KR101194891B1

KR101194891B1 - 해룡 추출물을 포함하는 자외선으로 인한 피부 손상 예방 및 치료용 의약품 조성물

Info

Publication number: KR101194891B1
Application number: KR1020120003823A
Authority: KR
Inventors: 박찬익; 김보애; 장정희; 이찬
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-15
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2012-10-25
Also published as: KR20120016302A; KR101202468B1; KR20110115499A; KR20120016303A; KR101194907B1

Abstract

본 발명은 해룡 추출물을 이용한 자외선으로 인한 피부의 산화적 스트레스에 의하여 발생하는 피부 손상을 예방 및 치료할 수 있는 의약품 조성물에 관한 것이다.

Description

해룡 추출물을 포함하는 자외선으로 인한 피부 손상 예방 및 치료용 의약품 조성물{Pharmaceutical composition containing extract of Syngnathoides biaculeatus for preventing and curing of UV-induced skin damage}

본 발명은 자외선으로 유도된 섬유아세포 손상, 즉 피부의 광산화에 의한 광노화를 예방하고 치료하는 효과가 탁월한 항산화 효과를 갖는 의약품 조성물에 관한 기술이다. 특히, 본 발명은 종래 육상 식물을 주성분으로 하는 항산화 조성물과는 달리, 특정 해양생물을 주성분으로 하는 항산화 효과를 갖는 의약품 조성물에 관한 기술에 관한 것이다.

피부는 기본적인 신진대사 과정을 통하여 우리 몸의 항상성을 저해하는 다양한 외부 요인으로부터 위해를 막아주는 일차적인 기능을 담당하고 있다. 즉, 피부는 신체 가장 바깥쪽에 위치함으로써 물리적, 화학적, 생물학적 장벽기능을 통한 보호작용, 체온조절작용, 감각작용, 분비 및 배설작용, 흡수작용, 저장작용, 재생작용 등의 다양한 역할을 수행하고 있지만, 지속적인 외부 스트레스가 가해지는 경우 가장 손상을 받기 쉽다. 이러한 외부 스트레스의 주요 원인으로는 자외선 노출, 배기가스, 황사, 환경오염물, 중금속, 온도변화, 미생물을 대표적인 예로 들 수 있으며, 이들은 주로 산화적 스트레스(oxidative stress)를 통하여 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성함으로써, 항산화 방어체계를 붕괴시켜 세포 손상 및 사멸을 야기하게 된다.

최근 활성산소종이 다양한 종류의 인체 질병에 관련되어 있음이 밝혀짐에 따라 활성산소의 생체 내 발생 및 생성억제에 관한 연구가 전 세계적으로 활발히 수행되고 있다. 활성산소종은 산소보다 산화력이 더 큰 분자들로, 초산화음이온(superoxide anion), 과산화수소, OH 라디칼(hydroxyl radical), 일중산소(singlet oxygen), 과산화라디칼(peroxy radical) 등을 포함한다. 세포 내 주요한 활성산소종은 미토콘드리아 전자전달계, 퍼옥시좀(peroxisome)의 지방산 대사과정, 시토크롬(cytochrome) P450, 잔틴산화효소(xanthine oxidase), NADPH 옥시다제, 사이클로옥시지나제 등의 다양한 효소들로부터 생성이 되는 것으로 알려져 있다. 적절한 농도의 활성산소는 체외로부터 침입하는 병원균, 바이러스, 이물질들을 상대로 강력한 방어 역할을 하지만, 과량으로 생성되는 경우 세포와 장기를 공격하여 노화 및 이와 관련된 만성, 난치성 질환을 일으키는 원인이 된다.

