KR101165248B1 - 플라반계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

플라반계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 플라반(flavan)계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 플라반계 화합물은 에스트로겐 수용체에 대한 에스트로겐 수용체 유전자 전사활성이 있고, 에스트로겐 수용체와의 리간드 결합활성을 나타내며, 에스트로겐 민감성 유방암 세포를 농도 의존적으로 세포증식을 유도함으로써 에스트로겐 활성을 나타낸다. 상기와 같이 에스트로겐 활성이 에스트로겐 수용체 알파(ER-α)보다 에스트로겐 수용체 베타(ER-β)에서 더 선택적인 활성을 나타내기 때문에 부작용이 경감된 식물성 에스트로겐으로서, 갱년기 증후군 또는 골다공증 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

플라반계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions for prevention and treatment of menopausal symptoms or osteoporosis containing the flavan compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof as active ingredient}
플라반(flavan)계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
에스트로겐(estrogen)은 세포 수의 증가와 분화를 포함하는 다양한 생물학적 작용을 한다. 에스트로겐의 생물학적 작용들은 핵 수용체 슈퍼 페밀리에 속하는 두 개의 에스트로겐 수용체 알파(ER-α)와 에스트로겐 수용체 베타(ER-β)를 통하여 그 활성을 발휘한다(Nilsson et al., 2001, Physiol . Rev ., 81(4):1535-1565.). 에스트로겐 수용체(ER)의 작용메커니즘은 에스트로겐과 세포 내 에스트로겐 수용체들과의 결합으로 수용체들의 이합체(dimer)를 형성하고 이들이 표적 유전자(target gene)의 프로모터(promoters)에 위치한 특정한 에스트로겐 수용체 요소(estrogen response elements, EREs)와 결합함으로써 관련 유전자의 발현을 조절한다. 두 개의 에스트로겐 수용체는 서로 다른 조직분포 패턴, 리간드 결합력과 전이활성 부위를 가지므로 이러한 차이는 다른 조직에서 에스트로겐 수용체의 작용제(agonists)와 저해제(antagonists)의 서로 다른 선택적 역할을 가능하게 한다(Kuiper et al., 1997, Endocrinology , 138(3):863-870.). 에스트로겐 수용체에 작용하는 화합물은 폐경기여성의 호르몬대체요법과 생식기암의 화학요법제 개발을 위한 표적으로 활용되고 있다.
에스트로겐 수용체들에 결합할 수 있는 화합물 중, 조직선택성 및 두 가지의 에스트로겐 수용체에 선택적으로 작용제 또는 저해제 역할을 할 수 있는 화합물을 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(selective ER modulators, SERMs)라고 한다(Paech et al., 1997, Science , 277:1508-1510.). 대표적인 SERM으로는 랄록시펜(raloxifene)과 타목시펜(tamoxifen)이 있으며, 이들은 골다공증과 에스트로겐 의존성 유방암의 치료용 의약품으로 임상에서 사용되고 있다.
일반적으로 알려진 호르몬제제는 에스트로겐의 보충을 할 수 있으나 심장질환, 치매와 유방암의 발병위험을 동반한다(Chlebowski et al., 2003, J.A.M.A., 289, (24):3243-3253.). ER-α는 유방암세포의 증식을 유발하는 것으로 알려진 반면, ER-β는 종양억제인자가 될 수 있음이 밝혀지면서, 조직선택적이고 ER-α에 대해 길항작용을 하면서 ER-β에는 작용제 역할을 하는 화합물을 도출하여 유방암치료, 골다공증 치료 및 호르몬 대체요법제로 개발하려는 시도가 다양하게 시도되고 있다.
식물성 에스트로겐(Phytoestrogens)은 에스트로겐 수용체에 결합하여 체내에서 생성된 에스트로겐의 역할들을 모방하거나 조절하는 화합물이다(Setchell, 1998, Am . J. Clin . Nutr ., 68:1333-1346.). 이 화합물들은 구조적으로 다양하며 플라보노이드(flavonoids), 스틸벤(stilbenes) 및 리그난(lignans)을 포함한다. 이들의 구조적 특징은 에스트로겐 수용체와의 결합을 통해 에스트로겐성 또는 항에스트로겐성 활성을 발휘할 수 있다.
식물성 에스트로겐의 대부분은 두 종류의 에스트로겐 수용체 모두의 유전자들을 활성화시키는데, ER-α 또는 ER-β를 선택적으로 활성화시키는 식물성 에스트로겐을 발굴할 수 있다면, 에스트로겐의 암 유발 부작용을 최소화한 호르몬 대체요제로 개발할 수 있다. ER-α 또는 ER-β의 두 에스트로겐 수용체에 선택적으로 작용하는 식물성 에스트로겐은 각종 갱년기 증후군 및 골다공증의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 에스트로겐 수용체 알파(ER-α) 및 에스트로겐 수용체 베타(ER-β)에 선택적인 활성을 가진 물질을 연구하던 중, 닥나무 추출물로부터 기존에 알려진 플라반계 화합물 및 이소프레닐기가 있는 신규한 플라반계 화합물을 순수하게 분리 정제한 후 화학구조를 결정하고, 상기 화합물이 에스트로겐 수용체에 선택적으로 활성을 나타내므로 갱년기 증후군 및 골다공증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 플라반계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 