KR101209541B1 - Ｃｄ20-결합 폴리펩티드 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD20 항원, 특히 인간 CD20 항원에 결합하는 폴리펩티드 조성물에 관한 것이다. 본 폴리펩티드 조성물은 공지된 항-CD20 항체, 예컨대 2B8 또는 Leu16 의 생물 활성을 가지나, 비-개질된 분자와 비교하여 감소된 면역원성을 나타낸다. 본 폴리펩티드 조성물은 키메라성 항체, 항체 단편, 및 항체 또는 항체 단편과 사이토카인의 융합 단백질을 포함한다.

Description

ＣＤ20-결합 폴리펩티드 조성물 {CD20-BINDING POLYPEPTIDE COMPOSITIONS}

본 발명은 CD20 항원에 결합하는 폴리펩티드 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 인간 CD20 항원에 결합하는 폴리펩티드 조성물 및 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드 조성물은 키메라성 항체, 항체 단편, 및 항체 또는 항체 단편과 사이토카인의 융합 단백질을 포함한다.

치료 단백질의 효과가 치료 단백질에 대한 원하지 않는 면역 반응에 의해 제한되는 많은 예가 있다. 여러 마우스 단일클론 항체가 다수의 인간 질병 상황에서 치료제로서 가망성을 나타내었지만, 특정 경우에서 인간 항-쥐과 항체 (HAMA) 반응을 유의한 정도로 유도하기 때문에 실패하였다 (Schroff, R.W. 등. (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D.L. 등. (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535). 단일클론 항체에 관해서, HAMA 반응을 감소시키기 위해 다수의 기술이 개발되어 왔다 (WOA8909622; EPA0239400; EPA0438310; WOA9106667; EPA0699755). 상기 재조합 DNA 접근법은 일반적으로 최종 항체 구조물 내의 마우스 유전 정보를 감소시키면서 최종 구조물 내의 인간 유전 정보를 증가시켜, 일반적으로 "인간화" 항체라고 불리는 항체 분자를 야기한다.

인간화 항체는, 대체로, 수용자의 과가변 영역 잔기가 마우스, 래트, 토끼 또는 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체) 으로부터의 과가변 영역 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체) 이고, 상기 과정은 종종 "CDR 이식" 이라고 불린다. 일반적으로 인간 면역글로불린의 부가적인 Fv 골격 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체되고, 일부 사례에서, 항체 기능을 추가로 복구하기 위해 다른 치환이 이뤄진다. 전형적으로 인간화 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 과가변 루프 (loop) 가 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 서열의 것인, 2 개의 가변 도메인을 포함하는 전체 항체 분자 내로 재건된다. 인간화 항체는 또한 일반적으로 적어도 일부의 인간 유도된 면역글로불린 불변 영역 (Fc) 을 포함할 것이다 (Jones 등. (1986), Nature 321: 522-525; Reichmann 등. (1988), Nature 332: 323-329). 그럼에도 불구하고, 인간화 항체는 여러 경우에서, 여전히 환자에서 면역 반응을 유도해낸다 (Issacs J.D. (1990) Sem . Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. 등. (1999) Transplantation 68: 1417-1420).

면역 반응의 유도에 대한 열쇠는 소위 "T-세포 에피토프 (epitope)" 로 불리는, MHC 부류 Ⅱ 분자 상에 제시함으로써, T-세포의 활성을 자극할 수 있는 펩티드의 단백질 내에 존재한다. 이러한 T-세포 에피토프는 통상적으로 MHC 부류 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 함축적으로, "T-세포 에피토프" 는 MHC 분자에 결합될 경우, T-세포 수용체 (TCR) 에 의해 인지될 수 있고, 적어도 원리상으로는, TCR 을 끌어들임으로써 상기 T-세포의 활성을 야기하여 T-세포 반응을 촉진할 수 있는 에피토프를 의미한다.

MHC 부류 Ⅱ 분자는 보조 T-세포 선택 및 활성화에 있어서 핵심적인 역할을 하는 고도로 다형성인 단백질의 군이다. 인간 백혈구 항원 군 DR (HLA-DR) 은 상기 군의 단백질의 두드러진 동종형 (isotype) 이고, 동종형 HLA-DQ 및 HLA-DP 는 유사한 작용을 수행한다. 인간 개체에서, 개개인은 2 개 내지 4 개의 DR 대립유전자, 2 개의 DQ 및 2 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 다수의 DR 분자의 구조는 밝혀졌으며, 이들은 펩티드의 소수성 잔기 (포켓 (pocket) 잔기) 를 이끌어내는 다수의 소수성 포켓을 갖는 열린-말단 펩티드 결합 홈 (groove) 과 같이 나타난다 (Brown 등. Nature (1993) 364: 33; Stern 등. (1994) Nature 368: 215). 부류 Ⅱ 분자의 상이한 알로타입 (allotype) 을 나타내는 다형성은, 펩티드 결합 홈 내에서 펩티드에 대한 상이한 결합 표면의 넓은 다양성에 기여하고, 개체 수준에서 외부 단백질을 인지하고 병원성 유기체에 대한 면역 반응을 고정시키는 능력과 관련하여 최대 유연성을 확실히 한다.

치료 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 부류 Ⅱ 펩티드 제시 경로를 통해 진행된다. 여기서 외생 단백질이 포획되고, DR, DQ 또는 DP 유형의 MHC 부류 Ⅱ 분자와 연합하여 제시되도록 처리된다. MHC 부류 Ⅱ 분자는 그 중에서도 대식세포 및 수지상 세포와 같은 전문 항원 제시 세포 (APC) 에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 특정 기타 공-수용체의 교차-결합과 함께, T-세포의 표면상의 동일기원 (cognate) T-세포 수용체에 의한 MHC 부류 Ⅱ 펩티드 복합체의 관여는, T-세포 내에서 활성화된 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 B 세포와 같은 다른 림프구를 추가로 활성화시켜 사이토카인의 분비를 초래해, 항체를 생성하거나, 또는 완전 한 세포 면역 반응으로서 T 살해 세포를 활성화한다.

T-세포 에피토프 동정은 에피토프 제거를 위한 첫번째 단계이다. 동정된 에피토프는 적절한 아미노산 치환 또는 기타 변형 전략에 의해서 제거될 수 있다. 이러한 접근법은 WO98/52976 및 WO00/34317 에서 인지되며, 여기 후자의 경우에서 인간 MHC 부류 Ⅱ DR 알로타입의 서브셋 (sub-set) 에 결합하는 잠재력을 갖는 폴리펩티드 서열을 동정하기 위한 수단으로 전산 누비기 (computational threading) 기술을 기재하고, 예정된 T-세포 에피토프는 유익한 단백질 내의 아미노산 치환에 의해 제거된다.

제공된, 원칙적으로는 치료적으로 유용한, 그러나 본래는 면역원성인 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 T-세포 에피토프를 동정 및 제거, 또는 적어도 감소시키는 것이 바람직할 것이다. 상기 치료적으로 유용한 분자 중 하나는 인간 B-세포 항원 CD20 에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 본 발명의 바람직한 단일클론 항체는 항체 2B8 및 Leu16 으로부터 개질된 형태이다. 항체 2B8 은 그 명세가 본원에 참고로서 인용되는 미국 특허 번호 제 5,736,137 호에 기재되어 있다. 항체 Leu16 은 그 명세가 본원에 참고로서 인용되는 [Wu 등. Protein Engineering (2001) 14: 1025-1033] 에 기재되어 있다.

CD20 은, 전형적으로 인간 B 림프구 제한된 분화 항원 Bp35B 로 지정된 35,000 달톤의 비-글리코실화 인단백질이다. 상기 단백질은 90% 초과의 B-세포 비-호지킨스 림프종 (non-Hodgkin's lymphomas; NHL) 을 포함하는 예비-B 및 성숙 B-세포 상에서 발현되는 고도로 세포 특이성인 표면 분자이다. 단일클론 항체 및 방사성면역컨쥬게이트 표적 CD20 은 NHL 에 대한 신규 치료제로서 알려져 있다. 가장 확실한 예는 본 발명의 모 항체, 즉 단일클론 항체 2B8 을 포함한다 (Reff, M.E. 등. (1994) Blood 83: 435-445). 2B8 의 가변 영역 도메인은 클로닝되고, 인간 불변 영역 도메인과 조합되어, USA 에서 RITUXAN™ 또는 유럽에서 MABTHERA^® (리툭시마브 (rituximab)) 로 시판되는 C2B8 이라는 키메라성 항체를 생성한다. C2B8 은 NHL 및 기타 B-세포 질병의 치료를 위한 유용한 치료제로서 인지된다 (Maloney, D.G. 등. (1997) J. Clin. Oncol. 15: 3266-3274; Maloney, D.G. 등. (1997) Blood 90: 2188-2195).

항-CD20 치료법의 부가적인 예는 미국 특허 번호 제 6,090,365 호에 기재되어 있는 항체 B1 에 의해 제공된다. 상기 항체는, 상기 경우에서 분자 (BEXXAR™) 가 ¹³¹I 방사성면역컨쥬게이트임에도 불구하고, NHL 치료적으로 사용하기 위해 유사하게 등록되었다. 고유한 B1 (비-컨쥬게이트됨) 항체는 림프종 및 난치성 백혈병에 대한 자가 조직의 골수 이식 치료법을 위한 생체 외 (ex vivo) 정화 양생법에서 사용된다 (Freedman, A.S. 등. (1990), J Clin . Oncol . 8: 784).

C2B8 (리툭시마브) 및 BEXXAR™ 과 같은 항체의 성공에도 불구하고, 향상된 특성을 갖는 항-CD20 유사체에 대한 지속적인 요구가 있다. 인간 환자에 투여할 경우, 생체 내 특징을 향상시키기 위한 특별한 요구가 있다. 이와 관련해, 인간 환자에서 면역 반응을 유도하는 잠재력이 감소되거나 또는 부재된 항-CD20 항체를 제공하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 단백질은 인간 환자 내에서 증가 된 순환 시간을 나타낼 것이고, 항-CD20 분자를 치료적 용도로 사용하는 경우와 같은 장기간에 걸친 용도 분야에서 특히 유익할 것이다. 본 발명은 생체 내에서 향상된 특성을 나타내는 개질된 항-CD20 항체를 제공한다.

발명의 개요

본 발명은 CD20 항원, 바람직하게는 인간 CD20 항원에 결합하는 폴리펩티드 조성물을 제공한다. CD20 조성물은, 항-CD20 항체 2B8 의 중쇄 가변 영역 (Vh) 의 개질된 형태, 항-CD20 항체 2B8 의 경쇄 가변 영역 (Vk) 의 개질된 형태, 항-CD20 항체 Leu16 의 중쇄 가변 영역 (Vh) 의 개질된 형태 및 항-CD20 항체 Leu16 의 경쇄 가변 영역 (Vk) 의 개질된 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드일 수 있는, 항-CD20 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 분절을 하나 이상 포함한다. 개질된 Vh 및 Vk 폴리펩티드는, 2B8 및 Leu16 의 고유한 Vh 또는 Vk 영역과, 항체 Vh 및/또는 Vk 영역의 고유한 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기 치환에 의해 상이하다. Vh 또는 Vk 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기 치환은, 고유한 2B8 및 Leu16 항체의 Vh 또는 Vk 영역의 면역원성에 비해, 본 발명의 Cd-20 결합 조성물이 더 낮은 수준의 면역원성을 제공하도록 한다.

본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은, 서열 목록 번호: 1 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 폴리펩티드 (2B8 항체의 Vh) (그러나 이는 V₁₂K, A₁₄P, M₂₀V, I₄₈T, A₆₈T, Q₈₂E, T₈₇R, S₉₁T, 및 T₁₀₆W 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 1 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함함); 서열 목록 번호: 4 의 아미노 산 잔기 서열을 갖는 폴리펩티드 (2B8 항체의 Vk) (그러나 이는 L₁₁I, S₁₂T, S₂₇T, V₂₉A, G₄₀T, V₅₉S, S₆₉T, L₇₂M, R₇₆S, 및 V₇₇L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 4 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함함); 서열 목록 번호: 9 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 폴리펩티드 (Leu16 항체의 Vh) (그러나 이는 V₁₂K, M₂₀V, A₆₈T, Q₈₂E, T₈₇R, S₉₁T, D₉₃V, 및 A₁₁₄T 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 9 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함함); 및 서열 목록 번호: 11 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 폴리펩티드 (Leu16 항체의 Vk) (그러나 이는 L₁₁I, S₁₂T, A₅₉S, S₆₉T, L₇₂M, R₇₆S, 및 V₇₇L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 11 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함함) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드 분절을 포함한다.

본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 잔기 치환은 서열에서 고유한 아미노산 잔기에 대한 단일 문자 코드를 쓰고, 이어서 잔기의 위치 숫자 (아래 첨자됨) 를 쓰고, 이어서 고유한 아미노산을 대체하는 아미노산 잔기에 대한 단일 문자 코드를 열거함으로써 지명된다. 따라서 서열 목록 번호: 4 에 있는 치환 L₁₁I 는 서열 목록 번호: 4 에 있는 위치 11 (N-말단으로부터 번호를 매김) 에서의 류신 잔기 (L) 가 이소류신 (I) 으로 대체된 (즉, 치환된) 것을 의미한다.

바람직하게는 본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 단일클론 항체 2B8 또는 Leu16 의 인간 CD20 결합 친화성과 대략 동등하거나 또는 이보다 강한, 인간 CD20 항원에 대한 결합 친화성을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예는 하기와 같은 폴리펩티드 분절을 포함한다:

서열 목록 번호: 2 의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 여기에서 VhC 라고 불리는 중쇄:

QVQLQQPGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWTGAIYPG

NGDTSYNQKFKGKTTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYF

NVWGAGTTVTVSA;

서열 목록 번호: 3 의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 여기에서 VhD 라고 불리는 단일클론 항체 V-영역 중쇄:

QVQLQQPGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPG

NGDTSYNQKFKGKTTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYF

NVWGAGTTVTVSA;

및 서열 목록 번호: 10 의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 여기에서 VhY 라고 불리는 단일클론 항체 V-영역 중쇄:

EVQLQQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPG

NGDTSYNQKFKGKTTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSNYYGSSYWFF

DVWGTGTTVTVSS.

