reduce sustancialmente la propiedad de formar 1-octen-3-ol de composiciones de soya. Lipoxigenasas fúngicas y hidroperóxido liasas forman 10-hidroperóxidos y 1-octen-3-ol, respectivamente (Wurzenberger y Grosch, 1984; Husson et al., 1998). En esta invención se razonó que semillas de soya que producen menores cantidades de 1-octen-3-ol, resisten la contaminación dei recubrimiento por hongos tales como Phomopsis (Minor et al., 1995) y o contienen componentes que inhiben ias lipoxigenasas fúngicas. Las propiedades organolépticas de productos de soya dependen de los contenidos de glicininas y ß-conglicininas. Las glicininas son más propensas a retener olores y a formar partículas insolubles que afectan adversamente la calidad sensorial de productos de soya. La presente invención provee semillas de soya que tienen más que 30% de la proteína como ß-conglicinina y menos de 25% de las proteínas como glicininas y que producirán menos de 20 µg del total 2,4-decadienal más hexanal más hexanol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las mismas semillas pueden también produce menos de 8 µg de 1-octen-3-ol por gramo de semillas molidas bajo condiciones similares. De acuerdo con la presente invención, ß-conglicinina se refiere a un trímero proteina con un peso molecular de 150-200 kDa. Tres subunidades principales de ß-conglicinina son la a' (72 kDa), a (68 kDa) y ß (52 kDa). Las subunidades alpha-prima y alpha contienen dos fracciones de carbohidratos ligadas covalentemente y la subunidad beta contiene una. Utsumi et al., (1997) proveen una revisión de la estructura y propiedades de ß-conglicinina y de la otra proteína de almacenamiento principal, glicina. Se puede usar germoplasma público como el "Moshidou Gong 503" para cambiar la proporción de subunidades a a a' de la ß-conglicinina usando métodos de cría tradicionales. El término ß-conglicinina en esta solicitud incluye estas variaciones de subunidades. En esta invención se proveen semillas que tienen más que 30% de la proteína como ß-conglicinina y o menos de 25% de la proteína como glicininas que comprenden menos de 5.000 µg/g arginina libre y menos de 900 µg/g asparagina libre. El término "libre" se refiere a amino ácidos que no están ligados con otras moléculas presentes en los frijoles de soya o en la harina de semillas de soya y se pueden extraer y solubilizar con 5% de solución acuosa de ácido tricloroacético (TCA) a 4°C hasta el día siguiente. No se había demostrado previamente ei valor de la selección de semillas de soya que comprenden niveles bajos de amino ácidos libres para producir carnes de soya, leche de soya, harina de soya, concentrados de proteínas de soya y aislados de proteínas de soya de alta calidad.

El color de los ingredientes de soya y de alimentos hechos de acuerdo con la invención puede mejorarse reduciendo los niveles de aldehidos formados (p.ej. hexanal y 2,4 decadienal) porque los aldehidos reaccionan con aminas para formar pigmentos marrones. Niveles reducidos de productos de oxidación de lípidos pueden también limitar el blanqueo oxidativo de pigmentos amarillos dando un producto final, menos blanco. El problema potencial del bajo blanqueo se resuelve en esta invención seleccionando semillas de soya con bajos niveles de pigmento amarillo. La invención provee composiciones de soya que tienen color amarillo medido como "valor b*" de menos de 30 y que produce menos de 20 µg del total 2,4-decadienal más hexanal más hexanol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación bajo condiciones acuosas suaves. El "valor b*", según se usa aquí para describir el color de la semilla de soya representa la Escala de Color CIE-L*a*b* (CIÉ, Colorimetry, Publicación 15.2, Segunda Edición, Viena (1986) utilizando el procedimiento Colorflex) y se refiere al azul (números negativos) a amarillo (números positivos) de semillas de soya o harina de soya, y similarmente el valor "L*" se refiere a la claridad del color de semillas de soya o harina de soya en la Escala de Color CIE-L*a*b*. Las semillas de soya o la harina de soya en una modalidad de ia invención tendrán el valor L* superior a 80. La soya del tipo salvaje, el cultivar comercial o híbridos de ellas se pueden cruzar por los métodos convencionales con una planta de soya que tenga semillas con el fenotipo de la invención que produce bajos olores para crear semillas que comprenden el rasgo de bajo olor más otros rasgos deseados (p. ej., rendimiento, composición de ß-conglicinina, resistencia a herbicidas). Se eligen la progenie híbrida que exhibe el rasgo de bajo olor y otros fenotipos deseados. Los métodos de cría usados de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, métodos descritos en Knowles y Briggs (1967) o cualesquiera métodos conocidos en el arte. Métodos específicos para la selección y desarrollo de nuevas variedades de soya, por ejemplo, se presentan en la Patente de E.U.A. 6,653,534. La invención también provee alimentos procesados para consumo humano hechos de composiciones de soya de la invención. Un ejemplo de alimento procesado para consumo humano se puede hacer, por ejemplo, de una composición de harina de soya pelada de la invención. Ejemplos de estos derivados incluyen, entre otros, barras, bebidas, carne y sustitutos de carne, yogurt de soya, sustitutos de queso y suplementos nutricionales. Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar modalidades preferidas de la invención. Los idóneos del arte apreciarán que las técnicas presentadas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la práctica de la invención y pueden, así, considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los idóneos, a la luz de esta presentación, apreciarán que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se hacen públicas y todavía mantener un resultado similar sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, resultará claro que algunos agentes que son química y fisiológicamente relacionados pueden sustituirse con los agentes descritos aquí y mantenerse resultados similares. Todos esos sustitutos y modificaciones se consideran estar dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se definen en las reivindicaciones.

EJEMPLO 1 Materiales y métodos Este ejemplo describe un método analítico de la presente invención. El propósito de este método es determinar las propiedades de producir olores de diferentes líneas de soya. El método determina olores elegidos iniciando primero— la-formación de olores. El olor se forma al moler las semillas a harina fina y activar enzimas con agua. Estudios sobre la tasa de formación indicaron que a temperatura ambiente la formación de olores generalmente se completaba a alrededor de 20 minutos (Cuadro 1). Este tiempo fue importante para cuantificar exitosamente los compuestos de los olores y para determinar las propiedades de producir olores de diferentes líneas de soya. Luego de 20 minutos, se agregaron sustitutos deuteriados de hexanal, hexanol y 2,4 decadienal para proporcionar patrones internos. La reacción se detuvo con la adición de sulfato de sodio inmediatamente seguida de la adición de 10% metanoI:éter para extraer aldehidos, alcoholes y cetonas. El método no se restringió a los compuestos enumerados. Se pueden cuantificar todos los otros aldehidos, cetonas y alcoholes pero no con la precisión de los tres usando sustitutos deuteriados.

CUADRO 1 Efecto del tiempo luego de mezclar harina de soya con agua (0.5 g de harina con 2 mL agua, es decir relación 1 :4) sobre la formación de componentes del sabor. El pH de las suspensiones para cuatro diferentes líneas de soya (A-4, A-5. A- 0 y A-14) fue de alrededor de 6.3 Tiempo Hexanal 2 x st l-Octen- 2 x 2,4 2 x st pH(A- pH( PH (A- pH (A- (minutos) (µg/g) dev. 3- st Decadienal dev. 4) IO) 14) oi(µg/g) dev. (ug?g) 0 1.3 2.6 0.8 0.4 0.4 0.4 6.4 6.4 6.3 6.3 5 11.8 0.2 2.9 0.4 6.9 0.7 10 11.4 1.4 3.7 0.7 6.5 0.6 6.3 6.3 6.3 6.3 20 14.0 0.8 5.8 0.6 7.8 0.9 6.3 6.3 6.3 6.3 40 15.7 1.9 7.8 0.5 8.6 2.3 6.3 6.3 6.3 6.3 240 17.0 4.2 8.9 1.8 9.9 1.7 El tiempo analítico para determinar estos componentes en 175 muestras lleva 24 horas. Esto incluye extracción y determinación usando cromatografía de gas/espectrometría de masa. El tamaño de muestras para análisis fue típicamente de 0.5 gramos (g), pero puede variar de 0.2 g a 0.7 g. El intervalo de una concentración de olores sobre un peso húmedo fue de 0.2 µg/g a 120 µg/g.

Preparación de muestra de carnes de soya: Se recogieron semillas enteras de soya o carnes de semillas de soyas como muestras. Se molieron aproximadamente 6 a 12 semillas o su peso equivalente como piezas de carnes de soya de una muestra en un molino de bolas a aproximadamente 1200 revoluciones por minuto (rpm) por 1 minuto para producir una harina fina. El molino de bolas para moler semillas se describe en la Patente Publicada de E.U.A. 2003/0146313 A1. El número de semillas o carnes de soya se determinó para obtener aproximadamente 0.5 a 1.0 g de harina de soya al final de la molienda. La harina de soya recién molida se usó para otros-análisis más.