외부 스트레스 중 태양광선 특히 자외선(ultraviolet, UV)은 활성산소종의 생성을 통하여 피부 세포 및 조직에 손상을 일으키며, 지속적인 스트레스는 생체내 거대분자인 지질의 과산화, 단백질 산화, DNA 산화, 단백 분해효소 활성화, 탄력섬유 손상, 멜라닌 생성반응, 염증반응, 면역기능 저하 등을 유발하며 궁극적으로 피부 노화 과정을 가속화하는 것으로 알려져 있다. 특히, 자외선은 파장의 길이에 따라 장파장(UV-A, 320~400 nm), 중파장(UV-B, 290~320 nm), 단파장(UV-C, 200-290 nm)로 구분된다. 자외선 A는 피부 내 진피까지 도달하며 탄력 및 교원섬유의 변성으로 인한 피부탄력 감소, 피부위축, 주름형성, 색소침착, 광독성, 광알러지, 피부암 등을 유발할 수 있다. 자외선 B는 표피의 기저층 또는 진피의 상부까지 도달하며 다량으로 노출되는 경우 면역저하, 염증악화, 피부각화, 홍반, 일광화상, 색소침착, DNA 손상, 피부암 등을 일으키게 된다. 특히, 자외선 A 및 자외선 B 조사 후 생체 내 활성산소의 증가 및 내인성 항산화 효소 및 항산화제들의 감소가 보고되고 있으며, 그 결과로 인하여 광노화 과정이 촉진되게 된다.

따라서, 외부 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 노화를 예방하기 위해서는 활성산소로 인한 산화적 스트레스를 억제하고, 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있는 항산화 방어 강화가 중요하며, 최근에는 인체에 무해하고 보다 강력한 항산화력을 가진 천연 물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

예를 들어, 한국공개특허 제10-2009-70455호에서는 초임계 자초 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있으며, 한국공개특허 제10-2009-92898호에서는 정향, 백단향, 감송향, 침향, 귤홍, 회향, 곽향, 백복령, 백급, 백작약, 백과, 백삼, 백질려 및 백렴으로 구성되는 생약 추출물과 칠향팔백산을 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있으며, 한국특허등록 제10-899502호에서는 석류, 무화과, 은행, 오디로 구성된 혼합물의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있다. 또한, 한국특허등록 제10-898307호에서는 금은화, 백작약, 고삼, 황금, 오배자, 녹차, 도엽, 은행잎으로부터 추출된 한방식물 추출물을 함유하여 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있다.

상기 종래 특허기술들은 육상의 식물, 특히, 약초의 추출물을 주성분으로 하여 항산화효과를 가지는 화장료 조성물을 제시하고 있으나, 바다에 존재하는 생물을 이용하여 항산화 효과를 갖는 의약품 조성물에 대하여는 현재까지 특별한 연구가 이루어지고 있지 않고 있다.

본 발명의 목적은 자외선으로 인하여 피부 세포에 생성된 유해한 라디칼의 소거능이 탁월하고, 자외선으로 인한 섬유아세포의 세포독성 및 사멸, 산화적 스트레스를 억제하고, 세포 내 항산화 기능을 강화시킬 수 있는 의약품 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 종래 육상 식물 위주의 항산화 효과를 갖는 의약품 조성물이 아닌 해양 생물을 이용한 천연 의약품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여 해룡 추출물을 포함하는 자외선으로 인한 피부 손상 예방 및 치료용 의약품 조성물을 제공한다.

특히, 상기 해룡 추출물의 농도는 전체 조성물 중 0.01 ~ 50 중량%가 바람직하다.

특히, 상기 해룡 추출물은 열수 추출물인 것이 바람직하다.

본 발명의 추출물을 이용한 조성물은 자외선에 의한 피부 세포의 노화를 촉진하는 산화적 스트레스를 방지하기 위한 항산화 작용 효과가 매우 우수함을 확인할 수 있었다. 해양생물 추출물의 라디칼 소거능을 DPPH(1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 사용하여 비교 측정한 결과 미역, 모자반, 다시마, 해마, 석결명, 모려, 해룡의 순으로 항산화력을 나타내었다. 자외선 B로 인한 산화적 세포 손상 및 사멸은 모자반, 석결명, 청각, 해마 열수 추출물을 처리함으로써 현저히 억제되었으며, 이들 물질은 특히 대표적인 내인성 항산화 효소인 카탈라아제, SOD(superoxide dismutase) 및 HO-1(heme oxygenase-1)을 높은 수준으로 발현하였다. 즉, 이상의 결과는 본 발명의 해양생물 추출물이 다양한 항산화 작용을 가짐으로써, 특히 산화적 스트레스가 매개하는 피부손상 및 노화과정을 보호하는 새로운 기능성 의약품 천연소재로 활용될 수 있음을 시사한다.