플라반계 화합물을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명이 또 다른 목적은 신규한 플라반계 화합물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 플라반계 화합물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 플라반계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 플라반계 화합물을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이소프레닐기를 포함하는 신규한 플라반계 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112010036054542-pat00001
(상기 화학식 1의 R1, R2, R3 , R4 ,고리 A의 "
Figure 112010036054542-pat00002
" 및 X는 본 명세서에서 정의한 바와 같다).
또한, 본 발명은 닥나무의 뿌리껍질을 에탄올로 추출하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 얻은 닥나무 뿌리껍질 추출물을 물에 현탁 시킨 후, 추출 용매로 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 사용하여 닥나무 뿌리껍질 분획물을 얻는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2에서 얻은 에틸아세테이트 분획물을 컬럼크로마토그래피를 수행하여 이소프레닐기를 포함하는 신규한 플라반계 화합물의 분리 및 정제하는 단계(단계 3)를 포함하는 상기 신규한 플라반계 화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 플라반(flavan)계 화합물은 에스트로겐 수용체 베타(ER-β)에 선택적인 활성이 있으므로, 부작용이 경감된 식물성 에스트로겐으로서 갱년기 증후군 또는 골다공증 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 화학식 1c로 표시되는 화합물의 수소 핵자기 공명 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 화학식 1c로 표시되는 화합물의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 화학식 1c로 표시되는 화합물의 이핵종간 1양자 코히렌스 분광법(HSQC) 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 화학식 1c로 표시되는 화합물의 이핵종간 원격상관 분광법(HMBC) 스펙트럼이다.
도 5은 본 발명의 화학식 1d로 표시되는 화합물의 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 화학식 1d로 표시되는 화합물의 핵자기 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 화학식 1d로 표시되는 화합물의 이핵종간 1양자 코히렌스 분광법(HSQC) 스펙트럼이다.
도 8는 본 발명의 화학식 1d로 표시되는 화합물의 이핵종간 원격상관 분광법(HMBC) 스펙트럼이다.
도 9은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 에스트로겐 수용체 알파를 경유한 유전자 전사활성을 나타낸 그래프이다.
도 10는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 에스트로겐 수용체 베타를 경유한 유전자 전사활성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 에스트로겐 수용체 유전자 전사활성(ER-ERE)을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 에스트로겐 수용체 리간드 결합력을 나타낸 그래프이다.
도 13는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 민감성 유방암세포(MCF-7 BUS)의 세포증식 효능을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 플라반(flavan)계 화합물을 제공한다:
Figure 112010036054542-pat00003
(상기 화학식 1에서, R1은 수소 또는
Figure 112010036054542-pat00004
이고; R2는 수소 또는 하이드록시기이고; R3 및 R4 는 각각 수소 또는
Figure 112010036054542-pat00005
이며,
상기 화학식 1에서, 고리 A상의 "
Figure 112010036054542-pat00006
"은 단일결합 또는 비결합이고, 여기서 상기 고리 A상의 "
Figure 112010036054542-pat00007
"이 단일결합인 경우, X는 부재이고, 상기 고리 A상의 "
Figure 112010036054542-pat00008
"이 비결합인 경우, X는 수소이다).
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 플라반계 화합물의 구체적인 예는 아래와 같다.
(1) 2-(3-(4-하이드록시페닐)프로필)-5-메톡시페놀;
(2) (R)-2-(4-하이드록시페닐)크로만-7-올;
(3) (S)-4-(7-하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-2-일)-3-(3-메틸부트-2-에닐)벤젠-1,2-다이올; 및
(4) (R)-5-(7-하이드록시크로만-2-일)-3,4-비스(3-메틸부트-2-에닐)벤젠-1,2-다이올.
본 발명에 따른 상기 화합물의 구조식을 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.
구조식


