BRPI0513067B1

BRPI0513067B1 - composições de carne de soja com melhores propriedades organolépticas

Info

Publication number: BRPI0513067B1
Application number: BRPI0513067A
Authority: BR
Inventors: Neal A Bringe; Robert G Orth
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2004-07-09
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2016-12-06
Also published as: WO2006010049A1; US20100199373A1; NZ585893A; NZ552434A; CN101123887A; ZA200700225B; AU2005265311B2; CN101123887B; RU2375917C2; JP2008505647A; KR101220017B1; CA2572761C; UA97941C2; MX2007000382A; BRPI0513067A; AR049715A1; JP5396021B2; KR20070040387A; EP1765092A1; RU2007104935A

Abstract

composições de soja com melhores propriedades organolépticas e métodos de geração. a presente invenção refere-se composições de carne de soja com melhores propriedades organolépticas, e métodos para identificar grãos de soja com melhores qualidades organolépticas. a invenção fornece também métodos para produzir composições de soja com melhores propriedades organolépticas e para criar plantas que produzem grãos de soja com tais características.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES DE CARNE DE SOJA COM MELHORES PROPRIEDADES ORGA-NOLÉPTICAS".

Antecedentes da Invenção Este pedido de patente reivindica a prioridade do pedido de patente provisório n° de série 60/521846, depositado em 9 de julho de 2004, cujo teor inteiro é aqui especifica mente incorporado como referência Campo da Invenção A presente invenção refere-se ao campo das ciências de nutrição e alimentação. Particularmente, a invenção refere-se a composições de soja com melhores propriedades organoléptícas, tal como menor odor, e métodos para seu uso e produção.

Descrição das Técnicas Anteriores Os grãos de soja fornecem proteínas de alta qualidade que proporcionam benefícios de saúde para seres humanos (Hermansen et a/., 2003; Bazzano et ai., 2001; Food and Drug Administration, 1999). A demanda por grãos de soja para fabricar alimentos de soja não tem subido tanto quanto esperado nas últimas três décadas {Wolfe e Cowan, 1975; e "Soy-source", The United Soybean Board, 1999}. Isto de deve em parte por causa do odor indesejável associado a produtos de soja {McLeod e Ames, 1988; e Freese, 1999). O odor indesejável dos grãos de soja é comumente descrito como "granoso". Os componentes que conferem a característica granosa aos grãos de soja incluem muitos ácidos graxos voláteis, carbonílas alifáti-cas, aminas, álcoois, aldeídos e furanos derivados da ação de enzimas sobre vários compostos encontrados em grãos de soja e sua oxidação posterior que é causada por muitos mecanismos (Wolfe e Cowan, 1975; Sesssa e Rackis, 1977).

Kobayashi et at. (1995) concluíram que os principais contribuido-res para o odor do leite de soja não-fervido eram (trans, trans)-2,4-nonadíenal, (trans, trans)-2,4-decadienaI, hexanal, 2-pentil-furano, 1 -octen-3-ona, (trans)-2-nonenai, e (trans,. cís)-2,4-nonadienal. Os odores mais intensos extraídos do leite de soja tratado termicamente foram identificados como (trans, trans)-2,4-decadienal e n-hexanal (Feng, Cornell University Ph.D. Dissertatlon, 2000). A formação de (trans, trans)-2,4-decadienal ocorre em uma baixa velocidade à temperatura ambiente (Frankel, 1988); entretanto, esta reação é intensificada por causa da degradação térmica durante o processamento dos grãos de soja sob condições quentes (Lin, 2003). Outros contribuidores para odores foram (trans)-4,5-epóxi-(E)-decenal (formado a partir de 2,4-decadienal), (trans, ci$)-2,6-nonadienal, (trans)-2-nonenal, (trans, trans)-2,4-nonadienal, 2,4-nonadienal, maltol, vanilina e β-damas-cenona. Os odorantes mais potentes no leite de soja, determinados pelo volume do espaço vazio mínimo necessário para detectar por olfatometria, foram hexanal, acetaldeído, metanotiol, trissulfeto de dimetila, e 2-metil-furano (Boatright, 2002).

Os odorantes mais intensos em isolados protéicos de soja foram identificados como trissulfeto de dimetila, (trans, trans)-2,4-decadienal, 2-pentilpiridina, (trans, trans)-2,4-nonadienal, hexanal, acetofenona, e 1-octen-3-ona (Boatright e Lei, 1999). O mecanismo de formação de metanotiol e trissulfeto de dimetila envolve radicais livres formados por oxidação de lipí-deos (Lei e Boatright, 2003), e os produtos de enzimas, tal como cisteína sintase (Boatright, 2003, cartaz 45C-26, reunião anual da IFT, Chicago). A formação de 2-pentil-piridina ocorre a partir de uma reação espontânea entre 2,4-decadienal e amônea à temperatura ambiente. Os a-minoácidos livres arginina, lisina, asparagina e glutaminase aumentam a formação de 2-pentilpiridina provavelmente por fornecer amônea durante o processamento das proteínas de soja (Zhou e Boatright, 2000; Kim et a/., 1996). Assim sendo, os aminoácidos livres podem formar também outros produtos indesejáveis. A exposição de asparagina e glicose a altas temperaturas resulta na formação de acrilamida (Jung et a!., 2003). A asparagina exposta a temperaturas de cozimento pode formar mutágenos (Knize et ai, 1994). A arginina livre foi enriquecida em grãos de soja carecedores de β-conglicininas e glicininas (Takahashi et ai, 2003).

Uma vez formados, os odores são difíceis de remover dos ingredientes da soja porque eles estão associados a proteínas (Franzen e Kinsel- Ia, 1974). A qualidade de sabores naturais adicionados a alimentos de soja também é alterada desfavoravelmente porque alguns dos odores se ligam à proteína da soja. Os compostos de carbonila e 2-pentil-piridina se ligaram com maior afinidade a frações de glicinina do que frações de β-conglicininas (Zhou et ai, 2002; 0'Keefe eia/., 1991). A extração de proteínas associadas óleo-corpo e lipídeos polares reduziu significativamente a quantidade de o-dores associados com isolados protéicos de soja (Samoto et al., 1998).

As texturas criadas por interações proteína-proteína podem ter mais efeito sobre a intensidade do que a concentração de odores no nariz (Weel etal., 2002). A proteínas da soja podem contribuir para a baixa qualidade organoléptica de bebidas de soja por formarem agregados insolúveis e sensação arenosa na boca (Skarra e Miller, 2002). Dentre as principais proteínas da soja, as glicininas são mais sensíveis ao pH e insolubilização induzida por Ca+2 (Yuan, 2002) e os grãos de soja que contêm uma baixa razão de glicininas para β-congiicininas são úteis para criar ingredientes protéicos de soja solúveis (patente n2 US 6.171.640).

As reações de oxidação de lipídeos também influenciam a solu-bilidade de proteínas. Podem ser adicionados antioxidantes durante a fabricação de isolados de proteínas de soja para limitar a oxidação de proteínas induzida por radicais livres e melhorar o rendimento de proteína solúvel (patente n° US 5.777.080). Alguns peptídeos podem reagir durante o processamento oom polissacarídeos, para formar compostos antioxidantes (Mat-sumara, 2003). A cor influencia as percepções de frescor e sabor (Joshi, 2000). Baixas quantidades de açúcar redutor e aldeídos formados a partir da oxidação de lipídeos reagem com grupos amino de proteínas sob aquecimento, para formar pigmentos marrons pela reação de bronzeamento de Maillard (Kwok etal., 1999). O leite de soja com um teor mais alto de aldeídos criará uma cor mais escura, menos atrativa, depois do processamento térmico. Por outro lado, a oxidação de lipídeos durante o processamento do leite de soja descolore pigmentos amarelos no leite de soja (Obata e Matsuura, 1997).

Os grãos de soja são refinados para melhorar o sabor por extrair lipídeos e outros componentes por extração com álcool, tratamentos com enzimas, lavagem de coágulos protéicos, ultrafiltração de proteína e/ou uso de vaporização instantânea. Estes processos aumentam o custo dos ingredientes protéicos de soja, e tipicamente, baixam as quantidades de componentes saudáveis que ficam disponíveis (como por exemplo, fibra, oligossa-carídeos, isoflavonas, ácidos graxos poliinsaturados, tocoferóis, fosfolipí-deos, peptídeos bioativos). As abordagens do processamento usadas para melhorar as propriedades organolépticas de ingredientes protéicos de soja são limitadas em eficácia por odores ligados às proteínas da soja e por condições que promovem a formação de odores (pH 8-10). Foram criados grãos de soja carentes de uma a três das lipoxigenases 1, 2 e 3, usando geração de mutações para reduzir a formação de odores granosos (Hajika et a/., 1991). A análise do aroma do leite de soja e da farinha de soja fabricados a partir de grãos de soja carentes das três lipoxigenases demonstrou conter quantidades mais baixas de vários odores, mas quantidades mais altas de 1-octen-3-ol do que a linhagem de soja originária que contém as três lipoxigenases (Hao et al., 2002). Níveis similares de 2,4-decadienal foram encontrados na farinha desengordurada e no isolado de proteína de soja, fabricados a partir de um grão de soja carente das três lipoxigenases e de duas outras linhagens de soja (Boatright etal., 1998). Os alimentos de soja preparados a partir de grãos de soja carentes de lipoxigenases tinham melhor sabor em comparação com alimentos farbicados a partir de grãos de soja de controle (Wilson, 1996). O leite de soja preparado a partir de grãos de soja carentes das três lipoxigenases foi percebido como mais amargo do que o controle, especialmente depois de 15 meses de estocagem das sementes, mas esta diferença era esperada como sendo eliminada adicionando açúcar (Torres-Penaranda e Reitmeier, 2001). São propostas modificações transgênicas para melhorar o sabor de grãos de soja reduzindo os níveis de ácidos graxos poliinsaturados (patente nQ US 5.981.781), lipoxigenases (pedido de patente n2 US 2003/0074693 e/ou hidroperóxido liases (patente n2 US 6.444.874). Os grãos de soja que contêm menos do que 10% de ácidos graxos poliinsatura- dos e mais do que 75% de ácidos graxos oléicos produzem um óleo de fritara que é menos saboroso do que o óleo com mais ácidos graxos poliinsatu-rados (Warner et ai, 2001).

Produtos químicos tais como polifosfatos (patente n5 US 6.355.296) podem ser usados para limitar a produção de desvios de aroma e melhorar a solubilidade de proteínas. Outros aditivos, tal como o ácido gálico (documento PCT ns WO 01/06866) ou aldeído oxidase (Maheshwari et ai, 1997) podem ser usados para remover odores.

Existem poucas informações publicadas sobre o efeito de variações genéticas naturais sobre os atributos de sabor e cor de grãos de soja. O índice de acidez tiobarbitúrico para 16 variedades de soja foi determinado como uma medida da oxidação de lipídeos e nenhuma correlação foi encontrada com o teor de vitamina E dos grãos de soja (Dahuja e Madaan, 2004). As quantidades de 2-pentil-piridina e 2,4-decadienal na farinha de soja e no isolado protéico de soja, fabricados a partir de três variedades de grãos de soja foram determinadas (Zhou e Boatright, 1999). Os efeitos das condições de secagem sobre a remoção do pigmento verde, clorofila, dos grãos de soja, foram estudados (Salete et ai, 2003; Sinneckeref ai, 2002).

Nas últimas décadas os cientistas demonstraram que os óleos preparados a partir de grãos de soja carentes de lipoxigenases não tinham melhor estabilidade contra oxidação. As proteínas de grãos de soja produzidas a partir de grãos de soja isentos de lipoxigenases ainda continham níveis significativos de sabor granoso (Maheshwari et ai, 1997). A primeira etapa na fabricação de leite de soja ou ingredientes protéicos de soja é descascamento (ou descorticação) dos grãos de soja para criar polpas de grãos de soja. Os hipocótilos também podem ser separados dos cotilédones, As polpas dos grãos de soja são definidas como grãos de soja descascados e podem ou não incluir os cotilédones. Um método para preparar as polpas está descrito, por exemplo, na patente n° US 5.727.689. Um método para descascar inclui, porém sem limitações, escorrer as sementes entre rolos contracorrente ou um moinho de fracionamento e aspirar as cascas leves, deixando as polpas. As polpas podem ser embe- bidas em água para produzir leite de soja ou flocadas e extraídas usando hexano como uma etapa inicial na fabricação de farinha de soja desengordu-rada, concentrados de proteínas de soja, isolados de proteínas de soja e frações protéicas purificadas, conforme desejado. A presente invenção fornece um novo método para determinar a capacidade de as polpas de grãos de soja resistirem à produção de compostos odoríferos importantes identificados como 2,4-decadienal, hexanal, he-xanol e 1-octen-3-ol. Estes compostos foram selecionados como indicadores da extensão de diferentes tipos de reações de oxidação. Hexanal e hexanol resultam da decomposição de compostos que contêm hidroperóxidos (peró-xidos nas posições 9 e 12 dos carbonos de ácidos graxos) por hidroperóxido liases e álcool desidrogenases. O 2,4-decadienal é um produto da degradação da via de lipoxigenases, que reconhecidamente não envolve hidroperóxido liases. O 1-octen-3-ol é formado pela ação de hidroperóxido liases sobre os hidroperóxidos formados na posição 10 do carbono do ácido linoléico. Estes compostos podem reagir ainda mais por processamento adicional, para formar odores mais potentes, Por exemplo, o 2,4-decadienal está envolvido na formação de 2-pentil-piridina e o 1-octen-3-ol está envolvido na formação de 1-octen-3-ona.

