KR101198426B1 - 흡착수지 컬럼을 이용한 개선된 비배당체 이소플라본 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배당체 이소플라본으로부터 비배당체 이소플라본을 효과적으로 생산하기 위한 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 배당체 이소플라본을 흡착수지가 충진된 컬럼에 흡착시키는 단계, 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 순환시켜 흡착된 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 단계 및 상기 전환된 비배당체 이소플라본을 회수하는 단계를 포함하는 비배당체 이소플라본 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 기존의 방법에 비하여 배당체 이소플라본을 높은 회수율과 전환율로 한번에 많은 양을 신속히 비배당체 이소플라본으로 전환하여 비배당체 이소플라본을 더욱 경제적으로 제조할 수 있다.

Description

흡착수지 컬럼을 이용한 개선된 비배당체 이소플라본 제조방법{Improved method for producing isoflavone aglycone using adsorbent resin column}

본 발명은 대두가공 부산물을 흡착수지 컬럼에 흡착시키고 베타글루코시다제 효소액을 순환시켜 비배당체 이소플라본을 생산하는데 있어서, 경제성을 높인 개선된 베타글루코시다제 효소액의 순환방식에 관한 것으로서, 좀 더 자세하게는 컬럼내 기포주입과 함께 상향류 방식으로 효소액을 순환시킴으로써 비배당체 전환효율을 높인 비배당체 이소플라본 제조방법에 관한 것이다.

최근 식습관과 관련된 질병발생과 관련해서 식물성 식품의 섭취가 질병 예방과 관련이 깊은 것으로 연구되어 발표되고 있으며, 특히 콩의 생리활성 기능에 관심이 집중되고 있다. 연구결과에 의하면 미국인보다 다양한 형태의 콩 가공식품을 많이 섭취하는 아시아인 국가들은 유방암과 전립선암 발생률이 더 낮은데 이는 콩에 함유된 이소플라본의 생리활성 때문이라 한다. 콩 이소플라본은 여성 호르몬인 estrogen과 유사한 구조를 가지며 여성호르몬 유사작용을 약하게 가지기 때문에 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)이라 부른다.

과거에는 두부, 두유 등 대두식품의 불쾌한 맛 성분으로서의 연구가 시작되었으나, 최근 많은 연구를 통해 혈중 콜레스테롤을 낮추고 폐경기 여성의 골격 손실을 억제하여 심혈관질환, 골다공증을 예방할 뿐만 아니라 폐경기 이후의 각종 증후군을 완화하고 유방암, 전립선암, 난소암, 대장암 등의 예방 효과를 보이는 등 이소플라본의 생리적 활성에 대해 활발하게 보고되고 있다. 대두나 대두로 만든 식품에 주로 존재하는 이소플라본은 글루코스 배당체인 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 글라이시틴(glycitin) 등 이들 3종이 대부분이지만, 실제 여러가지 생리활성을 나타내는 이소플라본은 글루코스가 분리된 비배당체 형태인 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein), 글라이시테인(glycitein)으로 이들 성분들은 자연 상태에서는 극히 미량으로만 존재한다. 일부 배당체 이소플라본은 체내 장내 미생물에 의해 비배당체로 전환되기도 하지만 개인별로 전환율의 차이가 크고 생체 흡수율도 낮은 문제가 있어 이소플라본 섭취시 효과를 높이기 위해서는 비배당체 형태의 이소플라본 섭취가 필수적이다.

한편, 두부 제조공정 중 발생하는 부산물인 순물에는 콩의 불용성 섬유질과 다수의 수용성 물질이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 순물의 고형분 함량은 2~3%로 고형분 중 단백질 등의 질소화합물은 약 16%, 당류는 약 53% 정도이며, 특히 기타성분으로 이소플라본 및 사포닌 등의 기능성 물질이 다량 함유되어 있는데, 최근 두부 생산량이 증가함에 따라 연간 국내에서 발생되는 순물의 양도 급격하게 증가하면서 폐수 처리되는 순물에 함유된 이소플라본 및 기능성 물질을 재활용하기 위한 분리 및 정제공정이 개발되어 산업적으로 활용되고 있다.