도 1은 12종의 해양생물 추출물(각 농도는 12.5, 25, 50, 100 μg/ml)에 대하여 각 농도별 자유라디칼(DPPH) 제거 능력에 대한 실험결과이다.
도 2는 다양한 농도(0.1, 0.3, 1 mg/ml)의 해양생물 추출물을 HS68 세포주에 24시간 동안 처리하고, MTT reduction assay로 세포생존률을 측정한 결과이다. 도 2에서 각 열수 추출물당 3개의 막대 그래프는 농도 0.1, 0.3 및 1 mg/ml에서의 세포생존률(대조군 대비)을 의미한다.
도 3은 HS68 세포를 자외선B에 노출시킨 후, 각 해양생물 추출물들의 농도를 0.1, 0.3, 1 mg/ml로 하여 HS68 세포를 처리하여, 세포생존률(대조군 대비)을 측정한 결과이다. 도 3에서 각 열수 추출물당 3개의 막대 그래프는 농도 0.1, 0.3 및 1 mg/ml에서의 세포생존률(대조군 대비)을 의미한다.
도 4는 자외선 B로 인하여 손상된 세포내 미토콘드리아 막전압을 TMRE 형광염색시약 실험결과이다.
도 5는 자외선 B로 인한 세포 내 활성산소 축적에 대한 실험으로서, 자외선 B를 3시간 HS68 세포에 처리한 결과 세포 내 강한 형광을 나타내는 세포의 수가 증가 함을 측정함으로써, 활성산소의 증가를 확인하는 실험결과이다.
도 6은 항산화 효소의 mRNA 발현에 대한 본 발명의 조성물의 영향을 실험한 결과이다.

자외선 A, B 및 C 중 특히, 자외선 B는, 활성산소종을 생성하여 산화적 스트레스를 유발함으로써 다양한 피부 구성 세포에 손상을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이는 궁극적으로 광노화 과정을 가속화시킨다. 본 발명에서는 특정한 해양생물 추출물, 즉, 김, 다시마, 모려, 모자반, 미역, 석결명, 청각, 해룡, 해마, 해삼, 파래 및 톳 12종의 추출물을 이용하여 자유라디칼 소거능, 자외선 B 조사로 인한 세포독성 및 산화적 사멸 억제능, 세포내 항산화능을 비교하는 일련의 실험을 통하여 상기 12종의 해양생물 중 미역, 모자반, 다시마, 해마, 석결명, 청각, 모려, 해룡의 추출물이 항산화 효과를 갖는 조성물로서 적절함을 확인하였다.

본 발명의 항산화 조성물 중 해양생물 추출물은 건조중량 기준으로 0.01 내지 50중량% 함유하는 것이 바람직하다. 0.01 중량% 이하로 사용되면 효과가 없으며, 50중량% 이상이면 과도한 사용으로 인하여 부작용이 발생할 수 있기 때문이다. 또한, 본 발명의 항산화 조성물은 의약적 제형이나, 로션, 크림, 샴푸 등의 화장품 형태일 수 있다.

이하 실험에서 사용한 해양생물, 즉, 김(Porphyra Thalli; PT), 다시마(Laminariae japonicae thallus; LJ), 모려(Ostreae Concha; OC), 모자반(Sargassum Thallus; ST), 미역(Undaria thallus; UT), 석결명(Haliotidis Concha; HC), 청각(Codium thalli; CT), 해룡(Syngnathoides biaculeatus; SB), 해마(Hippocampus; Hc), 해삼(Stichopus Stichopus; SS), 파래(Thalli; Th), 톳(Hizikia fusiforme thalli; HF)은 경상북도 포항에서 구입하여 실험에 사용하였다. 물 1.5 L에 상기 해양생물을 첨가한 후 3시간 진탕한 후, No.2 필터페이퍼(Nalgene, New York, NY, USA)로 여과하여 각각 상기 해양생물의 열수 추출물(water extract : WE)을 얻었다. 이후 여액을 진공회전농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축하고, 동결 건조하여 -20℃에서 보관하였다. 각 추출물의 최종 수율은 김(PTWE) 45.38%, 다시마(LJWE) 2.74%, 모자반(STWE) 6.63%, 모려(OCWE) 0.27%, 미역(UTWE) 3.32%, 석결명 (HCWE) 0.2%, 청각(CTWE) 5.8%, 해룡(SBWE) 15.82%, 해마(HcWE) 14.23%, 해삼 (SSWE) 3.74%, 파래(ThWE) 13.15%, 톳(HFWE) 3.69%였다.