1a
Figure 112010036054542-pat00009


1b
Figure 112010036054542-pat00010



1c
Figure 112010036054542-pat00011




1d
Figure 112010036054542-pat00012
또한, 본 발명은 닥나무의 뿌리껍질을 에탄올로 추출하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 얻은 닥나무 뿌리껍질 추출물을 물에 현탁시킨 후, 추출 용매로 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 사용하여 닥나무 뿌리껍질 분획물을 얻는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2에서 얻은 에틸아세테이트 분획물에 컬럼크로마토그래피를 수행하여 화학식 1의 플라반계 화합물을 분리 및 정제하는 단계(단계 3)를 포함하는 상기 화학식 1의 플라반계 화합물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 제조방법을 단계별로 살펴본다.
상기 단계 1은 닥나무 뿌리껍질을 에탄올로 추출하는 단계이다.
상기 단계에 있어서, 에탄올 추출물을 얻는 방법은 닥나무 뿌리껍질을 세절하여 추출용기에 넣고, 에탄올을 넣어 상온에서 추출하여 추출액을 얻는다. 닥나무 뿌리껍질의 추출 효율을 높이기 위하여 상기 과정을 수회 반복 수행할 수 있다. 이후, 상기 추출액을 일정 시간 동안 방치한 다음 거름종이 등으로 여과하여 에탄올 추출물을 제조할 수 있다.
상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 닥나무 뿌리껍질 추출물로부터 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 분획하여 닥나무 뿌리껍질 분획물을 얻는 단계이다.
구체적으로 상기 단계에서 얻은 닥나무 뿌리껍질 에탄올 추출물을 물에 현탁시킨 후 추출용매로 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 사용하여 순차적으로 분획하여 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 및 물 분획물을 얻을 수 있다.
상기 단계 3은 상기 단계 2에서 얻은 닥나무 에틸아세테이트 분획물을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 플라반계 화합물을 분리, 정제하는 단계이다.
본 발명에서는 단계 2로부터 얻은 분획물들 중 에틸아세테이트 분획물을 헥산/아세톤을 유출용매로 사용하여 분획한 후, 헥산/아세톤(3/1(v/v)) 분획물을 클로로포름/메탄올을 유출용매로 사용하여 분획하고, 다시 클로로포름/메탄올(30/1(v/v)) 분획물을 메탄올을 유출용매로 사용하여 RP-C18 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1a 및 1b로 표시되는 플라반계 화합물을 분리, 정제할 수 있다.
또한, 헥산/아세톤(2/1(v/v)) 분획물을 메탄올을 이용하여 화학식 1c로 표시되는 이소플레닐기를 포함하는 신규한 플라반계 화합물을 얻을 수 있다.
나아가, 상기 클로로포름/메탄올(10/1(v/v)) 분획물을 헥산/에틸아세테이트를 이용하여 화학식 1d로 표시되는 이소프레닐기를 포함하는 신규한 플라반계 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 플라반계 화합물뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체, 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.
본 발명의 화학식 1의 플라반계 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.
동량의 화학식 1의 플라반계 화합물 및 산 수용액 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 상기 플라반계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 화학식 1의 플라반계 화합물의 에스트로겐 활성을 검증하기 위해 먼저, 에스트로겐 수용체 발현 벡터와 Luc-ERE(luciferase-estrogen response element) 플라스미드 벡터를 이용하여 CV-1 세포의 형질전환(transfection)에 의한 루시페라아제 보고자 유전자 시험(luciferase reporter gene assay)을 수행하였다.
구체적으로, 루시페라아제 활성 및 베타-갈락토시아제 활성을 측정하여, 루시페라아제 활성을 베타-갈락토시아제 활성으로 나눈값으로 최종활성을 계산하였다. 본 발명의 화합물에 대조물질 에스트라다이올(0.1 μM)(E2)을 처리한 결과, 최종활성은 120% 내지 21%로 우수함을 나타내었다(표 4 참조).
아울러 에스트로겐 수용체의 의존성에 대해 측정하기 위하여 본 발명의 화학식 1a로 표시되는 화합물의 농도를 다르게 하고, 에스트로겐 수용체 저해제인 ICI 182780을 처리하여 활성이 낮아지는 것을 확인한 결과, 상기 화합물은 농도에 의존성을 보이며, 에스트로겐 수용체에 의존적임을 나타내었다(도 11 및 표 5 참조).
또한, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 에스트로겐 수용체에 대한 선택성을 알아보기 위하여 에스트로겐 수용체 리간드 결합활성을 측정하였다. 상기 화합물을 인간 재조합형 에스트로겐 수용체 알파(hER-α) 및 인간 재조합형 에스트로겐 수용체 베타(hER-β)에 대한 결합력을 측정한 결과 hER-α 보다 hER-β에 대한 결합 친화력이 있음을 나타내었다(도 12 및 표 6 참조).
나아가, 본 발명의 화합물에 대한 에스트로겐 활성을 측정하기 위하여 시행한 에스트로겐 민감성 유방암 세포(MCF-7 BUS)를 이용한 세포증식 시험결과 본 발명의 화합물 모두 농도 의존적으로 세포증식을 유도하였으며, 에스트로겐 수용체 저해제인 ICI 182780의 처리에 의해 세포증식활성이 낮아지는 것을 확인하였다(도 13 및 표 7 참조).
상기 결과들을 종합해 볼 때, 본 발명의 플라반계 화합물은 에스트로겐 수용체에 에스트로겐 수용체 유전자 전사활성이 있고, 에스트로겐 수용체에 의존적이며, 에스트로겐 의존적인 유방암 세포를 농도 의존적으로 세포증식을 유도함으로써 에스트로겐 활성을 나타내고, 에스트로겐 수용체 알파(ER-α) 보다 에스트로겐 수용체 베타(ER-β)에서 더 선택적인 활성을 나타내기 때문에 부작용이 경감된 식물성에스트로겐으로서, 갱년기 증후군 또는 골다공증 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 본 발명의 플라반계 화합물을 포함하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 조성물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제 화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기 화학식 1로 표시되는 플라반계 화합물을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 에스트로겐 수용체 베타에 선택적으로 활성을 나타내므로 갱년기 증후군 또는 골다공증 예방 및 개선을 목적으로 상기 플라반계 화합물을 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 플라반계 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 플라반계 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 플라반계 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 닥나무로부터 분리된 플라반계 화합물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 플라반(flavan)계 화합물의 제조
단계 1: 닥나무 뿌리 껍질 추출물의 제조
건조된 닥나무의 뿌리껍질을 세절한 후, 0.6 kg에 2 L의 에탄올을 가하여 상온에서 추출한 후 추출액을 여과하여 에탄올 추출물 51 g을 수득하였다.
단계 2: 닥나무 뿌리 껍질 분획물의 제조
상기 단계 1의 에탄올 추출물을 물에 분산시키고, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하고, 순차적으로 분획하여 n-헥산 분획물(1.9 g), 클로로포름 분획물(4.3 g), 에틸아세테이트 분획물(31 g), n-부탄올 분획물(0.8 g) 및 물 분획물(8.6 g)을 얻었다.
단계 3: 플라반계 화합물의 분리 및 동정
단계 3A: 플라반계 화합물 Brossonin A(화학식 1a로 표시되는 화합물) 및 Tupichinol(화학식 1b로 표시되는 화합물)의 제조방법
상기 단계 2에서 수득한 에틸아세테이트 분획물 31 g을 20/1(v/v) 내지 1/1(v/v)의 헥산/아세톤(n-hexane/acetone)을 기울기 용출용매로 이용하여 실리카 젤 컬럼크로마토그래피를 수행하고, 얻은 분획 중 헥산/아세톤(3/1(v/v))에서 용출된 분획을 클로로포름/메탄올(chloroform/methanol)을 기울기 용출용매로 이용하여 실리카 젤 컬럼크로마토그래피를 수행하였다. 상기 분획물 중 클로로포름/메탄올(30/1(v/v))로부터 용출된 분획을 40 % 내지 100 %의 메탄올을 기울기 용출용매로 이용하여 RP-C18 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리한 결과, 본 발명의 화학식 1a로 표시되는 화합물(17 mg)(Rf:0.64, 헥산/에틸아세테이트=2/1) 및 화학식 1b로 표시되는 화합물(7 mg)를 얻었다(Rf:0.78, 헥산/에틸아세테이트=2/1). 상기 화합물들의 구조분석을 위하여 NMR 분석 및 질량분석을 실시하였다. 그 결과 화학식 1a 및 1b로 표시되는 화합물은 각각 brossonin A(Bae et al., 2007, Chem . Biodiversity, 4(9):2231-2235.)와 tupichinol(Pan et al., 2003, J. Nat . Prod., 66(2):161-168.)로 확인되었다.
[화학식 1a]
Figure 112010036054542-pat00013
[화학식 1b]
Figure 112010036054542-pat00014

