KR101671713B1 - 닥나무 유래 플라반 유도체를 유효성분으로 함유하는 근육위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
닥나무 유래 플라반 유도체를 유효성분으로 함유하는 근육위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
닥나무에서 유래된 플라반 유도체인 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C를 유효성분으로 함유하는 근육위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 근육세포 재생촉진 및 근육세포로의 분화유도에 효과적이다.
Description
본 발명은 근육위축증(muscular dystrophy)의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로서, 보다 구체적으로는 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여, 근육줄기세포의 근육세포로의 분화를 촉진하고, 섬유아세포를 근육세포로의 전환분화를 촉진하여 섬유화를 막고, 근육 재생 능력을 강화하여 근육위축증을 치료하는 닥나무 유래 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 대한 것이다.
근육 이상과 관련된 질환은 근육 손실 및 관련 질환, 예를 들면,근육감소증, 악액질, 근육손상, 근이영양증 및 근육피로이다. 근육 질환의 치료는 근육 수행력, 강도 및 근육기능의 유지를 포함한다.
근육 손실은 근육량의 점진적 손실, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다. 위축증 및 비대증이 일어나는 과정은 포유동물 종 전체에서 나타난다. 다양한 연구에 의해 동일한 분자기전, 세포 및 생리학적 과정이 설치류와 인간 모두의 위축증에서 동일함이 입증되었다.
근육 손실은 다양한 원인에 기인하며, 다양한 병증, 질병 및 질환과 관련된다. 이들로는 유전자 이상에 의해 야기된 근이영양증, 예를 들면, 뒤센(Duchenne)형 근이영양증(Duchenne Muscular Dystrophy (DMD)), 진행성 근이영양증, 베커(Becker)형 근이영양증, 디제린-란도즈(Dejerine-Landouzy) 근이영양증, 에르브(Erb)씨 근이영양증, 척수성 근위축증 및 영아 신경축삭퇴행위축증이 포함되나, 이들로 한정되지만은 않는다.
근육 손실은 또한 다양한 만성 질환 및 노화 과정에 의해 야기될 수 있다. 신체가 노화됨에 따라, 새롭게 생성되는 골격근의 일부가 섬유 조직으로 대체된다.그러므로, 인간의 정상적 노화는 약화 및 퇴화의 원인이 되는, 근육감소증으로 불리는 상태인 골격 근육량 및 강도의 진행성 감소와 관련된다.
또한, 연령관련 질환, 예를 들면, 고혈압, 내당능장애 및 당뇨, 비만, 이상지질혈증, 아테롬성경화증 및 심혈관 질환도 근육량의 손실과 관련된다.
또한, 암, 자가면역 질환, 감염 질환, HIV 감염, AIDS, 만성 염증, 관절염, 영양실조, 신장 질환, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐기종, 구루병, 만성 하부 척추 통증, 말초신경 손상, 척수 손상, 화학적 손상, 중추신경계(CNS) 손상과 같은 다른 질환도 근육 손실과 연관되거나 근육 손실을 야기할 수 있다. 최종적으로, 근육 손실을 야기하는 상태는 질병으로 인한 장기 고정과 같은 폐용 상태, 또는 장기간 휠체어 사용, 장기 침상 요양, 골절 또는 외상과 같은 무력함으로부터 비롯될 수 있다. 수술 후 침상 요양은 주당 약 10%의 골격 근육량의 손실을 야기하는 것으로 평가된다.
치료되지 않은 근육 손실 질환은 심각한 건강상의 문제를 초래할 수 있다. 근육 손실 시에 일어나는 변화는 약화된 신체 상태를 유발하여 무능한 신체 수행력 및 유해한 건강 상태를 야기할 수 있다.
따라서, 근위축증은 환자의 사회복귀를 심각하게 제한할 수 있다. 만성 질환에 기인한 근육 손실은 운동성의 조기 손실을 유발하고 질환-관련 사망률의 위험성을 증가시킬 수 있다. 폐용으로 인한 근육 손실은 근육 기능 및 근육량에 있어 연령 관련 결함을 이미 가질 수 있는 노년층에서 특히 심각한 문제로, 영구적 무력함 및 조기 사망뿐 아니라 골절률의 증가를 야기한다. 상기 상태의 임상적 중요성에도 불구하고, 상기 상태를 예방하거나 역전하기 위한 치료법이 거의 존재하지 않아 이에 대한 해결방안이 요구된다.