이하 첨부 도면에서 김 열수 추출물은 "PTWE", 다시마 열수 추출물은 "LJWE", 모자반 열수 추출물은 "STWE", 모려 열수 추출물은 "OCWE", 미역 열수 추출물은 "UTWE", 석결명 열수 추출물은 "HCWE", 청각 열수 추출물은 "CTWE", 해룡 열수 추출물은 "SBWE", 해마 열수 추출물은 "HcWE", 해삼 열수 추출물은 "SSWE", 파래 열수 추출물은 "ThWE", 톳 열수 추출물은 "HFWE"라고 표기하였다.

이하 실시예에서 사용한 인간 피부 섬유아세포주(human skin fibroblast, HS68 세포주)는 ATCC사 (Rockville, MD, USA)로부터 분양받아 사용하였으며, 세포배양을 위한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagel’s medium), FBS(fetal bovine serum) 및 항생제(penicillin/streptomycin)는 깁코사(Gibco, Grand Island, NY, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. H2DCF-DA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate) 및 TRME(tetramethylrhodamine ethyl ester)는 인비트로젠사(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였고, MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 및 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 포함한 일반 시약은 시그마-알드리치사 제품(St. Louis, MO, USA)을 사용하였다.

상기 HS68 세포는 10% FBS, 페니실린(10,000 IU/ml) 및 스트렙토마이신(10,000 g/ml)을 포함하는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagel’s medium) 배지를 이용하여, 5% CO₂, 37℃ 배양기를 사용하여 배양하였다. 세포배양 배지는 2일마다 새로운 배지로 갈아주었다. 실험을 위하여 4 × 10⁴개/ 300 μl의 세포를 48-well 및 2 × 10⁶개/ 2 ml의 세포를 6-well plate에 접종 한 후, 24시간 뒤 세포가 안정적으로 부착되면, 상기 해양생물의 열수 추출물로 처리하였다.

또한, 이하 실험예에서 자외선 B 조사로 인한 세포독성 및 산화적 세포사멸에 대한 열수 추출물의 보호 효과를 확인하기 위해서, HS68 세포를 80% 밀도가 되도록 배양한 뒤 배지를 걷어내고 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 1회 세척한 다음, 자외선 조사장치(BLX-E254, Viber Lourmat, Paris, France)를 사용하여 120 mJ/cm²의 자외선 B를 조사하였다. 자외선 조사 후 다양한 농도의 열수 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다.

이하 실험예를 통하여 본 발명에 대하여 설명하기로 한다.

실험예 1 : 해양생물 추출물의 라디칼 소거능 실험

노화의 원인에 대하여 여러가지 학설이 있으나, 이 중 자유라디칼 이론은 1956년 Harman에 의해 제안되었으며, 정상적인 대사과정에서 부수적으로 생성되는 여러 가지 활성산소들에 의하여 생체구성 성분(지방, 단백질, 핵산)들이 산화적 손상을 받게 되고 이러한 손상들이 축적되어 노화에 이르게 된다는 것이다. 유해한 활성산소의 작용은 수년 내지 일생을 통하여 만성적으로 일어나 누적되어 세포나 조직의 기능을 저하시키고, 이것이 곧 노화 및 질병의 원인이 된다. 활성산소로 인한 산화적 손상 중 특히 지질 과산화 과정에서 지질의 과산화수소 라디칼은 이웃한 불포화지질의 이중 결합쇄로부터 수소원자를 하나 빼앗아 과산화물(hydroperoxide)과 알킬 라디칼로 전환된다. 이후 알킬 라디칼은 산소와 결합하면 새로운 과산화수소 라디칼을 비롯한 여러 가지 부산물(malondialdehyde, 4-hydroxynonenal, isoprostanes)들이 만들어지게 되고, 이들은 돌연변이원으로 작용하거나, 다양한 효소들의 활성을 억제하거나, 단백질 및 핵산과 작용하여 가교결합(cross-link)을 이룬다.

