JP2022502085A - 植物タンパク質及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、乾物１グラム当たり総和で１０マイクログラム未満、好ましくは５マイクログラム未満の、ヘキサナールと、２−ペンチル−フランと、（Ｅ）−２，４−ヘプタジエナールと、１−オクテン−３−オールと、を含有する植物タンパク質単離物と、その調製方法と、に関する。植物タンパク質は、好ましくはマメ科植物から、より好ましくはエンドウ又はソラマメから、最も好ましくはエンドウから得られる。植物タンパク質単離物を抽出する方法は、（ａ）タンパク質含有種子を提供する工程と、（ｂ）前記種子を製粉する工程と、（ｃ）製粉された種子を水中に懸濁する工程と、（ｄ）前記製粉された懸濁液からタンパク質を抽出する工程と、（ｅ）抽出されたタンパク質を６０℃〜１００℃の温度且つ４〜５．５の範囲内のｐＨの水で洗浄する工程と、からなる。

Description

本発明は、植物タンパク質（単離物及び濃縮物を含む）、好ましくはマメ科タンパク質単離物、より好ましくは乾物１グラム当たり合計で１０μｇ未満の揮発性化合物を含有するエンドウタンパク質単離物に関する。先行技術の植物タンパク質単離物と比較して、かかる植物タンパク質（単離物及び濃縮物を含む）、好ましくはマメ科タンパク質単離物、より好ましくはエンドウタンパク質単離物は、明らかに摂取時に異風味の少ない味を有する。本発明はさらに、本発明の植物タンパク質（単離物及び濃縮物を含む）、好ましくはマメ科タンパク質単離物、より好ましくはエンドウタンパク質単離物の抽出及び精製のプロセスに関する。最後に、本発明はまた、食品、飼料、及び医薬品産業における本発明の植物タンパク質（単離物及び濃縮物を含む）、好ましくはマメ科タンパク質単離物、より好ましくはエンドウタンパク質単離物の用途に関する。

炭水化物及び脂質と共に、タンパク質は我々の食事の有意な部分を構成する。タンパク質の所要量は、我々の１日食物摂取量の１２％〜２０％であると一般に言われている。

摂取されるタンパク質は、一般に、肉、魚、卵、乳製品などの動物起源又は穀物、油料植物、マメ科植物などの植物起源のどちらかである。

工業国では、タンパク質摂取は、主に動物起源のタンパク質に由来する。動物起源のタンパク質の過剰摂取及び有意により少ない植物タンパク質は、癌及び心血管疾患の割合の増加の原因の１つであることが多くの研究から示されることに留意することが重要である。

さらに、動物タンパク質は、そのアレルゲン性（とくに乳及び卵のタンパク質に関して）と、動物タンパク質生産に必要な集約農業に起因する我々の環境の劣化と、の両方に関して多くの欠点を有する。

こうしたことを考慮して、生産者は、動物タンパク質の代替物として植物タンパク質に徐々に目を向けてきた。実際には、食物製品において動物タンパク質の全部又は一部を置き換えるために、植物タンパク質を使用することが公知の規範となっている。

植物タンパク質の機能性は動物タンパク質のものとは異なるので、このような種類の置換えは必ずしも容易であるとは限らない。この場合、機能性とは、技術的変換時、貯蔵時、又は家庭調理時に生成された食物系の官能品質に影響を及ぼす物理的又は物理化学的性質を意味する。

植物タンパク質の中では、マメ科植物タンパク質を使用することが周知の規範となっている。乳タンパク質は栄養上の大きな利点を有するが、生産コストが高いため、大規模な食物加工分野でのその使用は制限される。代替物として、マメ科植物タンパク質は乳タンパク質を置き換えることが可能である。とくにエンドウタンパク質は、現在、この分野ではゲームチェンジャータンパク質と見られている。エンドウタンパク質単離物は、非ＧＭＯ由来種子から得られ、ダイズタンパク質単離物ではない。

ある特定の植物タンパク質、とくにマメ科植物タンパク質及びエンドウタンパク質の欠点の１つは、それらが無味でないという事実である。このことは、それらが組み込まれた製品でさえも異風味の原因となりうることを意味する。摂取者は、「エンドウ臭い味」、
「マメ臭い味」、「青臭い味」、又は「植物臭い味」として異風味を表現することが多い。

周知の単純な解決策は、溶液への化学化合物の導入により配合プロセス時に異風味をマスクすることである。これは、異風味マスカー、風味剤、及び／又は異風味モジュレーターで行うことが可能である。残念ながら、多くの場合、このタイプの解決策は、完全に機能するわけではない。つまり、異風味をマスクするのではなく単に低減するにすぎない。追加の欠点は、配合者が追加の化合物を購入しなければならなくなるので、その配合コストが上昇することである。規制（主に食品及び医薬品の規制）もまた、かかる化合物の使用のハードルとなりうる。他の重要な一因子は、今日の消費者が「クリーンラベル」製品を望んでおり、こうしたタイプの化合物を製品ラベルに含めると何人かの潜在的摂取者を遠ざけることになる点である。

より好ましい解決策は、異風味の少ないタンパク質単離物を直接機能させることであり、植物タンパク質単離物の生産者は、ある解決策でいくつかの提案をすでに行ってきた。

たとえば、国際公開第２０１５／０７１４９８号パンフレットには、精製エンドウタンパク質単離物を抽出するために、乳酸発酵と組み合わされて湿式製粉抽出プロセスをいかに使用するかが説明されている。このプロセスは、ある種の平凡な「良好な味」を有するエンドウタンパク質単離物を生成可能であるが、残念ながら、無風味エンドウタンパク質単離物の創出には失敗している。本特許出願の表１０を参照して、あらゆるエンドウタンパク質サンプルは、「マメ臭い」又は「エンドウ臭い」味を有すると表現され続けてきた。

他の一例として、国際公開第２０１７／１２０５９７号パンフレットには、大量タンパク質洗浄とりわけ中性ｐＨ及び平均温度の水を大量に用いた洗浄と組み合わせて、塩析沈殿をいかに使用するかが説明されている。このプロセスは、大量の塩及び大量の中性ｐＨ上水（エンドウの１５〜３０体積）を含む。それにもかかわらず、エンドウタンパク質単離物に≪マメ臭い≫及び≪苦い≫味が依然として検出され、平均の市販のエンドウタンパク質単離物と同レベルである（グラフ１８Ａ、Ｂ、及びＣを参照されたい）。