본 발명의 기타 바람직한 구현예는 하기와 같은 폴리펩티드 분절을 포함한다:

서열 목록 번호: 5 의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 여기에서 VkA 라고 불리는 단일클론 항체 V-영역 경쇄:

QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASTSASYIHWFQQKPTSSPKPWIYATSNLASGVP

SRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK;

서열 목록 번호: 6 의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 여기에서 VkB 라고 불리는 단일클론 항체 V-영역 경쇄:

QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASTSVSYIHWFQQKPTSSPKPWIYATSNLASGVP

SRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK;

서열 목록 번호: 7 의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 여기에서 VkC 라고 불리는 단일클론 항체 V-영역 경쇄:

QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASTSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGV

PSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK;

서열 목록 번호: 8 의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 여기에서 VkD 라고 불리는 단일클론 항체 V-영역 경쇄:

QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGV

PSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK;

및 서열 목록 번호: 12 의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 여기에서 VkZ 라고 불리는 단일클론 항체 V-영역 경쇄:

DIVLTQSPAIITASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASG

VPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK.

본 발명은 사람에서 CD20 양성 B-세포 질병의 치료를 위해 치료 잠재력을 갖는 폴리펩티드 조성물을 제공한다. 본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 손상되지 않은 항체, Fab 단편, 또는 전체 항체 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질, 항체 단편 및 사이토카인의 융합 단백질의 형태, 또는 CD20 항원에 결합하는 기타 임의의 다른 형태일 수 있다.

본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 바람직하게는 함께 CD20 항원에 결합하는, 중쇄 (Vh) 항-CD20 항체 가변 영역 및 경쇄 (Vk) 항-CD20 항체 가변 영역의 조합을 포함한다. Vh/Vk 조합은 손상되지 않은 항체, Fab 단편, 또는 전체 항체 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질, 항체 단편 및 사이토카인의 융합 단백질, 또는 CD20 항원에 결합하는 기타 임의의 다른 배열로 배열될 수 있다. 기타 바람직한 구현예에서, V 영역은 폴리펩티드 백본 (backbone) 을 통해 서로 부착된다.

바람직하게는, 본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 손상되지 않은 항체로 배열되는 Vh 및 Vk 폴리펩티드를 포함하며, 이는 경쇄 불변 영역, 및 중쇄 CH1, CH2, 및 CH3 도메인을 포함한다. 대안적으로는, Vh 및/또는 Vk 폴리펩티드는 Fab 단편 또는 CH3 도메인은 가지나, CH2 도메인은 결여된 "미니체 (minibody)" (예를 들어, Wu 등, US 5,837,821 참조) 내로 배열될 수 있다. 대안적으로는, Vh 및 Vk 폴리펩티드는 링커 (linker) 를 통해 서로 부착되어, "단일-쇄 Fv" 항체 분자를 형성할 수 있다. 한 세트의 바람직한 구현예에서, 인간 불변 영역은 CD-20-결합 Vh 및 Vk 폴리펩티드와 조합된다. 이러한 불변 영역은 IgA, IgD, IgM, IgE, 또는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4-유형 면역글로불린으로부터 유래된 것들을 포함한다. CH2 도메인이 CD20-결합 폴리펩티드 조성물에 포함될 경우, IgG1 CH2 도메인과 같은 인간 IgG 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 기타 바람직한 구현예는 IgG CH2 도메인에서 발견되는 N-연결된 올리고당 글리코실화 부위가 결여된다. N-연결된 글리코실화 부위의 부재는 바람직하게는 적절한 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌, 또는 인접한 아미노산의 돌연변이에 의해 공학설계되거나, 또는 PNGase F 와 같은 효소를 CH2-함유 단백질에 처리하여 올리고당을 제거하여 이루어진다.

Vh 및 Vk 영역의 바람직한 조합은, 중쇄 V-영역 VhC (서열 목록 번호: 2) 및 경쇄 VkA (서열 목록 번호: 5) 를 포함하는 폴리펩티드 조성물; 중쇄 V-영역 VhC (서열 목록 번호: 2) 및 경쇄 V-영역 VkB (서열 목록 번호: 6) 를 포함하는 폴리펩티드 조성물; 중쇄 V-영역 VhC (서열 목록 번호: 2) 및 경쇄 V-영역 VkC (서열 목록 번호: 7) 를 포함하는 폴리펩티드 조성물; 중쇄 V-영역 VhC (서열 목록 번호: 2) 및 경쇄 V-영역 VkD (서열 목록 번호: 8) 를 포함하는 폴리펩티드 조성물; 중쇄 V-영역 VhD (서열 목록 번호: 3) 및 경쇄 V-영역 VkB (서열 목록 번호: 6) 를 포함하는 폴리펩티드 조성물; 중쇄 V-영역 VhD (서열 목록 번호: 3) 및 경쇄 V-영역 VkD (서열 목록 번호: 8) 를 포함하는 폴리펩티드 조성물; 및 중쇄 V-영역 VhY (서열 목록 번호: 10) 및 경쇄 V-영역 VkZ (서열 목록 번호: 12) 를 포함하는 폴리펩티드 조성물을 포함한다.

본 발명의 하나의 바람직한 폴리펩티드 조성물은, V₁₂K, A₁₄P, M₂₀V, I₄₈T, A₆₈T, Q₈₂E, T₈₇R, S₉₁T 및 T₁₀₆W 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 1 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 항체 2B8 의 V-영역 중쇄 (서열 목록 번호: 1) 를 포함한다.

또 다른 바람직한 폴리펩티드 조성물은 L₁₁I, S₁₂T, S₂₇T, V₂₉A, G₄₀T, V₅₉S, S₆₉T, L₇₂M, R₇₆S 및 V₇₇L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 4 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 함유하도록 개질된 항체 2B8 의 V-영역 경쇄 (서열 목록 번호: 4) 를 포함한다. 도 16 은 바람직한 아미노산 잔기 치환의 위치를 볼드체 유형으로 예증한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 V₁₂K, M₂₀V, A₆₈T, Q₈₂E, T₈₇R, S₉₁T, D₉₃V 및 A₁₁₄T 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 9 에서 하나 이상의 치환을 함유하도록 개질된 항체 Leu16 의 V-영역 중쇄 (Vh) (서열 목록 번호: 9) 를 포함한다.

본 발명의 더욱 또 다른 바람직한 폴리펩티드 조성물은 L₁₁I, S₁₂T, A₅₉S, S₆₉T, L₇₂M, R₇₆S 및 V₇₇L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 11 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 함유하도록 개질된 항체 Leu16 의 V-영역 경쇄 (Vk) (서열 목록 번호: 11) 를 포함한다. 도 16 은 바람직한 아미노산 잔기 치환의 위치를 볼드체 유형으로 예증한다.

본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 또한 SGAELKKPGAS (서열 목록 번호: 15), VSCKASGYT (서열 목록 번호: 16), LEWTGAIY (서열 목록 번호: 17), YNQKFKGKT (서열 목록 번호: 18), FKGKTTLTA (서열 목록 번호: 19), YMELSSLRS (서열 목록 번호: 20), SSLRSEDTAV (서열 목록 번호: 21), 및 DWGTGTTVT (서열 목록 번호: 22) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 분절을 포함하는 하나 이상의 항-CD20 항체 중쇄 V 영역을 갖는 조성물을 포함한다.

유사하게는, 본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 또한 IITASPGEKV (서열 목록 번호: 23), CRASTSASY (서열 목록 번호: 24), QQKPTSSP (서열 목록 번호: 25), LASGVPSRF (서열 목록 번호: 26), FSGSGSGTT (서열 목록 번호: 27), 및 YSMTISSLE (서열 목록 번호: 28) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 분절을 포함하는 하나 이상의 항-CD20 항체 경쇄 V 영역을 갖는 조성물을 포함한다.

V 영역 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어, 손상되지 않은 항체, 항체 단편, 항체와 사이토카인의 융합 단백질, 항체 단편-사이토카인 융합 단백질, Fab 분자, 단일-쇄 Fv 분자, 및 미니체로 배열될 수 있다. 바람직하게는, CD20-결합 조성물은 손상되지 않은 항체, 더욱 바람직하게는 인간 불변 영역과 IgG 중쇄 불변 영역 동종형을 갖는 항체, 가장 바람직하게는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 항체-의존성, 세포-매개 세포 독성과 같은 손상되지 않은 효과기 작용을 갖는 것으로 배열된다.

또 다른 바람직한 구현예에서 CD20-결합 조성물은 항체-사이토카인 융합 단백질, 바람직하게는 인간 불변 영역과 동종형 IgG1 을 포함하고, 항체-의존성, 세 포-매개 세포 독성과 같은 손상되지 않은 효과기 작용을 갖는 것으로 배열된다. 이러한 바람직한 항체-사이토카인 융합 단백질에서, 인터루킨-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 및 IL-18 과 같은 인터루킨, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 와 같은 조혈 인자, 에리트로포이에틴 (erythropoietin), TNF알파와 같은 종양 괴사 인자 (TNF), 림포톡신 (lymphotoxin) 과 같은 림포카인 (lymphokine), 렙틴 (leptin) 과 같은 대사 과정 조절자, 인터페론 알파, 인터페론 베타 및 인터페론 감마와 같은 인터페론, 또는 케모카인 (chemokine) 을 포함하는 것이 유용하다. 바람직하게는, 본 발명의 항체-사이토카인 융합 단백질은 사이토카인 생물 활성 (예를 들어, T-세포 또는 B-세포와 같은 면역 세포의 자극) 을 나타낸다.

본 발명의 폴리펩티드 조성물은, 인간 B-세포에 결합하는 능력; CD20 항원에 결합하는 능력; 항체 Leu16, 2B8, 또는 1H4 에 관한 감소된 면역 반응 능력; 및 백혈병, 림프종, 류머티스성 관절염 및 기타 자가면역 질병과 같은 B 세포 증식 장애에 대항하는 활성을 포함하는, 다수의 유용한 생물 특성을 갖는다. 본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물에 대한 진단상 용도를 또한 심사숙고하며, 여기서, 이 조성물은 전장 항체, 항체 단편 (예를 들면. F(ab')₂), 방사성표지된 항체, 고정화 항체, 또는 이종기원 화합물과 공액된 항체가 될 수 있다. 이러한 진단 방법은 CD20-제시 세포의 존재를 검출하기 위해, CD20-제시 세포 등을 정제 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 본원에 정의된 바와 같은 CD20-결합 조성물을 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 약제학 조성물뿐 아니라, 폴리펩티드 조성물의 제조 방법을 제공한다.

도 1 은 단일 문자 코드로, 2B8 항체의 V-영역 중쇄 단백질의 고유한 아미노산 잔기 서열 및 고유한 서열에 기초한 개질된 아미노산 잔기 서열 VhC 및 VhD 를 나타낸다.

도 2 는 단일 문자 코드로, 2B8 항체의 V-영역 경쇄 단백질의 고유한 아미노산 잔기 서열 및 고유한 서열에 기초한 개질된 서열 VkA, VkB, VkC 및 VkD 를 나타낸다.

도 3 은 단일 문자 코드로, Leu16Vh 및 VhY 로 지정된 개질된 Leu16Vh 영역의 중쇄 가변 영역의 아미노산 잔기 서열을 나타낸다.

도 4 는 단일 문자 코드로, Leu16Vk 및 VhZ 로 지정된 개질된 Leu16Vk 의 경쇄 가변 영역의 아미노산 잔기 서열을 나타낸다.

도 5 는 실시예 3 에서 기술된 항체-의존성 세포의 세포 독성 (ADCC) 용해 어세이 (assay) 의 도식이다; 시험된 단백질은 키메라성 Leu16 항체 (chLeu16; 채워진 삼각형), chLeu16 및 IL2 의 융합 단백질 (chLeu16-IL2; 채워진 사각형), LeuVhY/VkZ-IL2 융합 단백질 (채워진 사각형), 키메라성 2B8 항체 (C2B8, 채워진 원), C2B8-IL2 융합 단백질 (열린 사각형), 및 CD20 에 표적하지 않는 KS-IL2 면역사이토카인 융합 단백질 (열린 원) 이었다. X-축: 농도 (ng/ml); y-축: 용해 %.

도 6 은 CD20-결합 폴리펩티드 조성물 및 면역사이토카인 (IC) 의 항-CD20 결합 활성을 예증한다. 인간 Daudi 림프종 세포를 폴리펩티드 조성물 및 IC 의 농도를 다양하게 하면서 인큐베이션시키고, 세포에 대한 상대적인 결합을 실시예 2 에서 기술되는 바와 같은 유세포 분석기로 평가하였다. 도 6A 는 폴리펩티드 농도 (X 축) 의 함수로서 증가하는 평균 형광 세기 (MFI, Y 축) 를 나타낸다. 도 6B 는 1차 항체가 존재하지 않는 (최좌측 피크); Daudi 세포 상에서 발현되지 않는 EGF 수용체에 대항하는 항체-IL2 융합체가 있는 (좌측-중앙 피크); 및 Leu16VhY/VkZ-IL2 (최우측 피크) 가 있는, Daudi 세포 샘플상에서 측정된 형광 세기를 나타낸다. X-축: 10 ㎍/ml 에서 형광 세기; Y-축: 사건의 수 (number of event).