이러한 자유라디칼(free radical) 소거능력을 특정하기 위하여 DPPH를 사용하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 화학구조에 안정화된 라디칼을 갖는 물질로 반응 중 DPPH의 감소는 자유라디칼 소거반응을 의미한다.

따라서, 본 발명의 해양생물의 열수 추출물의 항산화 활성은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼에 대한 시료의 환원력으로 측정하였다. DPPH는 보라색을 띠며 화학적으로 안정화된 자유라디칼을 가지고 있는 수용성 물질로 전자를 받게 되면 흡광도가 감소하며, 환원력이 있는 물질과 만나 전자를 내어주면 DPPH 라디칼이 소멸되어 특유의 보라색이 옅은 노란색으로 변하는 것을 측정하게 된다. 각 50mM Tirs-HCl(pH. 7.4)에 적정 농도로 희석된 열수 추출물 100μl에 0.2 mM DPPH 용액 100μl를 첨가하여, 상온에서 10분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디컬 소거 활성(radical scavenging activity)은 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 흡광도(Acontrol) 및 추출물을 첨가한 실험군(experiment)의 흡광도(Aexperiment)를 측정하여 다음의 식으로 계산하였다. 특히, 라디칼 소거활성이 50% 감소하는데 필요한 추출물의 농도(μg/ml)를 IC₅₀로 하였다.

라디칼소거활성(%) = [ 1 - (A_experiment/A_control) ] x 100

해양생물 추출물의 라디칼 소거능을 비교 측정한 결과(도 1 참조), 미역 열수 추출물(UTWE), 모자반 열수 추출물(STWE)의 경우 라디칼을 50% 소거할 수 있는 농도(IC₅₀)가 각각 27.45, 45.88 μg/ml로 비교적 낮게 나타나 높은 항산화력을 보였으며, 그 다음으로 다시마(LJWE), 해마(HcWE), 석결명(HCWE), 모려(OCWE), 해룡(SBWE)의 순으로 각각 66.10, 87.46, 87.65, 112.92, 118.86 μg/ml로 중간 정도의 항산화력을 나타내었다(표 1 참조). 한편 김, 해삼, 톳, 파래 추출물의 경우 IC₅₀이 300 μg/ml 이상의 수치를 보여 라디칼 소거능이 비교적 약한 것으로 관찰되었다.

열수 추출물 종류	IC₅₀
미역	27.45 μg/ml
모자반	45.88 μg/ml
다시마	66.10 μg/ml
해마	87.46 μg/ml
석결명	87.65 μg/ml
모려	112.92 μg/ml
해룡	118.86 μg/ml
김	300 μg/ml ↑
해삼	300 μg/ml ↑
톳	300 μg/ml ↑
파래	300 μg/ml ↑
청각	248.47μg/ml ↑

실험예 2 : MTT 분석법을 이용한 세포 생존율 실험(자외선B 조사 없음)

세포 생존율 측정을 위하여 MTT 분석법을 이용하였으며, 이는 노란색의 테트라졸륨(tetrazolium)이 살아있는 세포의 미토콘리아 효소에 의해 보라색의 포마잔으로 변환되는 것을 측정하는 분석 방법이다. HS68 세포를 48-well culture plate에 4 × 10⁴개/ 300 μl의 세포를 접종한 후, 24시간 뒤 세포가 안정적으로 부착되면 각 해양생물 열수 추출물로 처리한 후 열수 추출물로 처리하여 24시간 배양한 뒤 MTT(최종 농도 1 mg/ml) 시약을 첨가한 후, 2시간 동안 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상등액을 제거한 후 200 μl DMSO를 가하여 포마잔을 용해한 다음, ELISA 리더(Emax, Molecular device, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 추출물을 첨가하지 않은 배지만 넣고 배양한 대조군의 흡광도를 기준으로 세포생존율(%)을 산출하였다.

상기와 같이 자외선 B의 조사 없이, 해양생물 추출물들을 단독으로 처리하고 세포생존에 미치는 영향을 살펴보았다. 다양한 농도(0.1, 0.3, 1 mg/ml)의 해양생물 추출물을 HB86 세포주에 24시간 동안 처리하여 실험한 결과, 해삼(SSWE)의 경우 다른 해양생물 추출물들과 비교한 경우 0.1 mg/ml의 농도에서도 세포 생존율이 15% 이하로 상대적으로 강한 독성을 나타냈으나, 해삼(SSWE)을 제외하고, 1 mg/ml 이하의 농도에서 세포 독성을 보이지 않아 상대적으로 높은 안전성을 보였다(도 2 참조).