残念ながら、現在の市販のエンドウタンパク質単離物は、摂取時に依然として異風味を発し、「マメ臭い」又は「植物臭い」異味と表現される。異風味をなんら有していない無味のマメ科タンパク質単離物、好ましくはエンドウタンパク質単離物の必要性が依然として存在する。

そういったことを踏まえて、本発明の目的は、先行技術の欠点の少なくとも１つを克服若しくは低減すること及び／又は有用代替物を提供することである。

本発明の第１の態様は、乾物１グラム当たり合計で１０μｇ未満の揮発性化合物、好ましくは乾物１グラム当たり合計で５μｇ未満の揮発性化合物を含有する植物タンパク質（単離物又は濃縮物を含む）である。

好ましい実施形態では、揮発性化合物の合計は、ヘキサナールと、２−ペンチル−フランと、（Ｅ）−２，４−ヘプタジエナールと、１−オクテン−３−オールと、の含有量の総和として理解されるべきである。そのため、この実施形態では、本発明に係る植物タンパク質単離物は、乾物１グラム当たり総和で１０μｇ未満、好ましくは５μｇ未満の、ヘ
キサナールと、２−ペンチル−フランと、（Ｅ）−２，４−ヘプタジエナールと、１−オクテン−３−オールと、を含有する。より好ましい実施形態では、揮発性化合物の合計は、以下に記載の本発明の方法により検出及び分析されるすべての揮発性化合物の総和として理解されるべきである。

より好ましい実施形態では、植物タンパク質はまた、乾物１グラム当たり合計で５ｍｇ未満のサポニンを含有する。

さらにより好ましい実施形態では、植物タンパク質は、マメ科植物から、好ましくはエンドウ又はソラマメから得られ、エンドウタンパク質が最も好ましい。

本発明のすべてのタンパク質実施形態は、「マメ臭い」異風味も「植物臭い」異風味もなく、識別可能に中性の味により特徴付けられる。これらの実施形態は、本発明の詳細な説明及び非網羅的例のリストでさらにカバーされる。

本発明に係るタンパク質単離物はまた、先行技術のタンパク質と比較して改善された水への溶解性により特徴付け可能である。とりわけ、本発明に係るタンパク質単離物は、以下に記載の試験に従って決定したとき、２０℃且つｐＨ６で３０％超、好ましくは４０％超、より好ましくは約５０％の水への溶解性、及び２０℃且つｐＨ７で４０％超、好ましくは６０％超、より好ましくは７０％超の溶解性を有する。

本発明の第２の態様は、植物タンパク質（単離物又は濃縮物を含む）、好ましくはマメ科タンパク質単離物、より好ましくはエンドウタンパク質単離物を得る方法である。本方法は、下記工程：
（ａ）タンパク質を含有する植物種子、好ましくはマメ科種子、より好ましくはエンドウ種子を提供する工程と、
（ｂ）前記種子を製粉する工程と、
（ｃ）製粉された種子を水中に懸濁する工程と、
（ｄ）前記製粉された懸濁液から好ましくは等電点ｐＨでの熱凝固によりタンパク質を抽出する工程と、
（ｅ）６０℃〜１００℃、より好ましくは７５℃〜９５℃の温度且つ４〜５．５、より好ましくは４．５〜５のｐＨｃでタンパク質を水で洗浄する工程と、
（ｆ）任意選択的に、工程（ｅ）の終了時に得られた洗浄されたタンパク質を剪断ポンプ又はホモジナイザーに通してタンパク質の機能性を改善する工程と、
（ｇ）任意選択的に、工程（ｅ）又は（ｆ）で得られたタンパク質を乾燥する工程と、からなる。

好ましい実施形態では、工程（ｂ）の種子の製粉は、直接水中で且つ酸素の不在下で、好ましくは３００μｇ／リットル未満、好ましくは２００μｇ／リットル未満の二酸素の残留濃度で行われる。残留酸素濃度は、これ以降に記載のプロトコルに従って決定されうる。

より好ましい実施形態では、製粉は、追加の水の不在下で行われ、且つ工程（ｃ）の製粉された懸濁液は、乾燥粉と水とを混合することにより得られる。これは、好ましくは３００μｇ／リットル未満の二酸素の残留濃度、好ましくは２００μｇ／リットル未満の測定値で行われるであろう。残留酸素濃度は、これ以降に記載のプロトコルに従って決定されうる。

本発明の第３の態様は、食品用途、飼料用途、化粧品用途、及び医薬用途における本発明の植物タンパク質（単離物又は濃縮物を含む）、好ましくはマメ科タンパク質単離物、
より好ましくはエンドウタンパク質単離物の使用への関与である。

本発明は、下記の詳細な説明に目を通せばよりよく理解される。

「マメ臭い」又は「植物臭い」味に関連付けられる主要揮発性化合物の化学構造。 実施例３に係る本発明のプロセス＃１−高温及び酸洗浄。 実施例４に係る本発明のプロセス＃２−低酸素粉砕及び高温酸洗浄。 先行技術及び本発明のタンパク質単離物の比較。

「植物タンパク質」という用語は、本明細書では、すべてのタイプの植物から抽出されたすべてのタイプのタンパク質と見なされる。植物とは、葉緑体を特徴的に含有し、セルロースで作製された細胞壁を有し、胚を生成し、且つ移動力の欠如した植物界（Ｐｌａｎｔａｅ）の各種光合成、真核、多細胞生物のいずれかとして理解されなければならない。植物は、樹木、灌木、ハーブ類、シダ類、蘚類、及びある特定の緑藻類を含む。とくに本願では、植物という用語は、エンドウ及びソラマメを含むマメ科に適用される。他の好ましいタイプの植物は、アマ、エンバク、コメ、及びヒラマメである。

本願での「タンパク質」とは、アミノ酸残基の１つ以上の長鎖からなる分子を意味するものとして理解されるべきである。本願では、タンパク質は、植物に固有のものでありうるか又は加水分解タンパク質を含めて修飾されたものでありうる。こうしたタンパク質は、８０％超の単離物又は５０％超の濃縮物を含めてさまざまな濃度でありうる。

「マメ科」という用語は、エンドウ科（マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ））の植物として理解されなければならない。これらは、莢、特有の花、及び典型的には根粒に種子を有する。これらの根粒は、窒素を固定可能な共生細菌を含有する。