Sumário da Invenção Em um aspecto, a invenção fornece uma composição de carne de soja produzida a partir de grãos de soja que compreendem as lipoxigenases 1, 2 e 3, onde a composição compreende mais do que 10% de ácido linoléico como uma porcentagem de ácidos graxos totais e menos do que 20 pg de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total por grama, após oxidação sob condições aquosas brandas. A composição pode ou não compreender as lipoxigenases, ou qualquer combinação delas, e pode compreender lipoxigenase desativada. Em uma modalidade, a composição compreende lipoxigenase-2. Em certas modalidades, a composição fornecida pela invenção pode compreender menos do que cerca de 15 pg ou menos do que cerca de 18 pg de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total. Em outras modalidades, a composição pode compreender cerca de 6 pg a cerca de 20 pg, cerca de 10 μ9 a cerca de 20 pg, ou cerca de 12 a 18 pg de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total. Em outras modalidades, a composição pode compreender menos do que 4% de ácido linolênico como porcentagem de ácidos graxos totais, incluindo menos do que cerca de 3% e entre cerca de 1 % e 4% ou cerca de 2% a cerca de 4%.

Em outra modalidade, uma composição da invenção pode compreender menos do que 2.000 pg por grama de arginina livre e/ou menos do que 400 pg de asparagina livre por grama, incluindo menos do que cerca de 1.800 pg por grama de arginina livre e/ou menos do que cerca de 350 pg de asparagina livre por grama. Tal composição, em certas modalidades, pode compreender cerca de 300 pg a 2.000 pg, por grama, de arginina livre, incluindo cerca de 500-2.000, cerca de 1.200-1.800, e cerca de 1.000-2.000 pg, por grama, de arginina livre. Uma composição fornecida pela invenção pode ainda, em certas modalidades, compreender entre cerca de 50 pg e cerca de 400 pg de asparagina livre por grama, incluindo cerca de 100-400,100-350, 200-400,300-400, e 250-400 pg de asparagina livre por grama.

Em ainda outra modalidade, as composições fornecidas pela invenção podem ter uma cor medida como valor de b* menor do que 30 e um valor de L* maior do que 80, monitorado pelo sistema CIE-L*a*b*, onde L* indica luminosidade e b* indica o matiz em um eixo azul (-) a amarelo (+). Em certas modalidades, uma composição da invenção pode compreender uma cor medida como valor de b* de cerca de 18-30, cerca de 20-30, cerca de 25-30, e menor do que cerca de 25. Em outras modalidades, uma composição fornecida pela invenção pode compreender um valor de L* de cerca de 80-100, cerca de 80-90 e maior do que cerca de 90. Em certas modalidades, uma composição fornecida pela invenção pode compreender menos do que 8 pg de 1-octen-3-ol por grama após oxidação sob condições aquosas brandas, incluindo menos do que cerca de 6 pg, menos do que cerca de 5 pg, entre cerca de 1,3 e cerca de 8 pg, entre cerca de 2 e cerca de 8 pg, e entre cerca de 4 e e cerca de 8 pg. Uma composição fornecida pela invenção pode ter também mais do que 30% da proteína como β-conglicinina e pode ter menos do que 25% da proteína como glicinina. Tal composição po- de ser definida ainda como tendo mais do que cerca de 40% da proteína como β-conglicinina, e tendo um teor de β-conglicinina entre cerca de 30% e cerca de 60%, cerca de 40% a 60%, cerca de 35% a 55%, e cerca de 30% a cerca de 50% da proteína. Tal composição pode ser definida ainda como tendo um teor de glicinina menor do que cerca de 20%, 15% e 10%, e pode compreender entre cerca de 0% e 25%, 5% a 20%, 1% a 25%, e cerca de 10-25% da proteína como glicinina.

Em outro aspecto da invenção, fornece-se uma composição de carne de soja que tem mais do que 30% da proteína como β-conglicinina e menos do que 25% da proteína como glicinina, menos do que 5.000 pg por grama de arginina livre, e menos do que 900 pg por grama de asparagina. Tal composição pode compreender, em certas modalidades, entre cerca de 300 e 5.000 pg por grama, entre cerca de 1.000 e 5.000 pg por grama, entre cerca de 3.000 e 5.000 pg por grama, entre cerca de 1.000 e 4.000 pg por grama, e entre cerca de 500 e 2.000 pg por grama de arginina livre. Tal composição pode compreender, em certas modalidades, menos do que 400 pg por grama de asparagina livre, entre cerca de 50 e 400 pg por grama, entre cerca de 100 e 400 pg por grama, entre cerca de 100 e 700 pg por grama, e entre cerca de 200 e 900 pg por grama de asparagina livre. Em uma modalidade, a composição tem menos do que 2.000 pg por grama de arginina livre e menos do que 400 pg por grama da asparagina livre.

Em outra modalidade, a composição fornecida compreende menos do que 4 pg por grama de 1-octen-3-ol após oxidação sob condições aquosas brandas, incluindo menos do que cerca de 3 pg, entre cerca de 1,3 e 3 pg, entre cerca de 1,3 e 4 pg, e entre cerca de 2 pg e 4 pg por grama. Em ainda outras modalidades, a composição tem uma concentração de ácido linolênico entre 1% e 14% dos ácidos graxos totais, incluindo cerca de 3 a 14%, cerca de 5 a 14%, cerca de 1,5% a 12%, cerca de 3% a 12%, e cerca de 7 a 14%. Em ainda outra modalidade, a composição tem uma concentração de ácido linoléico entre 10% e 60% dos ácidos graxos totais, incluindo entre cerca de 10% e 50%, entre cerca de 10% e 40%, entre cerca de 15% e 60%, entre cerca de 20% e 50%, e entre cerca de 20% e 60%.

Em certas modalidades, uma composição de carne de soja fornecida pela invenção pode ser definida como carecendo de uma ou mais lipoxigenases. Em uma modalidade, uma composição de carne de soja fornecida pela invenção pode ser definida como carecendo de lipoxigenase-2. Em outras modalidades, qualquer combinação de lipoxigenase-1, lipoxigenase-2 e/ou lipoxigenase-3 está ausente, incluindo quaisquer duas ou todas três destas lipoxigenases. Uma composição da invenção pode ser definida também como tendo uma cor caracterizada por um valor de b* menor do que 30 e um valor de L* maior do que 80, monitorado pelo sistema CIE-L*a*b*, onde L* indica luminosidade e b* indica o matiz em um eixo azul {-) a amarelo (+). Em ainda outras modalidades, uma composição fornecida pela invenção pode compreender 67-69 mg de lisina por grama de proteína, pode compreender 72-80 mg de arginina por grama de proteína e/ou pode compreender 28-30 mg de histidina por grama de proteína.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método para analisar as propriedades produtoras de odores de um grão de soja, compreendendo determinar o nível de pelo menos um composto selecionado no grupo que consiste em 2,4-decadienal, hexanol hexanal, e 1-octen-3-ol. Em uma modalidade, o método pode compreender a determinação do nível do composto, que compreende incubar uma mistura de cerca de 1 parte de farinha de soja e cerca de 4 partes de água por um período na faixa entre cerca de 1 e cerca de 40 minutos, e quantificar as quantidades de pelo menos um composto selecionado no grupo que consiste em 2,4-decadienal, hexanal, hexanol, e 1 -octen-3-ol, e combinações deles, usando padrões deuterados para hexanal, hexanol e decadienal. A farinha de soja pode ser fabricada a partir de grãos de soja descascados.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método para obter uma variedade de grão de soja que produz grãos de soja e carnes de soja com propriedades produtoras de odores diminuídas, compreendendo medir o nível de pelo menos um composto selecionado no grupo que consiste em 2,4-decadienal, hexanol, hexanal, 1-octen-3-ol, e qualquer combinação deles, em um ou mais grãos de soja ou carnes de soja da primeira e segunda variedades de grãos de soja, e selecionar a variedade que produz sementes com níveis mais baixos do composto. O método pode compreender ainda cruzar uma pianta da variedade selecionada com uma planta diferente, para produzir a progênie e medir o nível de pelo menos um composto selecionado no grupo que consiste em 2,4-decadienal, hexanol, hexanal, 1-octen-3-ol, e qualquer combinação deles, em um ou mais grãos de soja ou carnes de grão de soja da progênie.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método para selecionar uma variedade de grão de soja que resiste à contaminação fúngi-ca, compreendendo selecionar uma variedade que compreende menos do que 5 μg de 1-octen-3-ol por grama, medido incubando uma mistura de cerca de 1 parte de farinha de soja e cerca de 4 partes de água por um período na faixa entre cerca de 1 e cerca de 40 minutos, e medir o 1-octen-3-ol.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece uma semente da planta de soja designada 0119149, cuja semente representativa foi depositada sob o número de acesso da ATCC PTA-6197. A invenção fornece ainda uma planta de soja 011949 ou partes dela, produzida cultivando tal semente. Tal planta da invenção pode compreender um transgene. Em ainda outras modalidades, a invenção fornece um método para produzir uma planta de soja derivada da planta de soja 0119149, método este que compreende as etapas de: (a) preparar uma planta progênita derivada da planta de soja 0119149 cruzando uma planta de planta de soja 0119149 com uma segunda planta de soja, onde uma amostra da semente da planta de soja 0119149 foi depositada sob o n2 de acesso PTA-6197 da ATCC; (b) cruzar a planta progênita com ela mesma ou com uma segunda planta, para produzir uma semente de uma planta progênita de uma geração subsequente; (c) desenvolver uma planta progênita de uma geração subseqüente a partir da dita semente e cruzar a planta progênita de uma geração subseqüente com ela mesma ou com uma segunda planta; e (d) repetir as etapas (b) e (c) por uma adição de 3-10 gerações, para produzir um planta de soja endogâmica derivada da planta de soja 0119149.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece grãos de soja com melhores propriedades organolépticas (isto é, grãos de soja com melhores propriedades de sabor, cor, odor e sensação na boca), após oxidação sob condições aquosas brandas. São fornecidos também grãos de soja com baixas quantidades de arginina e asparagina livres para melhorar as propriedades organolépticas dos grãos de soja. Em outra modalidade, são fornecidos grãos de soja com níveis reduzidos dos ácidos linoléico e linolênico, para melhorar as propriedades organolépticas.

Uma planta de soja fornecida pela invenção pode compreender, em uma modalidade, um ou mais transgenes. Os exemplos incluem um gene que confere resistência a herbicidas, que produzirá plantas com resistência a herbicidas, e um gene que confere resistência a insetos.

De acordo com a invenção, são fornecidas sementes de soja que contêm as lipoxigenases 1,2 e 3, e mais do que cerca de 10% de ácido linoléico como uma porcentagem dos ácidos graxos totais, que produzem menos do que 20 pg de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total por grama de sementes moídas após oxidação sob condições aquosas brandas.

De acordo com outro aspecto da invenção, são fornecidos grãos de soja que contêm lipoxigenases, tendo menos do que cerca de 4% do ácido graxo linolênico e mais do que cerca de 10% de ácido linoléico como porcentagem de ácidos graxos totais, e que produzem menos do que 20 pg de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas. Os mesmos grãos de soja podem produzir também menos do que 8 pg de 1-octen-3-ol por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas.

De acordo com ainda outro aspecto da invenção, a invenção fornece grãos de soja que têm menos do que cerca de 2.000 pg de arginina livre e menos do que cerca de 400 pg de asparagina livre por grama de semente seca, e que produzem menos do que cerca de 20 pg/g de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas. As mesmas sementes podem produzir também menos do que 8 pg de 1-octen-3-ol por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas.

De acordo com mais outro aspecto da invenção, são fornecidos grãos de soja que têm uma cor amarela, medida como "valor de b*", menor do que 30, e que produzem menos do que 20 μ9 de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas. As mesmas sementes podem produzir também menos do que 8 μ9 de 1-octen-3-ol por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas.

De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, são fornecidos grãos de soja que têm mais do que 30% da proteína como β-conglicinina e/ou menos do que 25% da proteína como glicininas, os quais produzem menos do que 20 pg/g de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol totai por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas. As mesmas sementes podem produzir também menos do que 8 pg de 1 -octen-3-ol por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas.

De acordo com a presente invenção, são fornecidos grãos de soja que compreendem menos do que 5.000 pg de arginina livre, menos do que 900 pg asparagina livre, e mais do que mais do que 30% da proteína como β-conglicinina e menos do que 25% da proteína como glicininas, os quais produzem menos do que 20 pg/g de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas. As mesmas sementes podem produzir também menos do que 8 pg de 1-octen-3-ol por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas.

De acordo com ainda outro aspecto da invenção, são fornecidos grãos de soja resultantes de um cruzamento de uma primeira semente de soja que tem mais do que mais do que 30% da proteína como β-conglicinina e menos do que 25% da proteína como glicininas, e uma segunda semente de soja que produz menos do que 20 pg/g de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas.