Extracción de harina de soya: Se usó harina de soya recién molida para la extracción de los olores principales. Se tomó aproximadamente 0.5 g (0.48 a 0.52 g) de harina de soya en un vial o frasco de 20 mililitros (ml) (VWR TraceClean™ frascos de borosilicato claro con cierre recubierto de teflon) con una tapa. Se agregó agua desionizada (2 ml) a la harina en el vial antes de volver a poner la tapa. Se mezclaron los contenidos de los frascos por aproximadamente 30 segundos (seg) en un mezclador de vortex para asegurar que toda la harina de soya estuviese adecuadamente hidratada en el vial. La harina de soya hidratada se dejó incubar a temperatura ambiente (típicamente 22°C) por 20 minutos (min). Luego de 20 minutos, se agregó 11 ±0.3 gramos de sulfato de sodio anhidro en el vial seguido por la adición de 10 ml de 10% de metanol:éter en el vial. Se agregaron 30 microlitros de un sustituto estándar (mezcla de patrones deuteriados de hexanal, hexanol y decadienal) de solución marcadora (spiking) en el vial antes de volver a tapar y agitar por 30-40 minutos en un agitador de acción recíproca a -200 rpm. Luego de 30-40 minutos, se colocó 1 ml de extracto de metanol:éter en un vial Autosampler (vial Autosampler para 7683 HP Autosampler. El vendedor es VWR) para siguientes análisis. Análisis de Extractos de Harina de soya: Se analizaron extractos de harina de soya en metanol:éter en un cromatógrafo de gas Agilent 6890 (395 Agilent Technologies, Palo Alto CA 94306) equipado con autosampler Agilent 7683 y espectrómetro de masa Leco con software LECO Chrom TOF (LECO Corporation, St. Joseph, Michigan 49085). El cromatógrafo de gas también estaba equipado con columna de cromatografía de gas 10-meter DB-WAX o DB1701 con espesor de película de 0.4 o más e ID 0.18 mm (Agilent Technologies). Metanol (metanol de grado EM Science metanol purge y trap) se obtuvo de VWR (VWR International West Chester, PA 19380); Éter etílico (éter etílico anhidro) de Mallinckrodt (Mallinckrodt, Hazelwood, MO 63042). 2,4 decadienal, 85% trans (15% cis), Hexanal 98%, Hexanol, 99%, 1 octen-3-ol 98%, 2 undecanona 99%, 2 nonenal 97%, y 2,4 nonadienal 99% de Sigma- Aldrich Company (Saint Louis MO 63103). D12 Hexanal, D13 Hexanol, y D2 2,4 decadienal deuteriados se prepararon como se describen en Lin et al. (1999). Para el análisis, se inyectaron muestras de 1 micro-litro (µl) a través del puerto de inyección del aparato de cromatografía de gas (ge). Los parámetros usados para analizar las muestras en el cromatógrafo fueron como sigue: Chromatograph Parameters Column: DB-Wax o DB 1701 capillary 10 m x 0.18 mm, 0.4 mm Film Injection Volume: 1 ul Injection liner: Split/splitless liner. Programa de temperatura: Inicial 55°C por 1 minuto 40°C a 175°C a 40°C/minuto, mantener 0 minuto 175°C a 240°C a 35°C/minuto, mantener 0 minuto temperatura de ingreso: 220°C Modo de Inyección: Pulsed splitless con 0.56 kg/cm2 inicial por 1.5 minutos Split ratio : 20:1 Carrier gas: Helio a 1.8 mL/minuto a flujo constante. LECO Tiempo de parámetros de vuelo interfase de temperatura: 250°C Source Temperature: 200°C Mass Spectrometer source temperature: 150°C Sean parameters: 50 a 250 m/z a aproximadamente 50 scans por segundo. Control de calidad de análisis: Por cada tanda de muestras se corrió un blanco y un spike al mismo tiempo. El spike se hizo partiendo una de las muestras a analizarse en dos porciones. La muestra debe ser tan homogénea como sea posible. La segunda porción se marcó con una cantidad conocida de hexanal, 1 octen-3-ol y decadienal. Esta adición se hizo al tiempo de la adición de los compuestos deuteriados en el procedimiento de extracción descrito arriba. La concentración de los compuestos marcados y no marcados se determinó como el % de recuperación por la siguiente fórmula: % de recuperación = 100 x (C5) (wt5)-(C0) (wt5)/x5 donde: C5 = concentración de muestra marcada en µg/(gm peso húmedo). C0 = concentración de la -muestra-no marcada en µg/(gm peso húmedo) Wt5 = masa de muestra marcada en gm X = microgramos marcados en la muestra. El método en blanco siguió al procedimiento de extracción sin la adición de harina de soya. Exactitud y precisión del análisis: La exactitud y la precisión se determinaron corriendo una muestra homogénea de harina de soya y marcando la muestra con un nivel conocido de los tres compuestos hexanal, 1 octen-3-ol y 2,4 decadienal. Las muestras no marcadas se analizaron también para determinar las cantidades de recuperación de compuesto marcado. Se pueden usar diferentes niveles de marcación como un método de adición patrón para determinar bases debidas a errores sistemáticos. Se determinó el valor promedio junto con la desviación estándar. El valor promedio se comparó con el nivel conocido de material agregado para dar un estimado de la exactitud del método. La desviación estándar da la precisión de la medición.

Notar que es importante comprender que estos enfoques sólo miden la variabilidad analítica, ya que la molienda de más de 40 semillas para hacer la harina de soya homogénea promedia la variabilidad de las semillas. Puede ocurrir una variación mayor para la determinación real debido a la variación de semilla a semilla. Para el hexanal, el % de recuperación fue de 83.8%. Para el 1 octen-3-ol el % de recuperación fue de 93.6 %. Para 2,4 decadienal el % de recuperación fue de 99.3%. El hexanal fue el menos exacto según el enfoque de la marca. Se cree que esto se debe a la volatilidad del hexanal y al hecho de que el método tiene recuperaciones bajas para el hexanal. El octen-3-ol y 2,4 decadienal tienen niveles más altos de exactitud usando el enfoque de la marcación. La precisión, indicada por el % de desviación estándar relativa de las recuperaciones fue de 5% para el hexanal y el octen-3-ol. Para el 2,4 decadienal, la precisión medida por el % de desviación estándar relativa de las recuperaciones fue de 1.1 %. El tamaño de la muestra no se halló que tuviese un efecto desde 0.2 a 0.9 gramo para esta muestra homogénea, pero puede ser un problema entre muestras. Esto no fue comprobado. Así, el tamaño de la muestra debe ser alrededor de 0.5 gramos hasta que se sepa que el tamaño no es un problema o que el método se ajuste. El intervalo de detección para todos los compuestos está entre 0.5 microgramo a 25 microgramos. La adición de más estándares a la curva estándar puede extender el intervalo.

EJEMPLO 2 Identificación y selección de semillas de soya con baja producción de olores Se cuantificaron olores potentes en leche de soya hecha de una soya de control (Vinton 81), una soya que carece de lipoxigenasa-2 (QT-1) y una soya que carece de lipoxigenasas 1 , 2 y 3 (IA2025). Se hizo leche de soya de cada variedad remojando semillas limpias en agua en una proporción 1 :5 (1 g peso: 5 ml agua a 25° centígrados (C) por alrededor de ocho horas. Luego de descartar el agua de remojo, se drenaron las semillas de soya que pesaban el doble del peso original y se mezclaron con agua destilada (2X peso seco de semillas de soya) por cinco minutos. Se mezcló agua destilada adicional (7 x peso seco de semillas de soya) con el barro por alrededor de 2 minutos (min.) a 20°C. El barro se llevó a 95°-98°C por 20 min en baño de agua y se filtró por un lienzo grueso de queso y se estrujó a mano para exprimir tanta leche de soya como era posible. La leche de soya se pasteurizó manteniendo en baño de agua a 85° a 90°C 10 minutos para reducir la contaminación microbiana y se guardó a 4° C antes de la extracción de olores para seguir otros análisis. Se extrajeron olores de las muestras de leche de soya. Esta se extrajo con una porción de 0.67 de Freon™ 113 por al menos 30 minutos. Luego de remover el extracto en Freon™ 113, la fase acuosa se volvió a extraer con una porción de 0.67 de etil acetato. Luego de la toma del extracto de etil acetato, se descartó la fase acuosa. Tanto el Freon™ y el etil acetato se filtraron a través de sulfato de magnesio para remover tanta agua como fue posible y se concentró a 1 ml usando un evaporador rotativo Buchi 0.1. Los extractos de Freon se evaporaron a 48 kilopascal (kPa) y los de etil acetato a 86 kPa. Se cuantificaron olores fuertes producidos en leches de soya usando GC-Olfactometry (Aeree T. E, Analytical Chem. 69:170A-175A, 1997). GC-Olfactsmetery es cromatografía de gas con un puerto para respirar y oler en el que se mide la potencia olorosa de un compuesto químico como medida de la respuesta humana a sustancias olorosas en una corriente de aire. Se usó un cromatógrafo de gas Hewlett Packard 6890 equipado con una columna capilar (espesor de película 0.33 µm) de sílice fundida de metil silicona de 12 m x 0.32 mm ligada en cruz para CharmAnalysis™ (Aeree, T. E.; Bamard, J; Cunningham D. G.; Food Chem. 14, 273-286, 1984). El efluente consistió de helio (2 ml/min) como gas portante y nitrógeno para completar (ca. 30 ml/min). El efluente se mezcló con aire de oler (20 L/min), que era 99% aire del laboratorio humidificado entre 50% y 75% y se lo pasó por el "oledor" vía un tubo pirex de 10 mm de diámetro. El horno GCMS se programó para comenzar a aumentar la temperatura a tres minutos a partir de la temperatura inicial de 35°C a 225°C a 6°C/min. Se pueden obtener más detalles del método CharmAnalyis™ en leche de soya en la disertación para el acceso a Ph. D. presentada al cuerpo docente de la Gradúate School de Cornell University por Yu-Wen Feng.

Ambas semillas de soya carentes de lipoxigenasa-2 (IA2025, QT-1) produjeron menores niveles de hexanal que el control (Cuadro 2). La soya carente de las tres lipoxigenasas (IA2025) produjo los niveles más altos de 2,4 decadienal y 1-octen-3-ona, en tanto que la soya que no tenía lipoxigenasa-2 (variedad QT-1) tuvo los niveles más bajos de todos los cinco olores fuertes (Cuadro 2). Resultó claro, de los resultados, que otros factores desconocidos que no eran lipoxigenasa-2 estaban involucrados en controlar la oxidación de lípidos en semillas de soya. La variedad QT-1 de soya se identificó como variedad útil para crear variedades comerciales de poco olor que comprenden o no comprenden lipoxigenasa-2. El método del ejemplo 1 se desarrolló para identificar progenies de QT-1 y otras líneas de soya que producen bajas cantidades de 2,4 decadienal, hexanal, hexanol y 1-octen-3-ol.