두부 부산물을 활용하는 종래의 방법으로서, 한국공개특허 제94-9205호에는 두유 및 두부 제조공정 중 발생하는 폐수로부터 대두 올리고당을 추출하기 위하여 침지폐수를 한외여과하고, 이 여액을 이온 교환 수지탑에 통과시킨 후 역삼투를 실시하고 진공농축하여 대두 올리고당을 추출하는 방법을 개시하고 있다. 또한, 한국공개특허 제2000-55133호에서는 두부 폐액을 흡착수지가 충진된 컬럼을 통과시켜 사포닌과 이소플라본을 분리하고 이를 증류수로 세척한 뒤 에탄올을 이용하여 용출하고, 이 용출액을 농축 및 건조하는 공정을 통해 배당체 이소플라본을 추출하는 방법을 개시하고 있다.

한편, 비배당체 이소플라본 제조방법에 관한 기술로는 한국등록특허 10-0346818호가 있으며, 이 기술내용에서는 배당체 이소플라본이 함유된 식물체 추출물을 흡착수지 컬럼에 통과시켜 수지에 흡착시키고, 상기 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 연속적으로 순환시켜 배당체 이소플라본을 비배당체로 변환시킨 후 회수하는 것을 특징으로 하는 비배당체 이소플라본 제조방법을 개시하고 있다.

그러나 이와 같은 방법은 60시간의 장시간 효소 처리에도 불구하고 비배당체 이소플라본 전환율이 저조하여 경제성이 떨어지며, 많은 양의 기질을 처리하기에는 한계가 있다.

본 발명자들은 종래 비배당체 이소플라본 생산 공정의 효율을 높이는 방법에 관하여 연구하던 중 효소액 순환방식을 상향류(bottom-up) 방식으로 하며, 기포를 함께 주입시키는 경우 비배당체 전환율이 극대화 되는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은

(a) 배당체 이소플라본을 흡착수지가 충진된 컬럼에 흡착시키는 단계;

(b) 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 순환시켜 흡착된 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 단계; 및

(c) 상기 전환된 비배당체 이소플라본을 회수하는 단계

를 포함하는 비배당체 이소플라본 제조방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

(a) 배당체 이소플라본을 흡착수지가 충진된 컬럼에 흡착시키는 단계;

(b) 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 순환시켜 흡착된 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 단계; 및

(c) 상기 전환된 비배당체 이소플라본을 회수하는 단계

를 포함하는 비배당체 이소플라본 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

(a) 배당체 이소플라본을 흡착수지가 충진된 컬럼에 흡착시키는 단계;

(b) 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 순환시켜 흡착된 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 단계; 및

(c) 상기 전환된 비배당체 이소플라본을 회수하는 단계

를 포함하는 비배당체 이소플라본 제조방법.

것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 비배당체 이소플라본 제조방법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(a) 단계 : 배당체 이소플라본을 흡착수지가 충진된 컬럼에 흡착시키는 단계

(a)단계에서는 흡착수지가 충진된 컬럼에 배당체 이소플라본을 흡착시킨다.

상기 흡착수지는 방향족계 합성수지가 바람직하며, 예를 들면 Diaion HP 20(mitsubishi社) 합성흡착제를 사용할 수 있다.

이소플라본은 주로 식물에 존재하는 Phytochemical의 일종으로 이소플라보노이드(isoflavonoids)에 속한다. 콩과, 장미과, 붓꽃과 등의 식물에 널리 분포되어 있고 그 대부분은 배당체로 존재한다.

본 발명의 배당체 이소플라본은 통상의 방법에 따라 얻을 수 있으며, 예를 들어 상업적으로 판매하는 것을 구입하거나, 배당체 이소플라본을 포함하는 식물로부터 추출할 수 있으며, 바람직하게는 콩과 식물로부터 추출할 수 있다. 더욱 바람직하게는 두부 생산과정에서 발생되는 순물일 수 있다.

또한 상기 (a) 단계는 (a1) 배당체 이소플라본을 포함하는 용액을 흡착수지가 충진된 컬럼에 SV 1 내지 2.5의 속도로 BV 8 내지 14만큼 통과시켜 배당체 이소플라본을 흡착시키는 단계 및 (a2) 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 수세액을 SV 0.5 내지 2의 속도로 BV 10 내지 16만큼 통과시켜 수세하는 단계로 구성될 수 있다.