De acordo com ainda outro aspecto da invenção, são fornecidos grãos de soja resultantes de um cruzamento de uma primeira semente de soja que tem menos do que 4% do ácido graxo linolênico e mais do que cerca de 10% de ácido linoléico como porcentagem de ácidos graxos totais, e uma segunda semente de soja que contém as lipoxigenases 1,2 e 3, e mais do que 10% de ácido linoléico como porcentagem de ácidos graxos totais, os quais produzem menos do que 20 pg/g de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total por grama de sementes de soja moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas.

De acordo ainda outro aspecto da invenção, fomece-se um método para analisar a propriedade produtora de odor de variedades de sementes de soja, compreendendo incubar uma mistura de cerca de 1 parte de farinha de soja e cerca de 4 partes de água por um período na faixa entre cerca de 1 e cerca de 40 minutos, e quantificar as quantidades de pelo menos um composto selecionado no grupo que consiste em 2,4-decadienal, hexanol, hexanal, e 1-octen-3-ol, e combinações de dois, três ou quatro deles, usando padrões deuterados para hexanal, hexanol e decadienal.

De acordo com ainda outro aspecto da invenção, fomece-se um método para gerar grãos de soja, compreendendo incubar uma mistura de cerca de 1 parte de farinha de soja ou de grão de soja descascado e cerca de 4 partes de água por um período na faixa entre cerca de 1 e cerca de 40 minutos, e quantificar as quantidades de pelo menos um composto selecionado no grupo que consiste em 2,4-decadienal, hexanol, hexanal, e 1-octen-3-ol, usando padrões deuterados para hexanal, hexanol e decadienal, e selecionar sementes das populações geradas, baseado nos resultados.

De acordo com outro aspecto da invenção, são fornecidos grãos de soja que compreendem um transgene, como por exemplo, um gene de resistência a herbicidas que confere resistência a herbicidas ou um gene inseticida que confere resistência a insetos.

De acordo com outro aspecto da invenção, são fornecidos alimentos processados para consumo humano, compreendendo grãos de soja que têm mais do que 30% da proteína como β-conglicinina e menos do que 25% da proteína como glicininas, os quais produzem produzem menos do que 20 pg/g de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol por grama de sementes de soja moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas. Descrição de Modalidades Ilustrativas A invenção fornece composições de soja, grãos de soja, e derivados de sementes de soja com melhores propriedades organolépticas, e métodos para produzir os mesmos. As composições de soja da invenção proporcionam melhores propriedades de sabor, cor, odor e sensação na boca. A invenção fornece também métodos para produzir tais composições e métodos para determinar a capacidade de uma variedade de grão de soja produzir odores importantes identificados como 2,4-decadienal, hexanal, hexanol e 1-octen-3-ol, e o uso dos resultados para selecionar sementes a partir de populações geradas.

As condições de oxidação podem ser produzidas, de acordo com a invenção, quando aproximadamente 0,5 parte de farinha de soja é misturada com 2 mL de água ou 1 parte de farinha de soja é misturada com 4 partes de água para dispersar as partículas sólidas na água e permitir que as reações de oxidação ocorram por aproximadamente 1 a 40 minutos à temperatura ambiente, onde a temperatura ambiente pode variar entre 15 °C e 40 °C. A suspensão concentrada permite que enzimas, substratos, radicais livres, compostos removedores de radicais livres, inibidores de enzimas, e outros fatores influenciem as quantidades dos odores produzidos. A invenção fornece grãos de soja que contêm lipoxigenases e composições derivadas deles, que têm menos do que 4% do ácido graxo linolênico e/ou mais do que 10% de ácido linoléico como porcentagem de ácidos graxos totais, e que produzem menos do que 20 pg de 2,4-decadienal (CH3(CH2)4CHCHCHCHCHO, CAS n0 25152-84-5) mais hexanal (CH3(CH2)4CHO, CAS n2 66-25-1) mais hexanol (CH3(CH2)5OH, CAS ne 111-27-3) por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas. Os mesmos grãos de soja podem produzir também menos do que 8 pg de 1-octen-3-ol (CHaíCh^CHOHCHChb, CAS n2 3391-86-4) por grama de sementes moídas ou farinha de grão de soja descascado, após oxidação sob condições aquosas brandas. Os compostos 2,4-decadienal, hexanol, hexanal e 1-octen-3-ol, e suas combinações, foram usados para quantificar as propriedades produtoras de odores dos grãos de soja. Os odores não estão restritos a estes compostos listados. Outros aldeídos, cetonas e álcoois detectáveis podem ser usados como medidas de propriedades produtoras de odores usando o método da invenção. Os exemplos destes compostos incluem, porém sem restrições, propanal, pentenal, hexenal, pen-tenol, heptanal, hetenal, benzaldeído, hexadienal, heptadienal, heptanol, oc-tenol, octenal, nonanal, octadienona, 2-pentil-furano, pentanal, 2,3-dimetil-, nonenal, maltol, decenal, e 2-undecenal. De acordo com a invenção, o termo "lipoxigenase" refere-se a uma enzima que catalisa a oxidação de ácidos graxos ínsaturados com oxigênio para produzir peróxidos. O termo "lipoxigenase" (EC 1.13.11.12) é referido também como lipoxidase e dioxigenase nessas técnicas. Os odores do leite de soja e de ingredientes protéicos de soja a partir de grãos de soja que carecem de um, duas ou três das lipoxige-nases 1, 2 e 3 foram avaliados por outros pesquisadores. Existem grãos de soja com alto teor de ácido oléico com menos do que 4% de ácido linoléico. Alguns destes grãos de soja que têm esses traços podem produzir menos do que 20 μg do total de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol por grama de grãos de soja moidos, usando o ensaio desta invenção, e alguns não cairão dentro desta faixa. Descobriu-se nesta invenção que é possível criar grãos de soja que contêm as lipoxigenases 1, 2 e 3, que produzem níveis muito baixos de odores, e que os grãos de soja isentos de lipoxigenases podem produzir altos níveis de desvios de aroma. Além de composições com alto teor de β-conglicinina que não foram triadas anteriormente quanto às propriedades produtoras de odores, a invenção fornece particularmente novas composições de grãos de soja que têm as lipoxigenases 1, 2, e 3, e mais do que 10% de ácido linoléico. O ácido graxo linoléico (18:2 n-6) e o ácido graxo linolênico (18:3 n-6) são ácidos graxos poliinsaturados com duas ou três ligações duplas cis, de acordo com a invenção. Os métodos da invenção para selecionar linhagens com baixa produção de odores a partir da progênie de grãos de soja isentos de lipoxigenase e grãos de soja com alto teor de ácido oléico estão dentro do âmbito da invenção. 0 odor 1 -octen-3-o! é um produto da divagem de áddos graxos que têm hidroperóxidos na posição do carbono 10 do ácido linoléico. Descobriu-se nesta invenção que a remoção da casca reduz substancialmente a propriedade formadora de 1-octen-3-o! das composições de grãos de soja. As lipoxigenases e hidroperóxido liases fúngicas formam 10-hidroperóxidos e 1-octen-3-ol, respectivamente (Wurzenberger e Grosch, 1984; Husson et al., 1998). Concluiu-se nesta invenção que os grãos de soja que produzem quantidades mais baixas de 1-octen-3-ol resistem à contaminação das casca do grão de soja por fugos, tal como Phomopsis {Minor et al., 1995) e/ou contêm componentes que inibem as lipoxigenases fúngicas.

As propriedades organolépticas de produtos de grãos de soja dependem dos teores de glicininas e β-conglicininas. As glicininas são mais suscetíveis a reter odores e formar partículas insolúveis que afetam adversamente a qualidade sensorial de produtos de grãos de soja. A presente invenção fornece grãos de soja que têm mais do que 30% da proteína como β-conglicinina e menos do que 25% das proteínas como glicininas e produzirão menos do que 20 pg de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas. As mesmas sementes produzem também menos do que 8 μg de 1-octen-3-ol por grama de sementes moídas sob condições similares. De a-cordo com a presente invenção, β-conglicinina refere-se a um trímero protéi-co com um peso molecular de 150-200 kDa. As três subunidades principais são a a' (72 kDa), α (68 kDa) e β (52 kDa). A alfa principal e as subunidades alfa contêm dois grupamentos carboidrato ligados de forma covalente e a subunidade beta contém um. Uma revisão da estrutura e das propriedades de β-conglicinina e da outra proteína de estocagem importante, a glicinina, pode ser encontrada em Utsumi et al., (1997). Pode-se usar um germoplas-ma público, tal como "Moshidou Gong 503” para mudar a razão das subunidades α para a' da β-conglicinina, usando métodos de geração tradicionais. O termo "β-conglicinina", neste pedido de patente, inclui as variações de subunidades. São fornecidas as sementes da presente invenção que têm mais do que 30% da proteína como como β-conglicinina e menos do que 25% das proteínas como glicininas, e que compreendem menos do que 5.000 pg por grama de arginina livre, e menos do que 900 pg por grama de asparagina livre. O termo "livre" refere-se a aminoácidos que não estão ligados a outras moléculas presentes nos grãos de soja ou na farinha de soja e podem ser extraídos e solubilizados por uma solução aquosa a 5% de ácido triflúor-acético (TCA) a 4 °C durante a noite inteira. O valor de selecionar grãos de soja que compreendem baixos níveis de aminoácidos livres para produzir carnes de soja, leite de soja, farinha de soja, concentrados protéicos de soja e isolados protéicos de soja, de alta qualidade, não havia sido demonstrado anteriormente. A cor dos ingredientes e alimentos de soja, de acordo com a invenção, pode ser melhorada reduzindo os níveis de aldeídos formados {como por exemplo, hexanal e 2,4-decadienal) porque os aldeídos reagem com aminas para formar pigmentos marrons. Níveis reduzidos de produtos da oxidação de lipídeos também podem limitar a lixiviação oxidante de pigmentos amarelos que fazem com que a cor do produto final fique menos branca. O potencial do problema de baixa lixiviação é solucionado nesta invenção selecionando grãos de soja que têm uma cor amarela medida ramo "valor de b*", como aui utilizado, menor do que 30, e que produzem menos do que 20 pg de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol total por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas. O "valor de b*", como aqui utilizado para descrever a corda semente de soja, representa a Escala de Cores CIE-L*a*b* {CIE, Colorimetria, Publicação 15.2, Segunda Edição, Viena (1986), usando o procedimento Colorflex) e refere-se às tonalidades azuis (números negativos) até as tonalidades amarelas (números positivos) de grãos de soja ou farinha de soja; similarmente, o valor L* refere-se à luminosidade de grãos de soja ou farinha do soja na Escala de Cores L*a*b*. Os grãos de soja ou a farinha de soja, em uma modalidade da invenção, terá um valor L* maior do que 80. O grão de soja do tipo selvagem, o cultivar comercial, ou seu híbrido, desejado, pode ser cruzado por métodos convencionais de geração de plantas com uma planta de soja que tem sementes com o fenótipo produ- tor de baixo odor da invenção, para criar sementes que compreendem o traço de baixo odor mais outros traços desejados (como por exemplo, rendimento, composição com alto teor de β-conglicinina, resistência a herbicidas). A progênie híbrida, que apresenta o traço de baixo odor e outros fenótipos desejados, é selecionada. Os métodos de geração usados de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, os métodos descritos em Knowles e Briggs (1967) ou quaisquer métodos similares conhecidos nessas técnicas. Os métodos específicos para a seleção e desenvolvimento de novas variedades de grãos de soja estão descritos, por exemplo, na patente n° US 6.653.534. A invenção fornece também alimentos processados para consumo humano, fabricados com as composições de soja da invenção. Os e-xemplos de alimentos processados para consumo humano podem ser fabricados, por exemplo, a partir de uma composição de farinha de soja descascada da invenção. Os exemplos destes derivados incluem, porém sem limitações, barras, bebidas, carne e carnes alternativas, iogurte de soja, queijos alternativos, suplementos nutricionais.

Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Os versados nessas técnicas devem avaliar que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam técnicas que os inventores descobriram funcionar bem na prática da invenção, e assim sendo, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática. Entretanto, os versados nessas técnicas devem, à luz do presente relatório descritivo, avaliar que podem ser feitas mudanças nas modalidades específicas descritas e ainda assim obter um resultado semelhante ou similar, sem fugir do conceito, espírito e do âmbito da invenção. Mais especificamente, deve ficar evidente que certos agentes, que estão quimicamente e fisiologicamente relacionados, podem substituir os agentes aqui descritos, e ao mesmo tempo, atingir resultados iguais ou similares. Todos estas substituições e modificações similares, evidentes para os versados nessas técnicas, são julgadas como estando dentro do espírito, âmbito e conceito da invenção como definida pelas reivindicações apensadas. EXEMPL01 Materiais e Métodos Este exemplo descreve um método analítico da presente invenção. O propósito deste método analítico é determinar as propriedades produtoras de odores de diferentes linhagens de grãos de soja. O método determina os odores selecionados em primeiro lugar iniciando a formação de odores. A moagem da semente em farinha fina e a ativação de enzimas usando água causaram a formação de odores. Os estudos sobre a velocidade de formação indicaram que, à temperatura ambiente, a formação de odores estava quase completada depois de cerca de 20 minutos (Tabela 1). Este tempo foi importante para a quantificação exitosa dos componentes odoríferos e avaliação das propriedades produtoras de odores de diferentes linhagens de grãos de soja. Depois de 20 minutos, os substitutos deute-rados de hexanal, hexanol e 2,4-decadienal foram adicionados para fornecer padrões internos. A reação foi interrompida pela adição de sulfato de sódio, e imediatamente depois, adição de 10% de metanol em éter, para extrair os alde-ídos, álcoois e cetonas. O método não se restringiu aos compostos listados. Todos os outros aldeídos, cetonas e álcoois, detectáveis, podem ser quantificados, porém não com a precisão igual à dos três substitutos deuterados utilizados.