도 7 은 항체-의존성 세포-매개된 및 보체-의존성 세포 독성을 예증한다. 도 7A 및 7B 는 도 5 와 비교해서 독립된 ADCC 시험을 나타낸다. 효과기로서 ⁵¹Cr-표지된 Daudi 표적 세포 및 인간 PBMC 를 사용하여 4-시간 어세이에서 ADCC 를 측정하였다 (E:T=100). 도 7A. 시험된 항체는 2B8 (채워진 원), chLeu16 (채워진 다이아몬드), 및 Leu16VhY, VkZ (열린 삼각형) 였다. 도 7B. 시험된 면역사이토카인은 chLeu16-IL2 (채워진 사각형), 및 Leu16VhY/VkZ-IL2 (채워진 삼각형), 탈글리코실화 Leu16VhY/VkZ-IL2 (X 표시), 및 비-결합 대조군으로서 huKS-IL2 (열린 원) 이었다. Y-축: 용해 %, X-축: 농도 (ng/ml).

도 7C 는 실시예 4 에서 기술되는 바와 같이, ⁵¹Cr-표지된 Daudi 세포 및 보체의 공급원으로서 인간 혈장을 사용하는 CDC 활성을 나타낸다. 동일한 항체 및 면역사이토카인을 사용하여 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 시험된 항체는 2B8 (채워진 원), chLeu16 (채워진 다이아몬드), chLeu16-IL2 (채워진 사각형), 및 Leu16VhY/VkZ-IL2 (채워진 삼각형), 및 비-결합 대조군으로서 huKS-IL2 (열린 원) 였다.

도 8 은 실시예 5 에서 기술되는 바와 같이, 마우스에서 에피토프-제거된 Leu16 면역사이토카인의 약동학을 예증한다. 각 면역사이토카인의 정맥내 (i.v.) 투여에 이어서 시간-농도 분석을 수행하였다. 고유의 (입체 사각형) 및 탈글리코실화 단백질 (열린 원) 에 대한 손상되지 않은 형태를 검출하는 ELISA 에 의해 혈청 농도를 측정하였다. 25 mg 의 지시된 면역사이토카인을 마우스에 주사하고, 후안와 출혈에 의해 샘플을 취하고, 항-인간 IgG H&L 항혈청으로 포획하고 항-인간 IL2 항체로 검출하여 어세이를 하였다. 주사 후 즉시 취한 각 마우스의 혈청에서의 초기 농도로 결과를 표준화한다. X-축: 시간, Y-축: 잔여 ID %

도 9 는 SCID 마우스에서 항-종양 모델 평가를 나타낸다. SCID 마우스에 2 x 10⁶ CD20+ Daudi 림프종 세포를 i.v. 주사한 후, 제 3 일 (도 9A) 또는 제 7 일 (도 9B) 에 시작하는 면역사이토카인을 5 회 연속으로 매일 주사하였다. EGFR 에 대해 특이성인 비-표적 대조군 면역사이토카인 425-IL2 를, IL-2 의 변경된 반감기로 인한 불완전한 활성을 예증하기 위해 고투여량으로 사용하였다. 도 9A 에서 치료제를 제 3, 4, 5, 6 및 7 일에 투여하였고, PBS 만 (채워진 다이아몬드); 425-IL2 (짙은, 교차된 X 표시); 및 Leu16VhY/VkZ-IL2 를 5 마이크로그램 (mcg) (옅은 X 표시), 10 mcg (채워진 삼각형), 및 20 mcg (채워진 사각형) 으로 매일 투여한 것을 포함하였다. 도 9A 에서, 후자의 3 개의 투여량 모두는 마우스의 완전한 보호를 나타내었고, 데이타 지점은 중첩된다. 도 9B 에서 치료제를 제 7, 8, 9, 10 및 11 일에 투여하였고, PBS 만 (채워진 다이아몬드); 및 Leu16VhY/VkZ-IL2 를 5 mcg (옅은 X 표시); 및 20 mcg (채워진 사각형) 으로 매일 투여한 것을 포함하였다. X-축: 날짜; Y-축: 생존 %.

도 10 은 SCID 마우스에서 항-종양 모델 평가 (2B8 대 chLeu16-IL2) 의 결과를 나타낸다; SCID 마우스에 Daudi 림프종 세포를 주사하고, 도 9 에서 기술되는 바와 같이, 제 7 일 후에 지시된 항체 또는 면역사이토카인으로의 치료를 시작하였다. 치료는, PBS 만 (교차된 X, 제 7-11 일); 리툭시마브 (C2B8; 채워진 원, 25 mg/kg 제 7, 9 및 11 일); 고투여량 Leu16VhY/VkZ-IL2 (큰 사각형, 1 mg/kg 제 7-11 일); 저투여량 Leu16VhY/VkZ-IL2 (작은 사각형, 0.25 mg/kg 제 7-11 일) 을 포함하였다. (A): 건강한 마우스 (B) 마우스의 생존; X-축: 날짜; Y-축: 건강한 마우스 (A) %, 마우스의 생존 (B) %.

도 11 은 SCID 마우스에서 항-종양 모델 평가 (chLeu16-IL2 대 비면역화된 (DI)-Leu16-IL2) 의 결과를 나타낸다; SCID 마우스에 Daudi 림프종 세포를 주사하고, 도 9 에 대해 기술되는 바와 같이, 제 7 일 후에 지시된 항체 또는 면역사이토카인으로 치료를 시작하였다. 치료는, PBS 만 (교차된 X, 제 7-11 일); 리툭시 마브 (채워진 원, 25 mg/kg 제 7, 9 및 11 일); 고투여량 Leu16VhY/VkZ-IL2 (큰 사각형, 1 mg/kg 제 7-11 일); 저투여량 Leu16VhY/VkZ-IL2 (작은 사각형, 0.25 mg/kg 제 7-11 일); 고투여량 chLeu16-IL2 (큰 삼각형, 1 mg/kg 제 7-11 일); 및 저투여량 chLeu16-IL2 (작은 삼각형, 0.25 mg/kg 제 7-11 일) 를 포함하였다. (A) 건강한 마우스, (B) 마우스의 생존. X-축: 날짜; Y-축: 건강한 마우스 (A) %, 마우스의 생존 (B) %.

도 12 는 ADCC 활성의 감소가 Leu16VhY/VKZ-IL2 (DI-Leu16-IL2 대 탈글리코실 DI-Leu16-IL2) 에 의해 매개된 항-종양 활성에 있어 단지 부분적인 효과만을 갖는다는 것을 예증한다. 2 가지 상이한 투여량의 고유의 및 효소적으로 탈글리코실화된 Leu16VhY/VkZ-IL2 를, 도 9 에 대해 기술되는 바와 같이, Daudi 림프종 세포의 주사 후 제 7 일에 시작하는 SCID 마우스를 치료하기 위해 사용하였다. 치료는, PBS 만 (X, 제 7-11 일); 리툭시마브 (채워진 원, 25 mg/kg 제 7, 9 및 11 일); 고투여량 Leu16VhY/VkZ-IL2 (큰 삼각형, 1 mg/kg 제 7-11 일); 저투여량 Leu16VhY/VkZ-IL2 (작은 삼각형, 0.25 mg/kg 제 7-11 일); 고투여량 탈글리코실화된 Leu16VhY/VkZ-IL2 (굵은 선의 큰 X 표시, 1 mg/kg 제 7-11 일); 및 저투여량 탈글리코실화된 Leu16VhY/VkZ-IL2 (얇은 선의 작은 X 표시, 0.25 mg/kg 제 7-11 일) 를 포함하였다. (A) 건강한 마우스, (B) 마우스의 생존. X-축: 날짜; Y-축: 건강한 마우스 (A) %, 마우스의 생존 (B) %.

도 13 은 항원 특이성이 최적의 항-종양 활성에 중요하다는 것을 예증한다. 암 세포 표적화의 역할을, 단지 낮은 수준의 Daudi 림프종 세포에서 발현되는 분자 인, EGFR 에 대해 결합 특이성을 갖는 또 다른 면역사이토카인과 DI-Leu16-IL2 의 활성을 비교하여 시험하였다. 치료는, PBS 만 (X, 제 7-11 일); 리툭시마브 (채워진 다이아몬드, 25 mg/kg 제 7, 9 및 11 일); DI-leu16 항체 (열린 다이아몬드, 25 mg/kg 제 7, 9 및 11 일); 중간 투여량 DI-Leu16-IL2 (채워진 사각형, 1 mg/kg 제 7-11 일); 감소된 투여량 DI-Leu16-IL2 (열린 원, 1 mg/kg 제 7 및 10 일); 저투여량 DI-Leu16-IL2 (열린 사각형, 0.25 mg/kg 제 7-11 일); 및 중간 투여량 항-EGFR-IL2 (채워진 삼각형, 1 mg/kg 제 7-11 일) 를 포함하였다. 결과는 질병 없이 생존한 것으로 점수화하였다. X-축: 날짜; Y-축: 질병 없는 %.

도 14 는 Leu16VhY/VkZ-IL2 는 IL-2 가 없이 조합된 더 높은 투여량의 항-CD20 항체보다 더욱 강력하다는 것을 예증한다. 중간 투여량 Leu16VhY/VkZ-IL2 (채워진 사각형, 20 mg/마우스 제 7-11 일) 및 상응하는 투여량의 개개의 항체 및 IL-2 성분 (열린 사각형, i.v. 에 의해 16.7 mg Leu16VhY, VKZ 및 3.3 mg IL-2 제 7-11 일) 의 항-종양 활성을 고투여량 리툭시마브 및 피하 (s.c.) IL-2 (열린 다이아몬드, 500 mg 리툭시마브 제 7 일 및 10 mg IL-2 제 7, 9 및 11 일), 리툭시마브 단독 (채워진 다이아몬드, 500 mg 제 7 일) 또는 PBS 대조군과 비교하였다. X-축: 날짜; Y-축: 질병 없는 %.

도 15 는 정상 항-CD20+ B 세포의 존재가 Leu16VhY/VkZ-IL2 의 항-종양 활성을 감소시키지 않는다는 것을 예증한다. 정상 인간 CD20+ B 세포의 이전 이식의 효과를, 실험 방법에서 기술되는 바와 같이 동일한 SCID/Daudi 림프종 모델에서 시험하였다. 마우스 군을, 일시 고투여량의 리툭시마브 (다이아몬드, 25 mg/kg 제 7 일), Leu16VhY/VkZ-IL2 (사각형, 1 mg/kg 제 11-15 일), 2가지 모든 투여 양생법의 병용 (삼각형, 제 7 일에 리툭시마브를 처리한 후, 제 11-15 일에 Leu16VhY/VkZ-IL2) 또는 모든 투여일에 PBS 단독으로 치료하였다. 절반의 군에, 제 5 일에 4.5 x 10⁶ PBMC 를 i.v. 주사하거나 (열린 기호) 또는 PBS 만을 (채워진 기호) 수여하였다. B 세포 흡착 (engraftment) 을 모든 마우스의 혈청에서 인간 항체 농도를 측정함으로써 확인하였다. X-축: 날짜; Y-축: 질병 없는 %.

도 16 은 항-CD20 항체 2B8, Leu16, 및 1H4 의 중쇄 및 경쇄 V 영역뿐 아니라, 2B8 의 에피토프-제거된 유도체 V 영역 (VhC, VhD, VkA, VkB, VkC 및 VkD), 및 에피토프-제거된 Leu16 V-영역 VhY 및 VkZ 의 정렬을 나타낸다.

도 17 은 본 출원에서 사용되는 바와 같은 모든 서열 목록 번호 (서열 목록 번호: 1-43) 의 요약을 나타낸다.

본원에 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드 조성물" 및 그의 문법상의 변형은 단일 쇄 폴리펩티드뿐 아니라, 폴리펩티드 쇄가 예컨대, 하나의 쇄에 있는 시스테인 잔기와 또 다른 쇄 상의 시스테인 잔기 사이의 하나 이상의 디술피드 결합, 에스테르 결합, 아미드 결합, 또는 임의의 기타 적합한 연결에 의해 서로 화학적으로 결합된 복합 쇄 폴리펩티드를 말한다.

CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 서열 목록 번호: 1 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 개질된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드 (Vh) (그러나 이는 V₁₂K, A₁₄P, M₂₀V, I₄₈T, A₆₈T, Q₈₂E, T₈₇R, S₉₁T 및 T₁₀₆W 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 1 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함함); 서열 목록 번호: 4 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 개질된 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 (Vk) (그러나 이는 L₁₁I, S₁₂T, S₂₇T, V₂₉A, G₄₀T, V₅₉S, S₆₉T, L₇₂M, R₇₆S 및 V₇₇L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 4 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함함); 서열 목록 번호: 9 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 개질된 Vh (그러나 이는 V₁₂K, M₂₀V, A₆₈T, Q₈₂E, T₈₇R, S₉₁T, D₉₃V 및 A₁₁₄T 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 9 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함함); 및 서열 목록 번호: 11 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 개질된 Vk (그러나 이는 L₁₁I, S₁₂T, A₅₉S, S₆₉T, L₇₂M, R₇₆S 및 V₇₇L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 목록 번호: 11 에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함함) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드 분절을 포함한다.

바람직하게는, CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 서열 목록 번호: 15, 서열 목록 번호: 16, 서열 목록 번호: 17, 서열 목록 번호: 18, 서열 목록 번호: 19, 서열 목록 번호: 20, 서열 목록 번호: 21, 서열 목록 번호: 22, 서열 목록 번호: 23, 서열 목록 번호: 24, 서열 목록 번호: 25, 서열 목록 번호: 26, 서열 목록 번호: 27, 서열 목록 번호: 15 및 서열 목록 번호: 28 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드 분절을 포함한다.

한 바람직한 구현예에서, CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 개질된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 개질된 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함한다. 더욱 바람직하게는, CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 키메라성 항체의 형태이고, 또한 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다. 바람직하게는 인간 중쇄 불변 영역은 IgG 불변 영역, 더욱 바람직하게는 IgG1 불변 영역이다. 인간 경쇄 불변 영역은 바람직하게는 인간 카파 경쇄 불변 영역이다. 본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물의 또 다른 바람직한 구현예는 상기 기술된 바와 같이, 사이토카인과 융합된 개질된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 분절을 포함하는 폴리펩티드 조성물을 포함하는 융합 단백질이다. 바람직하게는 사이토카인은 IL2 이다.