실험예 3 : MTT 분석법을 이용한 세포 생존율 실험(자외선B 조사)

상기 실험예 2와는 달리 자외선 B를 조사한 후의 MTT 분석법을 이용하여 세포 생존율을 실험하였다. 해양생물 추출물들의 농도를 0.1, 0.3, 1 mg/ml로 고정 한 다음 자외선 B를 조사하여 세포독성에 미치는 해양생물 추출물들의 보호효과를 검토하였다. 도 3에서 대조군(도면에서 CONT로 표기)은 자외선 조사하지 않은 경우 100%(도 3의 CONT의 두 개의 막대 그래프 중 왼쪽)을 기준으로 하여 자외선 B를 조사한 경우 약 세포생존율이 55% 정도로 감소하였으며(도 3의 CONT의 두 개의 막대그래프 중 오른쪽), 1 mg/ml의 모자반(STWE), 석결명(HCWE), 청각(CTWE), 해마(HcWE) 열수 추출물을 함께 처리한 그룹에서 세포생존율이 각각 78.63, 81.82, 83.74, 81.2%로 증가됨을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 이는 모자반, 석결명, 해마, 청각 열수 추출물이 섬유아세포에서 자외선 B 조사로 인한 세포독성 및 사멸을 감소시키는 효과가 있다는 것을 의미한다.

실험예 4 : 미토콘드리아 막전압 ( mitocondrial transmembrane potential, ΔΨ) 측정을 통한 세포생존율 실험

자외선 B로 인해 세포가 손상을 받는 경우 아포토시스(apoptosis)를 통하여 세포사멸이 일어나게 되며, 이는 다양한 생화학적 지표로 측정이 가능하다. 일반적으로 아포토시스가 진행되는 과정에서 미토콘드리아는 손상을 받아 막전압 (mitochondrial transmembrane potential, MMP)이 감소되며, 이후 아포토시스를 매개하는 다양한 단백질들이 미토콘드리아로부터 세포질(cytosol)로 유출되는 과정을 촉진하게 된다. 그중 대표적인 것이 시토크롬 c인데, 이는 다양한 하위 카스파제(caspase)를 활성화시켜 궁극적으로 아포토시스를 매개하게 된다. 그러므로, 이후 실험에서는 세포사멸의 지표 중의 하나로 자외선 B로 인하여 손상된 세포내 미토콘드리아 막전압을 TMRE 형광염색시약을 사용하여 측정하였다.

미토콘드리아 막전압을 측정하기 위하여 TMRE(tetramethylrhodamine ethyl ester) 다이(dye)를 사용하였다. 세포(6 x 10⁴개/ 500 μl)를 챔버슬라이드(chamber slide)에 넣고 자외선 B를 조사한 후, 각 해양생물의 열수 추출물(각 0.3 mg/ml, 1 mg/ml)로 처리한 후, 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 배지를 덜어낸 후 PBS로 2회 세척한 뒤, 10 nM TMRE를 가하여 37℃에서 30분간 반응을 시킨 후 형광의 변화를 여기(excitation) 파장 540 nm 및 방출(emission) 파장 590 nm에서 형광현미경(fluorescence microscopy)으로 측정하였다(SpectraMax Gemini XS, Molecular Device).

도 4는 그 결과로서, 대조군의 경우 자외선을 조사하지 않은 경우를 100%(도 4의 CONT의 두 개의 그래프 중 왼쪽)로 하고, 자외선B를 조사한 경우에는 MMP가 30% 정도 감소된 것(도 4의 CONT의 두 개의 그래프 중 오른쪽)에 반하여 모자반(STWE), 석결명(HCWE), 청각(CTWE), 해마(HcWE) 열수 추출물을 1 mg/ml로 처리 한 그룹에서는 MMP가 93.38, 96.13, 94.43, 96.56%로 대조군(100%)과 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5 : 자외선 B로 인한 세포내 활성산소 축적에 대한 해양생물 추출물의 보호 효과 실험