Tabela 1: Efeito do tempo após a mistura da farinha de soja com água (0,5 g de farinha, 2 mL de água, isto é, razão 1:4) sobre a formação de componentes do aroma.. O pH das suspensões para quatro linhagens de grãos de soja diferentes (A-4, A-5, A-10 e A-14) foi de cerca de 6,3.

Tempo Hexanal 2x 1-Octen- 2x 2,4 2x pH pH pH (A-pH (A- (minutos) (pg/g) desvio-3-ol(p9/9) desvio-Decadi desvio-(A-4) (A-5) 10) 14) padrão padrão enal padrão (u9"a) 0 1,3 2,6 0,8 0,4 0,4 0,4 6,4 6,4 6,3 6,3 5 11,8 0,2 2,9 0,4 6,9 0,7 10 11,4 1,4 3,7 0,7 6,5 0,6 6,3 6,3 6,3 6,3 20 14,0 0,8 5,8 0,6 7,8 0,9 6,3 6,3 6,3 6,3 40 15,7 1,9 7,8 0,5 8,6 2,3 6,3 6,3 6,3 6,3 240 17,0 4,2 8,9 1,8 9,9 1,7 O tempo analítico para determinar esses componentes em 175 amostras leva 24 horas. Isto inclui extração e determinação usando croma-tografia gasosa/espectrometria de massas. O tamanho da amostra para análise foi tipicamente de 0,5 grama (g), mas pode ficar na faixa entre 0,2 g e 0,7 g. A faixa de uma concentração de odor, em base ponderai seca, foi entre 0,2 pg/g e 120 pg/g.

Preparação da Amostra de Came de Soja: A semente integral ou as carnes de soja foram coletadas como amostras. Aproximadamente 6 a 12 sementes selecionadas aleatoriamente ou um peso equivalente de pedaços de carne de soja de uma amostra foram moídos em um moinho de esferas em uma velocidade de aproximadamente 1.200 revoluções por minuto (rpm) por 1 minuto, para produzir uma farinha fina. O moinho de esferas para moer as sementes está descrito na publicação de patente ne US 2003/0146313 A1. O número de sementes ou carnes de soja foi determinado para obter aproximadamente 0,5 a 1,0 g de farinha de soja no final da moagem. Usou-se farinha de soja recém-moída para análise adicional.

Extração da Farinha de Soía: Usou-se farinha de soja recém-moída para extração de odores importantes. Aproximadamente 0,5 g (0,48 a 0,52 g) de farinha de soja foi colocado dentro de um frasco de 20 mililitros (mL) (frascos transparentes de borossílicato, revestidos com Teflon, para vedação) com uma tampa. Adicio-nou-se água desmineralizada (2 mL) à farinha no frasco antes de recolocar a tampa. O conteúdo do frasco foi misturado por aproximadamente 30 segundos (s) em um misturador turbilhonante para assegurar que toda a farinha fosse hidratada adequadamente no frasco. A farinha de soja hidratada foi deixada incubando sob condições aquosas brandas, que são aqui definidas como incubação em água à temperatura ambiente (22 °C) por 20 minutos (min). Depois de 20 min, adicionou-se 11 ± 0,3 g de sulfato de sódio anidro ao frasco, e em seguida, adicionou-se 10 mL de solução de metanol a 10% em éter ao frasco. Adicionou-se ainda 30 μΐ de uma solução de instilação de padrão substituto (mistura de padrões deuterados para hexanal, hexanol e decadienal) ao frasco, antes de tampar novamente e sacudiu-se o frasco por 30-40 min em um vascolejador recíproco a -200 rpm. Depois de 40 min, colocou-se 1 mL de extrato metanol:éter dentro de um frasco Autosampler (frasco Autosampler para Autosampler 7683 HP; fornecedor: VWR) para a-nálise adicional.

Análise de Extratos de Farinha de Soía: Extratos de farinha de soja em meio de extração metanokéter foram analisados adicionalmente em um Cromatógrafo de Gases Agilent 6890 (395 Agilent Technologies, Paio Alto, CA 94306, EUA), equipado com Autosampler série Agilent 7683 e espectrômetro de massas em tempo de vôo Leco com o software LECO Chrom TOF (LECO Corporation, St. Joseph, Ml, EUA). O cromatógrafo a gás estava equipado também com uma coluna de cromatografia gasosa DB-WAX ou DB1701 com espessura de película de 0,4 ou mais e diâmetro interno de 0,18 mm (Agilent Technologies). O metanol (metanol é metanol grau purga e sifão EM Science) foi obtido na VWR (VWR International, West Chester, PA 19380, EUA); o etóxi-etano (anidro) foi obtido na Mallinckrodt (Mallinckrodt, Hazelwood, MO 63042, EUA). O 2,4-decadienal, 85% trans (15% cis), o hexanal 98%, o hexanol 99%, 1-octen-3-ol 98%, 2-undecanona 99%, 2-nonenal 97%, e o 2,4-nonadienal 99% foram obtidos na Sigma-Aldrich Company (Saint Louis, MO 63103, EUA). O D12 hexanal, D13 hexanol e D2 decadienal foram produzidos internamente como descrito por Li net al. (1999). Para a análise, injetou-se 1 microlitro (pL) através do orifício de injeção do aparelho de cromatografia a gás (GC). Os parâmetros usados para analisar as amostras no cromatógrafo foram os seguintes: Parâmetros da Coluna do Cromatógrafo: DB-WAX ou DB1701 capilar 10 m x 0,18 mm, 0,4 mm, Volume de Injeção da Película: revestimento por injeção de 1 uL: revestimento divido/sem divsão.

Programa de Temperaturas: Inicial 55 °C por 1 min, 40 °C até 175 °C a 40 °C/min, manter 0 min 175 °C até 240 °C a 35 °C/min, manter 0 min temperatura de entrada: 220 °C, modo de injeção: pulsado sem divisão com 0,055 MPa (8 psi) inicial por 1,5 min, razão de divisão: 20:1. Gás carreador: hélio a 1,8 mL/min, vazão constante.

Tempo Parâmetros de Tempo de Vôo: Temperatura da interface: 250 °C, temperatura da fonte: 200 °C, temperatura da fonte do espectrômetro de massas: 150 °C, parâmetros de varredura: 50 a 250 m/z a aproximadamente 50 varreduras por segundo. Controle de Qualidade da Análise: Para cada batelada de amostras, um controle do método e uma instilação foram realizados na mesma hora. A instilação foi feita dividindo uma das amostras a serem analisadas em duas partes. A amostra deve ser tão homogênia quanto possível. A segunda parte foi instilada com uma quantidade conhecida de hexanal, 1 -octen-3-ol e decadienal. A adição foi feita na hora da adição dos compostos deuterados no procedimento de extração, como descrito acima. A concentração dos compostos instilados e não-instilados foi determinada como % de recuperação pela seguinte fórmula: % de recuperação onde: Cs = concentração da amostra instilada em pg/(g de peso úmido) Co = concentração da amostra não-instilada em pg/(g de peso úmido) wts = massa de amostra instilada em gramas Xs = microgramas instilados na amostra O controle do método seguiu o procedimento de extração sem adição de farinha de soja.

Exatidão e Precisão da Análise: A exatidão e a precisão foram determinadas usando uma amostra homogênea de farinha de soja e instilando a amostra com um nível conhecido dos três compostos, hexanal, 1-otecn-3-ol e 2,4-decadienal. Amostras não-instiladas também foram analisadas para determinar as quantidades da recuperação do composto instilado. Diferentes níveis de instilação podem ser usados como um método de adição padrão para determinar a base devido a erros sistemáticos. O valor médio junto com o desvio-padrão foi determinado. O valor médio foi comparado com o nível conhecido do material, para dar uma estimativa da exatidão do método. O desvio-padrão dá a precisão da medição. Note-se que é importante entender que estas abordagens medem apenas a variabilidade analítica, pois a moagem de 40 sementes para tornar a farinha de soja homogênea dá a média da variabilidade das sementes. Uma variação maior pode ocorrer para a determinação real por causa da variação das sementes. Para hexanal, a recuperação percentual foi de 83,8%. Para 1-octen-3-ol, a % de recuperação foi de 93,6%. Para 2,4-decadienal, a % de recuperação foi de 99,3%. O hexanal foi o menos exato, baseado na abordagem de instilação. Acredita-se que isto se deve à volatilidade do hexanal e ao fato de que o método tem baixas recuperações para hexanal. O octen-3-ol e o 2,4-decadienal têm graus mais altos de exatidão usando a abordagem de instilação. A precisão, indicada pelo desvio-padrão percentual relativo das recuperações foi de 5% para hexanal e e octen-3-ol. Para 2,4-decadienal, a precisão medida pelo desvio-padrão percentual relativo dos valores da recuperação foi de 1,1%. O tamanho da amostra demonstrou não ter um efeito entre 0,2 e 0,9 g para esta amostra homogênea, mas ele pode ser um problema entre amostras. Isto não foi testado. Assim sendo, o tamanho deve ser de cerca de 0,5 g até que o tamanho da amostra demonstre não ser um problema, ou o método é ajustado. A faixa de detecção para todos compostos é entre 0,5 micro-grama e 25 microgramas. Adicionar mais padrões à curva-padrão pode ampliar a faixa. EXEMPLO 2 Identificação e Seleção de Grãos de Soja Produtores de Baixo Odor Os odores potentes foram quantificados no leite de soja fabricado a partir de um grão de soja do controle (Vintor 81), um grão de soja sem lipoxigenase-2 (QT-1) e um grão de soja sem lipoxigenases 1, 2 e 3 (I-A2025). O leite de soja foi fabricado a partir de cada variedade de grão de soja embebendo as sementes limpas desejadas em água em uma razão 1:5 (peso de 1 grama:5 mL de água) a 25 °C por cerca de oito horas. Depois de descartar a água da embebição, os grãos de soja que pesavam duas vezes o peso original foram drenados e misturados com água destilada fresca (2 x o peso seco dos grãos de soja) por cinco minutos. Adicionou-se mais água destilada (7 x o peso seco dos grãos de soja) à pasta fluida por cerca de 2 min a 20 °C. A pasta fluida foi cozida lentamente a 95 °C a 98 °C por 20 min, em um banho de água, e filtrada através de um pano tecido grosso de algodão e espremida manualmente para extrair tanto leite de soja quanto possível. O leite de soja foi pasteurizado cozendo em um banho de água em uma temperatura entre 850 e 90 °C por 10 min, para reduzir a contaminação mi-crobiana, e estocado a 4 °C, antes da extração de odores para análise adicional.

Os odores foram extraídos das amostras de leite de soja. O leite de soja foi extraído com uma parte de Freon® 113 por pelo menos 30 min. Depois da remoção do extrato de Freon™ 113, a fase aquosa foi extraída adicionalmente com 0,67 parte de acetato de etila. Depois da coleta do extrato de acetato de etila, a fase aquosa foi descartada. O Feon™ e o acetato de etila foram filtrados através de sulfato de magnésio, para remover tanta água quanto possível, e concentrados até 1 mL, usando um evaporador rotativo Buchi 0,1. Os extratos de Freon foram evaporados sob 48 quilopascals (kPa) e os de acetato de etila sob 86 kPa.

Os odores potentes nos leites de soja foram quantificados usando olfatometria por GC {Acree, T.E., Analytical Chem. 69:170A-175A (1997)). A olfatometria por GC é uma cromatografia gasosa com um orifício inalador, onde a potência de um composto químico como um odorante é medida como uma medição da resposta humana aos odorantes em uma corrente ou baforada de ar. Usou-se um cromatógrafo a gás Hewlett Packard 6890 equipado com uma coluna de sílica pirogênica reticulada com metil-silicone (espessura da película = 0,33 pm) para a análise CharmAnalysis® (Acree, T.E., Bamard, J., Cunningham, D.G., Food Chem. 14:273-286 (1984)). O efluente consistia em hélio (2 mL/min) como gás carrreador e nitrogênio como gás de reposição (cerca de 30 mL/min). O efluente foi misturado com o ar de cheirada (20 mL/min) que era 99% de ar do laboratório umidificado até entre 50% e 75% e passado através do inalador por intermédio de um tubo de P-yrax sililado com 10 mm de diâmetro. O forno da GCMS foi programado para começar a aumentar sua temperatura três minutos a partir da temperatura inicial de 35 °C até 225 °C a 6 °C/min. Mais detalhes do método CharmA-nalysis™ em leite de soja podem ser encontrados na dissertação de doutorado apresentada à faculdade da Graduate School of Cornell University por Yu-Wen Feng.