본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물의 또 다른 바람직한 구현예는 상기 기술된 바와 같이 개질된 Vh 또는 개질된 Vk 분절을 하나 이상 포함하는 예컨대, Fab 항체 단편, 단일-쇄 Fv 항체 단편, 또는 미니체와 같은 항체 분자이다.

특히 바람직한 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 서열 목록 번호: 2, 서열 목록 번호: 3 및 서열 목록 번호: 10 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 서열을 갖는 하나 이상의 Vh 폴리펩티드 분절을 포함한다.

또 다른 특히 바람직한 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 서열 목록 번호: 5 서열 목록 번호: 6, 서열 목록 번호: 7, 서열 목록 번호: 8, 및 서열 목록 번호: 12 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 서열을 갖는 하나 이상의 Vk 폴리펩티드 분절을 포함한다.

더욱 바람직하게는, CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 서열 목록 번호: 2, 서열 목록 번호: 3, 및 서열 목록 번호: 10 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vh 폴리펩티드 분절; 및 서열 목록 번호: 5, 서열 목록 번호: 6, 서열 목록 번호: 7, 서열 목록 번호: 8, 및 서열 목록 번호: 12 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vk 폴리펩티드 분절을 포함한다.

본 발명의 기타 바람직한 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 개질된 Vh 및 개질된 Vk 분절의 조합을 포함한다:

(a) 서열 목록 번호: 2 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vh 분절 및 서열 목록 번호: 5 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vk 분절;

(b) 서열 목록 번호: 2 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vh 분절 및 서열 목록 번호: 6 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vk 분절;

(c) 서열 목록 번호: 2 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vh 분절 및 서열 목록 번호: 7 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vk 분절;

(d) 서열 목록 번호: 2 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vh 분절 및 서열 목록 번호: 8 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vk 분절;

(e) 서열 목록 번호: 3 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vh 분절 및 서열 목록 번호: 6 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vk 분절;

(f) 서열 목록 번호: 3 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vh 분절 및 서열 목록 번호: 8 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vk 분절; 및

(g) 서열 목록 번호: 10 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vh 분절 및 서열 목록 번호: 12 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 Vk 분절.

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물을, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제와 함께 포함하는 약제학 조성물이다. 약제학 조성물은 또한 부가적인 약리학적으로 효과적인 약물을 포함할 수 있다.

기재된 서열은 본원에서 "모" 항체라고 불리는 마우스 단일클론 항체 2B8 및 Leu16 의 V-영역 서열의 분석으로부터 유래되고, 미국 특허 번호 제 5,736,137 호; 미국 특허 번호 제 5,776,456 호; 미국 특허 번호 제 6,399,061 호; 미국 특허 번호 제 6,455,043 호 및 외국의 동등물, 및 Wu 등 (Protein Enginering (2001) 14: 1025-1033) 및 그곳에서의 참조에서, 그들의 유용한 시험관내 및 생체내 특성에 관해 완전히 기재되어 있다.

그렇게 수행되는 서열 분석은 MHC 부류 Ⅱ 리간드를 작동시켜서 사람에서 T-세포 에피토프로서 기능할 수 있는 서열 내에 함유된 펩티드를 동정하게 하였다. 본 발명의 목적은 개선된 버전 (version) 의 모 항체를 제공하는 것이다. 그러므로 잠재적인 MHC 부류 Ⅱ 에피토프의 위치에 대한 지식이 공학설계 과정의 중요한 첫 단계이다. 에피토프 동정을, 본원에 참조로서 완전히 인용되는 WO 02/069232 에서 세부 사항이 약술된 개요에 따라 계산적으로 수행하였다. 상기 첫 단계 후, 본원의 발명자들은 놀랍게도 모 항체에 대해 원하는 개질을 하는 것과 관련하여 집합적으로 여러 상이한 범주를 만족시키는 아미노산 치환의 세트를 발견하였다.

모 항체의 V-영역 내의 치환 세트는, 감소된 수의 MHC 부류 Ⅱ 리간드를 갖는 폴리펩티드 서열 및, 따라서 T-세포 에피토프로 작용하는 폴리펩티드에 대해 감소된 성향을 야기한다. 동등하게, 상기 치환 세트는 모 항체의 유지된 구조적 및 기능적 특성을 갖는 폴리펩티드 서열을 야기하고, 이것은 숙주 세포 내에서 유지되며 안정적인 발현의 특히 바람직한 이중 특성, 특히 중요하게는, 인간 CD20 항원에 결합하는, 특히 시험관내에서 인간 B-세포에 결합하는 폴리펩티드에 대한 유지된 능력과 관련해 사실이다.

2B8 및 Leu16 뿐 아니라, 항-CD20 항체 B1 의 Vh 및 Vk 아미노산 잔기 서열이, 심지어 그들이 독립적인 기원의 것이라 할지라도 꽤 유사하다는 것이 주목할 만하다. 이론에 구애됨이 없이, 본 발명의 통찰은 하기와 같다. CD20 의 짧은 세포외 펩티드의 일부이면서, 디술피드 결합을 형성하기 쉬운 시스테인의 측면에 위치하는 인간 CD20 내의 서열 CEPANPSEKNSPSTQYC (서열 목록 번호: 29) 는, 마우스 CD20 내의 서열 CEPSNSSEKNSPSTQYC (서열 목록 번호: 38) 에 상응한다. 마우스 NSS 서열은 N-연결된 글리코실화 부위일 경향이 있는 반면, 인간에서 상응하는 NPS 서열은 N-연결된 글리코실화 부위가 아닌 경향이 있다. 마우스와 인간 CD20 서열 사이의 이러한 차이가, 마우스 면역계의 관점으로부터 인간 서열 내의 에피토프를 밝힐 것이다. 그러므로, 인간 CD20 에 대해 발생되는 모든 마우스 항체는 매우 좁게 정의된 에피토프를 인지하기 위해 선택될 수 있고, 이것을 하기 위해 하나의 최적 세트의 마우스 V 영역이 있을 수 있다.

그러므로, 본 발명은 인간 CD20 의 인지에 중요한 일련의 감소된-면역원성 일치 V 영역 서열을 제공한다. 예를 들어, 중쇄 내의, 본 발명의 개질된 중쇄 내의 서열 분절 VSCKASGYT (서열 목록 번호: 16) 는 CD20 에 결합하는 항체의 내용면에서 유용하고; 보다 명확히, 상기 분절은 2B8 및 Leu16 항체로부터의 상응하는 분절 MSCKASGYT (서열 목록 번호: 30) 보다 덜 면역원성이다. 유사하게는, 서열 YNQKFKGKT (서열 목록 번호: 18), FKGKTTLTA (서열 목록 번호: 19), 및 YMELSSLRS (서열 목록 번호: 20) 는 CD20 항체의 내용면에서 유용하고, 모 2B8 및 Leu16 항체에서 발견되는 상응하는 서열 YNQKFKGKA (서열 목록 번호: 31), FKGKATLTA (서열 목록 번호: 32), 및 YMQLSSLRS (서열 목록 번호: 33) 보다 덜 면역원성이다.

경쇄를 고려하면, 본 발명의 개질된 경쇄 내의 서열 분절 IITASPGEKV (서열 목록 번호: 23) 는 CD20 에 결합하는 항체의 내용면에서 유용하고; 보다 명확히, 상기 분절은 모 2B8 및 Leu16 항체로부터의 상응하는 분절 ILSASPGEKV (서열 목록 번호: 34) 보다 덜 면역원성이다. 유사하게는, 서열 LASGVPSRF (서열 목록 번호: 26), FSGSGSGTT (서열 목록 번호: 27), 및 YSMTISSLE (서열 목록 번호: 28) 는 CD20 항체의 내용면에서 유용하고, 모 2B8 및 Leu16 항체에서 발견되는 상응하는 서열 LASGVPVARF (서열 목록 번호: 35), FSGSGSGTS (서열 목록 번호: 36), 및 YSLTISRVE (서열 목록 번호: 37) 보다 덜 면역원성이다.

본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 "실질적으로 비-면역원성의" 또는 "감소된 면역원성의 잠재력" 이란 언급은, 대응체 또는 "모" 항체, 즉, 비-개질된 쥣과 또는 키메라성 단일클론 항체, 예컨대 2B8 또는 Leu16 과 비교해 감소된 면역원성을 포함한다. 용어 "면역원성" 은 숙주 동물에서 특히 "숙주 동물" 이 인간인 경우, 체액성 및 또는 T-세포 매개된 반응을 유발, 유도하거나 또는 그렇지 않으면 이용하는 능력을 포함한다.

용어 "항체 분자" 는 항원과 조합, 상호작용하거나 또는 그렇지 않으면 결합할 수 있는 전체 항체를 포함하는 면역글로불린 족의 폴리펩티드를 말한다.

용어 "항원" 은 항체 분자와 상호작용할 수 있는 물질을 언급하기 위해 본원에 사용되고, 본 발명의 문맥에서는 CD20 을 의미한다. 본 발명의 CD20 은 인간 CD20 또는 항체 2B8 에 대한 항원을 나타내는 임의의 CD20 이다. CD20 은 가용성 CD20 유도체 또는 막에 결합된 CD20 이 될 수 있다.

용어 "면역글로불린" 은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 엔코딩된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 언급하기 위해 본원에 사용된다. 인지된 면역글로불린 유전자는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 불변 영역 유전자 및 사실상 복합 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 면역글로불린의 하나의 고유 형태는, 각 쌍이 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는 2 개의 동일한 쌍을 포함하는 4량체이다. 각 쌍에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 함께 항원과 상호작용할 수 있는 결합 표면을 제공한다. 용어 Vh 는 중쇄 가변 영역을 언급하기 위해 본원에 사용되고, 용어 Vk 는 경쇄 가변 영역을 언급하기 위해 본원에 사용되고, 상기 예에서 수많은 단일클론 항체와 공통으로 경쇄는 "카파" (k) 유형 쇄이다.

V-영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" (즉, Kabat 등 [Kabat 등. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 에 의해 정의된 바와 같이, 경쇄 가변 도메인 내의 아미노산 잔기 약 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 에서, 그리고 중쇄 가변 도메인 내의 아미노산 잔기 약 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 에서) 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. CDR 의 대안적 정의는 또한 CDR 이 경쇄 내의 아미노산 잔기 약 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 내의 아미노산 잔기 약 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) 에서 발견되는 경우, 예를 들어 Chothia (Chothia 및 Lesk (1987) J. Mol . Biol . 196: 901-917) 의 도식에 따라 당업계에 인지되어 있다. "골격" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같이 CDR 잔기가 아닌 그것들의 V-영역 잔기이다.

본원에 사용되는 바와 같이, Vh 는 길이가 약 110 내지 125 아미노산 잔기인 폴리펩티드를 의미하고, 이의 서열은 Vk 와 조합으로 인간 CD20 과 결합할 수 있는 본원에서의 임의의 상술된 Vh 쇄에 상응한다. 유사하게는, Vk 는 길이가 약 95-130 아미노산 잔기인 폴리펩티드를 의미하고, 이의 서열은 Vh 와 조합으로 인간 CD20 과 결합할 수 있는 본원에서의 임의의 상술된 Vk 쇄에 상응한다. 전장 면역글로불린 중쇄는 약 50 kDa 분자량이고, N-말단에 있는 Vh 유전자 및 C-말단에 있는 불변 영역 유전자 중의 하나에 의해 엔코딩된다. 유사하게, 전장 경쇄는 약 25 kDa 분자량이고, N-말단에 있는 V-영역 유전자 및 C-말단에 있는 불변 영역 유전자에 의해 엔코딩된다.

전체 항체 (4량체) 외에도, 면역글로불린은 재조합 DNA 기술 또는 단백질 생화학의 적용에 의해 유도된 다수의 기타 형태로 존재할 수 있다. 상기 형태는 예를 들어 Fv, Fab, Fab' 및 (Fab)₂ 분자를 포함하고, 모두 본 발명의 임의의 Vh 또는 Vk 서열을 함유할 수 있다. 추가 예는, 상이한 항원 특이성을 갖는 2 번째 Vh/Vk 조합과 함께 본 발명의 Vh/Vk 조합을 포함하는 "2-특이성" 항체를 포함할 수 있다.

본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 용어 "T-세포 에피토프" 는, MHC 부류 Ⅱ 에 결합할 수 있고, T-세포를 자극할 수 있고/있거나 또한 MHC 부류 Ⅱ 와 복합체로 T-세포에 결합할 수 있는 (반드시 측정가능하게 활성화하지는 않음) 아미노산 서열을 의미한다.

본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 용어 "펩티드" 는, 2 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 화합물이다. 아미노산 잔기는 펩티드 결합 (하기 본원에 정의됨) 에 의해 함께 연결된다. 펩티드의 생물학적 생성에 관여되는 20 개의 상이한 일반적인, 자연적으로 발생하는 아미노산이 있고, 이들의 임의의 수가 임의의 순서로 연결되어 펩티드 쇄 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생성에 사용되는 자연적으로 발생하는 아미노산 모두는 L-배열을 갖는다. 합성 펩티드는 또한 통상적인 합성 방법을 사용하여, L-아미노산뿐 아니라 D-아미노산, 또는 2 개의 상이한 배열의 다양한 조합의 아미노산을 이용하여 제조할 수 있다. 일부 펩티드는 단지 몇 개의 아미노산 잔기를 함유한다. 짧은 펩티드, 예를 들어, 10 개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 종종 "올리고펩티드" 라고 부른다. 기타 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예를 들어, 100 이하 또는 그 초과를 함유하고, "폴리펩티드" 라고 부른다.