세포 내에 생성되는 활성산소는 H₂DCF-DA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 사용하여 측정하였다. H₂DCF-DA는 지용성 물질로 세포 내로 쉽게 투과되며 에스테라아제(esterase)에 의해 아세틸기가 가수분해되어 수용성인 HDCF가 활성산소와 반응하여 형광을 띠는 DCF을 생성하며, 이 형광감도를 측정함으로써 활성산소 생성량을 측정할 수 있다. 활성산소의 측정을 위하여 HS68 세포에 120 mJ/cm² 강도의 자외선 B를 조사 한 후 각 해양생물의 열수 추출물을 처리하여 3시간 배양한 후, 50 μM H₂DCF-DA을 처리하여 37℃에서 20분간 배양하였다. 20분 뒤 PBS로 세척한 다음, DMSO를 사용하여 세포를 용해시켜 형광의 변화를 들뜸 파장 485 nm 및 방출 파장 535 nm에서 현광현미경으로 측정하였다(SpectraMax Gemini XS, Molecular Device).

도 5와 같이 자외선 B를 3시간 HS68 세포에 처리한 결과 세포 내 강한 형광을 나타내는 세포의 수가 증가 되어 형광강도가 진해진 것, 즉, 세포내 활성산소종이 축적됨을 확인할 수 있었으며(도 5의 CONT의 왼쪽은 자외선 조사 없는 경우이며, 오른쪽은 자외선 조사 후의 대조군임), 이와는 달리, 본 발명의 추출물을 적용한 경우, 예를 들어, 모자반(STWE), 석결명(HCWE), 청각(CTWE), 해마(HcWE) 열수 추출물(0.3, 1 mg/ml) 처리함으로써 현저히 감소되었다.

실험예 6 : RT - PCR ( reverse transcriptase - polymerase chain reaction )을 이용한 항산화 효소 mRNA 발현 측정 실험

우리 몸에는 이러한 활성산소로 인한 손상에 대응하는 항산화 방어 시스템을 갖추고 있어 산화적 스트레스에 대하여 대응하며 손상된 세포를 회복하여 항상성(homeostasis)을 끊임없이 유지하려고 한다. 이러한 항산화 방어 시스템은 항산화 효소에 의한 방어기전과 비효소성 항산화 방어기전의 두 가지 형태로 구분된다. 특히, 효소에 의한 방어기전은 CAT(catalase)와 SOD(sueproxide dismutase) 등을 대표적으로 들 수 있다.

카탈라아제는 과산화수소를 물과 산소로 분해하여 제거하는 역할을 하며, SOD(superoxide dismutase)는 초산화음이온(superoxide anion)을 과산화수소로 전환시킨다. 체내에 존재하는 SOD는 세포질에 있는 CuZnSOD, 미토콘드리아에 있는 MnSOD, 그 외 SOD의 3종류로 나뉜다. 이러한 항산화 효소들 이외에 최근 피부세포 보호과정에 있어 HO-1(heme oxygenase-1)에 대한 관심이 높아지고 있다. HO-1은 헴이화작용(heme catabolism)의 속도결정단계에 작용하는 효소로, 반응산물로 일산화탄소(CO), 빌리베르딘(biliverdin), 자유이온(Fe² ⁺)을 생성하며, 다양한 종류의 세포에서 자외선, 과산화수소, 사이토카인(cytokine), 글루타티온(GSH) 고갈 등에 의해 일종의 스트레스에 대한 방어 작용기전으로 증가되는 것으로 보고되었다. 반응산물 중 CO는 염증관련 인자들을 억제하며, 헴(heme) 또는 다른 금속이온을 가지고 있는 효소들과 반응하여 구조를 변형시켜 활성의 변화를 일으키며, 능동적 세포사멸을 억제한다. 빌리베르딘은 빌리베르딘 환원효소(biliverdin reductase)의 작용에 의하여 빌리루빈(bilirubin)으로 전환되며, 이는 모두 강한 항산화 작용을 가짐으로써 대부분의 HO-1의 보호작용을 매개한다.

이를 바탕으로, 본 실험예에서는 해양생물 추출물이 산화적 세포 손상 및 사멸에 대한 보호 효과를 갖는 작용기전을 규명하기 위하여 생체 내에 존재하는 대표적인 항산화 효소들의 mRNA 발현을 RT-PCR로 측정하였다.