Os dois grãos de soja sem lipoxigenase-2 (IA2025, QT-1) produziram níveis mais baixos de hexanal do que o controle (Tabela 2). O grão de soja sem todas as três lipoxigenases (IA2025) produziu os níveis mais altos de 2,4-decadienal e 1-octen-3-ona, enquanto que o grão de soja sem lipoxigenase-2 (variedade QT-1) teve os níveis mais baixos de todos os cinco odores potentes (Tabela 2). Ficou evidente a partir dos resultados que fatores composicionais desconhecidos que não a lipoxigenase-2 estavam envolvidos no controle da oxidação de lipídeos em grãos de soja. A variedade de grão de soja QT-1 foi identificada como uma variedade útil para criar variedades de grãos de soja comerciais com baixo odor, compreendendo ou não lipoxigenase-2. O método do Exemplo 1 foi desenvolvido para identificar a progênie de QT-1 e outras linhagens de grãos de soja que produzem baixas quantidades de 2,4-decadienal, hexanal, hexanol e 1 -oten-3-ol.

Tabela 2: Valor atrativo de odores presentes em leite de soja preparado a partir de três variedades de grãos de soja. A linhagem pertencente a Monsanto produziu níveis mais baixos de desvios de aroma do que um grão de soja isento das três lipoxigenases (IA2025) e de um grão soja tofu (Vinton 81). A Tabela 3 descreve os cruzamentos de grão de soja que foram usados para desenvolver a progênie para descrever a invenção. Foram usados métodos padronizados para gerar estas linhagens.

Tabela 3: Cruzamentos de Grãos de Soja Usados para Desenvolver a Pro-gênie Usada para Descrever os Grãos de Soja e os Métodos de Invenção EXEMPLO 3 Demonstração da Consistência Orelha-a-Orelha e Locai-a-Local de Características Produtoras de Odores, Baixa Cor e Baixo Teor de Aminoácidos de Linhagens de Grãos de Soja Selecionadas de Acordo com a Invenção Para a avaliação da cor, foram coletadas sementes como amostras. O número desejado de sementes de uma amostra foi moído em um Mega-Grinder em uma velocidade de 1.200 rpm, para produzir uma farinha de soja finamente moída. O Mega-Grinder para triturar as sementes está descrito na publicação da patente n2 US 2003/0146313 A1. Usou-se farinha de soja recém-moída para análise posterior. O sistema de medição de cores Espectrocolorímetro ColorFlex Modelo 45/0, fabricado pelos laboratórios Hunter (Hunter Associates Labora-tory, Inc., Reston, VA, EUA) foi usado para medir a cor da farinha de soja pelo procedimento operacional sugerido pelo fabricante. As cores foram medidas na Escala de Cores CIE-L*a*b* (CIE, Colorimetria, Publicação 15.2, Segunda Edição, Viena (1986), usando o procedimento Colorflex. A Comissão Internacional sobre Iluminação, abreviada CIE, segundo seu título francês Commission Intemacionale de TEclairage, e uma organização dedicada à cooperação internacional e troca de informações entre seus países-membros sobre todas as questões referentes à ciência e técnica de iluminação. O valor L* refere-se à luminosidade da farinha de soja, enquanto que o valor b* refere-se ao azul (números negativos) até o amarelo (números positivos) da farinha de soja. Os valores das cores da farinha de soja fabricada a partir de diferentes linhagens estão indicados nas Tabelas 4 e 5.

Aminoácidos Livres: Amostras não-moídas foram estocadas em uma sala isolada com temperatura e umidade controladas (aprovada pelo APHIS, Serviço de Inspeção de Saúde Animal e Vegetal). As amostras foram moídas usando o Mega-Grinder CAT, para criar farinha de soja e estocadas a 4 °C em sal de estocagem de sementes. A farinha de soja foi extraída com 5% de TCA a 4 °C durante a noite inteira, centrifugada, e os extratos foram estocados a -80 °C. Os extratos foram filtrados, diluídos caso necessário, e analisados quanto a aminoácidos livres pelo método OPA. O método OPA utiliza o-ftaldialdeído (OPA) para derivar amostras antes da injeção em uma coluna de HPLC C18 em fase reversa. Os aminoácidos primários derivados são separados eficientemente por grupo R e detectados quantitativamente por um fluorômetro sensível. O desvio-padrão relativo para este método é ~3%. Atividade de Lipoxiaenases: As amostras foram moídas usando um Mega-Grinder. Cada a-mostra recém-moída foi pesada em triplicata (5 ±1 mg) e colocadas dentro de uma cavidade específica de uma placa de extração com 96 cavidades de 2 mL. As amostras foram extraídas com K2P04 0,1 M (pH 7,0 ou pH 9) por 1 hora à temperatura ambiente. Depois da centrifugação, o sobrenadante obtido foi usado para medir o consumo de ácido linoléíco (substrato), usando um espectrofotômetro, e em seguida, determinação da proteína total por amostra, usando um Corante de Proteína Bio Rad. A unidade de lipoxigenases foi calculada usando mudanças de absorvância a 230 nm durante uma reação de 1 minuto e usando o coeficiente de extinção (ε = 23.000 M'1cm1). A concentração de substrato consumida durante a reação foi calculada substituindo cada valor na equação A = ebC. Uma unidade de lipoxigenase foi definida como os micromoles de substrato consumidos por minuto e mg total de proteína extraída. Usando soluções de reagentes preparadas em pH 7,0 ou pH 9,0, este ensaio permite medir os níveis (Unidades de enzima) de lipoxige-nase-2/-3 ou lipoxigenase-1, respectivamente. Os resultados das unidades de lipoxigenase são fomceidos em Unidades de LOX, pH 7,0, para atividades de lipoxigenase- 2 e 3 e como unidades de LOX, pH 9,0, para atividade de lipoxigenase-1.

Resultados: As características de odor dos grãos de soja persistiram quando cultivados em múltiplos locais (Tabela 4) e múltiplos anos (Tabelas 4 e 5). As linhagens de grãos de soja que produziram baixos níveis de hexanal, hexa-nol e 2,4-decadienal e 1-octen-3-ol no ensaio de odor (descrito no Exemplo 1) foram consistentemente diferentes das linhagens que produziram altos níveis (Tabela 4). As linhagens de grãos de soja na Tabela 4 foram selecionadas em ordem dos níveis de hexanal + hexanol _2,4-decadienal que as linhagens produziram. Por exemplo, a linhagem A-1 no topo da tabela produziu 18,21 ± 4,21 μg/g dos três odores. As quantidades de hexanal, mais hexanol produzidas pelos grãos de soja do memso cruzamento (como por exemplo, o cruzamento A) se correlacionaram com as quantidades de 2,4-decadienal produzida (Tabela 6, R2 = 0,85), sugerindo mecanismos similares e controle por variações genéticas e composicionais. Os níveis de 1-octen-3-ol produzidos eram independentes de hexanal, hexanol e 2,4-decadienal (Tabela 6, R2 = 0,01), sugerindo um mecanismo diferente de formação e controle. As linhagens de grãos de soja cultivadas em 2-3 locais que produzem baixos níveis de 1-octen-3-ol foram consistentemente diferentes das linhagens que produziram altos níveis de 1-octen-3-ol. Por exemplo, a linhagem A-18 produziu 4,70 ± 0,88 μο/g de 1-octen-3-ol e a linhagem A-12 produziu 14,67 ± 2,37 pg/g de octen-3-ol. Pode-se selecionar linhagens que têm uma combinação de composições genéticas que produzem níveis mais baixos de 1-octen-3-ol e níveis mais baixos de decadienal mais hexanal, mais hexanol (como por exemplo, a linhagem A-6).

Tabelas 4A e B: Cor e odores produzidos por grãos de soja moídos produzidos a partir da progênie de cruzamentos A, B, C, D e E, como indicado na Tabela 3. Os valores são a média e o desvio-padrão (Stdev) para cada linhagem cultivada em dois ou três locais em 2002 (Ames, lowa; Oxford, Indiana; Gladbrook, lowa). A progênie do cruzamento B listada teve baixo teor de ácido linolênico de 2,9 ± 0,4% de ácidos graxos totais. Todas linhagens apresentam hilo amarelo. Os grãos de soja moídos tinham um teor de umidade de 8%. Os valores das cores são L* (luminosidade), a* (verde-vermelho) e b* (azul-amarelo). Abreviaturas: Stdev = desvio-padrão.

Tabelas 5A e B: Características da farinha de grãos de soja, fabricada a partir de grãos de soja, commodity (mercadoria) comercial (controles) e da progênie dos cruzamentos A, B, C, D e E cultivadas em 2001. Os grãos de soja moídos tinham um teor de umidade de 7%. A ordem das linhagens é igual à da Tabela 4. A progênie do cruzamento B listada teve traço de baixo teor de ácido linolênico (2,9 ± 0,4% dos ácidos graxos totais). Duas progênies careciam de uma ou mais lipoxigenases, as outras continham todas três lipoxigenases designadas L1, L2 e L3. As atividades de lipoxigenases têm unidades de micromoles de substrato consumidos por mg de substrato. Os valores das cores são L* (luminosidade), a* (verde-vermelho) e b* (azul-amarelo). Abreviaturas: Stdev = desvio-padrão.

Tabela 6: Relações lineares, determinadas por valores de R ao quadrado, entre os odores produzidos a partir de colheitas da progênie de grãos de soja de 2001 e 2002. As regressões lineares foram calculadas a partir dos dados das Tabelas 4 e 5. Abreviaturas: Η + H = hexanal + hexanol; D = 2,4-decadienal; O = 1-octen-3-ol; DHH = 2,4-decadienal + hexanal + hexanol.

Foi possível desenvolver variedades produtoras de baixo odor e baixa cor com bom rendimento, pela primeira vez, usando os métodos e os grãos de soja desta invenção. Por exemplo, as linhagens A-1, A-4 e A-6 produziram 90,90,5 e 104% daquelas de controles comerciais.

Houve pouca ou nenhuma relação entre as atividades de lipoxi-genases em pH 7 e 9 e a formação de 2,4-decadienal + hexanal + hexanol a partir da farinha de soja hidratada (valores de R ao quadrado < 0,35, Tabela 7). Os grãos de soja que produziram atividades significativas de lipoxigena-ses em pH 7 e 9 (linhagem A-1) tiveram propriedades de odores similares às da linhagem que carecia de atividades de lipoxigenases (linhagem C-1) (Tabela 5). O grão de soja disponível no mercado, que carece de atividades de lipoxigenases 1, 2 e 3 (IA2032 da colheita de 1999) também foi testado quanto à atividade de lipoxigenases e à formação de odores. Nenhuma atividade de lipoxigenases foi encontrada em pH 7 e 9 para a farinha de soja isenta das três lipoxigenases, mas níveis significativos de hexanal (23,3 pg/g), hexanol (14,9 pg/g) e 2,4-decadienal (5,8 pg/g) foram formados no ensaio de odores da invenção. Após experimentos usando inibidores de li-poxigenases, concluiu-se que pelo menos outra lipoxigenase estava ativa nesta composição de grão de soja.

Ingredientes protéicos com cor clara foram apreciados pela indústria alimentícia, especialmente para produtos lácteos. Os grãos de soja foram cultivados em 2-3 locais, para determinar se poderíam ser selecionados grãos de soja com cor baixa. Descobriu-se que grãos de soja com baixa cor podiam ser selecionados, como se determina a partir do valor de b* de grãos de soja moídos (valor de b* alto indica mais amarelo, menos azul; Tabela 4). Por exemplo, o grão de soja A-2 teve um valor b* de 22,16 ± 1,39 e o grão de soja A-6 teve um valor b* de 27,35 ± 2,85 (Tabela 4). Existiu uma correlação entre o valor de b* das linhagens de soja cultivadas em 2001 e 2002 (R ao quadrado = 0,7; Tabela 7).

Tabela 7 Relações lineares determinadas por valores de R ao quadrado para odor, aminoácido livre, e cor, produzidos a partir da progênie de grãos de soja colhida em 2001 e 2002. As regressões lineares foram calculadas a partir dos dados das Tabelas 4 e 5. As correlações de aminoácidos livres com os dados de 2002 foram feitas sem três linhagens fora dos limites (A-4, B-5 e B-6).

Fatores ambientais, além de genéticos, afetam as composições que influenciam as propriedades produtoras de odores de grãos de soja. Os efeitos ambientais ficaram evidentes comparando as propriedades produtoras de odores de linhagens de grãos de soja cultivadas em duas safras, 2001 e 2002. A faixa de 2,4-decadienal + hexanal + hexanol para as linhagens criadas foi de 12-44 pg/g em 2001 e de 17-65 pg/g em 2002 (Tabelas 4 e 5). As propriedades produtoras de 1-octen-3-ol pareceram ser mais sensíveis a fatores ambientais, como evidenciado peia falta de correlação entre 1-octen-3-ol produzido pelas mesmas linhagens cultivadas em 2001 e 2002 (R ao quadrado = 0,62, Tabela 6).