통상적으로, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 임의의 펩티드 쇄로 간주될 수 있는 반면, "올리고펩티드" 는 통상적으로 특정 유형의 "짧은" 폴리펩티드로 간주된다. 그러므로, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 임의의 참조는 본원에서 또한 올리고펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 추가로, "펩티드" 에 대한 임의의 참조는 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각 상이한 배열의 아미노산 잔기는 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 - 그러므로 상이한 단백질의 수 - 는 특별히 제한되지 않는다.

용어 "펩티드 조성물" 은 항-CD20 항체, 바람직하게는 2B8 및 Leu16 으로부터 유도되는 하나의 폴리펩티드를 적어도 포함하는 조성물을 의미한다. 폴리펩티드는 단일 쇄 (예를 들어, 중쇄 또는 그의 부분, 경쇄 또는 그의 부분, 또는 단일-쇄 Fv) 또는 2량체 형태로 존재할 수 있다. 2량체 형태는 전체 항체, Fab 단편, 미니체, 또는 임의의 2개-쇄 분자가 될 수 있고, 여기서 단일 쇄는 단순한 화학 결합에 의해 연결된다. 조성물은 단지 여러 개의 단일 쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있고, 이것은 화학 또는 시스테인 결합에 의해 연결되지 않는다.

본 발명은 또한, 분자의 V-영역 내의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되어, 단백질로부터 하나 이상의 잠재 T-세포 에피토프의 활성의 실질적인 감소 또는 제거를 야기하는 항-CD20 단일클론 항체에 관한 것이다. 아미노산 개질 (예를 들어, 치환) 이 모 분자의 가장 면역원성이 큰 영역 내에서 수행되는 개질된 항체 분자를 제공하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 주요 바람직한 구현예는, 결합을 제거하도록 또는 그렇지 않으면 펩티드가 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 수를 감소시키는 것과 같이 임의의 MHC 부류 Ⅱ 리간드가 변형된 개질된 항체 분자를 포함한다. T-세포 에피토프의 제거를 위해, 아미노산 치환은 T-세포 에피토프의 활성의 실질적인 감소 또는 제거를 달성하기 위해, 예측된 펩티드 서열 내에 적합한 지점에서 이뤄진다. 실제로 적합한 지점은 바람직하게는 MHC 부류 Ⅱ 결합 홈 내에 제공되는 포켓 중 하나 내의 아미노산 잔기 결합과 동등할 것이다.

펩티드의 소위 P1 또는 P1 고정 위치에서 틈의 첫번째 포켓 내의 결합을 변경하는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 고정 잔기와 MHC 부류 Ⅱ 결합 홈의 첫번째 포켓 사이의 결합 상호작용의 특질은 전체 펩티드에 대한 전체 결합 친화성의 주요 결정소가 되는 것으로 인지된다. 펩티드의 상기 위치에서의 적합한 치환은 포켓 내에 덜 쉽게 적응된 잔기에 대한, 예를 들어, 더욱 친수성인 잔기에 대한 치환이다. MHC 결합 틈 내의 기타 포켓 영역 내의 결합에 동등한 위치에 있는 펩티드 내의 아미노산 잔기가 또한 고려되고, 본 발명의 범주 하에 있다.

제공된 잠재 T 세포 에피토프 내의 단일 아미노산 치환이 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 경로라고 이해된다. 단일 에피토프 내의 치환의 조합이 고려될 수 있고, 예를 들어, 개별적으로 정의된 에피토프가 서로 중복되는 곳이 특히 적합할 수 있다. 게다가, 제공된 에피토프 내에서 단독으로, 또는 단일 에피토프 내에서 조합하여, 아미노산 치환이 MHC 부류 Ⅱ 결합 홈과 관련된 "포켓 잔기" 에 동등하지 않은 위치에서 이뤄질 수 있으나, 펩티드 서열 내의 임의의 지점에서 이뤄질 수 있다. 모든 이러한 치환은 본 발명의 범주 내에 있다.

본 발명의 개질된 항체 분자의 중요하고 뚜렷한 특징은, 그들이 비-개질된 모 항체의 작용 활성을 유지한다는 것이다. 그러므로, 모체의 비-개질된 항체의 치료 효과와 연관된 이로운 기술 특징의 모두를 나타내는 개질된 항체 또는 개질된 항체 분자를 생성하는 것이 특히 바람직하다. 이는 본 발명의 고려된 이용에 적절하며, 즉 특히 B-세포 림프종 및 기타 B-세포 매개된 병리학을 포함하는, 사람의 다수의 중요한 질병에 치료 효과를 갖는 조성물을 제공한다. 이러한 치료법은 본 발명의 바람직한 구현예이다.

따라서, 본 발명의 개질된 항체 분자는 모 항체에 의해 나타나는 친화성과 유사한 그의 표적 항원에 대한 친화성을 나타낸다. 그러므로 항체 분자는 CD20 양성 인간 B-세포를 인지한다. 모 분자의 치료 효능은 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 을 유도할 수 있는 항체의 능력에 의해 매개되는 것으로 간주된다. 이러한 활성에 중요한 것은 인간 혈청 보체 성분 C1q 에 결합하는 항체 불변 영역 (즉, Fc 도메인) 의 능력이다. ADCC 및 C1q 결합은 전체 항체 분자의 불변 영역 도메인에 의해 매개되고, 본 발명은 ADCC 유도와 융화적인 인간 Fc 를 포함하는 전체 항체 분자의 생성을 고려한다. 이러한 불변 영역은 가장 바람직하게는 인간 카파 경쇄 (예를 들어, Km3) 와 조합을 이룬 IgG1 중쇄이다.

본 발명이 개질된 항-CD20 항체 분자에 관련되는 한, 개질된 항체 또는 개질된 항체의 단편을 함유하는 조성물 및 관련된 조성물은 본 발명의 범주 내에 있다. 그러므로 본 발명은 예를 들어 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 단편을 포함하는 항체 단편의 용도 및 발생을 고려한다. 이러한 단편은 표준 방법 (예를 들어; Coligan 등. [Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons 1991-1997]) 에 의해 제조할 수 있다. 본 발명은 또한 당업계에 잘 공지된 항체 분자 유도 분자 종의 다양한 재조합 형태를 고려한다. 이러한 종은, Vh 및 Vk 도메인을 연결하는 펩티드 링커를 포함하는 단일 쇄 Fv 형태 (예를 들어, scFv) 를 포함하는 안정화된 Fv 단편, 또는 상호-사슬 디술피드 결합에 의해 안정화된 Fv (dsFv) 를 포함하고, 이는 Vh 및 Vk 도메인의 결합을 이용하도록 공학설계된 부가적인 시스테인 잔기를 함유한다. 동등하게는, 기타 조성물은 당업계에 친숙하고, "미니체" 로 불리는 종; 및 단일 가변 도메인 "dAb" 를 포함할 수 있다. 여전히 기타 종은, 예를 들어 2 량체화 도메인 (예를 들어, "류신 지퍼 (zipper)") 의 공학설계 또는 또한 화학적 개질 전략에 의해 개질된 항체 V-영역 도메인, 즉, 다중 항원 결합 부위를 갖는 종의 원자가를 증가시킬 수 있는 수단을 혼입할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD20 V 영역이 항암 단백질과 같은 비-면역글로불린 융합 파트너 단백질과 커플링된 융합 단백질에 관한 것이다. 이러한 단백질의 예는, 수도모나스 (Pseudomonas ) 외독소와 같은 독소; 항체-의존성 프로드러그 (prodrug) 치료법 ("ADEPT") 을 위한 박테리아 프로테아제와 같은 효소, 또는 사이토카인을 포함한다. 특히 유용한 사이토카인은 IL-2, IL-12 의 야생형 및 변이체 버전, IL-2 및 IL-12 의 융합된 형태, 및 기타 인터루킨, 인터페론, 및 종양 괴사 인자이다. Gillies 및 동료들 (US5,150,650, WO98/25978, WO01/10912, WO02/72605, WO03/48334), Epstein (WO 03/15697), 및 Halin 등. (Cancer Res. (2003) 63: 3202-10) 은 항-암 항체 V 영역 및 사이토카인의 다수의 배열을 기술하고 있으며; 상기 방법 및 배열은 본원에 참조로써 인용되고 있다. 본 발명의 V 영역을 포함하는 융합 단백질의 면역글로불린 불변 영역은 보체 고정에 영향을 주는 돌연변이, Fc 수용체 결합에 영향을 주는 돌연변이, FcRn 결합에 영향을 주는 돌연변이, 및 융합 단백질의 혈청 반감기에 영향을 주는 돌연변이와 같은 돌연변이에 의해서 추가로 개질될 수 있고; 이러한 돌연변이의 예는 참조로써 인용된 WO09943713 및 WO01/58957 에서 기술되어 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 개질된 항-CD20 항체 분자, 개질된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드, 개질된 경쇄 가변 영역 폴리펩티드, 항-CD20 항체 융합 단백질 등을 엔코딩하는 핵산과 같은, CD20-결합 폴리펩티드 조성물을 엔코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다. Leu16 의 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드의 DNA 서열을 도 17 (서열 목록 번호: 39) 에 나타낸다. Leu16 의 경쇄의 바람직한 에피토프-제거된 버전 (즉, VkZ 및 인간 불변 영역을 포함함) 을 엔코딩하는 DNA 서열을 도 17 에 서열 목록 번호: 40 으로 나타낸다. Leu16 의 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드의 DNA 서열을 도 17 (서열 목록 번호: 41) 에 나타낸다. Leu16 의 중쇄의 바람직한 에피토프-제거된 버전 (즉, VhY 및 인간 불변 영역을 포함함) 을 엔코딩하는 DNA 서열을 도 17 에 서열 목록 번호: 42 로 나타낸다. IL-2 에 융합된 Leu16 의 중쇄의 바람직한 에피토프-제거된 버전 (즉, VhY, 인간 불변 영역, 및 불변 영역의 C-말단에 결합된 IL-2 를 포함함) 을 엔코딩하는 DNA 서열을 도 17 에 서열 목록 번호: 43 으로 나타낸다.

본 발명의 더욱 또 다른 측면은 본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물을 사용하는 인간의 치료적 치료 방법에 관한 것이다. 실시예는 본 발명의 폴리펩티드 조성물이 마우스 모델에서 인간 암 세포를 치료하기 위해 어떻게 사용되는가를 예증하고, 하기에 수득된 결과는 일반적으로 CD20 을 발현하는 B 세포 림프종 및 기타 암과 같은 인간 암을 치료하는데 사용할 수 있는 전략의 예증이다.

항-CD20-IL2 융합 단백질과 같은 본 발명의 CD20-결합 폴리펩티드 조성물은 하기와 같이 사용된다: B 세포 림프종과 같은 CD20-발현 암으로 고통받는 환자에게, 본 발명의 폴리펩티드 조성물을 투여한다. 바람직한 투여 경로는 정맥내 또는 피하 주사이지만, 근육내, 복강내, 피부내, 또는 기타 경로의 주사가 또한 가능하다. 기타 투여 경로로서, 흡입에 의한, 경구로, 또는 좌약에 의한 투여가 또한 가능하다. 바람직하게는 1 주 당 3 번의 4-주 주기로 투여 후, 그 다음 3 주 동안 치료하지 않는다. 치료는 수여된 개인에서 융합 단백질의 약동학 거동에 따라 더 또는 덜 자주 치료할 수 있다. 약 70 킬로그램의 성인에 대한 바람직한 투여량은 1 투여량 당 약 1 내지 약 100 밀리그램의 범위, 바람직하게는 1 투여량 당 약 4 내지 약 20 밀리그램의 범위이다. 가장 바람직한 투여량은 1 달 1 번 치료를 받는 70 kg 성인에 대해 약 10 밀리그램이다. 표준 절차에 따라 반응에 대해 환자를 모니터링한다.

실시예는 본 발명의 단백질의 임의의 특정 제조 방법을 기술하나, 단백질 발현의 당업자들은 본 발명의 단백질을 제조하기 위해 매우 다양한 잘 공지된 기술을 사용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 단백질은 바람직하게는 포유류 세포와 같은 진핵 세포, 예컨대 NS/0 세포, BHK 세포, CHO 세포, 293 세포, 또는 PERC6 세포에서 제조된다. 본 발명의 단백질은 예를 들어, 차례로, 하기 단계의 일부 또는 모두를 사용하여 정제될 수 있다: Abx Mixed Resin 컬럼 크로마토그래피, 재조합 Protein A 크로마토그래피, 및 Q Sepharose 컬럼 크로마토그래피를 한 후, 제형 완충액으로 완충액 교환을 위한 Pellicon 2 안젠셜 (angential) 유동 투석여과 (diafiltration). 바이러스 비활성화 및 제거 단계는 상기 단계 내에 서로 얽혀있다. 바이러스 비활성화 및 제거 단계는 그 자체가 정제에 필수적인 것은 아니지만, 조절성 고려를 만족시키기 위해 사용된다. 추가 양상에서, 본 발명은 개질된 항-CD20 항체 분자를 사용하는 인간의 치료적 치료법에 관한 것이다. 실시예는 본 발명의 단백질이 마우스 모델에서 인간 암 세포를 치료하기 위해 어떻게 사용되는가를 예증하고, 하기 수득된 결과는 일반적으로 CD20 을 발현하는 B 세포 림프종 및 기타 암과 같은 인간 암을 치료하기 위해 사용할 수 있는 전략의 예증이다.