CUADRO 2 Valor charm de olores presentes en leche de soya preparada de tres variedades de semillas de soya-La línea registrada de Monsanto produjo niveles más bajos de sabores desagradables gue una soya sin tres lipoxigenasas (IA2025) y que una soya tofu (Vinton 81) CUADRO 3 Cruzas de soya usada para desarrollar progenie usada para describir las semillas de soya y métodos de la invención EJEMPLO 3 Demostración de consistencia año a año y lugar a lugar de características de producir poco olor, bajo color y bajos amino ácidos en líneas de soya seleccionadas de acuerdo con la invención Se colectaron semillas enteras para evaluar el color. El número deseado de semillas seleccionadas se molieron en un Molino Mega-Grinder a 1.200 rpm 1 minuto para producir una harina finamente molida. El Mega-Grinder para moler semillas de soya se describe en la Patente Publicada de E.U.A. 2003/0146313 A1. Se usó harina de soya recién molida para otros análisis. Se usó un Espectrocolorímetro ColorFlex Modelo 45/0 sistema medidor de color hecho por Hunter Associates Laboratory Inc, Reston VA, EUA para medir el color de harina de soya por el procedimiento estándar sugerido por el fabricante. Los colores se midieron en la escala CIE-L*a*b* (CIÉ, Colorimetry, Publicación 15.2, Segunda Edición, Viena, 1986) usando el procedimiento ColorFlex. La International Commission on lllumination -abreviada como CIÉ por su titulo en francés Commission Internationale de TEclairage - es una organización dedicada a la cooperación internacional e intercambio de información entre sus países-miembros en todo lo que se refiera a la ciencia y al arte de la iluminación. El Valor L* se refiere a la claridad de la harina de soya, en tanto que el valor b* se refiere al azul (números negativos) a amarillo (números positivos) de la harina de soya. En los cuadros 4A-4B y 5A-5B se muestran los valores de colores de harinas de soya hechas de diferentes líneas. Amino ácidos libres: se almacenaron muestras no molidas en un ambiente a temperatura/humedad controlados y en condiciones de seguridad aprobadas por APHIS. Se molieron ias muestras usando el CAT Mega-Grinder para hacer harina de soya y se la guardó a 4°C en un cuarto para almacenaje. Se extrajo la harina de soya con 5% de TCA a 4°C hasta el día siguiente, se centrifugó y se guardaron los extractos a -80°C. Los extractos se filtraron, se diluyeron en caso de necesidad, y se analizaron por amino ácidos según el método OPA. El método OPA usa o-ftaldialdehido (OPA) para derivatizar muestras antes de la inyección en una columna C18 de fase reversa HPLC. Los aminoácidos derivatizados primarios se separan eficientemente por grupos R y se detectan cuantitativamente con un fluorómetro sensible. La desviación estándar relativa para este método es -3%.

Actividad de la lipoxigenasa: Se molieron muestras usando un Mega-Grinder. Cada muestra recién molida se pesó en triplicado (5 mg ± 1 ) y se colocó en un hoyo específico de una placa de extracción de 96 hoyos de 2 ml. Las muestras se extrajeron con K2HPO4 0.1 M (pH 7.0 o pH 9) por 1 hora a temperatura ambiente. Luego de centrifugar, el sobrenadante obtenido se usó para medir el consumo de ácido linoleico (substrato) usando un espectrofotómetro seguido por una determinación de proteína total por muestra usando el colorante Bio Rad Protein Dye. La unidad de lipoxigenasa se calculó usando los cambios de absorbancia a 230 nm durante 1 minuto de reacción y usando el coeficiente de extinción (e =23,000 M"1crrf1). La concentración de sustrato consumido durante la reacción se calculó sustituyendo cada valor en la ecuación A = ebC. Una unidad de lipoxigenasa se definió como los µmoles de substrato consumido por min y mg total de proteína extraída. Usando reactivos preparados a pH 7.0 o pH 9.0, este arreglo permite medir los niveles (unidades de enzima) de lipoxigenasa-2/-3 o lipoxigenasa-1 , respectivamente. Los resultados de unidades de lipoxigenasa se dan como unidades LOX a pH 7.0 para las actividades de lipoxigenasa-2 y 3 y como unidades LOX a pH 9.0 para la actividad de lipoxigenasa-1. Resultados: Las características del olor de las semillas de soya persistieron al cultivarlas en múltiples lugares (Cuadros 4A-4B) y en múltiples años (Cuadros 4A-4B y 5A-5B). Líneas de semillas de soya que produjeron niveles bajos de hexanal, hexanol y 2,4 decadienal y 1-octen-3-ol en el ensayo de olores (descrito en el Ejemplo 1 ) fueron consistentemente diferentes de líneas que produjeron altos niveles (Cuadros 4A-4B). Las líneas en los Cuadros 4A-4B se ordenaron según los niveles de hexanal + hexanol + 2,4 decadienal producidos por esas líneas. Por ejemplo, la línea A-1 en la parte superior de los Cuadros produjo 18.21 +/- 4.21 µg/g de los tres olores en contraste con la línea A-18 al final de los Cuadros, que produjo 65.74 +/-21.97 µg/g de los tres olores. Las cantidades de hexanal más hexanol producida por las semillas de soya de la misma cruza (p. ej., cruza A) correlactsnadHS_con las^cantidades de 2,4 decadienal producido (Cuadro 6, R2 = 0.85) sugieren mecanismos y control similares por variaciones genéticas y de composiciones. Los niveles de 1-octen-3-ol producido fueron independientes del hexanal, hexanol y 2,4 decadienal (Cuadro 6, R2 = 0.01 ) sugiriendo un mecanismo diferente de formación y control. Líneas de semillas de soya lines cultivadas en 2-3 lugares que produjeron niveles bajos de 1-octen-3-ol fueron consistentemente diferentes de líneas que produjeron altos niveles de 1-octen-3-ol. Por ejemplo, la línea A-18 produjo 4.70 +/- 0.88 µg/g de 1-octen-3-ol y la línea A-12 produjo 14.67 +/- 2.37 µg/g de 1-octen-3-ol. Se pueden seleccionar líneas que tengan una combinación de composiciones genéticas que produzcan niveles de 1-octen-3-ol más bajos y más bajos niveles de 2,4 decadienal más hexanal más hexanol (p. ej., línea A-6).

CUADROS 4A y 4B Color y olores producidos por semillas de soya molidas de las progenies de cruzas A, B, C, D y E como se muestra en la Tabla 3. Los valores son la media y la desviación estándar (Stdev) para cada línea cultivada en dos o tres lugares en 2002 (Ames, lowa; Oxford, Indiana; Gladbrook, lowa). La progenie de la cruza B tuvo bajo contenido de ácido linoleico 2,9 +/0,4% de ácidos grasos totales. Todas las líneas tienen hilum amarillo. Las semillas de soya molidas tuvieron 8% de humedad. Valores de color son L* (lightness = claro), a* (verde-rojo), y b* (azul-amarillo). Abreviaturas: Stdev = desviación estándar ^ oo CUADROS 5A v 5B Características de harina de soya hecha de semillas de soya comerciales (controles) y de las progenies de cruzas A, B, C, D y E, cultivadas en 2001. Las semillas de soya molidas tuvieron 7% de humedad. El orden de las líneas es el mismo que en la Tabla 4. La progenie de la cruza B tuvo un rasgo de bajo ácido linoleico (2.9 +/ 0.4 % de ácidos grasos totales). Dos progenies carecían de una o más lipoxigenasas, las otras contenían las tres lipoxigenasas designadas como L1, L2 y L3. Las actividades de lipoxigenasa tuvieron unidades de micromoles de substrato consumido por mg de substrato. Valores de color son L* (lightness = claro), a* (verde-rojo), y b* (azul-amarillo). Abreviaturas: Stdev = desviación estándar. é CUADRO 6 Relaciones lineales determinadas por valores de R-cuadrado entre olores producidos provenientes de cosechas de progenies en 2001 y 2002. Se calcularon regresiones lineales a partir de los Cuadros 4A-4B y 5A-5B. Abreviaturas: H+H = hexanal + hexanol; D = 2,4 decadienal; O = 1 -octen-3-ol; DHH = 2,4 decadienal + hexanal + hexanol Fue posible desarrollar variedades de buenos rendimientos, bajos olores y colores por primera vez usando los métodos y semillas de soya de esta invención. Por ejemplo, líneas A-1 , A-4 y A-6 rindieron 90, 90.5 y 104 % de los controles comerciales. Hubo poca o ninguna relación entre las actividades de lipoxigenasa a pH 7 y 9 y la formación de 2,4 decadienal + hexanal + hexanol de harina de soya hidratada (valores R-al cuadrado <0.35, Cuadro 7). Semillas de soya que produjeron actividades de lipoxigenasa significativas a pH 7 y 9 (línea A-1) tuvieron propiedades de olor similares a las de una línea que no tenía actividades de lipoxigenasa (Línea C-1 ) (Cuadros 5A-5B). La soya disponible en el comercio que no tenía lipoxigenasas 1 , 2 y 3 (IA2032 de la cosecha 1999) también fue probada en cuanto a actividad de lipoxigenasa y formación de olores. No se encontraron actividades de lipoxigenasa a pH 7 y 9 en las harinas de soya carentes de las tres lipoxigenasas, pero sí niveles significativos de hexanal (23.3 µg/g), hexanol (14.9 µg/g), y 2,4 decadienal (5.8 µg/g) se formaron en el ensayo de olores de la invención. Siguiendo experimentos que usaban inhibidores de lipoxigenasa, se concluyó que al menos otra lipoxigenasa era activa en esta composición de soya. Ingredientes de proteínas de soya de color claro son apreciados en la industria de alimentos, especialmente para productos tipo lácteos. Se cultivaron semillas de soya en 2-3 lugares para determinar si se podrían seleccionar semillas de color claro. Se descubrió que se podía seleccionar semillas de color claro según determinación del valor b* de semillas de soya molidas (alto valor b* indica más amarillo, menos azul; Cuadros 4A-4B). Por ejemplo, la soya A-2 tuvo un valor b* de 22.16 +/- 1.39 y la soya A-6 tuvo un valor b* de 27.35 +/- 2.85 (Cuadros 4A-4B). Existía una correlación entre el valor b* de líneas de soya cultivadas en 2001 y 2002 (R-cuadrado = 0.7; Cuadro 7).