단계 3B: 플라반계 화합물 Kazinol U(화학식 1 c로 표시되는 화합물)의 제조
상기 단계 3A에서 수득한 헥산/아세톤 분획물 중 헥산/아세톤(2/1(v/v))에서 용출된 분획을 30 % 내지 100 %의 메탄올을 기울기 용출용매로 이용하여 RP-C18 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 본 발명의 이소프레닐기를 포함하는 신규한 플라반계 화합물 Kazinol U(화학식 1c로 표시되는 화합물, 139 mg)을 얻었다(Rf:0.64, 헥산/에틸아세테이트=1/1). 상기 화합물의 구조 분석을 위하여, IR 분석, NMR 분석 및 질량 분석을 하였다. 분자량 및 분자식은 Jeol사의 JMC-GC Mate II 기체크로마토그래피-질량분석기(GC-EI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 결정하였고, 핵자기공명기(Varian 400 NMR)를 이용한 1H, 13C-NMR 스펙트럼(spectrum) 분석을 통하여 그 구조를 하기 화학식 1c와 같이 동정하였다. 분석 결과는 도 1 내지 도 4 및 표 1에 나타내었다.
[화학식 1c]
Figure 112010036054542-pat00015
화합물 구조 분광학적 분석 데이터








Figure 112010036054542-pat00016


[화학식 1c]


 분자식 C2H22O4
EIMS(70 eV) m/z 326([M]+), 270, 203, 189, 161, 143, 123
HREIMS m/z 326.1516
UV 233(3.76), 286(3.69).
Optical rotation +4.3°(c 3.0, MeOH).
IR(NaCl) 3502, 3446, 2360, 2340, 1699, 1558, 1043, 668 cm-1.




1H NMR		 (CD3OD, 400 MHz): δ 1.64(3H, H3-4"), 1.68(3H, s, H3-5"), 1.80 - 2.10(2H, m, H-3), 2.50 - 2.90(2H, m, H-4), 3.43(2H, m, H-1"), 5.00(1H, dd, J = 10.4, 2.0 Hz, H-2), 5.13(1H, br t, J = 6.4 Hz, H-2"), 6.25(1H, d, J = 2.4 Hz, H-8), 6.32(1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6), 6.69(1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.79(1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.84(1H, d, J = 8.4 Hz, H-5).