본 발명의 융합 단백질은 하기와 같이 사용된다. B 세포 림프종과 같은 CD20-발현 암으로 고생하는 환자를 치료한다. 바람직한 투여 경로는 정맥내 또는 피하 주사이지만, 근육내, 복강내, 피부내, 또는 기타 경로의 주사가 또한 가능 하다. 기타 투여 경로로서, 흡입에 의한, 경구로, 또는 좌약에 의한 투여가 또한 가능하다. 바람직하게는 1 주 당 3 번의 4-주 주기로 투여 후, 그 다음 3 주 동안 치료하지 않으나, 수여된 개인에서 항-CD20-IL2 융합 단백질의 약동학 거동에 따라 더 또는 덜 자주 치료할 수 있다. 약 70 킬로그램의 성인에 대한 투여량은 1 투여량 당 약 1 내지 약 100 밀리그램의 범위, 바람직하게는 1 투여량 당 약 4 내지 약 20 밀리그램의 범위이다. 가장 바람직한 투여량은 1 달 1 번 치료받는 70 kg 성인에 대해 약 10 밀리그램이다. 표준 절차에 따라 반응에 대해 환자를 모니터링한다.

실시예 1. 비면역화된 Leu16 항체를 발현하기 위한 방법 및 시약.

1A: 세포 배양 및 트랜스펙션 (transfection): 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 수득하기 위해, 플라스미드 DNA 를 전기천공법에 의해 마우스 골수종 NS/0 세포 내로 도입시켰다. 약 5 x 10⁶ 개의 세포를 1 번 세척하고, 인산 완충액 (PBS) 으로 재현탁시켰다. 그 다음 10 ㎍ 의 선형 플라스미드 DNA 를 세포와 함께 Gene Pulser cuvette (0.4 cm 전극 간극, BioRad) 에서 10 분 동안 빙상에서 인큐베이션시켰다. 전기천공법을 0.25 V 및 500 μF 로 고정한 Gene Pulser (BioRad) 를 사용하여 수행하였다. 세포를 빙상에서 10 분 동안 회수하도록 놔두고, 그 다음 그것들을 성장 배지에 재현탁시킨 다음, 96-웰 (well) 플레이트 상에 평판배양시켰다. 100 nM 메토트렉세이트 (MTX) 의 존재하에서 성장시켜 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 선별하고, 트랜스펙션-2 일 후에 도입시켰다. 세포를 매 3 일마다 2 또는 3 번 이상 영양공급하였고, MTX-저항성 클론은 2 내지 3 주 내에 나타났다. 클론으로부터의 상청액을 항-인간 FC ELISA 및 분석용 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의해 어세이하여, 고생산자를 동정하였다 (Gillies 등. (1989) J. Immunol. Methods 125: 191). 고생산 클론 (중간 규모 세포 배양에서 세포 배양 상청액 1 ml 당 정제된 단백질 약 100 ㎍ 의 수율) 을 단리하고, 100 mM MTX 를 함유하는 성장 배지에서 번식시켰다.

1B: ELISA : MTX-저항성 클론의 상청액에서 단백질 생성물의 농도를 측정하기 위해 ELISA 를 사용하였다. 항-huFc ELISA 를 인간 Fc-함유 단백질의 양을 측정하기 위해 사용하였다. 항 hu-Fc ELISA 를 하기 세부 사항에서 기술하였다.

A. 코팅 플레이트: ELISA 플레이트를 PBS 중의 AFFINIPURE™ 염소 항-인간 IgG (H+L) (Jackson Immuno Research) 5 ㎍/ml 로, 96-웰 플레이트 (Nunc Immuno Plate Maxisorp) 에 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 덮어 씌우고, 4 ℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 다음 플레이트를 PBS 중의 0.05% Tween (Tween 20) 으로 4 번 세척하고, PBS 중의 1% 소 혈청 알부민 (BSA)/ 1% 염소 혈청, 200 ㎕/웰로 블로킹 (blocking) 하였다. 37 ℃ 에서 2 시간 동안 블로킹 완충액으로 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 0.05% Tween 으로 4 번 세척하고, 종이 타월 상에서 가볍게 두드려 건조시켰다.

B. 시험 샘플 및 2차 항체로 인큐베이션 : 시험 샘플을 PBS 중의 1% BSA/ 1% 염소 혈청/ 0.05% Tween 이 함유된 샘플 완충액에서 적합한 농도로 희석하였다. 농도가 공지된 키메라성 항체 (인간 Fc 을 가짐) 로 표준 곡선을 작성하였다. 표준 곡선을 작성하기 위해, 샘플 완충액에서 연속 희석하여, 125 ng/ml 내지 3.9 ng/ml 범위에 이르는 표준 곡선을 제공하였다. 희석된 샘플 및 표준을 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하고, 플레이트를 37 ℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다.

인큐베이션 후, 플레이트를 PBS 중의 0.05% Tween 으로 8 번 세척하였다. 그 다음 각 웰에 100 ㎕ 의 2 차 항체, 샘플 완충액 중에서 약 1:120,000 으로 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (horse radish peroxidase) (HRP)-공액된 항-인간 IgG (Jackson Immuno Research) 를 첨가하였다. 각 구역의 HRP-공액된 항-인간 IgG 에 대해 2 차 항체의 정확한 희석을 개별적으로 측정하여야 했다. 37 ℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 그 다음 플레이트를 PBS 중의 0.05% Tween 으로 8 번 세척하였다.

C. 현상: 즉시-제조된 기질 용액 (TMB Substrate, BioFX Laboratories, MD) 을 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하고, 색조가 현상되도록 상온에서 10 분 동안 두었다. 1N HCl 을 100 ㎕/웰로 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트를 450 nm 의 파장으로 고정된 플레이트 리더 (reader) 에 의해 읽었다.

1C: 단백질 농도를 측정하기 위한 분석용 HPLC 기재된 방법: 단백질 농도를 또한 분석용 HPLC 를 사용하여 측정하였다. 0.78 내지 50.0 ㎍/ml 범위에 걸친 단백질 농도에 대한 표준 곡선을 Agilent 1100 HPLC 시스템 상의 POROS 컬럼 (Perceptive Biosystems) 으로, KS-IL2 면역컨쥬게이트를 표준으로 하고 pH-기재된 용리 프로토콜을 사용하여 측정하였다.

실시예 2. CD20 항원을 제시하는 Daudi 종양 세포에 대한 에피토프 -제거된 Leu-16 항체- IL2 융합 단백질의 상대적 결합 친화성의 측정. CD20 항원을 갖는 Daudi 림프종 세포에 대한 에피토프-제거된 Leu16-IL2 융합 단백질의 결합을, 유세포 분석기 분석을 사용하여 기타 공지된 항-CD20 항체의 결합과 비교하였다. 시험된 각 샘플에 대해, 대략 10⁶ 개의 Daudi 세포를 100 ㎕ 부피에서 다양한 농도의 항체와 사용하였다. 분석은 VHY 및 VKZ 가변 영역을 갖는 개질된 항체-IL2 융합 단백질이 적어도 CD20-발현 세포뿐 아니라, 상응하는 키메라성 Leu16-IL2 융합 단백질에 결합되었다는 것을 나타내었다. 이는 VHY 및 VKZ 를 발생시키는 Leu16 V 영역 내로 도입된 돌연변이가 항원 결합을 방해하지 않았다는 것을 나타낸다. VHY 및 VKZ 가변 영역을 갖는 항체-IL2 융합 단백질을 또한 RITUXAN (C2B8) 뿐 아니라, 쥣과 2B8 V 영역을 함유하는 2B8-IL2 융합 단백질과 비교하여도 유리하였다. 하기 표 1 의 데이타는 상이한 농도의 항체 또는 항체-IL2 융합 단백질에 노출된 Daudi 세포의, 유세포 측정기로 측정된 바와 같은 평균 형광 세기를 나타내고; 본 데이타는 전형적인 세트의 실험 결과를 나타낸다.

표 1

	항체 농도 (㎍/ml)
항체	10	5	2.5	1.25	0.625	0.313	0.156	0.078
2B8-IL2	857.32	720.02	512.81	369.04	229.45	147.26	85.32	52.13
Ab(VhY/VkZ-IL2	987.54	848.56	677.11	539.35	336.41	219.48	124.33	74.77
chLeu16-IL2	789.20	665.20	489.04	363.00	219.06	131.92	78.24	52.31
2B8	997.18	816.47	647.43	491.38	311.52	215.34	130.70	86.48

실시예 3. 면역원성을 감소시키는 돌연변이를 가진 항- CD20 - IL2 융합 단백질 에 의해 유도된 항체-의존성, 세포- 매개된 세포 독성 ( ADCC).

CD20 을 발현하는 NS/0 세포를 다양한 농도의 항체 또는 항체-IL2 융합 단백질에 노출시키고, 표준 절차에 따라 ADCC 용해에 대해 시험하였다. 전형적인 데이타 세트를 도 5 에 제시하였다. 시험된 단백질은 하기와 같았다: chLeu16 은 Leu16 마우스 V 영역 및 인간 IgG1 불변 영역으로 이루어진 키메라성 항체임; chLeu16-IL2 는 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 인간 IL-2 부분을 갖는, Leu16 마우스 V 영역 및 인간 IgG1 불변 영역으로 이루어진 키메라성 항체임; Ab(VhY/VkZ)-IL2 는 도 3 및 도 4 에서 열거된 VhHY 및 VkZ 가변 도메인이 쥣과 Leu16 V 영역 대신에 존재하는 것을 제외하고는 chLeu16-IL2 와 동일함; 본 도면에서 2B8 은 2B8 마우스 V 영역 및 인간 IgG1 불변 영역으로 이루어진 키메라성 항체임; 본 도면에서 2B8-IL2 는 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 인간 IL-2 부분을 갖는, 2B8 마우스 V 영역 및 인간 IgG1 불변 영역으로 이루어진 키메라성 항체임; 및 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 인간 IL-2 부분을 갖는, 항-EpCAM 항체인, KS-IL2. KS-IL2 단백질을 음성 대조군으로 사용하였다. 특정 항체-IL2 융합 단백질은 Gillies 등 (WO02/66514) 에 의해 기술되는 바와 같이 C-말단 중쇄 아미노산의 돌연변이를 가졌는데, 상기 돌연변이는 ADCC 데이타 상에서 아무런 효과가 없었다.

데이타는 VhY 및 VkZ 가변 영역을 갖는 융합 단백질이 ADCC 를 자극하는데 있어 CD20-결합 쥣과 V 영역을 갖는 유사한 분자만큼 활성이었다는 것을 나타낸다. 여러 상이한 세포 어세이에 의해 IL2 활성을 측정하였다. 결과를 하기 표 2 에 제시하였다.

표 2

	T 세포		T 세포	+IL2 R
	CTLL-2 Avg.ED50 (ng/ml)	HU PBMC Avg.ED50 (ng/ml)	Kit-225 Avg.ED50 (ng/ml)	TF-1 Avg.ED50 (ng/ml)
KS IL2	1.71	2.09	0.08	0.51
R&D Hu IL2	0.65	1.51	0.07	0.71
ChLeu16-IL2			0.06	1.15
D1-Leu16-IL2	1.94	2.03	0.05	1.14
D1-Leu-16-IL2 Degly	3.30	3.42	0.09	1.99

IL-2 기재된 면역사이토카인 표적 CD20 은 잘 확립된 림프종의 SCID 마우스 모델에서, 적어도, 동일한 표면 항원을 발현하는 정상 인간 B 세포의 부재하에서 매우 효과가 있고, 많은 예비-임상 실험에서 면역사이토카인 항-종양 활성의 1차 효과기로 확인된 세포인 기능 T 세포의 결핍에도 불구하고, 면역사이토카인을 사용하면 파종성 질병을 갖는 마우스의 생존을 연장시키는데 노출된 항체의 것에 비해 더욱 더 효과적이었다는 것을 또한 발견하였다.

실시예 4. 면역원성을 감소시키는 돌연변이를 갖는 항- CD20 - IL2 융합 단백질에 의해 유도된 보체 -의존성 세포 독성 ( CDC).

본 발명의 항체 및 융합 단백질의 CDC 활성을 측정하기 위해, ⁵¹Cr-표지된 Daudi 세포를 보체의 공급원으로서 인간 혈장 (1/8 으로 희석됨) 과 함께 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 특이성 용해의 백분율을, 실험값에서 배경 방사능활성을 빼고, 세제 용해에 의해 수득되는 총 방출가능한 방사능활성으로 나누고, 100 을 곱하여 계산하였다.

키메라성 Leu-16 항체 및 에피토프-제거된 V 영역을 갖는 상응하는 Leu16 항체의 CDC 활성 비교는, 상기 2 개 항체의 활성이 본질적으로 동일하다는 것을 나타낸다. 키메라성 Leu-16 항체-IL2 융합 및 에피토프-제거된 V 영역을 갖는 상응하는 Leu16 항체-IL2 융합의 CDC 활성의 유사한 비교는, 상기 2 개 융합 단백질의 활성이 또한 본질적으로 동일하다는 것을 나타낸다.

ADCC 와 반대로, CDC 는 H 쇄의 C-말단에 IL-2 를 융합한 결과로 다소 감소되었다 (도 2B). 항-GD2 면역사이토카인으로의 유사한 효과가 이전에 보고되었다 (Gillies SD 등. Cancer Res. (1999); 59: 2159-2166). 전형적인 결과를 도 7C 에 나타낸다.

실시예 5. 에피토프 -제거된 Leu16 - IL2 융합 단백질의 약동학 프로필.

특히 유용한 Leu16VhY/VkZ-IL2 구조물에서, FcR 결합 및 ADCC 활성을 Cg1 중쇄 동종형을 사용하여 유지시켰지만, 세포내 단백질가수분해를 감소시키기 위해 H 쇄와 IL-2 사이의 개질된 접합 영역을 혼입시켰다 (WO01/58957). 구체적으로는, 항체 중쇄의 C-말단 아미노산에 상응하는 리신의 알라닌으로의 변경을 사용하였다. 생성 단백질은 i.v. 투여 후, 특히 분포 상 동안에 유리한 약동학 프로필을 가졌다 (도 8). 약동학 프로필 상에서 FcR 결합의 효과를, 동일 실험에서 효소적으로 탈-글리코실화된 Leu16VhY/VkZ (Lys-Ala)-IL2 를 시험하여 검사하였다. 결과는 FcR 결합의 감소가 약동학 거동을 다소 향상시킨다는 것을 나타낸다. 적용 및 바람직한 투여 빈도에 따라, ADCC 활성을 갖지만, 비교적 더 짧은 혈청 반감기를 갖는, CH2 도메인 내에 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는 Leu16VhY/VkZ-IL2 분자, 또는 ADCC 활성은 없으나, 비교적 더 긴 혈청 반감기를 갖는, CH2 도메인 내의 N-연결된 글리코실화 부위가 결핍된 Leu16VhY/VkZ-IL2 분자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

실시예 6. 에피토프-제거된 Leu16-IL2 융합 단백질의 효능 프로필.