또한 상기 (a1) 및 (a2) 단계는 순차적으로 2회 내지 5회 반복하여 배당체 이소플라본을 흡착할 수 있다.

상기 SV는 공간속도(space velocity)의 약자로 컬럼내 시간당 통액량을 흡착수지의 체적으로 나눈 수치이며, BV는 수지부피(Bed volume)의 약자로 컬럼안의 충진제가 차지하는 부피를 뜻한다.

상기 (a1) 단계에서는 배당체 이소플라본을 포함하는 용액을 흡착수지가 충진된 컬럼에 SV 1 내지 2.5의 속도로 BV 8 내지 14만큼 통과시켜 배당체 이소플라본을 흡착시킨다.

상기 배당체 이소플라본을 포함하는 용액은 이소플라본을 함유한 식물의 이소플라본 추출 용액일 수 있으며, 바람직하게는 두부 생산과정에서 발생되는 순물 일 수 있다. 상기 순물은 흡착의 효율성을 높이기 위하여 흡착 전 원심분리 또는 필터링 공정을 통하여 불순물을 제거하고 사용할 수 있다.

상기 흡착 단계에서 배당체 이소플라본을 포함하는 용액의 통액속도가 SV 2.5를 초과하는 경우 흡착수지의 이소플라본 흡착율이 저하되는 문제가 발생하며, SV 1 미만인 경우 흡착시간이 지나치게 길어져 비효율적이다.

상기 (a2) 단계에서는 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 수세액을 SV 0.5 내지 2의 속도로 BV 10 내지 16만큼 통과시켜 수세한다.

상기 수세과정을 통하여 배당체 이소플라본과 함께 수지에 부착된 불순물을 제거한다. 배당체 이소플라본이 함유된 용액은 많은 기타 부산물을 포함하고 있으며, 흡착과정에서 흡착수지에 부착되게 된다. 이러한 불순물은 흡착수지에 배당체이소플라본이 흡착되는 것을 방해하여 그 효율을 저하시킨다. 본 발명 방법의 상기 수세과정을 통하여 이러한 불순물을 제거하면 흡착수지의 흡착용량이 높아져 추가로 배당체 이소플라본을 흡착할 수 있게 된다. 그러나 상기 수세 단계에서 사용되는 수세액의 양 및 통액 속도에 따라 불순물이 충분히 제거되지 않거나, 이소플라본이 수세과정에서 함께 제거되므로 그 수세 조건 조절이 중요하다. 또한 수세액의 온도도 불순물 제거에 영향을 주기 때문에 40 내지 60℃ 범위에서 수세하는 것이 바람직하다.

본 발명의 수세액은 컬럼내 흡착된 배당체 이소플라본을 용리시키지 않으면서 불순물을 제거할 수 있는 용액이면 어떤 것이나 가능하나, 바람직하게는 정제수 일 수 있다.

본 발명의 (a2) 수세단계에서 사용되는 정제수의 양은 BV 10 내지 16인 것이 바람직하다. BV 10 미만으로 수세하는 경우 불순물이 충분히 제거되지 않을 수 있으며, BV 16을 초과하는 양으로 수세하는 경우 비효율적이며, 흡착된 배당체 이소플라본의 유실 가능성이 높아진다.

또한 수세액을 컬럼에 통과시키는 속도는 SV 0.5 내지 2가 바람직하다. 수세액의 유속이 SV 2를 넘게 되면 수지에 흡착된 이소플라본의 유실율이 증가되는 문제가 발생하며, SV 0.5 미만의 속도로 수세하는 경우 불순물이 충분히 제거되지 않을 수 있으며, 많은 시간이 소요되어 비효율적이다.

또한 상기 (a1) 및 (a2) 단계를 순차적으로 2회 내지 5회 반복할 수 있다. 상기 (a2) 수세단계를 통하여 컬럼내의 배당체 이소플라본이 흡착된 흡착수지의 불순물이 제거되므로 연속적인 배당체 이소플라본의 흡착이 가능하다.