CUADRO 7 Relaciones lineales determinadas por valores de R-cuadrado para olor, amino ácidos libres y color producidos de progenies cosechadas en 2001 y 2002. Se calcularon regresiones lineales a partir de datos de los Cuadros 4A-4B y 5A-5B. Se hicieron correlaciones de amino ácidos libres con datos de 2002 sin tres líneas (A-4, B-5 y B-6) Oí 4^ Los factores ambientales, además de los genéticos, afectan a las composiciones que ejercen influencia sobre las propiedades que producen olores de las semillas de soya. Los factores ambientales fueron evidenciados al comparar las propiedades de producir olores de líneas cultivadas en dos temporadas, 2001 y 2002. El intervalo de 2,4 decadienal + hexanal + hexanol para líneas creadas fue de 12-44 µg/g en 2001 y 17-65 µg/g en 2002 (Cuadros 4A-4B y 5A-5B). Las propiedades de producir 1-octen-3-ol de semillas de soya parecieron ser lasmás sensibles a factores ambientales según se evidenció por la carencia de correlación entre 1-octen-3-ol producido por las mismas líneas cultivadas en 2001 y 2002 (R-cuadrado = 0.07, Cuadro 6). En contraste, los niveles de 2,4 decadienal + hexanal + hexanol producidos por las líneas de soya en 2001 y 2002 correlacionaban (R2 = 0.62, Cuadro 6). Se determinó las cantidades de arginina libre (Arg) y asparagina (Asp) en progenies de soya. Las cantidades de arginina y asparagina libres se correlacionaban (R2 = 0.81 , Cuadro 7) y el total de arginina más asparagina variaba de 353 a 3300 µg/g (2001) (Cuadros 5A-5B). La arginina libre + asparagina en las semillas de soya no se relacionaban con las propiedades seleccionadas de olor o color de la soya (R-cuadrado < 0.3, Cuadro 7), de modo que es necesario determinar los amino ácidos para seleccionar las líneas que tengan combinaciones de bajo 2,4 decadienal, bajo color y bajos amino ácidos libres. La factibilidad de seleccionar líneas de soya con bajos amino ácidos fue apoyada por la buena correlación entre arginina libre + asparagina en líneas cosechadas en dos años diferentes (R-cuadrado = 0.8; Cuadro 7). EJEMPLO 4 Combinación de propiedad de producir bajos olores con una composición de alta ß-conglicinina y composiciones de baja arginina libre y asparagina y propiedad de bajo color El origen del rasgo de la alia ß conglicinina fue una soya mutada carente de glicininas y conteniendo alrededor de 55% de la proteína total como ß conglicininas (Patente de E.U.A. 6,171 ,640). Una determinación de lipoxigenasa no fue útil para seleccionar líneas productoras de bajos olores como se describió antes. Se crearon semillas de soya que tenían perfiles de proteína, grasas y aminoácidos que estaban dentro de los intervalos normales de semillas de soya comerciales. Cuantificación de subunidades de proteína de soya: Se molieron alrededor de 8 semillas usando un Mega Grinder (Publicación de Patente de E.U.A. 2003/0146313 A1 ). Para cada muestra, se extrajeron -30 mg de la harina en 1.0 ml de regulador de pH Laemmli SDS pH 6.8 con DTT 0.1 M en un "nutator" o multi platos de vortex de 45 a 60 minutos. Los tubos se centrifugaron 3-5 minutos. Una porción del sobrenadante se transfirió a tubos de microcetrifugas y se diluyó con el regulador de pH citado para dar 1.2-1.5 µg/µL de proteína total. Las muestras se hirvieron 3 minutos, se enfriaron y se centrifugaron. Se cargaron geles Criterion pre moldeados con 10-20% de gradiente Tris-HCl con 15-20 µg de proteína de cada muestra. Los geles se sometieron a electroforesis a 180-200v en 1X Tris-Glycine-SDS Run Regulador de pH hasta que el colorante alcanzó el fondo del gel, alrededor de 1.2 horas. Los geles se fijaron durante 30-60 minutos en 40% de metanol/10% de acido acético y se colorearon con Colloidal Coomassie Blue G-250; como mínimo hasta el día siguiente o hasta 3 días. Para remover el background, los geles se destiñeron con agua desionizada. Los geles se imagearon usando el densitómetro calibrado GS800. La cuantificacion se realizo usando el Bio-Rad Quantity One Software. El software se usa para determinar la cantidad relativa de cada banda en la línea de la muestra. El % de las sub-unidades de glicinina y el % de sub-unidades de beta-conglicinina se informaron como el % relative de la proteína total en la línea. Análisis de aminoácidos totales: La muestra se determinó por tres métodos para obtener el perfil completo. El Triptofano requirió una hidrólisis básica con hidróxido de sodio. Los aminoácidos con azufre recibieron una oxidación con acido perfórmico antes de la hidrólisis con acido hidroclórico. El análisis de las muestras para los aminoácidos restantes se realizó por hidrólisis acida directa con ácido hidroclórico. Una vez hidrolizados, los aminoácidos individuales fueron cuantificados usando un analizador automático de aminoácidos (métodos oficiales de análisis de la AOAC INTERNATIONAL, 2000).

Ceniza: la muestra se colocó en una mufla a 550°C y se prendió para eliminar toda la materia orgánica volátil. La materia no volátil restante se cuantificó gravimetricamente y se calculó para determinar la ceniza %. Métodos oficiales de la AOAC INTERNATIONAL (2000). Hidratos de carbono: El nivel total de los hidratos de carbono se calculó por diferencia usando los datos recientes y la siguiente ecuación: % hidratos de carbono = 100% - (% proteína + % grasa + % humedad + % ceniza). United States Department of Agriculture (1973). Grasa por extracción Soxhlet: La mezcla se pesó en un dedal de celulosa conteniendo arena o sulfato de sodio y se secó para remover el exceso de humedad. Se agregó pentano a través de la mezcla para remover la grasa. El extracto se evaporó luego, se secó y se pesó. Official Methods of Analysis, AOAC INTERNATIONAL (2000). Humedad: La muestra se secó en un horno al vacío a aproximadamente 100°C hasta peso constante. La pérdida de peso se determinó y se convirtió a humedad %.

Proteínas: Los compuestos nitrogenados en la muestra se redujeron en presencia de ácido sulfúrico hirviendo y un catalizador de mercurio para formar amoniaco. La digestión acida se hizo alcalina. Se destiló el amoniaco y se tituló con un estándar ácido. Se calculó el nitrógeno % y se convirtió a proteína usando el factor 6,25. Official Methods of Analysis, AOAC INTERNATIONAL (2000). Bradstreet, (1965). Kalthoff y Sandell (1948).

Resultados: Una población de líneas de semillas de soya de alta ß- conglicinina seleccionadas de una cruza con una soya que contenía el rasgo de producir bajos olores exhibió una amplia variación de propiedades de producir olores al medirse la formación de hexanal, hexanol, 2,4 decadienal y 1-octen-3-oI (Cuadros 8A-8B). Las semillas de soya comerciales contenían alredor de 22% de proteína total como ß conglicinina y alrededor de 38% glicininas, en comparación con las semillas de soya en el Cuadros 8A-8B que tenían más de 30% de la proteína como ß-conglicininas y menos de 25% de las proteínas como glicininas. Se crearon semillas de soya con más de 30% de la proteína total como ß- conglicinina que produjeron menos de 20 µg/g total de hexanal más hexanol y 2,4 decadienal en la determinación de olor del ejemplo 1 , y también comprendían niveles bajos de asparagina y arginina libres. (Cuadros 8A-8B). Por ejemplo se crearon 20 líneas de alta ß-conglicinina según la invención que produjeron menos de 20 µg/g del total de 2,4 decadienal más hexanal mas hexanol y un total de arginina más asparagina libres entre 360 y 2,840 µg/g de semillas de soya molidas. (Cuadros 8A-8B). La asparagina libre de éstas líneas estuvo entre 35 y 1 ,000 µg/g y la arginina libre entre 500 y 2,400 µg/g de semillas de soya molidas.