SCID 마우스에 5 x 10⁶ CD20+ Daudi 림프종 세포를 i.v. 주사한 후 (제 0 일), 제 7 일에 면역사이토카인을 i.v. 주사 (5 회, 5 또는 20 mg 의 매일의 투여량) 하거나 또는 대조군 항체 (총 3 회 투여량에 대해 격일, 500 mg) 를 주사하였다. EGFR (대조군) 에 특이성인 저-표적 대조군 면역사이토카인 425-IL2 는, 일차적으로 IL-2 의 변경된 반감기로 인한 활성을 나타내기 위해 고투여량으로 사용되었다. 결과는 제 10-14 일까지 사망으로 진행되는 일반적 건강 상태, 예를 들어, 마비, 및 마우스의 생존으로 기록하였다. 도 9-12 는 전형적인 결과를 나타낸다. 도 10-12 에서의 데이타는 단일, 대형 실험으로부터 나온 것이나, 데이타는 보기 용이하도록 상이한 도면에 제시된다. 첫번째 항-종양 실험에서 Daudi 세포를 SCID 마우스 내로 i.v. 주사하여, 제 30 일까지 모든 마우스의 마비를 야기하는 광범위하게 파종성 질병을 유발하였다. 치료를 제 7 일까지 연기하여, 종양 세포가 완전히 융합되는 것을 확실히 하였다. 출원인들은 5 번의 매일의 투여량의 면역사이토카인 및 3 회 격일의 투여량의 항체를 사용하여, 저투여량 및 적당한 투여량의 키메라성 및 Leu16VhY/VkZ-IL2 면역사이토카인 둘 다를, 고투여량 리툭시마브와 비교하였다. 면역사이토카인 (약 8 시간) 에 비해서, 훨씬 더 긴 리툭시 마브의 순환 반감기 (여러 일) 때문에 상기 일정을 선택하였다. 상기 조건하에서, 리툭시마브 (25 mg/kg x 3) 는 PBS 대조군에 비해서, 제 39 일부터 제 56 일까지 종양을 갖는 마우스의 생존을 50% 연장시켰다 (도 4). 저투여량의 키메라성 및 Leu16VhY/VkZ-IL2 군 (0.25 mg/kg x 5) 은 고투여량 리툭시마브와 유사한 생존 곡선 (제 64 일에 50% 생존) 을 가졌다. 더 높은 투여량의 면역사이토카인 (1 mg/kg x 5) 으로 치료된 군은, 실험 종료시 (제 110 일) Leu16VhY/VkZ-IL2 군에서 어떤 마우스도 죽지 않았고, chLeu16-IL2 군에서는 단지 1/8 의 마우스만 죽은, 극적인 생존 증가를 나타내었다. 그러므로, Leu16 항체의 에피토프-제거된 V 영역은 IL-2 기재된 면역사이토카인에 있어서, SCID 마우스에서 파종성 림프종의 치료에 대해 쥣과 Leu16 항체의 것만큼 효과적이다. 동일한 실험에서, 항-종양 활성 상에 대한 항체 효과기 기능의 기여를, ADCC 활성을 잃었다고 상기에 제시된 효소적으로 탈-글리코실화된 Leu16VhY/VkZ-IL2 를 사용하여 또한 시험하였다 (도 7B). 도 12 에서 나타나는 바와 같이, ADCC 활성의 감소에도 불구하고, 뚜렷한 일부의 항-종양 활성이 보존되었다. 후반 시간 지점에서, 더 높은 투여량 군에서 손상되지 않은 형태와 탈-글리코실화된 형태 사이의 뚜렷한 차이가 관찰되었다. 그러므로, 본 모델에서 ADCC 가 중요한 역할을 하는 것으로 보이는 한편, 본 모델에서 상당량의 항-종양 활성은 종양 단독에 대해 IL-2 의 표적화된 전달에 기여할 수 있다. IL-2 의 혈청 반감기를 단순히 연장하는 효과와 대조적으로, 표적 세포에 대한 에피토프-제거된 면역사이토카인의 실제적인 결합의 중요성을 다루기 위해, 본 세포주 상에 단지 매우 낮은 수준으로 발현되는 (도 6B), EGFR에 표적하는 대조군 IL-2 면역사이토카인 (Cruz 등. J Biotechnol. (2002) 26; 96: 169-183) 을 시험하였다. 5 일 연속으로 제공된 심지어 더 높은 투여량 (1 mg/kg) 이, 본 모델에서 CD20 에 표적하는 면역사이토카인의 동일한 투여량 (도 13) 보다 항-종양 활성을 훨씬 덜 갖는다는 것이 밝혀졌다. EGFR-표적화된 면역사이토카인은 또한 오직 2 회, 3 일 간격으로 (제 7 일 및 제 10 일) 제공된 동일한 투여량의 Leu16VhY/VKkIL2 보다, 또는 5 일에 걸쳐 제공된 4 배 더 낮은 투여량에서, 보다 두드러지게 낮은 활성을 가졌다. 상기 결과는 항-종양 활성에 표적하는 특이적 종양 세포의 중요성을 논증한다.

개별 항체 및 IL -2 성분의 항-종양 활성. 리툭시마브 및 IL-2 를 병용하는 임상 실험은 증가된 반응비를 나타내고 있다 (Friedberg 등. Br . J. Haematol . (2002); 117: 828-834). 상기 병용을 2 가지 상이한 접근법을 사용하는 동일한 Daudi 림프종 모델에서 시험하고, Leu16VhY/VkZ-IL2 를 처리하는 것과 비교하였다. 첫번째 경우에서, 동물에 20 mg 의 Leu16VhY/VkZ-IL2 중에 함유된 몰당량의 Leu16VhY/VkZ 항체 및 IL-2 를 5 일 연속 i.v. 투여하였다. 2 번째 경우에서, 25 mg/kg 의 리툭시마브 및 10 mcg 의 IL-2 를 3 회 투여 동안 격일로 s.c. 제공하였다. 상기 후자의 투여 양생법은 s.c. 투여의 잔류 효과 때문에 고농도의 항체뿐 아니라 지속되는 IL-2 활성화를 확실히 할 것이다. 결과는 2 가지 병용 프로토콜이 63 일째까지 50% 가 생존한 것으로 대략 동일한 정도의 항-종양 활성을 야기한다는 것을 나타내었다 (도 14). 저투여량 병용군에서 사용된 당량의 Leu16VhY/VkZ-IL2 면역사이토카인으로의 치료는 모든 마우스의 장기간 생존을 야기 하였다. 이것은 특히, 개별 항체 및 IL-2 를 처리한 군이 그의 훨씬 더 긴 반감기 때문에 Leu16VhY/VkZ-IL2 보다 훨씬 더 긴 시간 동안 항체에 노출되므로 주목할만하다. 게다가, 비교하기 위해 사용된 IL-2 의 양은 IL-2 활성 단위가 아닌, 질량에 기초하였다. 상기 표 2 에서 나타난 바와 같이, 유리 rIL-2 는 높은 친화성 IL-2R 을 발현하는 마우스 세포주로 측정한 경우, Leu16VhY/VkZ-IL2 중에 함유된 몰당량의 IL-2 보다 대략 3-배 더욱 활성이다. 오직 중간체 IL-2R 만을 발현하는 마우스 면역 세포에 대해, 상기 차이는 유리 rIL-2 에 비해 10-배 초과이다.

실시예 7. 인간 면역 세포로 재건된 마우스에서의 Leu16VhY , VKZ 분자의 항종양 활성 인간 B 세포로 재건된 SCID 모델에서, 마우스에 제 0 일에 5 x 10⁶ CD20+ Daudi 림프종 세포 및 제 5 일에 4.5 x 10⁷ 인간 PBMC 를 i.v. 주사하였다. 마우스의 한 군 (n=8) 은 PBS 만을 받았고; 한 군은 항체만을 받았고 (제 7, 9 및 11 일에 500 mg); 한 군은 면역사이토카인만을 받았고 (제 11-15 일에 20 mg); 한 군은 항체 (제 7, 9 및 11 일에 500 mg) 및 면역사이토카인 (제 11-15 일에 20 mg) 을 병용해서 받았다. 모든 마우스를 제 21 일 및 제 34 일에 항-인간 IgG ELISA 에 의해 그들의 혈청내에 인간 항체의 존재를 조사하였다. B 림프종 세포 상에서 CD20 에 표적하는 것은, 항원이 정상 B 세포 상에 발현된다는 사실에 의해 복잡해진다. 그러므로, 치료법은 광대한 수의 정상 B 세포의 배경에서 종양 세포의 표적화된 제거를 포함한다. IL-2 면역사이토카인 투여는 IL-2 성분의 독성에 의해 제한되기 쉬우므로, 노출된 항체에 의한 정상 B 세포 제거에 요구되는 고투여량을 Leu16VhY, VKZ-IL2 에 대해 사용할 수 없을 것이다. 병용 치료는, 우선 CD20+ 종양 세포 및 정상 B 세포 둘 다를 탈-벌크 (de-bulk) 하기 위해 리툭시마브를 처리한 후, Leu16VhY, VKZ-IL2 치료가 뒤따르는 임상 접근법일 것이다. 더욱 실제적인 종양 모델을 제조하기 위한 시도에서, 마우스에 인간 B 세포를 함유하는 PBMC 를 주사한 다음, 리툭시마브 또는 Leu16VhY/VkZ-IL2 로의 단일치료법뿐 아니라, 제 7 일에 항체를 단일 투여로 제공한 후, 이어서 Leu16VhY/VkZ-IL2 로의 치료 과정을 제 11 일에 시작하는 병용치료법을 비교하였다. 2 번째 세트의 마우스는 인간 PBMC 로 이식되지 않았으나, 동일한 치료 양생법을 받았다. B 세포가 이식되었다는 확인을 모든 마우스 군에서 인간 IgG 의 농도를 측정함으로써 획득하였다. 표 3 에서의 데이타는 인간 PBMC 를 받은 마우스 모두가 효과적인 조직 이식을 나타내는 500 ug/ml 초과의 인간 IgG 농도를 갖는다는 것을 나타낸다.

표 3. 인간 PBMC 로 이식된 SCID 마우스에서 인간 항체 생산

	제 21 일		제 34 일
치료군	- B 세포	+ B 세포	- B 세포	+ B 세포
PBS	NT	>500	0	>500
DI-Leu16-IL2 (d11-15)	NT	64.1	0.83	88.31
리툭시마브 (d7)	NT	14.32	9.12	6.18
병용	NT	9.55	6.0	5.8

인간 항체를 항-IgG ELISA 에 의해 정량화하고, mcg/ml 로 나타내었다.

- B 세포 군에서 검출되는 항체는 총 순환 항체에 대한 리툭시마브 및 DI-Leu16-IL2 (둘 다 인간 IgG) 의 기여를 나타낸다. 제 21 일에 항체 농도는 Leu16VhY/VkZ-IL2 로의 단일치료법을 포함하는 모든 치료 군에서 극적인 감소를 나타내지만, IgG 농도는 제 34 일에 약간 증가하여, B 세포에 의한 생성이 계속되는 것을 나타낸다. 한편, 리툭시마브 또는 병용 치료는, 제 34 일까지 인간 항체 생성의 제거를 야기하였다. 리툭시마브 및 병용 치료 군 모두의 마우스 혈액에서 검출된 잔여 농도는, PBMC 로 이식되지 않은 상응하는 군에서 동일한 농도를 보이므로, 명확하게 리툭시마브 그 자체였다. 또한 결과는 모든 치료 군의 항-종양 활성이 CD20+ 인간 B 세포의 존재에 의해 뚜렷하게 영향을 받지 않는다는 것을 나타내었다 (도 15). 이론에 구애됨 없이, 이는 부분적으로는 대부분의 이식된 B 세포뿐 아니라 종양 세포를 제거하기 위한 Leu16VhY/VkZ-IL2 단독의 능력 때문일 것이다. 상기 모델에서 Leu16VhY/VkZ-IL2 의 활성 수준은 치료 시작의 지연 때문에 (제 11 일 대 제 7 일) 이전의 실험과 비교하여 뚜렷하게 감소하였으나, 오직 단일 과정의 치료가 상이한 분자와 비교하기 위해 사용되었고, 부가적인 주기의 치료가 임상적으로 사용될 것이라는 것을 유의해야만 한다. 본 출원인들은 또한 단일 투여량의 리툭시마브 후, 단일 과정의 Leu16VhY/VkZ-IL2 를 병용하면, 실험의 종료시에 (제 120 일) 질병이 없이 남아있는 마우스의 대부분이 적어도 부가적인 항-종양 활성을 갖는다는 것을 발견하였다.