본 발명의 일실시예에서는 흡착수지를 1,000L 충진시킨 컬럼에 순물 12,000L를 6시간동안 통과시켜 이소플라본 배당체를 흡착시킨 후, 12,000L의 정제수를 12시간 동안 통과시켜 수세하였다. 이를 3회 반복하여 총 36,000L의 순물에 포함된 배당체 이소플라본을 하나의 컬럼에 모두 흡착시켰으며, 순물로부터 회수한 총 배당체 이소플라본 회수율은 96.5%로 확인되었다.

이로서 본 발명의 방법은 기존의 방법에 비하여 월등히 많은 양의 배당체 이소플라본을 한 번에 처리할 수 있으므로 매우 경제적임을 알 수 있다.

(b) 단계 : 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 순환시켜 흡착된 배당체 이소플라본 을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 단계

(b) 단계에서는 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 순환시켜 흡착된 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환한다.

상기 베타글루코시다제(β-glucosidase)는 두 글루코오스 또는 글루코오스 치환기 분자를 연결한 베타 1-4 결합에 작용하는 효소들을 말한다. 베타 글루코시다제는 베타-D-글루코시드의 비 환원 말단잔기의 가수분해를 촉매하여 글루코오스를 방출한다.

통상 비배당체 전환을 위해 상업적으로 사용할 수 있는 효소는 베타글루코시다제의 역가가 우수한 싸이톨라제 피씨엘5(cytolase PCL5)나 멀티펙트 펙티나이제 에프이(Multifect pectinase FE)가 대표적이며, 효소의 양은 반응시키고자 하는 배당체 이소플라본의 총 중량 대비 4배 내지 8배의 양으로 사용하는 것이 바람직하다.

상기 (b) 단계의 효소액 순환 속도는 SV 3 내지 SV 6 이며, 상기 기포 주입 속도는 SV 0.1 내지 SV 0.5 인 것이 바람직하다.

효소액의 순환속도가 SV 6을 초과하면 효소와 기질간의 접촉시간이 짧아져서 이소플라본 전환율이 감소 할 수 있으며, 순환속도가 SV 3 미만으로 낮은 경우 효소 반응시간이 길어져서 비효율적일 수 있다.

또한 효소액의 pH는 3.5 내지 4.5 이며, 온도는 35℃ 내지 45℃인 것이 바람직하다.

효소액의 pH는 효소의 활성에 영향을 준다. 본 발명의 효소액의 pH는 사용되는 효소의 활성을 감소시키지 아니하는 범위이면 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 베타글루코시다제의 활성이 최고점에 이르는 pH 3.5 내지 pH 4.5일 수 있다.

효소액의 온도도 효소의 활성을 감소시키지 아니하는 범위이면 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 35℃ 내지 45℃ 일 수 있다. 효소액의 온도가 지나치게 낮은 경우 효소의 활성이 떨어질 수 있으며, 지나치게 높은 경우 단백질로 구성된 효소가 실활 될 수 있다.

(c) 단계 : 상기 전환된 비배당체 이소플라본을 회수하는 단계

(c) 단계에서는 상기 전환된 비배당체 이소플라본을 회수한다. 본 발명의 회수단계는 비배당체 이소플라본의 용출이 가능한 용출액을 컬럼에 흘려보내어 비배당체 이소플라본을 회수한다. 상기 용출액을 이용한 회수 단계 전 비배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼을 정제수로 흘려보내 남아 있는 효소 및 불순물 등을 제거할 수 있다.

상기 용출액은 비배당체 이소플라본을 용출할 수 있는 용액이면 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 탄소수 1개 내지 4개의 저급 알코올 또는 물과 탄소수 1개 내지 4개의 저급 알코올의 혼합용액 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에탄올 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 전환이 완료된 컬럼에서 효소액을 제거하고 80% 주정으로 흡착된 이소플라본을 회수하였다. 이소플라본이 포함된 주정용리액은 진공농축을 통하여 주정을 제거하고 여액을 5℃ 이하로 냉각하여 결정화시키고, 이를 회수 건조하여 최종적으로 비배당체 이소플라본 분말을 얻었다.