「エンドウ」という用語は、本明細書では、その許容可能な意味の最広義で考慮される。特定的には、それは「マルエンドウ」及び「シワエンドウ」のすべての品種並びに「マルエンドウ」及び「シワエンドウ」のすべての突然変異品種を含む。これらの品種は、各エンドウタイプに対して通常意図される使用（ヒト摂取食品、動物飼料、及び／又は他の使用）に関係する。本願では、「エンドウ」という用語は、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）に属するエンドウの品種、より特定的にはサチバム（ｓａｔｉｖｕｍ）種及びアエスチバム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）種を含む。前記突然変異品種は、特定的には、「新規なエンドウデンプンの開発」というタイトルのＣ−Ｌ ＨＥＹＤＬＥＹらの論文Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｔｈｅ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９６，ｐｐ．７７−８７に記載されるように、「ｒ突然変異体」、「ｒｂ突然変異体」、「ｒｕｇ３突然変異体」、「ｒｕｇ４突然変異体」、「ｒｕｇ５突然変異体」、及び「ｌａｍ突然変異体」として知られるものである。

「揮発性」という用語は、本明細書では、常温及び常圧で容易に蒸発する化学化合物に適用される。これらの化学化合物は、以下で説明されるようにクロマトグラフィー法を用いて容易に分析される。

「サポニン」という用語は、本明細書では、水との混合撹拌時に石鹸のような泡を形成する各種植物グリコシドのいずれかと見なされる。具体的には、これらのサポニンは、水
性溶液中でサポニンを振盪したときに生成される石鹸様の泡により現象学的にグループ化される両親媒性グリコシドである。それらは、親油性トリテルペン誘導体と組み合わされた１つ以上の親水性グリコシド部分を有することに基づいて構造的にグループ化される。

本発明の概要で以上に記載されたように、本発明の第１の態様は、乾物１グラム当たり合計で１０μｇ未満の揮発性化合物、好ましくは乾物１グラム当たり合計で５μｇ未満の揮発性化合物を含有する植物タンパク質単離物（単離物又は濃縮物を含む）である。

好ましい実施形態では、揮発性化合物の合計は、ヘキサナールと、２−ペンチル−フランと、（Ｅ）−２，４，ヘプタジエナールと、１−オクテン−３−オールと、の含有量の総和として理解されなければならない（図１の式を参照されたい）。より好ましい実施形態では、揮発性化合物の合計は、以下に記載の方法を用いて本発明により検出及び分析されるすべての揮発性化合物の総和として理解されなければならない。これらの特定揮発性化合物は、「マメ臭い」、「植物臭い」、又は「エンドウ臭い」味に関連付けられる。以下の実施例は、本発明のタンパク質が乾物１グラム当たり１０μｇ未満のこれらの揮発性化合物を含有することを示す。さらに進んで、本願の実施例の節では、市販のタンパク質単離物又は公知の抽出プロセス（溶媒の使用を除く）により今までにこうした結果が得られていないことが示される。

より好ましい実施形態では、植物タンパク質単離物また、乾物１グラム当たり合計で５ｍｇ未満のサポニンを含有する。

さらにより好ましい実施形態では、植物タンパク質単離物が、マメ科植物から、好ましくはエンドウ又はソラマメから得られ、エンドウタンパク質由来のものが最も好ましい。

異風味と植物タンパク質組成との関連は、当業者に周知である。かかる異風味をもたらす化合物は、２つのファミリーにカテゴリー化可能である。当業者は、３０〜３００ｇ・ｍｏｌ^−１の範囲内の典型的分子量を有する揮発性化合物で構成されるものとして第１のファミリーを記述するであろう。かかる化合物の例は、ヘキサナール、２−ペンチル−フランなどである。これらの揮発性化合物は、多くの場合、「マメ臭い」、「植物臭い」、及び／又は「エンドウ臭い」味／異風味をもたらす。「マメ臭い味」や「エンドウ臭い味」などの異風味と揮発性化合物との関連が周知であっても、いかなる異風味も摂取者によりほとんど検出されない十分に低いレベルを達成できるプロセスや単離物は現在のところ入手できないことが知られている。産業プロセスで深刻な欠点となる可能性のある溶媒の使用を含むプロセスがただ１つ存在する。

かかる揮発性化合物は、マメ科植物とくにエンドウの内部に直接存在するが、残留脂質を酸化するリポキシゲナーゼなどの内因性酵素によりタンパク質抽出時に合成される可能性もある。

揮発性化合物の合計は、ＨＳ−ＳＰＭＥ分析手順により評価される。この手順は、Ｓｏｒａｙｙａ＆ａｌ．，Ｖｏｌａｔｉｌｅ ｆｌａｖｏｒ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔ ｆｉｅｌｄ ｐｅａ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ａｓ ｔｈｅｙ ａｒｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｒｏｐ ｙｅａｒ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２４（２０１１），３２６−３３５では変化を調べることにより行われる。１００ｍｌ １５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水性溶液中に１ｇエンドウタンパク質サンプルが懸濁される。５ｍｌ溶液を混合した後、サンプルボトル中に配置される。風味抽出のためにＳＰＭＥファイバー（５０／３０μｍ、ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃｏ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）が利用される。各使用前、ファイバーは、２５０℃で１時間コンディショニングされる。１００ｍＬ １５％（ｗ／ｖ）
ＮａＣｌ（ＡＲ）水性溶液中に室温で１ｇエンドウタンパク質サンプルが懸濁される。混合後、３０ｍＬ透明ガラスバイアル（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃｏ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）中に溶液の５ｍｌが配置され、次いで、Ｔｅｆｌｏｎ被覆ゴムセプタムを含有する蓋でシールされ、そして小型磁気撹拌子が取り付けられる。内部標準２−メチル−３−ヘプタノン（１ｍｇ／Ｌ溶液）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）が添加される。バイアル中のサンプルは、水浴中６０℃で３０分間加熱され、ＳＰＭＥファイバーを用いて３０分間抽出され、そして吸着プロセスの磁気撹拌速度は、５００ｒｐｍである。次いで、ファイバーは、ＤＢ−ＷＡＸの極性樹脂を有するキャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．、０．２５μｍ膜厚、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を備えたＧＣ−ＭＳ（ＳＣＩＯＮＳＱ−４５６−ＧＣ，Ｂｒｕｋｅｒ，Ａｍｅｒｉｃａ）に注入される。スプリットレス注入が使用される。クロマトグラフ温度は、４０℃で３分間等温に、６℃・ｍｉｎ^−１の速度で１００℃に、次いで、１０℃・ｍｉｎ^−１の速度で２３０℃に、最後に７分間等温にするようにプログラムされる。質量分析は、７０ｅＶの電子衝撃モードで操作される。質量分析計は、ｍ／ｚ３３〜３５０の質量をスキャンする。イオン化源は２００℃に、移送ラインは２５０℃に設定される。揮発性化合物は、質量スペクトルライブラリーとの比較を行うことにより並びにアルカン系列（Ｃ８〜Ｃ３０）のＧＣ保持指数の計算及び比較により同定される。保持指数は、同一クロマトグラフィー条件下で計算された発表データに基づく。定量データは、合計イオン電流（ＴＩＣ）ピーク下の面積のエレクトロニック積分により得られる。次いで、内部標準２−メチル−３−シクロヘプタノンを用いて相対量が計算され、乾物を考慮に入れることにより規格化される。