As quantidades de arginina (Arg) livre e asparagina (Asp) livre na progênie dos grãos de soja foram determinadas. As quantidades de arginina e asparagina se correlacionaram (R2 = 0,81, Tabela 7) e a arginina mais asparagina total nos grãos de soja não se relacionaram com as propriedades de odores e cores selecionadas do grão de soja (R ao quadrado < 0,3, Tabela 7); assim sendo, é necessário testar quanto a aminoácidos livres para selecionar linhagens que têm combinações de baixo teor de 2,4-decadienal, baixa cor e baixo teor de aminoácidos. A factibilidade de selecionar linhagens de grãos de soja com baixo teor de aminoácidos foi fundamentada pela boa correlação entre arginina + asparagina livres em linhagens colhidas em dois anos diferentes (R ao quadrado = 0,8; Tabela 7). EXEMPLO 4 Combinação de Propriedade Produtora de Baixo Odor com Composição de Alto Teor de β-Conglicinina e Composições com Baixo Teor de Arginina e Asparagina Livres e Propriedade de Baixa Cor A origem do traço de alto teor de β-conglicinina foi um grão de soja mutado carente de glicininas e contendo cerca de 55% da proteína total como β-conglicininas (patente n2 US 6.171.640). Um ensaio de lipoxigena- ses não foi útil para selecionar as linhagens produtoras de baixo odor, como descrito acima. Foram criados grãos de soja que tinham espectros de proteínas, gordura e aminoácidos que estavam dentro das faixas normais para grãos de soja commodities.

Quantificação de Subunidades de Proteínas de Grãos de Soja: Cerca de 8 sementes foram moídas usando um Mega Grinder (publicação da patente n2 US 6.171.640). Para cada amostra, ~30 mg da farinha foram extraídos em 1,0 mL de Tampão SDS Laemmli pH 6,8 com DTT 0,1 M em um turbilhonador giratório ou de múltiplas placas por 45 a 60 min. Os tubos foram centrifugados por 3 a 5 min. Uma parte do sobrenadan-te foi transferida por tubos de microcentrifugação e diluída com o tampão acima, para produzir 1,2 a 1,5 pg/pL de proteína total. As amostras foram fervidas por 3 min, resfriadas e centrifugadas. Géis Criterion pré-moldados, com gradiente de 102-% de Tris-HCI, foram carregados com 15-20 pg de proteína de cada amostra. Qs géis passaram por eletroforese a 180-200 V, em Tampão 1X Tris-Glicina-SDS, até que o corante de rastreamento atingisse o fundo do gel, por cerca de 1,2 h. Os géis foram fixados por 30-60 min em 40% de metanol/10% de ácido acético, e coloridos com Azul de Coo-massie Coloidal G-250; no mínimo durante a noite inteira ou por até 3 dias. Para remover o fundo, os géis foram descoloridos com água desmineraliza-da. Os géis foram revelados em imagens usando o Densitômetro Calibrado GS 800. A quantificação foi realizada usando o software Bio-Rad Quantity One. O software é utilizado para determinar a quantidade relativa de cada banda na fileira de amostras. As subunidades percentuais de glicinina e as subunidades percentuais de β-conglicinina foram relatadas como porcentagem relativa da proteína total na fileira.

Análise de Aminoácidos Totais: A amostra foi testada por três métodos para obter o perfil completo. Triptofano requereu uma hidrólise básica com hidróxido de sódio. Os aminoácidos que contêm enxofre requereram uma oxidação com ácido per-fórmico antes da hidrólise com ácido clorídrico. A análise das amostras quanto aos aminoácidos remanescentes foi realizada através de hidrólise ácida direta com ácido clorídrico. Uma vez hidrolisados, os aminoácidos individuais foram então quantificados usando um analisador de aminoácidos automatizado (Métodos Oficiais de Análise da AOAC International, 2000). Cinzas: A amostra foi colocada em um forno elétrico a 550 °C e inflamada para expulsar todos os materiais orgânicos voláteis. A matéria não-volátil remanescente foi quantificada por gravimetria e calculada para determinar a porcentagem de cinzas. (Métodos Oficiais de Análise da AOAC International, 2000).

Carboidratos: O nível total de carboidratos foi calculado por diferença, usando os dados derivados dos peso recém-obtidos e a seguinte equação: % de carboidratos = 100% - (% de proteína + % de gordura + % de umidade + % de cinzas). (Ministério da Agricultura dos Estados Unidos da América do Norte, 1973).

Gordura por Extração Soxhlet A amostra foi pesada em um dedal de celulose, contendo areia e sulfato de sódio, e secada para remover o excesso de umidade. O pentano foi gotejado através da amostra para remover a gordura. O extrato foi então evaporado, secado, e pesado. (Métodos Oficiais de Análise da AOAC International, 2000), Umidade: A amostra foi secada em uma estufa a vácuo a aproximadamente 100 °C até atingir peso constante. A perda de peso de umidade foi determinada e convertida em porcentagem de umidade.

Proteína: Os compostos nitrogenados na amostra foram reduzidos na presença de ácido sulfúrico fumegante e uma mistura de catalisadores de mercúrio, para formar amoníaco. A digestão ácida foi tornada alcalina. O amoníaco foi removido por destilação e depois titulado com um ácido-padrão. A porcentagem de nitrogênio foi calculada e convertida em proteína, usando o fator 6,25. (Métodos Oficiais de Análise da AOAC International, 2000; Brads- treet (1965); Kalthoff e Sandell (1948)).

Resultados: Uma população de linhagens de grãos de soja com alto teor de β-conglicinina selecionada a partir de um cruzamento com um grão de soja que contém o traço produtor de baixo odor, apresentou uma ampla variação de propriedades produtoras de odores, medidas pela formação de hexanal, hexanol, 2,4-decadienal e 1-octen-3-ol (Tabela 8). Os grãos de soja commo-dity continham cerca de 22% da proteína total como β-conglicininas e cerca de 38% de glicininas, em comparação com os grãos de soja na Tabela 8 que tinham mais do que 30% da proteína como β-conglicininas e menos do que 25% das proteínas como glicininas. Foram criados grãos de soja que têm mais do que 30% da proteína total como β-conglicininas, que produziram menos do que 20 pg/g total de hexanal, mais hexanol e 2,4-decadienal no ensaio de odores do Exemplo 1, e compreendem também baixos níveis de asparagina e arginina livres (Tabela 8). Por exemplo, foram criadas pela invenção 20 linhagens com alto teor de β-conglicininas, que produziram menos do que 20 pg/g do total de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol e um total de arginina mais asparagina livres entre 360 e 2.840 pg/g de grãos de soja moídos (Tabela 8). A asparagina livre destas linhagens ficou entre 35 e 1.000 pg/g e a arginina livre desta linhagens ficou entre 500 e 2.400 pg/g de grãos de soja moídos.

Tabelas 8A e B

Características da progênie de grãos de soja com alto teor de β-conglicininas, colhida nos Estados Unidos. Foram criados grãos de soja que têm mais do que 30% da proteína como β-conglicininas e menos do que 25% da proteína como glicininas, que também produzem menos do que 20 μg/g de 2,4-decadienaí mais hexanal, mais hexanol por grama de farinha de soja no ensaio de odores do Exemplo 1. O ensaio da atividade de lipoxigenases não foi útil para identificar as linhagens produtoras de baixo odor.

Tabela 8A

Tabela 8B

As atividades de lipoxigenases variaram significativamente nas amostras de grãos de soja com alto teor de β-conglicininas. Não houve qualquer relação entre as atividades de lipoxigenases em pH 7 e 9 e as quantidades totais de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol, produzidas a partir da mesma farinha de soja (valores de R2 < 0,02).

Um experimento adicional foi conduzido para demonstrar que podem ser selecionados grãos de soja que têm mais do que 30% de β-conglicinina e menos do que 25% de glicininas, que têm baixa cor e uma composição de aminoácidos que fica dentro da faixa dos grãos de soja commodities. Foram selecionados quatro grãos de soja com alto teor de β-conglicininas, e que continham também o traço de Roundup Ready®, que produziram os requisitos comerciais de qualidade iguais ou melhores do que a média em três locais. Estes grãos de soja tinham o traço de cor ilustrado por uma média de b* de cerca de 22 e uma média de L* de cerca de 85 (Tabela 9). As composições de aminoácidos (Tabela 9) caíram dentro das faixas de grãos de soja de exportação (Tabela 10), como publicado na Base de Dados das Composições de Culturas do Life Science Institute (versão 1.0, acessada em 22 de março de 2004). As composições médias de aminoácidos das três linhagens de grãos de soja com alto teor de β-conglicininas (Tabela 9) foram comparadas com a composição média de grãos de soja na base de dados do ILSI (Tabela 10). Quatro aminoácidos (arginina, lisina, his-tidina e serina) das linhagens com alto teor de β-conglicininas ficaram entre 10 e 15% diferentes da composição média dos grãos de soja de exportação, mas ainda estavam dentro da faixa de composições de grãos de soja de exportação.

Prevê-se também que as propriedades organolépticas dos grãos de soja com alto teor de β-conglicininas serão melhoradas ainda mais cruzando com grãos de soja com baixo teor de linolênico e oléico médio. Foram criados grãos de soja com baixo teor linolênico e oléico médio na Monsanto, usando geração tradicional, e que compreendem um teor linolênico de cerca de 2%, um teor linoléico de cerca de 25% e um teor oléico de cerca de 59% dos ácidos graxos totais.

Tabela 9 Composição, cor e propriedades de odores de grãos de soja cultivados em três locais em 2003. Todos tinham o traço Roundup Ready® e hilo escuro.

Tabela 10 Comparação da Composição Média dos Três Grãos de Soja com Alto Teor de Beta-conglicinina com a composição média de grãos de soja na Base de Dados das Composições de Culturas do Life Sciences Institute (versão 1.0). Critérios de seleção usados para obter os dados: tipo de cultura: grãos de soja Glycine Max\ tipo de tecido: semente; ano da safra, tudo, país, tudo, estado, tudo. Abreviaturas: FW = peso da farinha de soja; DW = peso seco; HBC = alto teor de beta-conglicininas EXEMPLO 5 Comparação de Propriedades de Odor e Cor de Grãos de Soja de Exportação com Grãos de Soja Selecionados de Acordo com a Invenção As propriedades de odor e cor de grãos de soja de exportação foram determinadas para comparar com as propriedades de odor e cor dos grãos de soja da invenção. Alguns grãos de soja produziram menos do que 17,5 pg/g de hexanal mais haxanol e alguns produziram menos do que 11 pg/g de 2,4-decadienal no ensaio de odor (Tabela 11). Entretanto, nenhum dos grãos de soja de exportação produziu menos do que 20 pg de decadie-nal mais hexanal, mais hexanol por grama de sementes moídas, após oxida-ção sob condições aquosas brandas. Foram criadas quatro linhagens que contêm lipoxigenases, desta invenção, que produziram menos do que 20 pg/g de hexanal + hexanol e 2,4-decadienal, em duas safras (Tabelas 4, 5). Por exemplo, a linhagem A-1 das safras de 2001 e 2002 produziu 18,0 e 18,2 pg/g, respectivamente, da soma de hexanal + hexanol e 2,4-decadienal (Tabelas 4, 5). Foram criadas mais de 20 linhagens com alto teor de β-conglicininas pela invenção, que produziram menos do que 20 pg/g de hexanal + hexanol e 3,2 pg/g de 2,4-decadienal, em duas safras (Tabela 8). A cor dos grãos de soja de exportação cobriu uma faixa ampla. Por exemplo, o valor de b* ficou na faixa entre 27 e 34 (Tabela 11). As linhagens de grãos de soja da invenção demonstraram estender os valores de b* até tão baixo quanto 22 (Tabela 4, Tabela 9). EXEMPLO 6 Demonstração da Capacidade de Combinar o Traço Produtor de Baixo Odor com um Traço de Composição com Baixo Teor de Ácido Linolênico Este exemplo demonstra que é possível combinar o traço produtor de baixo odor com um traço de composição com baixo teor de ácido linolênico, e explora ainda os efeitos de descascar os grãos de soja sobre a produção de odores. A porcentagem de ácidos graxos de grãos de soja que é ácido linolênico é normalmente cerca de 8%. Usando geração tradicional, foi possível criar grãos de soja que têm menos do que 6% de ácido linolênico e propriedade produtora de baixo odor (Tabela 12). A formação de 1-octen-3-ol é independente da formação de outros compostos voláteis medidos no ensaio de odores. Uma hipótese é que enzimas fúngicas sobre a superfície dos grãos de soja são a fonte da formação rápida de 1-octen-3-ol no ensaio. Teorizou-se que descascara semente antes de moer para dar farinha deve diminuir os níveis de enzimas fúngicas no ensaio de odores. Grãos de soja inteiros são moídos normalmente para produzir a farinha que é usada no ensaio de odores. Realizou-se um novo teste usando seis linhagens de grãos de soja com baixo odor e baixo teor de linolênico, que foram descascados cuidadosamente. A quantidade de 1-octen-3-ol, formada a partir das sementes descascadas, foi cerca da metade daquela das sementes inteiras, fundamentando a hipótese de que os componentes, tais como fungos e enzimas fúngicas, na parte das casca, contribuem para a formação de 1-octen-3-ol (Tabela 13). Os grãos de soja isentos de lipoxigenases produzem freqüentemente níveis mais altos de 1-octen-3-ol. Teorizou-se que as lipoxigenases podem desempenhar um papel importante na inibição do crescimento de mofo, e assim sendo, na ausência de lipoxigenases, as infecções por mofo podem ser maiores, permitindo mais enzimas fúngicas e a formação de 1-octen-3-ol. Os grãos de soja com baixo odor, que contêm lipoxigenases, e que foram identificados pela triagem desta invenção, tendem a ter um teor mais baixo de 1-octen-3-ol do que aquele dos grãos de soja com odor mais alto (como por exemplo, Tabela 12). Tabelas 12 A1 a A4: Propriedades Produtoras de Cor e Odor de Linhagens de Grãos de Soja com Baixo Teor Linolênico Os valores das cores são L* (luminosidade), a* (verde-vermelho), e b* (azul-amarelo).