본 발명의 방법은 배당체 이소플라본으로부터 높은 효율로 비배당체 이소플라본을 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 방법에 의하면 배당체 이소플라본을 기존의 방법에 비하여 월등히 많은 양을 한 번에 처리할 수 있으므로 시간 및 비용 면에서 훨씬 경제적이다.

본 발명의 이러한 효과는 본 발명의 실시예에서 입증되었다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 방법으로 비배당체 이소플라본을 제조하였다. 두부 생산과정에서 발생한 순물 36,000L를 원심분리로 불순물을 제거한 후 살균 과정을 거쳐, 합성흡착수지가 1,000L 충진된 컬럼에 흡착시켰다. 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 효소액을 24시간 동안 기포와 함께 상향류(bottom-up) 방식으로 순환시켜 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하였다. 전환된 비배당체 이소플라본을 80% 주정으로 용리시켜 수득한 후 주정을 제거하고 냉각결정 및 건조 과정을 통해 비배당체 이소플라본 분말을 수득하였다. 수득한 분말의 비배당체 이소플라본 함량은 730,000mg/kg이며, 비배당체 전환율은 99.5%로 확인되었다. 또한 흡착시킨 순물로부터의 총 배당체 이소플라본의 회수율은 96.5%로 확인되었다. 이로선 본 발명의 방법에 의하는 경우 비배당체 전환율을 극대화 할 수 있음을 확인하였고, 본 발명의 흡착방법에 의하면 기존의 방법에 비하여 월등히 많은 배당체 이소플라본을 한 번에 처리할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 이소플라본 전환 방식에 따른 이소플라본 전환율을 비교하였다. 하향류(top-down), 상향류(bottom-up) 및 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 각각 효소액을 순환시키면서 효소 전환율을 측정하였다.

그 결과 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 효소액을 기포와 함께 순환시키는 경우 이소플라본 전환율이 가장 우수한 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 이소플라본 전환 조건에 따른 이소플라본 전환율을 비교하였다. 효소액의 온도, pH 및 상향류 유속에 따른 전환율을 비교하였다.

그 결과 효소액 순환 속도는 SV 3 내지 SV 6 인 경우 가장 전환율이 우수한 것을 확인하였다. 또한 효소액의 pH는 3.5 내지 4.5 사이이며, 온도는 35℃ 내지 45℃인 것이 가장 효율적인 것을 확인하였다.

따라서 이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 배당체 이소플라본을 높은 회수율과 전환율로 한번에 많은 양을 신속히 비배당체 이소플라본으로 전환하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 기존의 방법에 비하여 효율적으로 이소플라본을 전환할 수 있어 비배당체 이소플라본을 더욱 경제적으로 제조할 수 있다.

도 1은 효소액 순환 방식의 모식도를 나타낸 그림이다.
도 2는 순물에 함유된 이소플라본 성분을 나타내는 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

비배당체 이소플라본 제조

<1-1> 이소플라본 흡착

두부 생산과정에서 발생되는 순물 원수를 수집하여 상온으로 온도를 낮춘 다음, 연속식 원심분리기를 이용하여 3,000G로 원심분리하여 불순물을 제거하였다. 불순물이 제거된 순물 여액은 순간살균기를 이용하여 90℃에서 20초간 살균하고 다시 상온이 될 때까지 냉각시켜 합성흡착수지인 Diaion HP-20 수지가 1,000 L 충진되어 있는 컬럼에 이소플라본을 흡착시켰다. 순물을 흡착시키기 전 순물의 배당체 이소플라본 함량을 분석한 결과 80 mg/kg으로 확인되었다.

순물 흡착은 12,000 L의 순물을 한번에 연속적으로 6시간 동안 컬럼에 흘려 보내고, 정제수 12,000 L를 다시 12시간 동안 천천히 통과시켜 컬럼을 수세시켰다. 이와 같이 조작을 3일 동안 3회 반복 실시하여 36,000 L의 순물을 동일한 컬럼에 모두 흡착시켰고, 이때 컬럼에 흡착된 배당체 이소플라본 함량은 2,880 g으로 산출되었다.