13C NMR		 (CD3OD, 100 MHz): δ 18.0(C-4"), 25.5(C-1"), 25.8(C-5"), 26.1(C-4), 30.7(C-3), 76.2(C-2), 104.0(C-8), 109.0(C-6), 113.5(C-5'), 114.3(C-10), 118.3(C-6'), 124.7(C-2"), 127.5(C-2'), 130.9(C-5), 131.4(C-3"), 132.7(C-1'), 144.0(C-3'), 145.4(C-4'), 157.2(C-9), 157.4(C-7).
도 1 내지 4 및 표 2에서 나타낸 바와 같이, 분석결과 상기 화학식 1c의 화합물은 하나의 이소프레닐기를 포함하는 신규한 플라반계 화합물임을 확인하였다.
단계 3C: 신규한 플라반계 화합물 (+)-(2R)- Kazinol I(화학식 1d로 표시되는 화합물)의 제조
상기 단계 3A의 클로로포름/메탄올 분획물 중 클로로포름/메탄올(10/1(v/v))에서 용출된 분획을 40/1(v/v) 내지 2/1(v/v)의 헥산/에틸아세테이트를 기울기 용출용매로 이용하여 실리카 젤 컬럼크로마토그래피를 수행하여 두 개의 이소프레닐기를 포함하는 신규한 플라반 화합물 (+)-(2R)-Kazinol I(화학식 1d로 표시되는 화합물, 14 mg)을 얻었다(Rf:0.46, 헥산/에틸아세테이트=2:1).
상기 화합물의 구조 분석을 위하여, IR 분석, NMR 분석 및 질량 분석을 실시하였다. 분자량 및 분자식은 Jeol사의 JMC-GC Mate II 기체크로마토그래피-질량분석기(GC-EI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 결정하였으며, 핵자기공명기(Varian 400 NMR)를 이용한 1H, 13C-NMR 스펙트럼(spectrum) 분석을 통하여 그 구조를 하기 화학식 1d와 같이 동정하였다. 분석 결과는 도 5 내지 도 8 및 표 3에 나타내었다.
[화학식 1d]
Figure 112010036054542-pat00017
화합물 구조 분광학적 분석 데이터








Figure 112010036054542-pat00018


[화학식 1d]


 분자식 C25H30O4
EIMS(70 eV) m/z 394([M]+), 377, 338, 295, 272, 257 , 229, 215, 201, 173, 137, 123.
HREIMS m/z 394.2142
UV 227(3.28), 243(3.40), 283(3.59), 306(3.10).
Optical rotation +2.5°(c 3.05, CHCl3).
IR(NaCl) 3463, 3364, 2920, 1617, 1507 cm-1.




1H NMR		 (CD3OD, 400 MHz): δ 1.43(9H, s, H3-4", H3-4"', H3-5"'), 1.51(3H, s, H-5"), 1.66 ? 1.90(2H, m, H2-3), 2.40-2.70(2H, m, H2-4), 3.01(1H, dd, J = 16.2, 5.0 Hz, Ha-1"), 3.10 ? 3.17(3H, m, Hb-1", H2-1"'), 4.78(1H, br t, J = 5.6 Hz, H-2"'), 4.83(1H, dd, J = 10.6, 2.0 Hz, H-2), 4.87(1H, br t, J = 6.4, Hz, H-2"), 6.09(1H, d, J = 2.4 Hz, H-8), 6.14(1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6), 6.63(1H, s, H-2'), 6.66(1H, d, J = 8.4 Hz, H-5).



13C NMR		 (CD3OD, 100 MHz):δ 18.0(C-4"), 18.1(C-4"'), 25.8(C-5"'), 25.9(C-5"), 26.2(C-4), 26.3(C-1"'), 28.0(C-1"), 31.1(C-3), 76.3(C-2), 104.1(C-8), 109.0(C-6), 111.7(C-2'), 114.3(C-10), 124.9(C-2"), 125.(C-2"'), 128.3(C-5'), 130.3(C-5), 131.0(C-6'), 131.4(C-3"), 131.6(C-3"'), 132.1(C-1'), 143.9(C-4'), 144.1(C-3'), 157.(C-7), 157.5(C-9).
도 5 내지 8 및 표 3에서 나타낸 바와 같이, 분석결과 상기 화학식 1d의 화합물은 두 개의 이소프레닐기를 포함하는 신규한 플라반계 화합물임을 확인하였다.
< 실험예 1> 에스트로겐 수용체에 대한 유전자 전사활성
본 발명의 화합물이 가지는 에스트로겐 수용체에 대한 유전자 전사활성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
CV-1세포(원숭이 신장세포주)를 에스트로겐이 제거된 10% 활성탄-덱스트란을 처리한 소태아혈청(charcoal-dextran stripped FBS; CD-FBS) 배지에서 배양한 후, 48웰 플레이트에 mL당 150000세포로 접종하여 24시간 배양하였다. 상기 CV-1세포에 hER-α 또는 hER-β 플라스미드 및 3개의 에스트로겐 반응 요소(estrogen response element; ERE) 복제단을 포함하는 pERE-루시페라아제 플라스미드(pERE-luciferae plasmid)를 혈청-제거배지에서 6시간 동안 리포펙타아민 LTX(Lipofectamine LTX)시약을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환 효율을 균일하게 평가하기 위해, 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 플라스미드를 동시에 처리하였다. 형질전환된 세포를 시료와 함께 24시간 동안 배양한 후 세포들을 세포용해용 완충용액으로 용해하고, 용해된 세포 용해물 중의 일부에 루시페라아제 기질을 첨가한 후 루미노미터를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정하고, 나머지 일부의 세포 용해물은 베타-갈락토시다아제용 시약을 첨가한 후 400 nm의 흡광도에서 베타-갈락토시다아제 활성을 측정하였다(최종 활성은 루시페라아제 활성을 베타-갈락토시다아제 활성으로 나눈 값이다). 에스트로겐 수용체의 유전자 전사에 대한 최종활성은 도 9, 도 10 및 표 4에 나타내었고, 활성이 가장 우수한 화학식 1a로 표시되는 화합물에 대한 에스트로겐 수용체의 유전자 전사활성은 도 11 및 표 5에 나타내었다.
화합물 농도(μM) ER-α(%) ER-β(%)
E2 0.1 100 100
1a
5