Tabela 13 A formação de 1-octen-3-ol no ensaio de odores foi reduzida quando o grãos de soja foram descascados antes de fabricar a farinha de soja. EXEMPLO 7 Efeitos do pH sobre a Formação de Odores Um ensaio de odores padronizado, fornecido pela invenção, envolveu a adição de farinha de soja à água, resultando na formação de odores em cerca de pH 6,3. O propósito do experimento que se segue foi determinar se as variedades que produzem baixos níveis de odores sob esta condição também produzem baixos níveis de odores sob outras condições de pH. As propriedades produtoras de odores de um grão de soja comercial de controle foram comparadas com uma linhagem produtora de baixo odor (A-4). A linhagem A-4 produziu níveis mais baixos de decadienal e hexanal em pH 3,0 e pH 5,5, e pH 7 e pH 9,2 (Tabela 14). Estes dados fundamentam o uso do ensaio sem tampão como um método para selecionar grãos de soja que produzirão níveis mais baixos de odores dentro de uma ampla faixa de condições de pH. As concentrações mais altas de hexanal e 2,4-decadienal foram produzidas em pH 9, o pH no qual a menor quantidade de 1-octen-3-ol foi produzida (Tabela 14).

Tabela 14 Efeitos do pH sobre a formação de odores a partir do grão de soja comercial de controle e do grão de soja produtor de baixo odor (A-4 das Figuras 4 e 5, colhido em 2003). O uso do ensaio de odores para esta medição foi igual ao do Exemplo 1, exceto que a farinha de soja foi adicionada a K2HP04 0,1 M no respectivo pH (3,02, 5,45, 7,01 e 9,16). EXEMPLO 8 Efeitos da Composição de Proteínas dos Grãos de Soja sobre o Sedimento do Leite de Soia Este exemplo descreve os níveis mais baixos do sedimento formado no leite de soja fabricado a partir de grãos de soja que têm a composição de proteína modificada da invenção. O sedimento que contém proteína tem um impacto negativo sobre a qualidade organoléptica do leite de soja, pois não se deseja sentir partículas em bebidas.

Preparação do Leite de Soia: Um grão de soja de baixo odor do controle (A-4) e um grão de soja que tem cerca de 39% de β-congicinina e cerca de 13% de glicinina foram moídos usando um Mega Grinder, para fabricar farinha de soja. Cada amostra de farinha foi adicionada a 36,75 g de água (4 °C) em um tubo de centrifugação de polipropileno descartável, de tal modo que a concentração final de proteína nas misturas fosse de 3,3% em peso, e passaram por ultra-som por 15 segundos com um ajuste de controle da potência de saída de 8. As amostras passadas no ultra-som foram centrifugadas por 10 min a 8.000 rpm a 4 °C, usando A Centrífuga Eppendorf 5804 R. Os sobrenadantes (leite de soja) foram decantados em tubos de centrifugação de polipropileno descartáveis. Uma parte de cada leite de soja (27,75 g) foi transferida para outro tubo de centrifugação descartável de 50 mL. As amostras acima foram preparadas em duplicata para possibilitar a variação na adição de sacarose que se segue. Adicionou-se sacarose (0,6987 g) as 27,25 g de leite de soja, antes ou depois do tratamento térmico.

As amostras de leite de soja foram tratadas termicamente colocando o tubo de centrifugação de polipropileno descartável de 50 mL dentro de um banho de óleo de silicone a 95 °C por 5 min, e depois as amostras foram transferidas para um banho de gelo a fim de resfriar, e em seguida, foram estocadas em um refrigerador por 30 dias. Formou-se um sedimento nas amostras de leite de soja no decorrer do tempo. A quantidade de sedimento formada foi quantificada da maneira que se segue. Os sedimentos no fundo dos tubos de centrifugação foram dispersados virando os tubos para a frente e para trás. As amostras de leite de soja foram transferidas para dentro de um tubo de centrifugação tarado e o peso final foi registrado. Os tubos foram colocados dentro da Centrífuga Eppendorf 5804 R e centrifugados por 2 min a 8.000 rpm e 25 °C. O sobrenadante do leite de soja foi decantado e o peso do sedimento remanescente foi calculado. A quantidade de sedimento foi registrada como porcentagem do peso de leite de soja (% de sedimento = 100 x Peso do sedimento/Peso de leite de soja).

Resultados: Os leites de soja do controle tinham pelo menos o dobro da quantidade de sedimento dos leites de soja com alto teor de β-conglicinina (Tabela 15).

Tabela 15 Efeitos da Composição de Proteína de Grãos de Soja sobre os Sedimentos do Leite de Soja. A-4 é o grão de soja do controle. HBC é um grão de soja com alto teor de β- conglicinina e baixo teor de glicininas.

Os exemplos acima indicam que foram criadas composições singulares que podem produzir baixos níveis de odores, mesmo quando os grãos de soja continham as lipoxigenases 1, 2 e 3. Também foi demonstrada a capacidade de selecionar grãos de soja que têm melhores propriedades organolépticas, onde os grãos de soja são selecionados baseado nas quantidades de proteínas glicininas, arginina e asparagina livres, pigmentos amarelos e ácidos graxos poliinsaturados nos grãos de soja, e nas quantidades dos odores 2,4-decadienal, hexanal, hexanol e 1-octen-3-ol, produzidas pelas suspensões aquosas de grãos de soja moídos. Foi descrito um método para estimar o potencial para que os grãos de soja produzam 2,4-decadienal, hexanal, hexanol e 1-octen-3-ol, e outros odores ainda mais po- tentes em ingredientes e alimentos de grãos de soja. Neste método de estimativa de odores de grãos de soja, a importância de incubar a farinha de soja em água em uma razão de 1 para 4 resultou em observações peculiares de que o 2,4-decadienal se forma rapidamente à temperatura ambiente nas suspensões, e que é possível gerar grãos de soja que contêm as lipoxi-genases 1,2 e 3 que produzem níveis muito baixos de odores.

Demonstrou-se também nos exemplos que é possível criar composições de soja endógenas que têm mais do que 30% de β-conglicininas e menos do que 25% de glicininas, que têm níveis normais ou baixos de argi-nina livre e asparagina livre. Demonstrou-se ainda que as propriedades de baixo odor e cor podem ser combinadas com composições de alto teor de β-conglicinina, e foram concebidas outras combinações com grãos de soja que têm baixo teor de ácido linolênico e médio teor de ácido oléico. As glicininas são uma fonte de proteínas insolúveis em ingredientes e alimentos de soja, criando sedimentos em bebidas e uma sensação indesejável na boca. A ar-ginina e a asparagina livres podem formar amoníaco durante o processamento, que pode reagir adicionalmente com os compostos de odor, tal como 2,4-decadienal, para formar odores potentes, tal como 2-pentil-piridina. Os ácidos linoléico e linolênico são ácidos graxos poliinsaturados que são substratos para a formação de odores; baixar seu teor em grãos de soja ajudará a baixar a formação de odores. Os pigmentos dos grãos de soja contribuem para desvios de cor de produtos de grãos de soja, tendo impacto ainda sobre a resposta organoléptica. Somando tudo, a composição de grão de soja com alto teor de β-conglicinína, baixo teor de arginina e asparagina livres, baixo odor e baixa cor, e baixo teor de ácidos graxos poliinsaturados, e a composição mais valiosa da invenção para criar ingredientes protéicos e a-limentos de soja que são agradáveis em termos organolépticos. Reconhece-se também que estas composições não carecerão de propriedades saudáveis associadas com ingredientes protéicos de soja, pois as β-conglicininas estão associadas a propriedades redutoras de colesterol e triglicerídeos da proteína de soja (Duranti et al., 2004) e na inibição de arteriosclerose (A-dams etaL, 2004). EXEMPLO 9 Análise de Sedimentação Adicional de Composições de Soja com Baixo 0-dor 0 estudo no Exemplo 8 foi repetido com as mudanças que se seguem. Incluiu-se um grão de soja de exportação como controle (AG3302). Os grãos de soja foram descascados antes de fabricar a farinha e a farinha foi peneirada antes da adição à água. Os sobrenadantes (leite de soja) foram transferidos para tubos de centrifugação tarados. Adicionou-se sacarose antes do tratamento térmico, para produzir uma concentração final de sacarose de 2,5% em peso. As amostras foram estocadas em um refrigerador por 21 dias. As alturas dos sedimentos do leite de soja nos tubos de centrifugação foram medidas, e depois as amostras foram centrifugadas por 5 min a 8.000 rpm. Os sobrenadantes foram decantados e pesados, o pH dos sobrenadantes foi determinado (todas amostras tinham pH = 7), e os tubos contendo péletes foram pesados. O peso percentual dos sedimentos de soja úmidos foi calculado para cada amostra (% ponderai de sedimentos de soja úmidos = 100 x peso dos sedimentos de soja úmidos/(peso de sedimentos de soja úmidos + peso do sobrenadante de soja)).

Os efeitos benéficos dos grãos de soja com HBC e baixo odor em reduzir a formação de sedimentos protéicos foram obtidos usando grãos de soja descascados (Tabela 16). O leite de soja com HBC teve uma redução de 2,2 vezes de sedimentos em comparação com a linhagem de grão de soja de baixo odor e uma redução de 7 vezes de sedimentos em comparação com o grão de soja do controle. Uma redução surpreendente de 3,1 vezes foi encontrada em sedimento no grão de soja com baixo odor em comparação com o controle. É possível que o traço de baixo odor tenha reduzido a formação de sedimentos por limitar a formação de radicais livres e a oxi-dação de proteínas. Isto indicou, portanto, as propriedades benéficas adicionais da composição otimizada, combinando traços de alto teor de β-conglicinina e de baixo odor.

Tabela 16 Efeitos de Traços de alto teor de beta-conglicinina e de baixo odor sobre a Altura dos Sedimentos do Leite de Soja e Peso dos Péletes de Sedimentos em Comparação com uma Composição de Grão de Soja do Controle EXEMPLO 10 Preparação de Farinha de Grão de Soia Descascado e Ingrediente isolado de Protéina de Soia Um grão de soja do controle (AG3302) e grãos de soja que compreendem mais do que 30% das proteínas totais como beta-conglicininas e menos do que 25% de proteínas totais como glicininas e menos do que 2.500 microgramas/grama de arginina mais asparagina livres (DJB2104GOR, EXP319AP) foram descascados para fabricar farinha de grãos de soja descascados, e depois processados adicionalmente para fabricar ingrediente protéico de soja isolado, de acordo com as etapas abaixo. Tabela 17 Composição de beta-conglicininas e glicininas em diferentes linhagens de grãos de soja. 1. Ajustar os grãos de soja até cerca de 10% de umidade e temperatura ambiente. 2. Fracionar os grãos de soja usando um moinho de fracionamento. 3. Descascar os grãos de soja fracionados usando um Aspirador. 4. Condicionar os grãos de soja fracionados e descascados a 50-60 °C, u-sando um cozedor. 5. Flocaros grãos de soja condicionados usando um Moinho de Flocagem. 6. Extrair os flocos de grãos de soja com hexano. 7. Remover o solvente da papa de grão de soja desengondurada, resultando em flocos. 8. Moer os flocos para fabricar farinha. 9. Adicionar água a um tanque de 300 L encamisado e ajustar para 50 °C e pH 9,0, usando NaOH a 40%. A farinha de soja desengordurada foi adicionada e misturada. A razão de água para farinha de soja foi de 12:1 (em peso), O tempo de extração foi de 45 min. 10. Recuperar a proteína de soja solubilizada a partir da pasta fluida de extração, usando uma centrífuga de discos com remoção de lama (contrapres-são de 0,4-0,414 MPa (58-60 psi)). 11. Ajustar o pH da solução protéica clarificada para 4,5 adicionando ácido clorídrico (18%) e deixando reagir por 30 min a 45 °C. 12. Recuperar a proteína precipitada usando uma centrífuga de disco com remoção de lama. 13. Lavar o coágulo protéico duas vezes, usando água acidificada (pH 4,5 ± 0,1, 30-35 °C). A razão de água de lavagem para sólidos úmidos compactados foi de 6:1 em peso. O coágulo protéico foi recuperado usando uma centrífuga de disco com remoção de lama depois de cada lavagem (contrapres-são 0,4-0,414 MPa (58-60 psi)). 14. Misturar o coágulo protéico com hidróxido de sódio (30%), a fim de ajustar o pH para 6,8, usando NaOH a 30% e depois tratar termicamente a 116 °C por 7,5 segundos. Depois, ajustar o pH para pH 6,8. 15. Ajustar a temperatura da solução protéica para 45-55 °C e atomizar u-sando uma temperatura do ar de entrada de 204-215 °C e uma temperatura do arde saída de 82-88 °C. 16. Determinar o índice de solubilidade em nitrogênio dos ingredientes pro-téicos de soja isolados. Colocar uma parte da amostra em suspensão em água sob agitação a 30 °C por duas horas. Depois, diluir com água até um volume de conhecido. Analisar uma parte da amostra separada quanto à proteína total e analisar uma alíquota quanto à proteína pelo mesmo método.