순물에 함유된 배당체 이소플라본 함량은 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 분석하였다. 순물을 100% 메탄올에 초음파처리를 통해 용해시킨 후, 여과하여 수득한 액상성분을 HPLC에 주입하였다. C18을 고정상으로 하는 컬럼(Symmetry 5u C18, 150 x 3.9mm)을 사용하여, 이동상으로는 초산이 0.1% 함유된 아세토니트릴(acetonitrile)과 물을 gradient 방식으로, 초기에는 물과 아세토니트릴의 비율이 85 : 15로 시작하여 50분까지 65 : 35로 점진적으로 변화시키면서 용출시켰다. 이동상의 용출속도는 1.0 ml/min로 하였고, UV 검출기 파장은 254 nm로 유지시켜 이소플라본을 검출하였다. [도 2]는 순물의 HPLC 분석결과로서, 배당체 이소플라본(다이드진, 제니스틴, 글라이시틴)과 비배당체 이소플라본(다이드제인, 제니스테인, 글라이시테인)의 분석피크를 크로마토그램에 나타내었다.

<1-2> 효소액을 이용한 이소플라본 전환 및 회수

효소액 제조를 위해 싸이톨라제 피씨엘5 효소를 배당체 이소플라본 흡착량 대비 4배인 17,280g을 1,500 L 정제수에 용해시키고 수산화나트륨을 가하여 pH를 4.5로 조절하였고, 이를 컬럼에 투입하고 40℃로 가온 유지시키면서 기포와 함께 bottom-up으로 24시간 동안 순환시켜 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환시켰다.

효소 전환이 완료된 컬럼에서 효소액을 제거하고 80% 주정 2,000 L를 90분간 흘려 보내서 수지에 흡착된 이소플라본을 회수하였다. 상기 주정 용리액에서는 진공농축을 통해 주정을 제거하고 여액은 5℃ 이하로 냉각하여 결정화시키고 이를 회수하여 건조시켜 최종적으로 비배당체 이소플라본 분말을 얻었다.

실시예를 통해 수득한 분말의 중량은 2.4kg이며, 비배당체 이소플라본 함량은 730,000mg/kg, 비배당체 전환율은 99.5%로 확인되었다.

한편, 흡착시킨 순물로부터의 총 배당체 이소플라본 회수율은 96.5%로 확인되었다. 이로서 본 발명의 흡착 및 수세를 수회 반복하는 흡착 방법은 이소플라본의 손실이 거의 없이 기존 방식에 비하여 많은 양의 이소플라본을 흡착시킬 수 있음을 확인하였다.

총 배당체 이소플라본 회수율은 합성수지컬럼에 흡착시킨 순물의 총 배당체 이소플라본 함량 대비 컬럼을 통과한 순물 여액의 총 배당체 이소플라본 함량의 비율의 나머지 값을 백분율로 나타낸 것으로 수학식 1에서 상세히 기술하였다.

<수학식 1>

또한 비배당체 이소플라본 전환율은 합성수지컬럼에 흡착시킨 순물의 총 배당체 이소플라본 함량 대비 최종 수득한 이소플라본 분말의 총 비배당체 이소플라본 함량의 비율을 백분율로 나타낸 것으로, 특히 배당체에서 비배당체로의 전환시 배당체의 글루코스가 제거되면서 분자량이 감소하기 때문에 배당체 이소플라본 함량에 비배당체 전환계수인 0.625를 곱하여 환산하는 것이 중요하며, 이에 대해서는 수학식 2에서 상세히 기술하였다.

<수학식 2>

< 실시예 2>

흡착방식에 따른 이소플라본 흡착율 비교

흡착과 수세를 반복하는 본 발명의 방법과 1회 흡착을 하는 기존의 방법 간 이소플라본 흡착율을 비교 하였다.

<실시예 1> 과 동일한 방법으로 순물을 준비하여 Diaion HP-20 수지가 1,000 L 충진되어 있는 컬럼에 이소플라본을 흡착시켰다. 순물을 흡착시키기 전 순물의 배당체 이소플라본 함량을 분석한 결과 80 mg/kg으로 확인되었다.

순물 흡착은 8,000 L의 순물(BV 8)을 한 번에 연속적으로 4시간 동안 컬럼에 흘려 보내고, 정제수 12,000 L를 다시 12시간 동안 천천히 통과시켜 컬럼을 수세시켰다. 이와 같이 조작을 7회 반복실시하며, 매번 컬럼을 통과한 순물을 회수하여 흡착되지 않고 빠져나온 배당체 이소플라본의 양을 <실시예 1>과 동일한 방법으로 측정하였다.