オフノートに関連付けられる第２のファミリーに関して、当業者は、４０〜１，０００ｇ・ｍｏｌ^−１の典型的分子量範囲を有する不揮発性化合物であることを知っている。「苦い」異風味に対しては、サポニン、酸化リン脂質などである。「塩辛い」に対しては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどである。「酸っぱい」に対しては、酪酸、酢酸などである。マメ科タンパク質とくにエンドウでは、サポニン及びその苦いオフノートは取組みがより困難な化合物である。

サポニン抽出物は、Ｌｙｎｎ Ｈｅｎｇ＆ａｌ．，Ｂｉｔｔｅｒｎｅｓｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｄｒｙ ｐｅａｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，８６（２００６），１２２５−１２３１及びＫ．Ｄｅｃｒｏｏｓ＆ａｌ．，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ，ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ，ａｎｄ ２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｏｙ ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ
ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１０７２（２００５）１８５−１９３で着想された修正プロトコルに従って分析される。エンドウタンパク質サンプルは、その際、ヘキサン（ＡＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）で６時間還流することにより脱脂され、続いて、エンドウタンパク質は、ヒュームフード内で一晩空気乾燥される。脱脂されたエンドウタンパク質（１ｇ）は、インキュベーターシェーカー（ＳＷＢ１５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）で２００ｒｐｍの一定した振盪を行いながら、４０ｍｌ、６０％、（ｖ／ｖ）メタノール（ＨＰＬＣグレード、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を用いて２５℃で４時間抽出される。抽出前、１００ｍｇ・ｋｇ^−１の内部標準エキレニン（エストロゲン様ステロイド
、３−ヒドロキシエストラ−１，３，５，７，９−ペンタエン−１７−オン）が添加される。粗抽出物は、無灰濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ、１１０ｍｍ、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）に通して濾過される。４０℃真空下での蒸発により透明濾液からメタノールが除去される。この蒸発工程は、１Ｌ丸底フラスコを用いて１５分間未満で実施される。濃縮物は、５ｍＬまで蒸溜水が加えられ、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８固相抽出カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｐｌｕｓ
ｔＣ１８カートリッジ、３７〜５５μｍ、Ｓｕｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）に通され、続いて、非結合材料を除去するために１５ｍＬの水で濯がれる。結合化合物は、１０ｍｌ １００％（ｖ／ｖ）メタノール（ＨＰＬＣグレード、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）で溶出され、ＬＣ−ＭＳにより分析される。ＬＣ−ＭＳクロマトグラフィー条件は次の通りである。キャピラリー電圧は４．４ＫＶであり、コーンホール電圧は４０Ｖであり、イオン源温度は１００℃であり、溶媒ガス温度は２５０℃であり、光電子増倍管電圧は７００Ｖであり、且つ流量は４．２Ｌ／ｈである。液体クロマトグラフィーは、Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｃ−１８（２．１×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）カラム及び検出器Ｗａｔｅｒｓ９９６を備えたＷａｔｅｒｓ２６９０液体クロマトグラフシステムで実施される。カラム温度は３５℃であり、注入体積は０．３ｍＬ／ｍｉｎの流量で１０μＬである。ＬＣ−ＭＳ実験のグラジエント溶出条件は、０．５％ギ酸（ＡＲ Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）で３０分間（０〜３０ｍｉｎ）、続いて、２０：８０の比のアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）対０．５％ギ酸で１０ｍｉｎ（３０〜４０ｍｉｎ）、そして４０：６０の比で１分間（４０〜４１ｍｉｎ）、次いで０．５％ギ酸に調整される。ＤＤＭＰサポニン及びサポニンＢのピークの質量スペクトルにおける分子イオン［Ｍ＋Ｈ］^＋のｍ／ｚ比は、それぞれ、１０６９及び９４３であった。サポニンの相対量は、内部標準エキレニンを用いて計算され、乾物を考慮に入れることにより規格化される。

本発明に係るタンパク質単離物はまた、先行技術のタンパク質と比較して改善された水への溶解性により特徴付け可能である。とりわけ、本発明に係るタンパク質単離物は、２０℃且つｐＨ６で３０％超、好ましくは４０％超、より好ましくは約５０％の水への溶解性、及び２０℃且つｐＨ７で４０％超、好ましくは６０％超、より好ましくは７０％超の溶解性を有する。

溶解性は、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて測定可能である。
好ましくは、下記のプロトコル：
− ２．０ｇサンプル及び１００ｇの蒸溜水を２０℃で４００ｍＬビーカーに配置する。
− １Ｎ ＨＣｌ及び／又は１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを６又は７に調整し、混合物に蒸溜水を厳密に２００．０ｇまで加える。
− この混合物を３０分間撹拌し、次いで、３０００×ｇで１５分間遠心分離する。
− 遠心分離後、厳密に２５．０ｇの上澄みを結晶皿（ｍ１）に抜き取る。一定質量（ｍ２）に達するまで、皿を１０３℃のオーブン内に配置する。
− 溶解性＝（（ｍ２−ｍ１）／２５）×１００
に従って測定されるであろう。