Total RNA의 추출은 인비트로젠사의 TRIzol Reagent(Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 제시된 방법에 따라 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로 부터 M-MLV 역전사효소(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였으며, 항산화 효소들의 유전자 발현을 비교 측정하기 위하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 진행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 진행한 후, 95℃에서 30초, 53 ~ 61℃에서 1분, 72℃에서 1분을 40회 반복 수행하여 증폭시킨 다음, 72℃에서 5분간 더 반응시켰다. 각 PCR 산물들은 에디티움 브로마이드(edithium bromide)를 포함하고 있는 1.5% 아가로즈겔(agarose gel)에서 50V로 전기영동 한 후 이미지분석기(BIO-RAD사, Gel Doc XR System, Hercules, CA, USA)를 사용하여 항산화 효소의 유전자 발현을 측정하였으며, Quantity One Software(BIO-RAD사)를 이용하여 정량분석 하였다. 실험에 사용된 각 항산화 효소의 특정 프라이머(primer) 서열은 하기의 표 2와 같았다.

도 6은 그 결과로서, HS68 세포를 모자반(STWE), 석결명(HCWE), 청각(CTWE), 해마(HcWE) 열수 추출물(1 mg/ml)을 단독으로 24시간 처리하고 mRNA를 분리하여 대표적인 항산화 효소들의 발현을 측정한 결과로서, 도 6의 A는 측정이미지이며, 도 6의 B는 정량화한 수치를 그래프화한 것이다. 실험결과 CAT의 경우 석결명 > 해마 > 청각, CuZnSOD의 경우 석결명 > 청각 > 해마 > 모자반, MnSOD의 경우 석결명 > 모자반 > 해마, HO-1의 경우 해마 > 청각의 순으로 높은 항산화 효소의 발현을 보였다.

상기 실험과 같이 12종의 해양생물을 대상으로 다양한 실험을 한 결과, 미역, 모자반, 다시마, 해마, 석결명, 청각, 모려, 해룡의 8종의 해양생물의 추출물이 항산화 조성물로서 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 의약적 제형이나 화장료 제형일 수 있다. 로션형태로 제조할 경우, 일 예로 다음의 표 3과 같은 조성비로 제조할 수 있다.

성분	함량(중량%)
해양생물추출물	0.8
스테아릭산	1.0
세타놀	1.9
이소프로필미리스테이트	7.0
올리브오일	2.0
글리세릴모노스테아레이트	2.5
폴리솔베이트20	0.7
프로필렌글리콜	6.0
트리에탄올아민	0.7
셀룰로즈	0.1
향	미량
정제수	잔량
계	100

또한, 크림 형태로 제조하는 경우 일 예로 다음의 표 4와 같은 조성비로 제조할 수 있다.

성분	함량(중량%)
해양생물추출물	0.8
스테아릭산	3.0
유동파라핀	12.0
스쿠알렌	2.0
페닐디메치콘	0.3
글리세릴모노스테아레이트	2.2
폴리솔베이트60	1.3
프로필렌글리콜	2.0
글리세린	7.0
트리에탄올아민	0.2
향	미량
정제수	잔량
계	100

또한, 샴푸 형태로 제조하는 경우 일 예로 다음의 표 5와 같은 조성비로 제조할 수 있다.

성분	함량(중량%)
해양생물추출물	1.0
소디움라우레스설페이트	9.0
소디움라우릴설페이트	6.0
코카미도프로필베타민	1.2
라우라마이드디이에이	5.0
프로필렌글리콜	3.5
벤조페논-9	0.05
메칠클로로이소치아졸리논	0.01
소디움클로라이드	0.1
향	미량
소디움이디티에이	0.05
시트릭에씨드	적량
정제수	잔량
계	100

Claims

해룡 추출물을 포함하는 자외선으로 인한 피부 손상 예방 및 치료용 의약품 조성물.
제1항에서, 상기 해룡 추출물은 전체 조성물 중 0.01 ~ 50 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 자외선으로 인한 피부 손상 예방 및 치료용 의약품 조성물.
제1항에서, 상기 해룡 추출물은 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 자외선으로 인한 피부 손상 예방 및 치료용 의약품 조성물.