CUADROS 8A y 8B Características de progenie de soya con alta ß-conqlicinina cosechada en los Estados Unidos. Se crearon semillas de soya con más de 30% de la proteína como beta-conglicininas y menos de 2.5% de las proteínas como glicininas gue también produjeron menos de 20 µg/g de 2,4 decadienal más hexanal más hexanol por gramo de harina de soya en la determinación de olor del ejemplo 1. No fue útil una determinación de actividad de lipoxigenasa para identificar las líneas productoras de bajos olores. Cuadro 8A 0\ o CJ\ Las actividades de la lipoxigenasa variaron significativamente en las muestras de soyas de alta ß-conglicinina. No había relación entre actividades de lipoxigenasa a pH 7 y a pH 9, y las cantidades totales de 2,4 decadienal mas hexanal más hexanol producidas de la misma harina de soya (valores R2 < 0.02). Un experimento adicional se realizó para demostrar que las semillas de soya con más de 30% de ß-conglicinina y menos de 25% de glicininas se pueden seleccionar de manera que tengan bajo color y una composición de aminoácidos dentro del intervalo de las semillas de soya comerciales. Cuatro soyas con alta ß-conglicinina que también contenían el rasgo Roundup Ready® se seleccionaron y dieron lo mismo o mejor que el promedio de semillas comerciales en tres lugares. Estas semillas de soya tenían bajo color como se ilustra por un promedio b* de alrededor de 22 y una L* promedio de alrededor de 85 (Cuadro 9). Las composiciones de aminoácidos (Cuadro 9) cayeron dentro de los intervalos de las semillas de soya comerciales (Cuadro 10) como se- -publicó en la International Life Sciences Institute Crop Composition Datábase (Versión 1.0, ingresada en Marzo 22 de 2004). Las composiciones promedio de aminoácidos de tres líneas de soya de de alta ß-conglicinina (Cuadro 9) se compararon con la composición promedio de soya de la base de datos ILSI (Cuadro 10). Cuatro aminoácidos (arginina, lisina, histidina y serina) de las líneas de alta ß-conglicinina estaban entre 10 y 15% de diferencia de la composición promedio de semilla de soya comerciales pero todavía en el intervalo de composiciones comerciales de soya. También se anticipó que las propiedades organolépticas de semillas de soya de alta ß-conglicinina serían más mejoradas cruzándolas con semillas de soya bajas en linolenico y medio oleico. Las semillas de soya bajas en linolenico y medio oleico fueron creadas en Monsanto usando métodos de cría tradicionales y comprenden un contenido linolénico de alrededor de 2%, eí contenido linolénico de alrededor de 25% y el contenido oleico de alrededor de 59% de los ácidos grasos totales.

CUADRO 9 Propiedades de composición, color y olor de semillas de soya cultivadas en tres lugares en 2003. Todas tenian el rasgo Roundup Ready® e hilum oscuro 1 o -o CUADRO 10 Comparación de la composición promedio de tres semillas de soya de alta ß-conglicinina con la composición promedio de soya en la International Life Sciences Institute Crop Composition Datábase (Versión 1.0). Los criterios de selección usados para obtener los datos: tipo de cultivo, semillas de soya - Glycine max, tipo de tejido: semilla, año del cultivo, toda, país, toda, estado, toda. Abreviatura: FW = peso de la harina de soya. DW = peso seco.

EJEMPLO 5 Comparación de propiedades de olor y color de semillas de soya comerciales y de semillas de soya seleccionadas de acuerdo con la invención Las propiedades de olor y color de semillas de soya comerciales se determinaron para comparar con las propiedades de olor y color de semillas de soya de la invención. Algunas semillas de soya produjeron menos de 17.5 µg/g de hexanal más hexanol y algunas produjeron menos de 1 1 µg/g de 2,4 decadienal en la determinación de olores (Cuadros 11A-11 B). Sin embargo, ninguna de las semillas de soya comerciales produjo menos de 20 µg del total de 2,4 decadieanal más hexanal más hexanol por gramo de semillas molidas luego de una oxidación en condiciones acuosas suaves. Cuatro líneas conteniendo lipoxigenasa de esta invención fueron creadas y produjeron menos de 20 µg/g de hexanal más hexanol más 2,4 decadienal en dos temporadas (Cuadros 4A-4B y 5A-5B). Por ejemplo, la línea A-1 de las cosechas 2001 y 2002 produjo 18.0 y 18.2 µg/g respectivamente de la suma de hexanal más hexanol y 2,4 deacadienal (Cuadros 4A-4B y 5A-5B). Más de 20 líneas de alta ß-conglicinina se crearon según esta invención y produjeron menos de 20 µg/g del total de hexanal más hexanol y 2,4 decadienal (Cuadros 8A-8B). Por ejemplo una soya de alta ß-conglicinina produjo 9.7 µg/g de hexanal mas hexanol y 3.2 µg/g de 2,4 decadienal (Cuadros 8A-8B).

El color de las semillas de soya comerciales cubría un amplio intervalo. Por ejemplo b* varió entre 27 y 34 (Cuadros 11A-11B). Las líneas de la invención se encontró que extendían sus valores de b* hasta un bajo de 22 (Cuadros 4A-4B, cuadro 9).

CUADROS 11A y 11B Propiedades de producir color y olor de semillas de soya comerciales CUADRO 11A Sabor Muestra Hexanal Hexanal Hexanol + 2,4 l-octen-3-ol 2,4 decadienal + número (pg/g) (pg/g) (pg/g) decadienal (MS'S) hexanal + hexanol µg/g 385 14.0 3.9 18.0 2.8 1.8 20.7 1 493 5.0 5.1 10.1 11.1 5.4 21.2 491-2 5.0 4.4 9.4 14.3 6.1 23.7 210 15.4 5.1 20.5 3.6 7.0 24.1 287 14.0 3.6 17.6 7.2 18. 24.8 387 15.6 3.9 19.6 5.3 8.5 24.8 138 14.9 5.0 19.9 5.0 9.3 24.9 379 17.4 4.1 21.5 3.4 9.1 24.9 137 15.0 4.8 19.9 5.1 8.4 25.0 CNJ co 00 O CO 00 CO NJ co »- oo 00 O v— CO LO LO co ^ h- r-- LO LO LO CD CD CO CD co -~ 00 00 00 0000 00 CO 00 co CNJ CNJ CN1 CNÍ CNJ CNJ CNJ CNJ CNJ CNJ NJ CNJ CM CNJ CNJ CNJ CNJ CNJ CNJ CNJ CNJ NJ v- h- CNJ co « M- 00 -co co o LO CD COt- co LO CM M-_ -t r- -co O ^t- CO r^ ^ -- co CNJ co LÓ C h~ ^f CM CO LM" t- co LO CM CD h- CO LO CO O CD co CNl CM T- - O - CM O LO CM CO -«t LO CO LO CO co CO CD V) - CO co OO CD ÜJ CD LO O h- LO CO - O — •r- O CO C CO 00 O CO f^- 00 CM 00 00 ^ CO t- LO O CM O O O O LO O CO O v- CO CM CO - O CM "5- CO LO CM t- CNl CM CM CM CM t- CM v CM CNl CM t- CM CM CM CNl CM CM CM LO OO O) C CO LO oo CO OO CO CO CO CO CM LO 00 T- CM t- LO co co CD LO LO LO LO CO ^ LO CO co LO LO " - LO -* «fr LO CD CD LO h~ oo oo LO oo LO oo N N ?n I? O OO CO LO O) ^ O) LO LO CO ^ Nt ^ ^ co ^ ^ N lO ^ N -j CD O CO l N oo oo co o LO o o co LO CO CD 00 CM ^ s> CM CD - ^ 00 o r-o oo o 00 00 o 00 - 00 ^~ r-~ 00 CM CO o v- 00 00 00 00 LO CM co co CM CM CM CM T- CO «t CM CO CM CM t- ^í- CM CO CO CM CM LO -- r-~- |N- O O V- t- CM CM CM CO 'st "st LO O CD CO CO O v- 00 00 00 O) s> O) 03 C30 CO OÓ OÍ s>" s>" C30 OO OO OO CO CO OÓ d o CM CM CM CM CM CM CM CNl CM CM CM CM CM CM CM CM CNl CM CM CM co co C óO O t-_ CO f-_ 00 00 N- co h- LO T co ~ h- 03_CD_ _CM_ _CO . CM LO 's 'st O OO C?' CNÍ ^f LO v-' -t o CNÍ co LO "t co r^ CM' CM - o LO CD CM 'st C0 LO co co LO CM J. . CNl OO oo oo co co LO LO LO OO CD 00 'st CM O h-' 00 co co co ^ r^ co q co h- od co C3 o? LO o co o O OO 'st CM "? o co q CM q q CM p co CO •st CO 00 CM' CO q CM CM C Í O co o -* 'st CM O CM CM h-' CNÍ O CM co ?' "«-" -st CM CM CM T- CM CM 00 ^ 00 CM CM v- CM CM v- CM CM CM CM CM CM CM •s- q O 00 q q oo q t-_ co q q CM O CO •Nt v-; q q O LO LO N-' "fr" LO LO co" LO c? o LO" LO -" CD -f LO CD 0 °0°. c ^o LO LO LO r^ CD CO q oo co LO oo q LO q q t-_ q CM LO q co ^ -' O LO tO oo Cc0o ^¡. CcOu CcDu ID ^ LO LO 00 M LO ^ co" co LO" LO ^ CM CM i v- t — OO CO LO ^ CD LO CM LO i -s CO 't ^ — o C0 CM LO O ^ O s> oo 00 T- "st 8 03 00 ^ 03 "st 03 O) - O v- CM CM CM "vt CM CM "st CM "* ?s -st CO 'st CM CM CM co CM CM CM CM CM "Ñ -st lO N r- CO C30 03 CO O co -st LO LO Lo co oo o o O O o o o o o o o O v- "^ CM co co co co co co co co 00 co co oo co c c co c co co co co co co - O CD LO CD TG CM ~ CO o CM oo CD CD O CO 00 CM oo CO O O 00 LO CO -st--CM-LO--'st r-—LO'st 's N- LO LO LO LO "st CM CD v- CO CD "s co v- 00 -Nt CO LO co q co CM 00 00 v- CD O LO o co 00 CO ^ 00 -N ^.