 123.389 61.4039
1b 80.871 43.9901
1c 42.3968 42.9863
1d 21.4483 33.392
도 9, 도 10 및 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 닥나무 추출물의 화합물은 대조군의 0.1 μM E2활성과 비교하였을 때, ER-α의 활성은 화학식 1a로 표시되는 화합물은 123%, 화학식 1b로 표시되는 화합물은 81%, 화학식 1c로 표시되는 화합물은 42% 및 화학식 1d로 표시되는 화합물은 21%이고, ER-β의 활성은 화학식 1a로 표시되는 화합물은 61%, 화학식 1b로 표시되는 화합물은 43%, 화학식 1c로 표시되는 화합물은 43% 및 화학식 1d로 표시되는 화합물은 33%로 유전자 전사활성을 나타냄을 확인하였다.
화합물 농도(μM) ER-α ER-β
E2 0.1 315.8 253.2

1a		 0.08 27.8 10.9
0.04 54.3 88.0
5 123.7 163.3
10 180.0 211.7
1a+ICI 1 3.2 1.5
PPT(대조약물) 1 330.2 0.7
DPN(대조약물) 1 9.2 172.9
도 11 및 표 5에 나타난 바와 같이, 상기 표 4에서 활성이 가장 좋은 화학식 1a로 표시되는 화합물에 대하여 ER-ERE 전사 활성을 확인한 결과 상기 화학식 1a로 표시되는 화합물은 농도에 의존적임을 확인하였고, 화학식 1a로 표시되는 화합물의 ER-α 및 ER-β의 EC50값이 각각 1.59 μM 및 0.53 μM로서 화학식 1a로 표시되는 화합물은 ER-β에 대해 3배 정도의 선택성적인 유전자 전사활성이 있는 것을 확인하였다. 또한 화학식 1a로 표시되는 화합물의 ERE 전사활성은 에스트로겐 수용체 길항 저해제(ICI-182780)에 의해 완전히 억제됨을 확인하였고, 이는 화학식 1a로 표시되는 화합물의 에스트로겐활성이 에스트로겐 수용체에 의존적임을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 에스트로겐 활성을 나타내며, 활성이 가장 우수한 화학식 1a로 표시되는 화합물의 에스트로겐 수용체 유전자 전사 활성이 농도에 의존적이고, 에스트로겐 수용체를 경유하며, ER-β에 선택성이 우수하므로 갱년기 증후군 개선제, 치료제, 골다공증 개선제 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 2> 에스트로겐 수용체 리간드 결합활성
본 발명의 화합물이 가지는 에스트로겐 수용체에 대한 리간드 결합 활성을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
에스트로겐 수용체에 대한 리간드 결합 활성은 hER-α와 hER-β를 사용하는 경쟁적 결합시험(competitive binding assay)으로 평가되었다(Jung et al., 2009, Phytother Res ., 24(2): 295-300.).
구체적으로, 재조합 인간 에스트로겐 수용체 알파(hER-α) 또는 재조합 인간 에스트로겐 수용체 베타(hER-β)를 10 mM 트리스(Tris, pH 7.5), 10% 글리세롤, 1 mM 디티올트레이톨(DTT) 및 1 mg/mL 소혈청 알부민(BSA)으로 구성된 결합완충액을 이용하여 5 nM로 희석하고, [3H]-E2(3 nM)로 처리하였으며 이때, 화합물 처리군, 1 μM의 표지 되지 않은 E2를 포함하거나 포함하지 않은 대조군을 운영하였다.
25℃에서 2시간 배양한 후, 유리섬유여과장치를 이용하여 여과하였다. 필터는 차가운 0.05%의 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)으로 구성된 완충용액으로 충분히 세척하고, 건조시킨 후, β-카운터를 이용하여 방사능을 측정하였다. 비특이적인 [3H]-E2결합(dpm nonspecific)은 표지 되지 않은 E2(1 μM )의 처리에 의한 값으로, 총 [3H]-E2결합(dpm control)은 [3H]-E2만 처리한 값으로 구하였다. 측정결과를 도 12 및 표 6에 나타내었다.
화합물 IC50(μM)α RBA(%)β 선택성(β/α)
hER-α hER-β hER-α hER-β
1a 8.1(±0.8) 1.8(±0.3) 0.069 0.394 5.71
1b 26.2(±2.3) 14.7(±0.4) 0.021 0.048 2.29
1c 57.2(±2.3) 41.7(±0.4) 0.010 0.017 1.70
1d 151.1(±11.1) 96.0(±10.5) 0.004 0.007 1.75
도 12 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 상기 화합물에 대한 에스트로겐 수용체 리간드활성을 평가한 결과, 닥나무에서 분리한 4개의 에스트로겐성 활성을 가진 화합물들은 hER-α와 hER-β에 유의할 만한 수준의 결합 친화력을 나타내었다. 구체적으로 실시예의 화합물들은 hER-α보다 hER-β에 더 높은 결합친화력을 나타내었고, 활성이 가장 우수한 화학식 1a로 표시되는 화합물의 IC50 값은 hER-α와 hER-β에 대해 각각 8.1과 1.8 μM로서 ER-α보다 ER-β에 대한 5.71배의 결합선택성을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 화합물은 hER-α와 hER-β에 대한 결합 친화력과 결합선택성이 있으므로 갱년기 증후군 개선제 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 3> 에스트로겐 민감성 유방암 세포( MCF -7 BUS ) 증식활성
본 발명에 따른 화합물이 가지는 에스트로겐 민감성 유방암세포(MCF-7 BUS)의 증식활성을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