대조군으로는 동일한 조건으로 순물을 준비하고 동일한 조성의 컬럼에 순물을 흘려보내 흡착시키되, 중간 수세 과정 없이 연속적으로 순물을 로딩하여 흡착을 진행하였다.

36,000L의 순물(BV36)을 18시간 동안 컬럼에 흘려보내며, 매 두 시간마다 컬럼을 통과한 순물을 회수하여 흡착되지 않고 빠져나온 배당체 이소플라본의 양을 <실시예 1>과 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과 기존의 방법에 의하는 경우 [표 1]에서 보는 바와 같이, 일정량 이상의 순물(BV 12)이 통과하고 나면, 배당체 이소플라본의 흡착율이 급격히 떨어지지만, 본 발명의 방법에 따라 수세와 흡착을 반복하는 경우 [표 2]에서 보는 바와 같이, 컬럼의 40배 이상을 흘려보내어도 배당체 이소플라본의 흡착율이 95%이상 유지되는 것을 확인하였다.

단회 순물 로딩시 흡착수지의 최대 흡착량 측정 결과

	BV4	BV8	BV12	BV16	BV20	BV24	BV28	BV32	BV36
순물내 이소플라본 회수율(%)	99.5	97.6	85.4	65.8	54.2	51.3	48.5	45.6	43.2

본 발명의 방법에 의한 순물 로딩시 흡착수지의 최대 흡착량 측정 결과

	BV8	BV16	BV24	BV32	BV40	BV48	BV56
순물내 이소플라본 회수율(%)	99.5	99.2	98.5	97.3	95.2	89.4	75.6

< 실시예 3>

효소 순환 방식에 따른 비배당체 이소플라본 전환율 비교

<3-1> 효소 순환방식별 비배당체 이소플라본 전환율 비교-12시간 효소 순환

이소플라본 전환시 효소액의 순환방식을 달리하여 비배당체 이소플라본 전환율을 측정하였다. 하향류는 일반적으로 알려진 방식으로 컬럼 상부에 효소액을 투여하여 컬럼을 통과하여 아래로 빠져나가게 하는 방식이며, 상향류는 컬럼의 아래에서 효소액을 통하여 컬럼을 통과하여 위로 빠져나가게 하는 방식이다. 상향류 및 기포주입의 복합순환방식(상향류와 기포주입복합 방식)은 효소액을 상향류 방식으로 통과시키되 동시에 기포주입을 하는 방식이다. 효소 전환시간은 12시간, 상향류 유속은 SV5, 온도는 40℃로 실험하였다.

그 결과 [표 3]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 전환하는 경우 기포주입 없이 효소액만 하향류 또는 상향류로 순환하는 방식에 비하여 비배당체 이소플라본 전환율이 월등히 높은 것을 확인하였다.

또한, 일반적인 생산현장에서는 비배당체 전환율 목표를 통상 95% 수준으로 설정하고 있는데 효소순환을 12시간으로 한정하는 경우에는 하향류 또는 상향류 순환방식으로는 상업적으로 활용하기 어려울 것으로 판단된다.

<3-2> 효소첨가량에 따른 순환방식별 비배당체 이소플라본 전환율 비교-24시간 효소 순환

실시예 3-1에서와 동일한 방법으로 24시간 동안 효소를 순환 시켜 비배당체 이소플라본 전환율을 측정하였다. 효소 전환시간은 24시간, 상향류 유속은 SV5, 온도는 40℃로 실험하였다.

그 결과 [표 4]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 전환하는 경우 기포주입 없이 효소액만 하향류 또는 상향류로 순환하는 방식에 비하여 비배당체 이소플라본 전환율이 월등히 높은 것을 확인하였다. 특히 하향류로 효소를 순환시키는 경우 기질의 10배의 효소를 투여하고 24시간 동안 효소액을 순환하여 전환하여도 이소플라본의 전환율은 80%대를 넘지 못하는 것을 알 수 있다. 따라서 효소액의 순환 방향을 일반적인 하향류로 하는 경우 비배당체 이소플라본 전환에 한계가 있음을 알 수 있다. 또한 상향류로 효소액을 순환시켜도 기포주입을 동시에 하는 본 발명의 방법에 비하여 2배 이상의 효소액 또는 2배 이상의 시간이 소요되는 것을 알 수 있다.