本発明の第２の態様は、植物タンパク質（単離物又は濃縮物を含む）、好ましくはマメ科タンパク質単離物、より好ましくはエンドウタンパク質単離物を得る方法である。本方法は、下記工程：
（ａ）タンパク質を含有する植物種子、好ましくはマメ科種子、より好ましくはエンドウ種子を提供する工程と、
（ｂ）前記種子を製粉する工程と、
（ｃ）製粉された種子を水中に懸濁する工程と、
（ｄ）前記製粉された懸濁液からタンパク質を抽出する工程と、
（ｅ）６０℃〜１００℃、より好ましくは７５℃〜９５℃の温度且つ４〜５．５、より好ましくは４．５〜５の範囲内のｐＨでタンパク質を水で洗浄する工程と、
（ｆ）任意選択的に、工程（ｅ）の終了時に得られた洗浄されたタンパク質を剪断ポンプ又はホモジナイザーに通してタンパク質の機能性を改善する工程と、
（ｇ）任意選択的に、工程（ｅ）又は（ｆ）で得られたタンパク質を乾燥する工程と、を含む。

工程（ａ）では、本発明に好適な植物種子は、食品適合可能植物種子のリスト、とくにエンドウ、ソラマメ、エンバク、ヒラマメ、及びアマから選択可能である。エンドウ種子は、実際には最良且つ最好適な種子であり、続いてそれに近いのはソラマメである。

工程（ｂ）は、種子を粉に製粉することを目指し、当業者に公知のあらゆるプロセスにより行うことが可能である。それは、その前に、リポキシゲナーゼのような内因性酵素を阻害するために使用される浸漬工程、漂白工程、さらには周知の焙煎工程を含みうる。種子は、水に混合する前に粉に製粉可能であり、これは「乾式製粉」として知られるプロセスである。しかしながら、製粉はまた、種子を水中に懸濁させた状態で行うことも可能であり、これは「湿式製粉」プロセスとしても知られる。

工程（ｃ）の目標は、製粉された粉を水中に懸濁することである。湿式製粉の場合、製粉前に水が導入される。乾式製粉のプロセスでは、２０〜３０乾燥重量％の濃度で、好ましくは２５乾燥重量％で水と共に粉が導入される。

工程（ｄ）の目標は、製粉された種子からタンパク質を抽出することである。湿式抽出プロセスは、本発明にとくに好適である。好ましいプロセスは、参照により本願に組み込まれる米国特許第７１８６８０７（Ｂ２）号明細書のその全体が記載されている。

本特許のプロセスの第１の工程では、事前に清浄化、選別、及び漂白されたエンドウの製粉から得られた粉は、水中に懸濁される。水中に粉を懸濁するとき、１００μｍ以下の平均粒子サイズを有する粉を２０〜３０乾燥重量％の濃度で、好ましくは２５乾燥重量％で選択することが最も有利である。溶液のｐＨは限定因子ではないが、懸濁液のｐＨを補正しないこと、つまり、６．２〜７のｐＨ範囲で操作することが最も有利である。

第２の工程では、この水性粉懸濁液を遠心分離デカンターのプロセスに直接暴露することが最も有利である。これは、エンドウファイバー画分が先行の篩分けにより除去されるのを防止する。ジャガイモデンプン工場で使用される構成に従って遠心分離デカンターを用いてこの分離操作を行うと、２つの識別可能画分、すなわち、一方では可溶性物質及びタンパク質、他方ではファイバー及びデンプンに容易に分離可能になることが、本出願人会社で観測された。

第３の工程では、こうして得られた可溶性物質とタンパク質との混合物を含有する画分からタンパク質を容易に単離することが可能である。これは、等電点ｐＨでのタンパク質の沈殿及び／又は限外濾過タイプの膜分離に使用されるいくつかの技術の１つを選択することにより達成される。好ましい方法は、等電点ｐＨと「熱凝固」と呼ばれるタンパク質の熱的凝固とを組み合わせて使用することである。

これらの得られたタンパク質は、エンドウの場合には主にグロブリンであり、工程（ｅ）の原料である。商用重量で典型的には乾物２０％未満のタンパク質溶液は、６０℃〜１００℃、より好ましくは７５℃〜９５℃、さらにより好ましくは約９０℃の温度の水浴中
で、好ましくはクエン酸を用いて、４〜５．５のｐＨ、好ましくはｐＨ４．５〜５、より好ましくはｐＨ４．５に調整される。タンパク質溶液は、ホエーを分離するためにプレート濾過器若しくは遠心分離機に直接に又は３０分間まで可能な接触時間の後にポンプ注入可能である。次いで、タンパク質カードは、６０℃〜１００℃、より好ましくは７５℃〜９５℃、さらにより好ましくは約９０℃の温度で、４〜５．５に調整されたｐＨ、好ましくは４．５〜５のｐＨ、より好ましくはｐＨ４．５に調整されたｐＨで、１〜５体積の水を用いて、好ましくは２回洗浄可能である。次いで、洗浄されたタンパク質カードはつまみだされ、１０％〜１２％の範囲内の固形分含有率が得えられように蒸溜水中に再懸濁され、そして２．０Ｍ ＮａＯＨで６．５〜７．０のｐＨに調整される。この工程に対する一選択肢は、高圧ホモジナイゼーション（２０ＭＰａ）及びスプレードライングで終了することでありうる。代替実施形態では、工程（ｄ）及び（ｅ）は同時に行うことが可能である。この場合、タンパク質は、１〜５体積の水を添加した後、６０℃〜１００℃、より好ましくは７５℃〜９５℃、さらにより好ましくは約９０℃の温度で且つｐＨ２．５で加熱することにより、凝固、好ましくは熱凝固される。これらの３つのパラメーターは、十分な官能品質を有する単離物を得るために不可欠である。最良の結果は、１〜５体積の水を用いて約９０℃で且つｐＨ４．５で加熱することにより得られる。