에스트로겐 민감성 유방암 세포(MCF-7 BUS)에서 실시예의 화합물 및 E2 처리에 의한 세포증식 효과를 평가하기 위하여 MTT assay법을 활용하였다. MCF-7 BUS 세포는 사용하기 전에 활성탄-덱스트란을 처리한 FBS(DC-FBS)를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 24시간 이상 배양한 후, 10% FBS를 포함하고, 페놀레드가 제거된 DMEM를 이용하고, 96웰 플레이트에 4000세포/웰 농도로 접종하여 48시간 동안 배양한 후 시료를 처리하였다. 시료로는 실시예에서 제조된 화학식 1a 내지 1d로 표시되는 화합물을 각각 0.1, 1, 10μM의 농도로 처리하거나, 상기 화합물 10μM에 ICI 182780 화합물(에스트로겐 수용체 저해제) 1μM을 혼합한 화합물을 사용하였으며, 대조군으로는 100 nM의 E2를 사용하였다. 6일 동안 배양한 후 MTT실험을 통해 세포의 증식 정도를 평가하였다. 측정결과를 도 13 및 표 7에 나타내었다.
화합물 농도(μM) RPE to E2(%)
E2 10 100
E2 + ICI 10 36.8


1a		 0.01 38.4
0.1 44.7
1 59.8
10 92.5
10(μM) +ICI 1(μM) 41.1


1b		 0.01 45.1
0.1 47.3
1 59.2
10 84.5
10(μM) +ICI 1(μM) 44.4


1c		 0.01 34.7
0.1 36.1
1 47.8
10 68.5
10(μM) +ICI 1(μM) 42.7


1d		 0.01 40.5
0.1 42.2
1 55.7
10 15.7
10(μM) +ICI 1(μM) 21.0
도 13 및 표 7에 나타난 바와 같이, 상기 화합물들을 0.01 μM 내지 10 μM 농도로 6일 동안 처리한 결과 농도 의존적으로 세포증식이 유도되는 것을 확인하였다. 또한 에스트로겐 수용체 길항저해제인 ICI 182780 화합물에 의해 세포증식활성이 음성 대조군 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 화합물들은 에스트로겐 수용체 민감성 유방암 세포에서 E2와 같이 에스트로겐기능을 농도 의존적으로 발휘하며, 에스트로겐 수용체 길항제에 의해 활성이 소멸 되는 것으로 보아 에스트로겐 수용체를 경유한 리간드 활성이 있다는 것이 확인되었으므로 갱년기 증후군 치료제 및 골다공증 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
<제제예 1> 약학적 제제의 제조
1-1. 산제의 제조
플라반계 화합물 500 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
플라반계 화합물 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캅셀제의 제조
플라반계 화합물 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
플라반계 화합물 500 ㎎
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
플라반계 화합물 100 ㎎
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.
제조예2: 건강식품의 제조
플라반계 화합물 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎎
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제조예 3: 건강 음료의 제조
플라반계 화합물 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
제조예 4: 기타 건강식품의 제조
4-1. 음료의 제조
꿀 522 ㎎
치옥토산아미드 5 ㎎
니코틴산아미드 10 ㎎
염산리보플라빈나트륨 3 ㎎
염산피리독신 2 ㎎
이노시톨 30 ㎎
오르트산 50 ㎎
플라반계 화합물 0.48~1.28 ㎎
물 200 ㎖
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.
4-2. 츄잉껌의 제조
껌베이스 20 %
설탕 76.36~76.76 %
플라반계 화합물 0.24~0.64 %
후르츠향 1 %
물 2 %
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.
4-3. 캔디의 제조
설탕 50~60 %
물엿 39.26~49.66 %
플라반계 화합물 0.24~0.64 %
오렌지향 0.1 %
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.
4-4. 밀가루 식품의 제조
플라반계 화합물 0.5 내지 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
4-5. 유제품( dairy products )의 제조
플라반계 화합물 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
4-6. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화 시켜서 건조한 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메시의 분말로 제조하였다. 검은콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조한 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메시의 분말로 제조하였다. 상기에서 제조한 곡물류 및 종실류와 본 발명의 플라반계 화합물을 다음과 같은 비율로 배합하여 제조하였다.
현미 30 %
율무 15 %
보리 20 %
들깨 7 %
검정콩 7 %
검은깨 7 %
플라반계 화합물 3 %
영지 0.5 %
지황 0.5 %