< 실시예 4>

효소 전환 조건에 따른 비배당체 이소플라본 전환율 비교

<4-1> 효소액 온도별 전환율 비교

효소액의 온도를 각각 달리하여 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하였다. 효소 전환시간은 24시간, 상향류 유속은 SV5, pH는 4.0 및 4.5로 각각 실험하였다.

그 결과 [표 5]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면 효소액의 온도가 35℃ 내지 45℃인 경우 우수한 이소플라본 전환율을 보이는 것을 확인하였다. 특히 효소액의 온도가 40℃ 전후인 경우 가장 전환율이 우수한 것을 확인하였다.

효소액 온도에 따른 전환율 변화

	35℃	40℃	45℃
pH 4.0	89.4%	98.8%	85.6%
pH 4.5	91.7%	99.5%	80.4%

<4-2> 효소액 pH 별 전환율 비교

효소액의 pH를 각각 달리하여 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하였다. 효소 전환시간은 24시간, 상향류 유속은 SV5, 온도는 40℃로 실험하였다.

그 결과 [표 6]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면 효소액의 pH가 3.5 내지 4.5인 경우 이소플라본 전환율이 우수하며, pH 4.0에서 4.5 사이가 매우 우수한 것을 확인하였다. 또한 pH가 4.5에서 pH가 5.0로 변하는 구간에서 전환율이 급격히 하락하는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 방법에 의하여 비배당체 이소플라본을 제조하는 경우 pH는 3.5에서 4.5가 바람직한 것을 확인하였다.

효소액 pH에 따른 전환율 변화

pH	3.5	4.0	4.5	5.0
전환율	91.1%	98.8%	99.5%	80.2%

<4-3> 상향류 유속에 따른 전환율 비교

상향류로 순환되는 효소액의 유속을 달리하여 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하였다. 효소 전환시간은 24시간, 온도는 40℃로 실험하였다.

그 결과 [표 7]에서 보는 바와 같이, 상향류 유속이 SV3 미만인 경우 전환율이 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 이로서 본 발명의 방법에 의하는 경우 순환되는 효소액의 유속은 SV 3 내지 SV 6이 적합한 것을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 배당체 이소플라본을 높은 회수율과 전환율로 한번에 많은 양을 신속히 비배당체 이소플라본으로 전환하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 기존의 방법에 비하여 효율적으로 이소플라본을 전환할 수 있어 비배당체 이소플라본을 더욱 경제적으로 제조할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (5)

1. (a) 배당체 이소플라본을 흡착수지가 충진된 컬럼에 흡착시키는 단계;
   (b) 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 순환시켜 흡착된 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 단계; 및
   (c) 상기 전환된 비배당체 이소플라본을 회수하는 단계
   를 포함하는 비배당체 이소플라본 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는
   (a1) 배당체 이소플라본을 포함하는 용액을 흡착수지가 충진된 컬럼에 SV(공간속도, Space velocity) 1 내지 2.5 의 속도로 BV(수지부피, Bed volume)의 8배 내지 14배만큼 통과시켜 배당체 이소플라본을 흡착시키는 단계; 및
   (a2) 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 수세액을 SV(공간속도, Space velocity) 0.5 내지 2의 속도로 BV(수지부피, Bed volume)의 10배 내지 16배만큼 통과시켜 수세하는 단계
   로 구성되며, 상기 (a1) 및 (a2) 단계를 순차적으로 2회 내지 5회 반복하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 흡착수지는 방향족계 흡착수지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 효소액 순환 속도는 SV(공간속도, Space velocity) 3 내지 6 이며, 상기 기포 주입 속도는 SV(공간속도, Space velocity) 0.1 내지 0.5 인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 효소액의 pH는 3.5 내지 4.5 이며, 온도는 35℃ 내지 45℃인 것을 특징으로 하는 제조방법.

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