Calcular a proteína solúvel em água como porcentagem de proteína total, que era proporcional ao nitrogênio solúvel em água como porcentagem do nitrogênio total.

Resultados: O índice de solubilidade em nitrogênio dos pós de proteína de soja (Tabela 18) foi diretamente proporcional às quantidades de beta-conglicinina nos grãos de soja usados para fabricar os ingredientes protéicos de soja: NSI = 1,4716 (% de beta conglicinina) + 7,4502; R ao quadrado = 0,9975. Uma redução nos níveis de proteína insolúvel melhora a qualidade organoléptica (sensação mais agradável e mais refrescante) de produtos alimentícios formulados com os ingredientes protéicos de soja.

Tabela 18 índice de Solubilidade em Nitrogênio A composição de aminoácidos dos ingredientes protéicos de soja isolados, fabricados a partir de grãos de soja, era similar, com a exceção de que o teor de lisina dos ingredientes com alto teor de beta-conglicinina (HBC)era 6% mais alto do que o controle.

Tabela 19 Composição de aminoácido total de ingredientes protéicos de soja EXEMPLO 11 Preparação de Produto de Soia Cultivado a Partir de Farinha de Grãos de Soia Descascados A farinha de grãos de soja descascados foi preparada a partir de um grão de soja de exportação (AG3302), um grão de soja com alto teor de beta-conglicinina (DJB2104GOR) e uma linhagem de grão de soja produtora de baixo odor (03JBK8-25), todos colhidos nos Estados Unidos em 2004.

Os métodos usados para preparar e testar o produto cultivado do teste fabricado a partir dos grãos de soja são: 1. Os grãos de soja foram fracionados usando um moinho de fracionamento. 2. Os grãos de soja quebrados foram descascados usando um aspirador. 3. As carnes dos grãos de soja (feijão de soja descascados) foram moídas por 1 passagem através de um moinho de martelos e 5 passagens através de um moinho de pinos. 4. A farinha de grãos de soja descascados foi embalada em sacos plásticos dentro de tambores de fibra. 5.0 teor de proteína da farinha foi determinado. 6. A farinha dos grãos de soja descascados (3 °C) foi adicionada à água (3 °C), de tal modo que o teor de proteína ficasse em 3,5% (base em peso) e misturou-se usando um homogeneizador portátil por cerca de 1 a 2 min. 7. A suspensão de farinha de soja foi aquecida em um trocador de calor com placas, e depois recebeu injeção de vapor d agua para tratar a suspensão a 141 °C por 3,5 segundos, e desaerada antes de resfriar até cerca de 4 °C. 8. As suspensões tratadas termicamente foram filtradas para remover as fibras, resultando em leite de soja. 9. Os ingredientes com sabor lácteo, açúcar (3%) e sal (0,2%) foram adicionados ao leite de soja e misturados usando um homogeneizador portátil. 10. O leite de soja aromatizado foi aquecido em um trocador de calor com placas e depois recebeu injeção de vapor d agua para tratar a suspensão a 141 °C por 3,5 segundos, e desaerada antes de resfriar até cerca de 4 °C, e embalado em recipientes esterilizados. 11. As amostras de leite de soja, cada uma contendo 2,2% de proteína, foram pesadas em frascos esterilizados de 1 litro e aquecidas no forno de microondas por 45 a 60 segundos (cerca de 24 °C). 12. Açúcar (3,1%), extrato de baunilha (0,4%) e iogurte de soja cultivado (L. bulgaricus, S. thermophillus, L acidophilus, B. bifidum, L casei, L rhamno-sus (8%) foram adicionados ao leite de soja e as amostras foram misturadas. 13. A cultura contendo leite de soja foi colocada em uma incubadora a 43 °C e incubada por 4 horas, removida e refrigerada durante a noite inteira (4 °C). 14. As medições do pH e da viscosidade foram feitas nas amostras refrigeradas e uma avaliação sensorial foi conduzida por um painel de 3 pessoas que não conheciam as formulações das amostras. A viscosidade foi medida em um viscosímetro Brookfield com Haste nQ 3 a 20 rpm.

Resultados: O perfil do aroma do produto cultivado fabricado a partir de DJB2104GOR foi agradável e serviria para uma bebida aromatizada com frutas. O perfil do produto fabricado a partir de 03JBK8-25 era agradável e serviria para uma coalhada ou pasta. Teorizou-se que uma combinação de traços produtores de alto teor de beta-conglicinina e baixo odor também criaria produtos de leite de soja cultivados agradáveis. A viscosidade mais baixa do material com alto teor de beta-conglicinina pode ajudar a criar produtos com teor protéico mais alto no mesmo nível de consistência.

Tabela 20: Composição de grãos de soja e propriedade de odores Tabela 21: Perfil de Sabor do produto cultivado EXEMPL011 Demonstração da Combinação de Baixo Odor com Alto Teor de β-Conglicinina Este exemplo descreve a combinação de composições com propriedades produtoras de baixo odor com alto teor de β-conglicinina. Ele demonstra a capacidade de produzir composições de soja com baixo odor, que compreendem menor teor de glicininas e maior teor de β-conglicinina. Os tipos de cruzamentos, tais como A e E {Tabela 3), foram combinados com o germoplasma de alto teor de β-conglicinina, que tem um pedigree de A3233/B2G2/A1923. A análise das proteínas foi conduzida da seguinte maneira: oito grãos de soja foram selecionados e moídos usando o Mega-Grinder CAT (SOP Asci-01-0002). As amostras moídas foram estocadas a 4 °C. Para a análise, ~30 g de farinha de cada um foram pesados dentro de uma placa de microtitulação de 2 mL com 96 cavidades. A proteína foi extraída por 1 hora sob vascolejamento em 1 mL de tampão de SDS Laemmli 1X, pH 6,8, contendo ditiotreitol (DTT) 0,1 M, como relutante. Depois da centrifugação, uma parte de cada extrato foi diluída ainda mais em tampão SDS, para produzir 0,2-0,5 pg/pL de proteína total, aquecida até 90-100 °C por 10 min, e resfriada. Para cada amostra, 1-2 pg de proteína total foram carregados usando uma pipeta de 12 canais em cima de um gel Criterion de Tris/HCI com gradiente T de 15% com 26 fileiras. Padrões de peso molecular e um controle parental foram incluídos em duas das fileiras em cada gel. Os géis passaram por eletroforese até que o corante de rastreamento atingisse o fundo do gel em ~1,2 hora, e depois corados durante a noite inteira em Azul de Coomas-sie coloidal G-250, descorados em água desmineralizada, e tiveram a imagem reproduzida usando o Densitômetro Calibrado GS800. A quantificação foi realizada usando o software Bio-Rad Quantity OneTM. O software foi u-sado para determinar a quantidade relativa de cada banda na fileira da a-mostra. As bandas das subunidades das proteínas da porcentagem de glici-nina e a porcentagem de β-conglicinina estão relatadas como porcentagem relativa da proteína total na fileira. A subunidade a5-glicinina não foi quantifi- cada e não foi incluída no valor de glicinina ácida total. As identidades e pesos das amostras são rastreados usando o Master LIMSTM.

As composições de grãos de soja produtores de baixo odor com traço de alto teor de β-conglicinina estão ilustradas com algumas linhagens que não tinham o traço de baixo odor (Tabela 22). As análises de odores em duplicata estão indicadas na primeira linha da tabela. Estão indicadas várias linhas que carecem de glicininas e produziram composições com menos do que 20 pg/g de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol por grama de sementes moídas, após oxidação sob condições aquosas brandas. As composições produzidas serão avaliadas adicionalmente quanto a outras características (como por exemplo, rendimento, aminoácidos livres, cor e espectro de ácidos graxos).

Tabela 22: Reposição da Produção de Odores e de Subunidades Protéicas de Composições de Grãos de Soja com Alto Teor de Beta-conglicinina Gly = glicininas ácidas ND = não-detectável Informações sobre o Depósito Um depósito da Monsanto Technology LLC, grão de soja 0119149, descrito acima e enunciado nas reivindicações, foi feito segundo o Tratado de Budapeste junto à American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, EUA. A linhagem 0119149 depositada tem as designações "A-4'' e "03JBK8-25”, que são utilizadas neste relatório descritivo e nos exemplos e tabelas do trabalho. O número de acesso da ATCC para o depósito é PTA-6197 e a data do depósito foi 10 de setembro de 2004. O depósito será mantido no depositário por um período de 30 anos, ou 5 anos depois da última solicitação, ou durante a validade efetiva da patente, qualquer que seja o mais longo, e será substituído conforme necessário durante esse período.

Todas as composições e métodos aqui descritos e reivindicados podem ser produzidos e executados sem experimentação excessiva à luz da presente descrição. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, deve ficar evidente para os versados nessas técnicas que variações podem ser aplicadas às composições e métodos e nas etapas ou na sequência das etapas aqui descritas, sem fugir do conceito, do espírito e do âmbito da invenção. Mais especificamente, deve ficar evidente que certos agentes, que são quimica-mente e fisiologicamente relacionados, podem substituir os agentes aqui descritos, e ao mesmo tempo, atingindo resultados iguais ou similares. Todas estas substituições e modificações similares, evidentes para os versados nessas técnicas, são julgadas como estando dentro do espírito, âmbito e conceito da invenção como definida pelas reivindicações apensadas. Listagem de Referências As referências que se seguem, até o grau em que elas fornecem detalhes procedimentais exemplificativos e outros detalhes suplementares àqueles aqui enunciados, são aqui especificamente incorporadas como referência. U.S. Patent 5.777.080 U.S. Patent 5.981.781 U.S. Patent6.171.640 U.S. Patent 6.171.640 U.S. Patent 6.171.640, U.S. Patent 6.355.296 U.S. Patent 6,444,874 U.S. Patent 6.653.534. U.S. Patent Appln, 20030074693. U.S. Patent Pub, 2003/0146313 Al.

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REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Composição de carne de soja produzida a partir de grãos de soja compreendendo lipoxigenases 1,2 e 3, caracterizada pelo fato de que a composição compreende mais do que 10% de ácido linoléico como uma porcentagem de ácidos graxos totais, e menos do que 20 ag do total de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol, por grama, seguido de oxidação sob condições aquosas brandas, em que a composição compreende menos do que 2.000 ag por grama de arginina livre e menos do que 400 ag de aspara-gina livre por grama.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende menos do que 4% de ácido linolênico como porcentagem de ácidos graxos totais.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que possui uma cor medida como valor b* menor do que 30 e um valor L* maior do que 80, monitorado pelo sistema CIE-L*a*b*, onde L* indica claridade e b* indica o matiz em um eixo azul (-) a amarelo (+).

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um teor menor do que 4 ocg de 1-octen-3-ol por grama, seguido de oxidação sob condições aquosas brandas.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que possui mais do que 30% da proteína como β-conglicinina.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que possui menos do que 25% da proteína como glicinina.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que possui uma concentração de ácido linoléico entre 10% e 60% dos ácidos graxos totais.

8. Composição de carne de soja, caracterizada pelo fato de que possui mais do que 30% da proteína como β-conglicinina e menos do que 25% da proteína como glicinina, menos do que 5.000 ag por grama de arginina livre e menos do que 900 ag por grama de asparagina livre.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que possui menos do que 2.000 ag por grama de arginina livre e menos do que 400 ocg por grama de asparagina livre.

10. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende um teor menor do que 4 ocg por grama de 1-octen-3-ol, seguido de oxidação sob condições aquosas brandas.

11. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende menos do que 20 ocg do total de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol por grama, seguido de oxidação sob condições aquosas brandas.

12. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que possui uma concentração de ácido linolênico entre 1,5% e 14% dos ácidos graxos totais.

13. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que possui uma concentração de ácido linoléico entre 10% e 60% dos ácidos graxos totais.

14. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que é definida como isenta de lipoxigenase-2.

15. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que é definida como isenta de lipoxigenases.

16. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que possui uma cor caracterizada por um valor b* menor do que 30 e um valor L* maior do que 80, monitorado pelo sistema CIE-L*a*b*, onde L* indica claridade e b* indica o matiz em um eixo azul (-) a amarelo (+).

17. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende 67-69 mg de lisina por grama de proteína.

18. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende 72-80 mg de arginina por grama de proteína.

19. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende 28-30 mg de histidina por grama de proteína.

20. Composição de carne de soja produzida a partir de soja compreendendo menos de 2.000 ocg por grama de arginina livre e menos de 400 ocg por grama de asparagina livre, caracterizada pelo fato de que possui mais do que 30% da proteína como β-conglicinina e menos do que 25% da proteína como glicinina, e menos do que 20 ocg do total de 2,4-decadienal mais hexanal, mais hexanol, por grama, seguido de oxidação sob condições aquosas brandas.

21. Composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que é definida como isenta de lipoxigenase-2.

22. Composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que possui uma concentração de ácido linolênico entre 1,5% e 14% dos ácidos graxos totais.

23. Composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que possui uma concentração de ácido linoléico entre 10% e 60% dos ácidos graxos totais.

24. Composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que é definida como isenta de lipoxigenases.

25. Composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que possui uma cor caracterizada por um valor b* menor do que 30 e um valor L* maior do que 80, monitorado pelo sistema CIE-L*a*b*, onde L* indica claridade e b* indica o matiz em um eixo azul (-) a amarelo (+)■