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CD CO i O Ñ CD CD CO Ñt CM Ñt oo co Ñt CM CO CO Ñt CO co LO CD O fN Ñ O LO O) LO LO LO CD CD CD CD CD CO CUADRO 11B Color EJEMPLO 6 Demostración de la capacidad de combinar el rasgo de producción de bajos olores con un rasgo de composición de bajo ácido linoleico Este ejemplo muestra que es posible combinar el rasgo de producción de bajos olores con un rasgo de bajo ácido linoleico y además explora los efectos de pelar semillas de soya en la producción de olores. El porcentaje de ácidos grasos de soya que son ácido linoleico es normalmente de alrededor de 8%. Usando las hibridaciones tradicionales fue posible crear semillas de soya con menos de 6% de ácidos linoleicos y la propiedad de producir bajos olores (Cuadros 12A1-12A4). La formación de 1-octen-3-ol es independiente de la formación de otros compuestos volátiles medidos en la determinación de olores. Una hipótesis es que las enzimas fungosas que están en la superficie de las semillas de soya son el origen de la rápida formación de 1-octen-3-ol en el ensayo. Se razonó que el pelado de la semilla antes de molerlas a harinas debiera disminuir los niveles de enzimas fungosas en la determinación de olores. Semillas enteras de soya normalmente se muelen para hacer harina que se usa en la determinación de olores. Se realizó una repetición de la prueba usando 6 líneas de soya de bajo olor y bajo linolénico que fueron cuidadosamente peladas (se les removió el recubrimiento). La cantidad de 1-octen-3-ol formado de las semillas peladas fue de alrededor de la mitad de la de semillas enteras, apoyando la hipótesis de que componentes tales como hongos y enzimas fungosas en la cutícula contribuyen a la formación de 1-octen-3-ol (Cuadro 13). Semillas de soya sin lipoxigenasa frecuentemente producen niveles más altos de 1-octen-3-ol (Cuadro 3). Se razonó que las lipoxigenasas pueden tener un papel en inhibir el crecimiento de moho de manera que en la ausencia de lipoxigenasas, las infecciones mohosas pueden ser mayores permitiendo el aumento de enzimas fungosas y formación de 1-octen-3-ol. Semillas de soya de bajo olor conteniendo lipoxigenasas, que fueron identificadas por el tamizado de esta invención tienden a tener un rango más bajo de 1-octen-3-ol que el de semillas de soya de olor más fuerte (por ej. Cuadros 12A1-12A4).

CUADRO 12A1 a 12A4 Propiedades de producir color y olor de líneas de soya de linolénico bajo. Valores de color son L* (claridad), a* (verde-rojo), y b* (azul-amarillo) CUADRO 13 La formación de 1-octen-3-ol en determinación de olor se redujo cuando las semillas de soya se pelaron antes de hacer la harina EJEMPLO 7 Efectos del pH en la formación de olor Una determinación estándar de olor provisto por la invención implicaba la adición de harina de soya a agua, resultando en la formación de olor a un pH de alrededor de 6.3. El propósito del siguiente experimento fue determinar si variedades que producen niveles bajos de olores en esta condición, también producen niveles bajos de olores en otros pH. Las propiedades de producir olores de una soya comercial de control se compararon con una línea que produce poco olor (A-4). La línea A-4 produjo niveles mas bajos de decadienal y hexanal a pH 3.0 y 5.5, y pH 7 y 9.2 (Cuadro 14). Estos datos apoyan el uso del ensayo sin regulador de pH como método para seleccionar semillas de soya que producirán niveles bajos de olores en un amplio rango de condiciones de pH. Las concentraciones más altas de exanal y 2,4 decadinal se produjeron a pH 9, el pH en el que se produjo la menor cantidad de 1-octen-3-oI (Cuadro 14).

CUADRO 14 Efectos del pH en la formación de olores en soya comercial de testigo y variedad productora de bajo olor (A-4 cosechada en 2003). El ensayo de olor para esta medición fue el mismo que en el Ejemplo 1 excepto que la harina se agregó a K2HPO 0.1 M al pH respectivo (3.02, 5.45, 7.01 , y 9.16) t o EJEMPLO 8 Efectos de la composición de proteínas de soya sobre el sedimento de la leche de soya Este ejemplo describe los niveles más bajos de sedimento formado en leche de soya hecha a partir de soya con composición proteínica modificada de la invención. El sedimento conteniendo proteína tiene un impacto negativo sobre la calidad organoléptica de la leche de soya ya que no se desea sentir partículas en las bebidas.

Preparación de la leche de soya. Se molieron una soya de control de bajo olor A-4 y una soya con alrededor de 39% de ß-conglicinina y alrededor de 13% de glicina usando un molino Mega para hacer harina de soya. Cada muestra de harina se agregó a 36.75 g. de agua a 4°C en un tubo de centrifuga de polipropileno desechable de 50 ml de modo que la concentración final de proteínas en las mezclas fuese 3.3% p/p y se sónico 15 segundos a un control de potencia de salida de 8. Las muestras sonicadas se centrifugaron 10 minutos a 8000 rpm a 4°C usando una centrífuga Eppendorf 5804 R. Los sobrenadantes (leche de soya) se decantaron en tubos de centrífuga de polipropileno desechables de 50 ml. Una porción de cada leche de soya (27.25 g) se transfirió a otros tubos de centrífuga desechable de 50 ml. Las muestras se prepararon en duplicado para acomodar la siguiente variación en la adición de sacarosa. Se agregó sacarosa 0.6987g a los 27.25g de leche de soya antes o después del tratamiento térmico. Las muestras de leche de soya se precalentaron poniendo el tubo de la cantrífuga en un baño de aceite de silicona a 95°C 5 minutos, luego se transfirieron las mezclas a un baño de hielo para enfriarlas, seguida por un almacenamiento refrigerado por 30 días. Se formaron sedimentos en las muestras de leche de soya con el tiempo. La cantidad de sedimento se cuantificó como sigue. El sedimento en el fondo de los tubos de centrífuga se dispersaron agitando los tubos. Las muestras de leche de soya se transfirieron a un tubo de centrífuga tarado y se registró el peso final. Los tubos se colocaron en la centrífuga Eppendorf 5804 R y se centrifugaron 2 minutos a 8000 rpm a 25°C. El sobrenadante de la leche de soya se decantó y se calculó el peso del sedimento remanente. Se registró la cantidad de sedimento como % del peso de la leche de soya (% sedimento = a 100 x peso de sedimento/peso de leche de soya).

Resultados: Las leches de soya de control tuvieron al menos dos veces tanto sedimento como las leches de alta ß-conglicinina (Cuadro 15).

CUADRO 15 Efectos de la composición proteínica de la soya sobre el sedimento de la leche de soya. A-4 es la soya de control. HBC es una soya de alta ß- conglicinina y baja glicina Los ejemplos anteriores muestran que se crearon composiciones únicas que pueden producir bajos niveles de olores aún cuando las semillas de soya contenían lipoxigenasas 1 , 2 y 3. También se demostró la posibilidad de seleccionar semillas de soya que tienen propiedades organolépticas mejoradas, semillas seleccionadas según las cantidades de proteínas glicinina, arginina y asparagina libres, pigmentos amarillos y ácidos grasos poliinsaturados en las semillas de soya y las cantidades de los olores 2,4 decadienal, hexanal, hexanol, y 1-octen-3-ol producidos por las suspensiones acuosas de soya molida. Se descubrió un método para estimar el potencial de semillas de soya para producir 2-4 decadienal, hexanal, hexanol, y 1-octen-3-ol y otros olores aún más potentes en ingredientes y alimentos de soya. En este método de estimación de olores, el valor de la harina de soya incubada en agua en proporción de 1 a 4 resultó en observaciones originales de que el 2,4 decadienal se forma rápidamente a temperatura ambiente en las suspensiones y que es posible criar soyas que contengan lipoxigenasas 1 , 2 y 3 que producen muy bajos niveles de olores. También se mostró en los ejemplos que es posible crear composiciones de soya endógenas con más de 30% de ß-conglicinina y menos de 25% de glicininas que tienen arginina libre y asparagina libre normales o bajas. También se demostró que las propiedades de bajo olor y color se pueden combinar con composiciones de alta ß-conglicinina y se consiguieron más combinaciones con semillas de soya de bajos ácidos linolénico y medio-oleicos. Las glicininas son una fuente de proteínas insolubles en ingredientes y alimentos de soya que crean sedimentos en las bebidas y una sensación desagradable en la boca. La arginina y la asparagina libres pueden formar amoniaco en el proceso industrial, el cual vuelve a reaccionar con compuestos de olores como el 2,4 decadienal para formar olores fuertes como el 2 pentil piridina. Los ácidos linoleicos y linolénico son ácidos grasos poliinsaturados que son sustratos para la formación de olores; bajando su contenido en semillas de soya se ayudará a disminuir la formación de olores. Los pigmentos de las semillas de soya contribuyen al descoloramiento de productos de soya, impactando sobre la respuesta organoléptica. En total, la composición de soya de alta ß-conglicinina, arginina y asparagina libres bajas, ácidos grasos poliinsaturados de bajo olor y bajo color es la composición más valorada de la invención para crear ingredientes y alimentos de proteínas de soya organolépticamente agradables. También se reconoce que estas composiciones no carecerán de las propiedades saludables asociadas con los ingredientes de proteína de soya como ß-conglícininas que están asociadas con las propiedades de las proteínas de soya de disminuir el colesterol y los triglicéridos ((Duranti et al., 2004) en la inhibición de la arteroesclrerosis. (Adams et al., 2004).

EJEMPLO 9 Análisis de sedimentación adicional de composiciones de soya de bajo olor El estudio del ejemplo 8 se repitió con los siguientes cambios. Se incluyó una soya comercial de control (AG3302). Las semillas de soya se pelaron antes de hacer harina y la harina se tamizó antes de agregarla al agua. Los sobrenadantes (leche de soya) se transfirieron a tubos de centrífuga tarados. Se agregó sacarosa antes de calentarlos para tener una concentración final de sacarosa de 2.5% p/p. Se guardaron las muestras en un refrigerador 21 días. Se midieron las alturas de los sedimentos en los tubos y luego se centrifugaron cinco minutos a 8000 rpm. Se decantaron los sobrenadantes y se pesaron, se determinó el pH de los sobrenadantes (todas las muestras tuvieron pH = 6.7 y se pesaron los tubos conteniendo el sedimento. El peso % de los sedimentos húmedos se calculó para cada muestra (p% de sedimento de soya húmedo = a 100 x peso de sedimento húmedo/(peso de sedimento húmedo más peso de sobrenadante de soya).