第２の好ましい実施形態では、工程（ｂ）での種子の製粉は酸素の不在下で行われる。酸素の不在とは、３００μｇ／ｌ未満、好ましくは２００μｇ／ｌ未満の酸素の残留含有量として理解されなければならない。残留酸素含有量は、酸素メーターなどの当技術分野で公知の通常の装置を用いて、好ましくは１５℃で測定される。好ましい方法は乾式製粉であるが、湿式製粉も使用可能である。乾式製粉では、酸素は、チューナブルダイオードレーザーガスアナライザー（ＴＤＬ、Ｍｅｔｔｌｏ Ｔｏｌｅｄｏ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）により分析可能であり、一方、湿式製粉では、酸素は、溶存酸素アナライザー（Ｍ４００、Ｍｅｔｔｌｏ Ｔｏｌｅｄｏ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を用いて分析可能である。製粉工程時の酸素の不在と工程（ｄ）の高温酸洗浄との組合せは、相乗効果を生成するように思われ、高品質レベルのマメ科エンドウタンパク質単離物、好ましくはエンドウタンパク質単離物をもたらす。低酸素での製粉単独では、本発明の結果とは異なり、良好な官能品質のタンパク質は得られない。かかる低残留酸素含有量は、当業界で周知のプロセスにより、たとえば、種子が製粉されるベッセル中で窒素をパージすることにより、得ることが可能である。より好ましい実施形態では、工程（ｃ）及び（ｄ）もまた、酸素の不在下で、好ましくは３００μｇ／ｌ未満、好ましくは２００μｇ／ｌ未満の酸素の残留含有量で行われる。プロセス装置のヘッドスペースの窒素と溶存酸素なしの水との使用は、かかる実施形態を確保する通常の方法である。

以上に記載の工程（ｄ）の両方の実施形態では、得られたタンパク質の任意選択的ホモジナイゼーションは、所要により、溶解性を上昇させるために剪断ポンプを用いて行うことが可能である。パスツール殺菌のような通常の公知のプロセス又は食品グレード補助化合物の導入もまた、プロセスに追加可能である。最後に、得られたタンパク質は、スプレー乾燥機などの通常の技術を用いて乾燥可能である。

本発明は、下記の実施例及び図面を参照すれば、よりよく理解されるであろう。これらの実施例は、本発明の具体的実施形態を代表することが意図され、本発明の範囲を限定することは意図されない。

実施例１：溶媒精製を含む先行技術のプロセス＃１
この実施例では、官能観点で参照タンパク質を明らかにする。それは、産業観点（爆発の危険性、クリーンラベル…）から回避されなければならない溶媒を使用する。

清浄化及び皮除去された乾燥黄エンドウを２０℃で粉砕し、次いで、４℃でエンドウ粉を１：５（ｗ／ｖ）の比でヘキサン−エタノール共沸混合物（８２：１８、ｖ／ｖ）中に懸濁して脂質を抽出した。ロースピードでスラリーを１．０ｈ撹拌し、次いで、真空濾過した。濾過ケークを２０メッシュのシフターに通した。手順を５回繰り返した。脱脂されたエンドウ粉を２０℃で１．０時間にわたり１：５（ｗ／ｖ）の粉溶媒比で９５％（ｖ／ｖ）エタノール中に浸漬した。真空濾過後、６０℃で真空ロータリーエバポレーションによりケークから残留溶媒を除去した。脱脂されたエンドウ粉を１：９（ｗ／ｖ）の粉対水の比で蒸溜水中に懸濁し、２ｍｏｌ Ｌ^−１ ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に調整した。２０℃で１．０ｈ撹拌した後、懸濁液を３，０００ｇで１５ｍｉｎ遠心分離して上澄み（タンパク質画分）を回収した。直接スチーム注入によりタンパク質抽出溶液を１２５〜１３０℃で３０秒間加熱して内因性酵素を不活性化し、プレート熱変換器を用いて５０℃に冷却し、次いで２ｍｏｌ Ｌ^−１ ＨＣｌを用いてｐＨを４．５に調整することにより沈殿させ、３，０００ｇで１５分間遠心分離した。２０℃で１．０ｈにわたり１：５（ｗ／ｖ）の比でタンパク質カードを８５％（ｖ／ｖ）エタノール中に３回浸漬した。真空濾過後、６０℃で真空ロータリーエバポレーションによりケークから残留溶媒を除去した。次いで、アルコール洗浄されたタンパク質粉を１：９（ｗ／ｖ）の粉対水の比で蒸溜水中に再懸濁し、２ｍｏｌ Ｌ^−１ ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に中和した。タンパク質溶液をフリーズドライして異風味をなんら有していないエンドウタンパク質単離物を得た。サンプル「先行技術のプロセス＃１−溶媒」を得た。

実施例２：先行技術のプロセス＃２（浸漬、湿式製粉、及び等電点沈殿を含む）
室温で１０時間にわたり１：５（ｗ／ｖ）の比のエンドウ対水で乾燥黄エンドウを蒸溜水にブレンドした。皮除去及び浸漬されたエンドウを１：４（ｗ／ｖ）の比の湿潤エンドウ対水で酸素の存在下で粉砕した。スクリュー押出し機により分離した後、デンプン及び内部ファイバーを除去するために水抽出物を３，０００ｇで１５分間遠心分離してタンパク質溶液が得られようにした。内因性酵素を不活性化するために直接スチーム注入によりタンパク質溶液を１２５〜１３０℃で３０秒間加熱し、次いでプレート熱変換器を用いて５０℃に冷却し、次いで２ｍｏｌ Ｌ^−１ＨＣｌを用いてｐＨを４．５に調整することにより沈殿させ、３，０００ｇで１５分間遠心分離した。１０％〜１２％の範囲内の固形分含有率が得られるように１：１（ｗ／ｖ）の比のカード対水でタンパク質カードを蒸溜水中に再懸濁し、２ｍｏｌ Ｌ^−１ＮａＯＨを用いて７．０のｐＨに中和した。プロセスのこれらの工程に続いて、高圧ホモジナイゼーション（２０ＭＰａ）、加熱処理（１２０℃、３０ｓ）、フラッシュ蒸発、及びスプレードライング（１８０℃、８０℃）を行う。サンプル「先行技術のプロセス＃２」を得た。

実施例３：本発明のプロセス＃１（抽出されたタンパク質の高温酸洗浄を含む）
室温で１：５（ｗ／ｖ）の比のエンドウ対水で乾燥黄エンドウを蒸溜水にブレンドした。次いで、酸素の存在下８．５〜９．０のｐＨでエンドウを粉砕した。スクリュー押出し機により分離した後、不溶性物質（主にデンプン及び内部ファイバー）を除去するために溶液を３，０００ｇで１５分間遠心分離し、生のタンパク質溶液を得た。次いで、２Ｍ ＨＣｌを用いて生のタンパク質溶液を７．０〜７．５のｐＨに調整し、内因性酵素を不活性化するために直接スチーム注入により１２５〜１３０℃に３０秒間加熱し、次いで、プレート熱変換器を用いて５０℃に冷却した。次いで、２ｍｏｌ Ｌ^−１ ＨＣｌを用いてｐＨを４．５に調整することによりタンパク質を沈殿させ、３，０００ｇで１５ｍｉｎ遠心分離した。遠心分離によりタンパク質カードを単離し、４．５のｐＨに調整された２重量部の９０℃蒸溜水で浸漬した。