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1 또는 화학식 1a로 표시되는 플라반(flavan)계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112012011747580-pat00019
    ;
    [화학식 1a]
    Figure 112012011747580-pat00058

    (상기 화학식 1에서, R1은 수소 또는
    Figure 112012011747580-pat00020
    이고; R2는 수소 또는 하이드록시기이고; R3 및 R4 는 각각 수소 또는
    Figure 112012011747580-pat00021
    이며,
    상기 화학식 1에서, 고리 A상의 "
    Figure 112012011747580-pat00022
    "은 단일결합 또는 비결합이고, 여기서 상기 고리 A상의 "
    Figure 112012011747580-pat00023
    "이 단일결합인 경우, X는 부재이고, 상기 고리 A상의 "
    Figure 112012011747580-pat00024
    "이 비결합인 경우, X는 수소이다).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 플라반계 화합물은 하기 화학식 1a 내지 1d로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1a]
    Figure 112010036054542-pat00025

    [화학식 1b]
    Figure 112010036054542-pat00026

    [화학식 1c]
    Figure 112010036054542-pat00027

    [화학식 1d]
    Figure 112010036054542-pat00028

  3. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 에스트로겐 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 하기 화학식 1 또는 화학식 1a로 표시되는 플라반계 화합물을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112012011747580-pat00029
    ;
    [화학식 1a]
    Figure 112012011747580-pat00059

    (상기 화학식 1에서, R1은 수소 또는
    Figure 112012011747580-pat00030
    이고; R2는 수소 또는 하이드록시기이고; R3 및 R4 는 각각 수소 또는
    Figure 112012011747580-pat00031
    이며,
    상기 화학식 1에서, 고리 A상의 "
    Figure 112012011747580-pat00032
    "은 단일결합 또는 비결합이고, 여기서 상기 고리 A상의 "
    Figure 112012011747580-pat00033
    "이 단일결합인 경우, X는 부재이고, 상기 고리 A상의 "
    Figure 112012011747580-pat00034
    "이 비결합인 경우, X는 수소이다).
  5. 제 4항에 있어서, 상기 플라반계 화합물은 하기 화학식 1a 내지 1d로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
    [화학식 1a]
    Figure 112010036054542-pat00035

    [화학식 1b]
    Figure 112010036054542-pat00036

    [화학식 1c]
    Figure 112010036054542-pat00037

    [화학식 1d]
    Figure 112010036054542-pat00038

  6. 제 4항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 에스트로겐 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 이소프레닐레이티드 플라반계 화합물:
    [화학식 1]
    Figure 112012011747580-pat00039

    (상기 화학식 1에서, R1은 수소 또는
    Figure 112012011747580-pat00040
    이고; R2는 수소 또는 하이드록시기이고; R3 및 R4 는 각각 수소 또는
    Figure 112012011747580-pat00041
    이며,
    상기 화학식 1에서, 고리 A상의 "
    Figure 112012011747580-pat00042
    "은 단일결합이고, X는 부재이되;
    다만, R1 내지 R4가 모두 수소이고, 고리 A상의 "
    Figure 112012011747580-pat00060
    "은 단일결합이고, X가 부재인 경우는 제외한다).
  8. 제 7항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 1c 또는 1d의 화합물인 것을 특징으로 하는 신규한 플라반계 화합물.
    [화학식 1c]
    Figure 112010036054542-pat00043

    [화학식 1d]
    Figure 112010036054542-pat00044

  9. 닥나무의 뿌리껍질을 에탄올로 추출하는 단계(단계 1);
    상기 단계 1에서 얻은 닥나무 뿌리껍질 추출물을 물에 현탁시킨 후, 추출 용매로 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 사용하여 닥나무 뿌리껍질 분획물을 얻는 단계(단계 2); 및
    상기 단계 2에서 얻은 에틸아세테이트 분획물에 컬럼크로마토그래피를 수행하여 신규한 플라반계 화합물을 분리 및 정제 하는 단계(단계 3)를 포함하는 제 7항의 플라반계 화합물의 제조방법.
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