Se hallaron los efectos benéficos de las semillas de alta ß-conglicinina y bajos olores para reducir la formación de sedimento de proteínas usando semillas peladas (Cuadro 16). La leche de soya de alta beta-conglicinina tuvo una reducción de 2.2 veces el sedimento comparando con la línea de soya de bajo olor, y una reducción de 7 veces el sedimento de la soya de control. Se halló una sorprendente reducción de 3.1 veces en sedimento en la soya de bajo olor comparada con el control. Es posible que el rasgo de bajo olor redujese la formación de sedimento limitando la formación de radicales libres y la oxidación de proteínas. Esto, por lo tanto, indicó las propiedades benéficas de la composición optimizada que combina alta ß-conglicinina y bajos olores.

CUADRO 16 Efectos de los rasgos de alta beta-conglicinina y bajo olor sobre la altura de los sedimentos de la leche de soya y sobre el peso del aglomerado de sedimentos en comparación con composiciones de una soya de control EJEMPLO 10 Preparación de harina de soya pelada e ingrediente de aislado de proteína de soya Una soya de control (AG3302) y soyas que comprenden más de 30 % de las proteínas totales como beta-conglicininas y menos de 25% de las proteínas totales como glicininas y menos de 2500 µg/g de arginina libre más asparagina (DJB2104GOR, EXP319AP) se pelaron para hacer harina de soya pelada y luego procesarlas para hacer un ingrediente de aislado de proteína de soya según las etapas siguientes.

CUADRO 17 Composición de beta-conglicininas y glicininas en diferentes líneas de soya 1. Ajustar semillas a alrededor de 10% de humedad y estabilizarlas a temperatura ambiente. 2. Romper las semillas de soya usando un molino quebrantador. 3. Sacar las cutículas de las semillas de soya quebradas usando un aspirador. 4. Acondicionar las semillas de soya quebrada y descuticuladas a 50-60°C usando un recipente adecuado. 5. Escamar las semillas de soya acondicionadas usando un molino para escamar. 6. Extraer las escamas de soya con hexano. 7. Eliminar el solvente del material de soya extraída. 8. Las escamas se muelen para hacer harina. 9. Agregar agua a un tanque encamisado de 300 litros y ajustar a 50°C y pH 9.0 usando NaOH al 40%. Se agregó y mezcló la harina de soya extraída. La proporción de agua a harina de soya fue de 12/1 (p/p). La extracción duró 45 minutos 10. La proteína de soya solubilizada se recuperó del barro de extracción usando una centrífuga de disco (contrapresión, 4-4.2 kg/cm2) 11. La solución de proteínas clarificadas se ajustó a pH 4,5 agregando ácido hidroclórico (18%) y se dejó reaccionar 30 minutos a 45°C. 12. La proteína precipitada se recuperó usando una centrífuga de disco. 13. El suero de la proteína se lavó dos veces usando agua acidificada (pH 4.5 +/- 0.1 , 30-35°C). La proporción de agua del lavado a sólidos mojados fue 6:1 (p/p). El suero de la proteína se recuperó usando una centrífuga de discos después de cada lavado (contrapresión, 4-4.2 kg/cm2). 14. El suero lavado se mezcló con hidróxido de sodio (30%) para ajustar el pH a 6.8 usando 30% NaOH y luego se trató con calor a 116°C 7.5 segundos. Luego se ajustó el pH a 6.8. 15. La solución de proteínas se ajustó a 45-55°C y se secó por spray (rocío) usando aire de entrada a 204-215°C y el aire de salida a 82-88°C. 16. Se determinaron los índices de solubilidad de nitrógeno de los ingredientes de aislados de proteína de soya. Una porción de muestra se suspendió en agua con agitación a 30°C dos horas. Luego se diluyo a un volumen conocido con agua. Una porción del extracto de la muestra se centrifugó y se analizó la proteína en una alícuota. Una porción separada de muestra fue analizada para determinar proteínas totales por el mismo método. Se calculó la proteína soluble en agua como porcentaje de la proteína total, que fue proporcional al nitrógeno soluble en agua como porcentaje de nitrógeno total.

Resultados: El índice de solubilidad de nitrógeno de los polvos de proteína de soya (cuadro 18) eran directamente proporcionales a las cantidades de beta conglicinina en las semillas de soya usadas para hacer los ingredientes de proteína de soya: NSI =1.4716 (% beta-conglicinina) + 7.4502; R2 = 0.9975. Una reducción en los niveles de proteína insoluble mejora la calidad organoléptica (por ejemplo sensación más suave y más refrescante en la boca) de productos alimenticios formulados con los ingredientes de proteína de soya.

CUADRO 18 índice de solubilidad del nitrógeno La composición de aminoácidos de los ingredientes aislados de proteína de soya hecha de semillas de soya tuvieron una composición similar de aminoácidos con la excepción del contenido de licina de los ingredientes de alta beta-conglicinina (HBC) que fue alrededor de 6% más alto que el control.

CUADRO 19 Composición de amino ácidos totales de ingredientes de aislados de proteínas de soya EJEMPLO 11 Preparación de productos de soya cultivados a partir de harina de soya pelada Se preparó harina de soya pelada a partir de una soya comercial (AG 3302), una soya de alta conglicinina (DJB2104GOR) y una línea de soya que produce abajo olor (03JBK8-25), todas cosechadas en los Estados Unidos en 2004. Métodos usados para preparar y comprobar productos cultivados hechos de semillas de soya: 1. Las semillas se quebraron usando un molino quebrantador. 2. Las semillas de soya quebradas se pelaron usando un aspirador. 3. Las carnes de soya (semillas de soya peladas) se molieron en una pasada por un molino de martillos y cinco pasadas por un pin mili. 4. La harina de soya pelada fue empacada en bolsas plásticas contenidas en tambores de fibra. 5. Se determinó el contenido de proteína de la harina. 6. La harina de soya pelada (3°C) se agregó al agua de manera que ei contenido de proteína fuese 3.5% (p/p) y se mezcló usando un homogenizador manual alrededor de 1 a 2 minutos. 7. La suspensión de harina de soya se calentó en un intercambiador de calor a placas y luego se inyectó vapor para tratar la suspensión a 141°C 3.5 segundos y se desaireó enfriando a alrededor de 4°C. 8. Las suspensiones termo-tratadas se filtraron para remover fibras resultando en leche de soya. 9. Se agregaron ingredientes saborizantes lácteos, azúcar (3%) y sal (0.2%) a la leche de soya y se mezcló usando un homogenizador manual. 10. La leche de soya saborizada se calentó en un intercambiador de calor de placas y se le inyectó vapor para tratar la suspensión a 141°C 3.5 segundos y se desaireó antes de enfriar a alrededor de 4°C y se envasó en envases estériles. 11. Se pesaron muestras de leche de soya conteniendo cada una 2.2% de proteínas en recipientes esterilizados de aproximadamente 1 litro y se calentaron en el horno de microondas entre 45 y 60 segundos (alrededor de 24°C). 12. Se agregaron azúcar (3.1%), extracto de vainilla (0.4%) y yogurt de soya cultivado (L. Bulgaricus, S. Thermophilus, L. Acidophilus, B. Bifidum, L. Casei, L. Rhamnosus) (8%) a la leche de soya y las muestras se mezclaron. 13. La leche de soya conteniendo el cultivo se puso en un incubador a 43°C 4 horas se la sacó y refrigeró hasta el día siguiente (4°C). 14. Se hicieron mediciones de pH y viscosidad en las muestras refrigeradas y se realizó una evaluación sensorial con un panel de 3 personas que no habían visto las formulaciones de las mezclas. La viscosidad se midió usando un viscosímetro Brookfield con un huso (spindle) #3 a 20 rpm.

Resultados: El perfil del sabor dei producto cultivado hecho de DJB2104GOR fue agradable y se prestaría para un smoothie (bebida cremosa con frutas o sabor a frutas). El perfil dei producto hecho de 03JBK8-25 fue agradable y se prestaría bien para un producto como crema agria o un dip product. Se razonó que una combinación de rasgos de alta ß-conglicinina y baja producción de olor también crearían productos de leche de soya cultivados agradables. La viscosidad menor del material de proteína con alta conglicinina puede ayudar a crear productos de proteína superiores al mismo nivel de espesor.

CUADRO 20 Composición de soya y propiedad de olor CUADRO 21 Perfil del sabor de producto cultivado EJEMPLO 12 Este ejemplo describe la combinación de las propiedades productoras de bajo color con las composiciones de alto contenido de ß-conglicinina. Demuestra la capacidad para producir composiciones de soya de bajo color que comprenden contenidos disminuidos de glicinina y contenidos incrementados de ß-conglicinina. Los tipos de cruza tales como A y E (cuadro 3) se combinaron con germoplasma de alto contenido de beta-conglicinina que tiene un pedigrí de A3233/B2G2/A1923. El análisis de proteína se llevó a cabo como sigue: ocho semillas de soya se agruparon y se molieron utilizando el CAT Mega-Grinder (SOP Asci-01-0002). Las muestras molidas se almacenaron a 4°C. Para análisis, se pesaron -30 mg de harina a partir de cada tipo dentro de un pozo de una placa de microtitulación de 96 pozos de 2 ml. La proteína se extrajo por 1 hora con agitación en 1.0 ml de regulador de pH 1X Laemmii SDS pH 6.8 que contenía ditiotreitol 0.1 M (DTT) como un reluctante. Después de la centrifugación, una porción de cada extracto se diluyó adicionalmente en regulador de pH SDS para producir 0.2-0.5 µg/µL de proteína total, se calentó a 90-100°C por 10 minutos, y se enfrió. Para cada muestra, se cargaron 1-2 µg de proteína total utilizando una pipeta de 12 canales sobre un gel de Tris/HCI Criterion gardiente T al 15% de 26 líneas. Los estándares de peso molecular y un control parental se incluyeron en dos de las líneas en cada gel.