緩やかな撹拌下の３０分間の接触時間の後、水からタンパク質を分離するためにタンパク質溶液をプレート濾過器にポンプ注入し、１０％〜１２％の範囲内の固形分含有率及び２．０Ｍ ＮａＯＨを用いて調整された７．０のｐＨが得られるように得られたタンパク
質カードを蒸溜水中に懸濁した。次いで、１２５〜１３０℃に３０秒間再加熱し、スプレー乾燥した（１８０℃、８０℃）。サンプル「本発明のプロセス＃１−ＨＴＡＷ単独 酸素あり」を得た。

高温と酸性ｐＨ洗浄との間の相乗効果を明らかにするために、本発明のプロセス＃１はまた、わずかな修正：
− 酸洗浄ｐＨ（４．５）で低温洗浄（５０℃）
− 高ｐＨ（７．０）及び酸性洗浄ｐＨ（４．５）で高温
− 中性洗浄ｐＨ（７）で低温洗浄（５０℃）
を行って３回再生された。

実施例３の結果を比較すれば、これはいかに革新的タンパク質単離物が両方のパラメーターの組合せを用いたときのみ達成可能であるかを説明するのに役立つ。

実施例４：本発明のプロセス＃２（高温酸洗浄と低酸素製粉とを含む）
室温で１：５（ｗ／ｖ）の比のエンドウ対水で乾燥黄エンドウを蒸溜水にブレンドした。次いで、１：４（ｗ／ｖ）の比でエンドウを２００μｇ／ｌ未満の酸素フリー水中で粉砕し、次いで、スクリュー押出し機で分離した。窒素雰囲気下で１時間間放置した後、不溶性物質（主にデンプン及び内部ファイバー）を除去するためにタンパク質溶液を３，０００ｇで１５分間遠心分離し、生のタンパク質溶液を得た。依然として窒素雰囲気下で生のタンパク質溶液を７．０〜７．５のｐＨに調整し、次いで、直接スチーム注入により１２５〜１３０℃に３０秒間加熱し、最後にプレート熱変換器を用いて３０〜４０℃に冷却した。次いで、２ｍｏｌ Ｌ^−１ ＨＣｌを用いて４．５のｐＨに調整することによりタンパク質を沈殿させ、３，０００ｇで１５分間遠心分離した。

遠心分離によりタンパク質カードを単離し、４．５のｐＨに調整された２重量部の９０℃蒸溜水で浸漬した。緩やかな撹拌下の３０分間の接触時間の後、水からタンパク質を分離するためにタンパク質溶液をプレート濾過器にポンプ注入した。４．５のｐＨの９０℃水を用いてこの工程を２回繰り返した後、水からタンパク質を分離するためにタンパク質溶液をプレート濾過器にポンプ注入し、１０％〜１２％の範囲内の固形分含有率及び２．０Ｍ ＮａＯＨを用いて調整された７．０のｐＨが得られるように得られたタンパク質カードを蒸溜水中に懸濁した。これに続いて、１２５〜１３０℃に３０ｓ再加熱し、スプレー乾燥した（１８０℃、８０℃）。サンプル「本発明のプロセス＃２−ＨＴＡＷと低酸素製粉との組合せ」を得た。

酸素フリー製粉と高温且つ酸性ｐＨ洗浄との相乗効果を示すために、本発明のプロセス＃２はまた、高温且つ酸性ｐＨ洗浄なしで再生された。

実施例５：官能試験プロセス
サンプル調製：室温（約２３℃）で脱イオン水中に溶解された４％タンパク質粉末
パネリスト：１０名の熟練者

官能試験は、３つの記述子：マメ臭い、苦い、及び渋いに基づく。各記述子に対するスケールは１〜１０であり、１０が最良のスコア及び１が最悪のスコアである。最終官能スコアは、すべてのパネリスト及び３つすべてのカテゴリーの合計の平均がとられる。

実施例６：先行技術のタンパク質単離物と実施例１〜４で生成された本発明のタンパク質単離物との比較
以下の表１は、実施例１〜４で生成されたすべてのタンパク質単離物を比較する。参照の市販のタンパク質単離物もまた、比較に含まれる。

結果は以下のことを明確に示す。
・ 予測通り、溶媒参照プロセスを介してより良好なサンプルが得られた。
・ 高温酸洗浄を含むプロセスのみが、７超の官能スコア及び合計で１０μｇ／ｇ未満の揮発性化合物を有する単離物をもたらす。つまり、溶媒参照プロセスに最も近い数値を有する。
・ 高温酸洗浄と酸素フリー粉砕との組合せは、さらにより良好な品質をもたらす。つまり、揮発性化合物の合計が５μｇ／ｇ未満である。酸素フリー粉砕単独の使用は、中程度の品質の製品を生成する。

結論として、本発明のプロセスは、これまで達成されてこなかったタンパク質品質レベルをもたらすことが、図４により明確に示される。その官能スコア及び揮発分含有量は、市販のタンパク質よりも溶媒参照に近い。使用された他の溶媒は、産業観点からそれほど興味深くない。

実施例７：先行技術の単離物と本発明の単離物との間の水への溶解性の比較
溶解性は、下記のプロトコルに従って測定されるであろう。
・ ２．０ｇのサンプル及び１００ｇの蒸溜水を２０℃で４００ｍＬビーカーに配置する。
・ １Ｎ ＨＣｌ及び／又は１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを６又は７に調整し、混合物に蒸溜水を厳密に２００．０ｇまで加える。
・ この混合物を３０分間撹拌し、次いで、３０００×ｇで１５分間遠心分離する。
・ 遠心分離後、厳密に２５．０ｇの上澄みを結晶皿（ｍ１）に抜き取る。
一定質量（ｍ２）に達するまで、皿を１０３℃のオーブン内に配置する。
・ 溶解性＝（（ｍ２−ｍ１）／２５）×１００、溶液１００ｇ当たりの乾物のｇ数で表現される。

比較できるように、以下に記載のＯＰＡ法を用いてすべてのタンパク質サンプルの加水分解度を測定する。

原理：
サンプルの遊離アミノ酸の「アミノ窒素」基は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及びｏ−フタリルジアルデヒド（ＯＰＡ）と反応してイソインドール誘導体を形成する。