실시예 8. 항- CD20 항체로부터 T 세포 에피토프를 제거하기 위한 일반적인 방법 Haisma 등. (Blood 92: 184 (1998)) 은 1H4 라고 부르는, 그의 V 영역이 Leu16 의 V 영역과 약 95% 동일한 또다른 항-CD20 항체를 기술하고 있다. 도 16 은 2B8, Leu16, 본 발명에 따른 그의 에피토프-제거된 유도체, 및 1H4 의 중쇄 및 경쇄 (카파) V 영역의 정렬을 나타낸다. 항체 2B8, Leu16, 및 1H4 의 서열이 그렇게 유사하다는 발견으로부터, 모든 상기 항체가 CD20 에서 동일한 에피토프를 인지한다는 것이 본 발명의 추론이다. 이론에 구애됨 없이, CD20 은 마우스와 인간 사이에서 고도로 보존된 단백질이고, 마우스 CD20 에서 서열 CEPSNSSEKNSPSTQYC (서열 목록 번호: 29) 에 상응하는 CD20 의 세포외 도메인에서 서열 CEPANPSEKNSPSTQYC (서열 목록 번호: 38) 가 있다는 것이 본 발명의 통찰이다. 인간 CD20 에서, 서열 NPS 가 N-글리코실화되지 않은 반면, 마우스 CD20 에서 상응하는 서열 NSS 는 N-글리코실화된다. 본 발명의 상기 이론에 따라, 인간 CD20 내의 N-글리코실화의 결핍은, 마우스 CD20 에는 결여된 항체 에피토프를 노출시켜, 마우스를 인간 CD20 으로 면역화할 경우, 상기 에피토프가 마우스 면역계에 의해 자기로 인식되지 않을 것이다. 그러므로, 본 발명에 따라, CD20 에 대해 유도된 단일클론 항체의 시작 V 영역은 Leu16 또는 2B8 V 영역과 서열이 80% 이상 동일하고, 더욱 종종 서열이 90% 이상 동일하다. 항체 1H4 는 하나의 그러한 예이다. 본 발명에 따라, 예를 들어 1H4 와 같은 항-CD20 항체 중의 T 세포 에피토프는, 첫번째로 Leu16, 2B8, 및 도 16 에서 제시되는 상응하는 에피토프-제거된 변이체를 갖는 중쇄 및 경쇄 V 영역을 정렬하고, 둘째로 Leu16 및/또는 2B8 의 에피토프-제거된 버전에 도입된 돌연변이에 상응하는 1H4 와 같은 CD20 항체의 V 영역에 돌연변이를 도입함으로써 제거한다. 정렬을 수작업 정렬 또는 BLAST 와 같은 잘-공지된 정렬 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 도 16 에서 정렬을 사용하여, 하나 이상의 하기 아미노산 분절을 갖는 항-CD20 Vh 도메인을 발생시키는 것이 명백하다: SGAELKKPGAS, VSCKASGYT, LEWTGAIY, YNQKFKGKT, FKGKTTLTA, YMELSSLRS, SSLRSEDTAV, 및 DWGTGTTVT 즉, 각각 서열 목록 번호: 15-22. 유사하게는, 도 16 에서 정렬을 사용하여, 하나 이상의 하기 아미노산 분절을 갖는 항-CD20 VL 도메인을 발생시키는 것이 명백하다: IITASPGEKV, CRASTSASY, QQKPTSSP, LASGVPSRF, FSGSGSGTT, 및 YSMTISSLE, 즉, 각각 서열 목록 번호: 23-28. 특히, 본 단락의 하나 이상의 전술된 아미노산 분절을 갖는 항체 1H4 의 변이체를 발생시켰다. 새롭게 도입된 돌연변이의 이용은 T 세포 에피토프가 실제로 제거되는 것을 확인하고, T 세포 에피토프 활성의 검출을 위해 표준 방법을 사용하여 추가로 증명할 수 있다. 예를 들어, Carr 등. (미국 특허 출원 제 20030153043 호 및 WO02/069232) 의 것과 같은 방법을 사용할 수 있다. 대안적으로는, 잠재 T 세포 에피토프에 상응하는 펩티드를 면역 세포, 바람직하게는 인간 면역 세포에 첨가하여, 표준 기술에 따라 세포 증식을 자극하는 능력을 시험할 수 있다. 상응하는 V 영역-함유 단백질을 전체 항체, 항체 융합 단백질, Fab, Fab 융합 단백질, 단일-쇄 Fv 단백질, 또는 항체 V 영역의 기타 표준 배열로 배열할 수 있다. 그 다음 상응하는 V 영역-함유 단백질을 상기 실시예에서 기술된 바와 같은 표준 단백질 발현 방법에 따라 제조한다.

<110> Merck Patent GmbH <120> CD20-Binding Polypeptide Compositions <130> P03/157-bz <140> PCT/EP2004/009033 <141> 2004-08-16 <160> 43 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain V region of the 2B8 antibody <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain V region VhC <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly 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Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Epitope Peptides of CD20 <400> 38 Cys Glu Pro Ser Asn Ser Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 39 <211> 992 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding the mature light chain of Leu16 comprising Leu16VK <400> 39 gacatcgttc tgacccagtc tccagcaatc ttgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gagccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccaggc 120 tcctccccca aaccttggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttctctggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt cgaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agcttcaacc cacccacgtt cggtggtggg 300 accaagctgg agatcaaacg taagtggatc ccgcaattct aaactctgag ggggtcggat 360 gacgtggcca ttctttgcct aaagcattga gtttactgca aggtcagaaa agcatgcaaa 420 gccctcagaa tggctgcaaa gagctccaac aaaacaattt agaactttat taaggaatag 480 ggggaagcta ggaagaaact caaaacatca agattttaaa tacgcttctt ggtctccttg 540 ctataattat ctgggataag catgctgttt tctgtctgtc cctaacatgc cctgtgatta 600 tccgcaaaca acacacccaa gggcagaact ttgttactta aacaccatcc tgtttgcttc 660 tttcctcagg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 720 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 780 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 840 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 900 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 960 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 992 <210> 40 <211> 992 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding an epitope-depleted variant of the mature light chain of Leu16 comprising Leu16VKZ <400> 40 gacattgttc tcacccagtc tccagcaatc atcacagcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaaac tacatggact ggtaccagaa gaagccaggg 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt cccttctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gactacttac tctatgacca tcagcagcct cgaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agcttcaacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaatcaaacg taagtggatc ccgcaattct aaactctgag ggggtcggat 360 gacgtggcca ttctttgcct aaagcattga gtttactgca aggtcagaaa agcatgcaaa 420 gccctcagaa tggctgcaaa gagctccaac aaaacaattt agaactttat taaggaatag 480 ggggaagcta ggaagaaact caaaacatca agattttaaa tacgcttctt ggtctccttg 540 ctataattat ctgggataag catgctgttt tctgtctgtc cctaacatgc cctgtgatta 600 tccgcaaaca acacacccaa gggcagaact ttgttactta aacaccatcc tgtttgcttc 660 tttcctcagg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 720 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 780 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 840 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 900 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 960 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 992 <210> 41 <211> 2184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding the mature heavy chain of Leu16 comprising Leu16VH <400> 41 gaggtccagc tccagcagtc tggagctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact agttataata tgcactgggt aaagcagaca 120 cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaagac tctgctgact attactgtgc gaggagtaac 300 tactacggta gtagctactg gttcttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 360 tcttcaggta agtaagcttt tctggggcag gccaggcctg accttggctt tggggcaggg 420 agggggctaa ggtgaggcag gtggcgccag ccaggtgcac acccaatgcc catgagccca 480 gacactggac gctgaacctc gcggacagtt aagaacccag gggcctctgc gccctgggcc 540 cagctctgtc ccacaccgcg gtcacatggc accacctctc ttgcagcctc caccaagggc 600 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 660 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 720 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 780 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 840 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga 900 gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag cgctcctgcc tggacgcatc ccggctatgc 960 agtcccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc ttcacccgga ggcctctgcc 1020 cgccccactc atgctcaggg agagggtctt ctggcttttt ccccaggctc tgggcaggca 1080 caggctaggt gcccctaacc caggccctgc acacaaaggg gcaggtgctg ggctcagacc 1140 tgccaagagc catatccggg aggaccctgc ccctgaccta agcccacccc aaaggccaaa 1200 ctctccactc cctcagctcg gacaccttct ctcctcccag attccagtaa ctcccaatct 1260 tctctctgca gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa 1320 gccagcccag gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat 1380 ccagggacag gccccagccg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg 1440 aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 1500 tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg 1560 tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 1620 aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 1680 ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg 1740 agaaaaccat ctccaaagcc aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga 1800 ggccggctcg gcccaccctc tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtccctaca 1860 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1920 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1980 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 2040 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 2100 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 2160 ctctccctgt ccccgggtaa atga 2184 <210> 42 <211> 2179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding an epitope depleted-variant of the mature heavy chain of Leu16 comprising Leu16VHY <400> 42 gaggtacaac tgcagcagtc tggggctgag ctgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaaacagaca 120 cctggtcagg gcctggaatg gattggagct atttatcccg gaaatggtga tacttcctac 180 aatcagaagt tcaaaggcaa gacaacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggaactca gcagcctgag atctgaggac actgcggtct attactgtgc aagatcgaat 300 tactacggca gcagctactg gttcttcgat gtctggggca ccgggaccac ggtcaccgtc 360 tcttcaggta agctttctgg ggcaggccag gcctgacctt ggctttgggg cagggagggg 420 gctaaggtga ggcaggtggc gccagccagg tgcacaccca atgcccatga gcccagacac 480 tggacgctga acctcgcgga cagttaagaa cccaggggcc tctgcgccct gggcccagct 540 ctgtcccaca ccgcggtcac atggcaccac ctctcttgca gcctccacca agggcccatc 600 ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg 660 cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac 720 cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag 780 cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca 840 caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttggtgag aggccagcac agggagggag 900 ggtgtctgct ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac gcatcccggc tatgcagtcc 960 cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac ccggaggcct ctgcccgccc 1020 cactcatgct cagggagagg gtcttctggc tttttcccca ggctctgggc aggcacaggc 1080 taggtgcccc taacccaggc cctgcacaca aaggggcagg tgctgggctc agacctgcca 1140 agagccatat ccgggaggac cctgcccctg acctaagccc accccaaagg ccaaactctc 1200 cactccctca gctcggacac cttctctcct cccagattcc agtaactccc aatcttctct 1260 ctgcagagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca ggtaagccag 1320 cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg 1380 gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctcagc acctgaactc 1440 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1500 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1560 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1620 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1680 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1740 accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag ggccacatgg acagaggccg 1800 gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca acctctgtcc ctacagggca 1860 gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcacgg gaggagatga ccaagaacca 1920 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga 1980 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg 2040 ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt 2100 cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc 2160 cctgtccccg ggtaaatga 2179 <210> 43 <211> 2578 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding a fusion protein of an epitope-depleted variant of the mature heavy chain of Leu16 comprising Leu16VHY and the cytokine IL2 <400> 43 gaggtacaac tgcagcagtc tggggctgag ctgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaaacagaca 120 cctggtcagg gcctggaatg gattggagct atttatcccg gaaatggtga tacttcctac 180 aatcagaagt tcaaaggcaa gacaacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggaactca gcagcctgag atctgaggac actgcggtct attactgtgc aagatcgaat 300 tactacggca gcagctactg gttcttcgat gtctggggca ccgggaccac ggtcaccgtc 360 tcttcaggta agctttctgg ggcaggccag gcctgacctt ggctttgggg cagggagggg 420 gctaaggtga ggcaggtggc gccagccagg tgcacaccca atgcccatga gcccagacac 480 tggacgctga acctcgcgga cagttaagaa cccaggggcc tctgcgccct gggcccagct 540 ctgtcccaca ccgcggtcac atggcaccac ctctcttgca gcctccacca agggcccatc 600 ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg 660 cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac 720 cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag 780 cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca 840 caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttggtgag aggccagcac agggagggag 900 ggtgtctgct ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac gcatcccggc tatgcagtcc 960 cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac ccggaggcct ctgcccgccc 1020 cactcatgct cagggagagg gtcttctggc tttttcccca ggctctgggc aggcacaggc 1080 taggtgcccc taacccaggc cctgcacaca aaggggcagg tgctgggctc agacctgcca 1140 agagccatat ccgggaggac cctgcccctg acctaagccc accccaaagg ccaaactctc 1200 cactccctca gctcggacac cttctctcct cccagattcc agtaactccc aatcttctct 1260 ctgcagagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca ggtaagccag 1320 cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg 1380 gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctcagc acctgaactc 1440 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1500 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1560 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1620 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1680 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1740 accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag ggccacatgg acagaggccg 1800 gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca acctctgtcc ctacagggca 1860 gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcacgg gaggagatga ccaagaacca 1920 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga 1980 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg 2040 ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt 2100 cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcgccac 2160 cgcgaccccg ggtgcagccc caacttcaag ttctacaaag aaaacacagc tgcaactgga 2220 gcatctcctg ctggatctcc agatgattct gaatggaatt aacaactaca agaatcccaa 2280 actcaccagg atgctcacat tcaagttcta catgcccaag aaggccacag agctcaaaca 2340 tctccagtgt ctagaggagg aactcaaacc tctggaggaa gtgctaaacc tcgctcagag 2400 caaaaacttc cacttaagac ctagggactt aatcagcaat atcaacgtaa tagttctgga 2460 actaaaggga tccgaaacaa cattcatgtg tgaatatgct gatgagacag caaccattgt 2520 agaattccta aacagatgga ttaccttttg tcaaagcatc atctcaacac taacttga 2578

Claims (28)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. C-말단이 IL-2 의 N-말단에 융합된 항-CD20 항체 분자를 포함하는 백혈병, 림프종, 류머티스성 관절염 또는 자가면역 질병 치료용 약학 조성물로서, 상기 항-CD20-IL2 융합 단백질은 하기의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 약학 조성물:

   (i) 서열 목록 번호: 10 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 중쇄 가변 영역;

   (ii) 서열 목록 번호: 12 의 아미노산 잔기 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 및

   (iii) 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역이 인간 IgG1 으로부터 유래됨.
5. 제 4 항에 있어서, 항-CD20-IL 융합 단백질이 서열 목록 번호: 40 및 서열 목록 번호: 43 의 DNA 서열에 의해 엔코딩되는 약학 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 단일클론 항체 리툭시마브 (rituximab) 를 추가로 포함하는 약학 조성물.
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