Los geles se sometieron a electroforesis hasta que el movimiento del colorante alcanzó la parte inferior del gel ~1.2 horas, luego se tiñó durante toda la noche en Azul de Coomassie coloidal G-250, se destiñó en agua DI, y se observaron las imágenes utilizando el densitómetro calibrado GS8O0. La cuantificación se llevó a cabo utilizando el software Bio-Rad Quantity OneTM. El software se utilizó para determinar la cantidad relativa de cada banda en la línea de la muestra. El porcentaje de las bandas de las subunidades de la proteína glicinina y de la proteína ß-conglicinina se reportan como el porcentaje relativo de la proteína total en la línea. La subunidad a5-gl¡cinina no se cuantificó y no se incluyó en el valor total de glicinina acida. Las muestras identificadas y los pesos son registrados utilizando un Master LIMSTM. Las composiciones de soya que producen bajo color con el rasgo de alta concentración de ß-conglicinina se ilustran junto con algunas líneas que no presentaron el rasgo de bajo color (Cuadro 22). Los análisis duplicados de olor se muestran para la primera línea en el cuadro. Se muestra que varias líneas carecen de glicininas y produjeron composiciones con menos de 20 µg/g de 2,4 decadienal total más hexanal más hexanal por gramo de semillas molidas después de la oxidación bajo condiciones acuosas suaves. Las composiciones producidas serán evaluadas adicionalmente para otras características (por ejemplo, rendimiento, aminoácidos libres, color y composición de ácidos grasos).

CUADRO 22 Producción de olor y elaboración de la subunidad de proteína de las composiciones de soya con alta concentración de beta-conglicinina LO Gly = glicininas acidas. ND = no detectable. o Información de depósito Se ha hecho un deposito por Monsanto Technology LLC, de semillas de soya 0119149 como se revela arriba y se describe en las reivindicaciones, según el Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. La linea 0119149 depositada también tiene las designaciones "A-4" y "03JBK8-25", que se usan aquí en los ejemplos y cuadros anexos. El número de acceso ATCC es PTA-6197 y la fecha del depósito fue septiembre 10, 2004. El depósito se mantendrá en el depositorio por un periodo de 30 años o 5 años después del ultimo pedido o por la vida efectiva de la patente, lo que sea más duradero, y se reemplazará según necesidad durante ese periodo.

Todas las composiciones y métodos presentados y reivindicados aquí pueden hacerse y ejecutarse sin experimentos indebidos a la luz de esta presentación. Aunque las composiciones y métodos de esta invención han sido descritos en términos de modalidades preferidas, resultará claro para los idóneos en el arte que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y métodos y en las etapas o secuencias de etapas del método descrito aquí sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más especificamente, será claro que ciertos agentes química y fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los agentes decritos aquí obteniéndose los mismos o similares resultados. Todos esos sustitutos y modificaciones, notorios para los ¡dóneos en el arte, se consideran dentro del espíritu, alcance y concepto de la ivnencion según se la define en las reivindicaciones anexas.

Referencias Las siguientes referencias se incorporan como referencias en cuanto provean detalles ejemplares de procedimiento o de otra naturaleza suplementarios a los presentados aquí Patente de E.U.A. 5,777,080 Patente de E.U.A. 5,981 ,781 Patente de E.U.A. 6,171 ,640 Patente de E.U.A. 6,171 ,640 Patente de E.U.A. 6,171 ,640. Patente de E.U.A. 6,355,296 Patente de E.U.A. 6,444,874 Patente de E.U.A. 6,653,534. Solicitud de Patente de E.U.A. 20030074693 Publicación de Patente de E.U.A. 2003/0146313 A1 Adams et al., J. Nutr., 134: 511-516, 2004.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición de carne de soya producida de semillas de soya que comprenden lipoxigenasas 1 , 2 y 3 en la que la composición comprende más de 10% de acido linoleico sobre los ácidos grasos totales y menos de 20 µg del total de 2,4 diecadenal más hexanal más hexanol por gramo luego de una oxidación en condiciones acuosas suaves.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende menos de 4% de acido linolénico como porcentaje de los ácidos grasos totales.

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende menos de 2000 µg por gramo de arginina libre y menos de 400 µg de asparagina libre por gramo.

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque tiene un color medido como valor b* de menos de 30 y un valor de L* de más de 80 monitoreados por el sistema CIE-L*a*b* en el que L* indica claridad de color y b* indica un tono sobre el eje azul (-) a amarillo (+).

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende menos de 4 µg de 1-octen-3-ol por gramo luego de una oxidación en condiciones acuosas suaves.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque tiene más de 30% de la proteína como ß-conglicinina.

7.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque tiene menos de 25% de la proteína como glicinína.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque tiene una concentración de ácido linoleico entre 10% y 60% de los ácidos grasos totales.

9.- Una composición de carne de soya que tiene más de 30% de la proteína como ß-conglicinina y menos de 25% de la proteína como glicinina, menos de 5,000 µg por gramo de arginina libre y menos de 900 µg por gramo de asparagina libre.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque tiene menos de 2,000 µg por gramo de arginina libre y menos de 400 µg por gramo de asparagina libre.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende menos de 4 µg por gramo de 1-octen-3-ol luego de una oxidación en condiciones acuosas suaves.

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende menos de 20 µg de 2,4 decadienal total más hexanal más hexanol por gramo después de la oxidación bajo condiciones acuosas suaves.

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque tiene una concentración de acido linoleico de entre 1.5% y 14% de los ácidos grasos totales.

14.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque tiene una concentración de acido linoleico de entre 10% y 60% de los ácidos grasos totales.

15.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque se define como carente de lipoxigenasa 2.

16.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque se define como carente de lipoxigenasas.

17.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada por tener un color caracterizado por un valor b* de menos de 30 y un valor L* de más de 80 monitoreados por el sistema CIE-L*a*b* donde L* indica claridad y b* indica un tono en el eje azul (-) a amarillo (+).

18.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende 67-69 mg de lisina por gramo de proteína.

19.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende 72-80 mg de arginina por gramo de proteína.

20.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende 28-30 mg de histidina por gramo de proteína.

21.- Una composición de carne de soya que tiene mas de 30% de la proteína como ß-conglicinina y menos de 25% de la proteína como glicinina y menos de 20 µg del 2,4 decadienal total más hexanal más hexanol por gramo después de la oxidación bajo condiciones acuosas suaves.

22.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque se define como carente de lipoxigenasa-2.

23.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque tiene una concentración de acido linoleico de entre 1.5% y 14% de los ácidos grasos totales.

24.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque tiene una concentración de acido linoleico de entre 10% y 60% de los ácidos grasos totales.

25.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque se define como carente de lipoxigenasa 2.

26.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque tiene un color caracterizado por un valor b* de menos de 30 y un valor L* de más de 80 monitoreados por el sistema CIE-L*a*b* donde L* indica claridad y b* indica un tono en el eje azul (-) a amarillo

(+)- 27.- Un método para analizar las propiedades de producir olor de una soya que comprende determinar el nivel de por lo menos un compuesto elegido del grupo consistente de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, y 1-octen-3-ol.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la determinación del nivel del compuesto comprende incubar una mezcla de alrededor de una parte de harina de soya y alrededor de 4 partes de agua por un periodo de alrededor de 1 a alrededor de 40 minutos y cuantificar las cantidades de por lo menos un compuesto elegido del grupo consistente de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, y 1-octen-3-ol y combinaciones de los mismos usando patrones deuteriados para el hexanal, hexanol y decadienal.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la harina de soya se hace de semilla de soya pelada.

30.- Un método para obtener una variedad de soya caracterizada por producir semillas de soya con propiedades disminuidas de producir olor que comprende medir el nivel de por lo menos un compuesto elegido del grupo consistente de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, 1-octen-3-ol y cualquier combinación de los mismos en una o más soyas de la primera y segunda variedades y seleccionar la variedad que produzca semillas con niveles más bajos de dicho compuesto.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende adicionalmente cruzar una planta de la variedad seleccionada con una planta diferente para producir progenie y medir el nivel de por lo menos un compuesto elegido del grupo consistente de 2,4 decadienal, hexanol, hexanal, 1-octen-3-ol y cualquier combinación de los mismos en una o más soyas de dicha progenie.

32.- Un método para elegir una variedad de soya que resista la contaminación fungal que comprende seleccionar una variedad que comprende menos de 5 µg de 1-octen-3-ol por gramo de semilla medidos incubando una mezcla de alrededor de una parte de harina de soya y alrededor de 4 partes de agua por un periodo en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 40 minutos y midiendo el 1-octen-3-ol.

33.- Una semilla de la planta de soya designada 0119149, semilla representativa de la cual ha sido depositada bajo el acceso ATCC No. PTA-6197.

34.- Una planta de soya No. 0119149 o partes de la misma producida sembrando la semilla de conformidad con la reivindicación 33.

35.- La planta de soya de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada además porque se define adicionalmente como comprendiendo un transgen.

36.- Un método para producir una planta de soya derivada de la planta de soya 0119149, el método comprendiendo las etapas de: (a) preparar una planta de la progenie derivada de la planta 0119149 por el cruce de una planta 0119149 con una segunda planta de soya y una muestra de la semilla de la planta 0119149 se depositó bajo el acceso ATCC No. PTA-6197; (b) cruzar la planta progenie consigo misma o con una segunda planta para producir una semilla de una planta de una generación subsecuente; (c) cultivar una planta progenie de una generación subsecuente de dicha semilla y cruzar la planta progenie de una generación subsecuente consigo misma o con una misma planta; y (d) repetir las etapas b y c por unas 3-10 generaciones más para producir una planta de soya afianzada derivada de la planta 0119149.