この反応時に形成されるイソインドール誘導体の量は、遊離アミノ窒素の量と化学量論的である。３４０ｎｍの吸光度の増加により測定されるのは、イソインドール誘導体である。

手順：
分析されるサンプルの正確に秤量された試験サンプルＰ＊を１００ｍｌビーカーに導入する（この試験サンプルは、サンプルのアミノ窒素含有量の関数としての０．５〜５．０ｇであろう）。

約５０ｍｌの蒸溜水を添加し、ホモジナイズし、そして１００ｍｌメスシリンダーに移し、５ｍｌの２０％ＳＤＳを添加し、蒸溜水でその体積まで満たし、１０００ｒｐｍでマグネチックスターラーで１５分間撹拌する。

３ｍｌの蒸溜水中にＭｅｇａｚｙｍｅキットのフラスコ１の１錠剤を溶解し、十分に溶解するまで撹拌する。１試験当たり１錠を提供する。

この溶液Ｎｏ．１は用時に調製されるべきである。

反応は、分光測光器のキュベット中で直接行われる。
ｏ ブランク：
３．００ｍｌの溶液Ｎｏ．１と５０μｌの蒸溜水とを導入する。
ｏ 標準：
３．００ｍｌの溶液Ｎｏ．１とＭｅｇａｚｙｍｅキットのフラスコ３の５０μｌを導入する。
ｏ サンプル：
３．００ｍｌの溶液Ｎｏ．１と５０μｌのサンプル調製物を導入する。

キュベットを混合し、約２分後、３４０ｎｍで分光測光器により溶液の吸光度測定値（Ａ１）を読み取る（１．０ｃｍ光路を有するキュベットを備えた分光測光器であり、３４０ｎｍの波長で測定可能であり、それに関連する製造業者の技術マニュアルに記載の手順に従って検証される）。

ＭｅｇａｚｙｍｅキットのＯＰＡ溶液フラスコ２の１００μｌを分光測光器キュベットに添加することにより反応をただちに開始する。

キュベットを混合し、暗所に約２０分間配置する。

次いで、３４０ｎｍで分光測光器によりブランク、標準、及びサンプルの吸光度測定値を読み取る。

計算方法：
生成物自体の質量パーセントとして表される遊離アミノ窒素の含有量は、下記の式：

（式中、
ΔＡ＝Ａ２−Ａ１
Ｖ＝フラスコの体積
ｍ＝ｇ単位の試験サンプルの質量
６８０３＝３４０ｎｍでのイソインドール誘導体の吸光係数（Ｌ・ｍｏｌ^−１・ｃｍ^−１単位）。
１４．０１＝窒素のモル質量（ｇ・ｍｏｌ^−１単位）
３．１５＝キュベット中の最終体積（ｍｌ単位）
０．０５＝キュベット中の試験サンプル（ｍｌ単位））
により与えられる。

加水分解度（ＤＨ）は、式：

（式中、タンパク質窒素は、規格ＩＳＯ１６６３４に準拠したＤＵＭＡＳ法に従って決定される）
により与えられる。

以下の表は、本発明のプロセスの単離物さらには先行技術の単離物に対するすべてのこれらの分析をまとめたものである。

以上の表の提示から、本発明のプロセスサンプル＃１及び＃２は、ｐＨ６で３０％超、好ましくは４０％超、より好ましくは約５０％の溶解性及びｐＨ７で４０％超、好ましくは６０％超、より好ましくは７０％超の溶解性を有する唯一のサンプルであることは明らかである。

この差は、同一範囲内にある加水分解度により説明できないが、我々の本発明のプロセスは、本発明の単離物の機能性に影響も及ぼし、とりわけｐＨ６及び７でのその溶解性を上昇させる。

Claims (11)

1. 乾物１グラム当たり総和で１０μｇ未満、好ましくは５μｇ未満の、ヘキサナールと、２−ペンチル−フランと、（Ｅ）−２，４−ヘプタジエナールと、１−オクテン−３−オールと、を含有する植物タンパク質単離物。
2. 前記タンパク質単離物が、マメ科植物から、好ましくはエンドウ又はソラマメから、より好ましくはエンドウから得られる、請求項１に記載の植物タンパク質単離物。
3. 乾物１グラム当たり合計で５ｍｇ未満のサポニンを含有する、請求項１又は２に記載の植物タンパク質単離物。
4. 下記工程：
   （ａ）タンパク質を含有する種子、好ましくはマメ科種子、より好ましくはエンドウ種子を提供する工程と、
   （ｂ）前記種子を製粉する工程と、
   （ｃ）前記製粉された種子を水中に懸濁する工程と、
   （ｄ）前記製粉された懸濁液からタンパク質を抽出する工程と、
   （ｅ）６０℃〜１００℃、好ましくは７５℃〜９５℃の温度且つ４〜５．５、好ましくは４．５〜５の範囲内のｐＨで、前記抽出されたタンパク質を水で洗浄する工程と、
   （ｆ）任意選択的に、工程（ｅ）の終了時に得られた前記洗浄されたタンパク質を剪断ポンプ又はホモジナイザーに通してタンパク質の機能性を改善する工程と、
   （ｇ）任意選択的に、工程（ｅ）又は（ｆ）で得られた前記タンパク質を乾燥する工程と、
   からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物タンパク質単離物を抽出する方法。
5. 工程（ｅ）で前記タンパク質を洗浄するのに必要とされる水の体積が、タンパク質懸濁液の量の１〜５倍であるが、好ましくは３倍未満である、請求項４に記載の方法。
6. 工程（ｂ）の製粉が酸素の不在下で行われる、請求項４又は５に記載の方法。
7. 工程（ｂ）の製粉が、３００μｇ／ｌ未満、より好ましくは２００μｇ／ｌ未満の二酸素の残留濃度で行われる、請求項４又は５に記載の方法。
8. 工程（ｅ）のｐＨが、とくに塩酸、クエン酸、又は硫酸を含む食品グレードの酸を用いて調整される、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 工程（ｅ）又は（ｆ）の終了時に得られた前記洗浄されたタンパク質が、スプレー乾燥機、好ましくはマルチステージスプレー乾燥機を用いて乾燥される、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 工程（ｂ）の製粉が湿式製粉工程である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 工程（ｂ）の製粉が乾式製粉工程である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。

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