이에 본 발명자는 닥나무 추출물에서 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C를 발굴하여 MyoD 활성을 조절하고, 근육 줄기세포 및 근육아세포를 근육세포로 분화시키는 현상을 규명하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 근육위축증의 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물 또는 기능성 식품의 제공을 목적으로 한다. 또한 손상된 근육을 위한 근육재생용 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 과제해결을 위해, 본 발명은 닥나무에서 유래된 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C를 유효성분으로 함유하는 근육위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 상기 근육위축증은 노화성 근육감소증, 퇴행성 근육감소증, 당뇨병성 근육감소증을 포함할 수 있다.
또한 상기 근육위축증은 지대형근위축증, 베커근위축증, 뒤세엔트근위축증, 근긴장성근위축증, 에머리-드레이푸스근위축증, 윈이근위축증, 안면겹갑상완근우위축증, 선천성근위축증을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 과제해결을 위해 닥나무에서 유래된 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C를 유효성분으로 함유하는 근육세포 분화유도용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 근육세포 분화유도는 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여 근육줄기세포의 근섬유로의 분화 및 섬유아세포를 근육세포로 전환하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 닥나무에서 유래된 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C를 유효성분으로 함유하는 근육위축증 예방 및 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
상기 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C는 닥나무의 추출물에서 얻어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 추출물은 에탄올 추출, 열수 추출을 통해 얻어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 닥나무 유래 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C를 유효성분으로 함유하는 근육위축증 예방 및 개선용 약학적 조성물 또는 기능성 식품은, 닥나무 추출물에서 유래된 것으로 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여, 근육줄기세포의 근육세포로의 분화를 촉진하고, 섬유아세포를 근육세포로 전환 분화를 촉진하고, 근육세포의 재생 능력을 강화시키며 또한 다핵성 근섬유 형성을 촉진하여 근육위축증 및 근육감소증을 치료, 예방 또는 개선할 수 있다.
도 1은 실험 전략과 닥나무의 에탄올 추출물과 그의 에틸아세테이트 분획물에 대한 근육 특이적 표지 단백질 (MHC)의 발현증가를 나타내었으며, 닥나무 유래 플라반유도체인 카지놀 P 카지놀 I, 카지놀 C 의 화학구조식과 MHC 발현 결과 (도 1-A)이다.
도 2는 C2C12 세포의 근관세포(myotube) 형성의 촉진정도를 확인하기 위해 MHC와 DAPI로 면역염색한 결과이고 (도 2-A), 도 2-A에서 보여준 세포에서의 근관세포(myotube) 형성을 정량한 결과(도 2-B)이다.
도 3은 근육 특이적 표지 단백질의 발현증가를 보기 위한 것으로 카지놀 P의 농도별 단백질 발현결과 (도 3-A) 이고, 카지놀 P의 분화유도 시간별 단백질 발현결과 (도 3-B) 이다.
도 4는 근원세포(myoblast) 분화에서 p38MAPK 신호전달 경로 활성을 보기 위한 것으로, 카지놀 P의 농도에 따라 MyoD 의존성 전사활성이 증가한 결과이고 (도 4-A), 카지놀 P의 농도에 따른 p38MAPK의 활성화를 p38MAPK의 인산화 형태인 p-p38MAPK (pp38)의 생성 정도로 나타낸 결과이고 (도 4-B 및 도 4-C), 카지놀 P의 처리기간에 따른 p38MAPK의 활성화를 p38MAPK의 인산화 형태인 p-p38MAPK (pp38)의 생성 정도로 나타낸 결과이고 (도 4-D 및 도 4-E), p38MAPK (p38) 억제자인 SB203580는 카지놀 P에 의한 MHC, 미오게닌(Myogenin), 트로포닌-T(Troponin-T)의 발현유도와 p38MAPK의 인산화 (pp38)를 저해하는 결과 (도 4-F 및 도 4-G)이다.
도 5는 10T1/2 섬유아세포(fibroblast)의 MyoD 매개 전환분화정도를 보기 위한 것으로, MyoD 발현 벡터를 형질주입한 섬유아세포(fibroblast)에 카지놀 P를 처리하였을 때, 미오게닌(Myogenin)과 MyoD의 발현정도를 나타낸 결과이고 (도 5-A 및 도 5-B), 섬유아세포에서의 p38MAPK의 인산화 (pp38) 정도를 나타낸 결과이다(도 5-C 및 도 5-D).
도 2는 C2C12 세포의 근관세포(myotube) 형성의 촉진정도를 확인하기 위해 MHC와 DAPI로 면역염색한 결과이고 (도 2-A), 도 2-A에서 보여준 세포에서의 근관세포(myotube) 형성을 정량한 결과(도 2-B)이다.
도 3은 근육 특이적 표지 단백질의 발현증가를 보기 위한 것으로 카지놀 P의 농도별 단백질 발현결과 (도 3-A) 이고, 카지놀 P의 분화유도 시간별 단백질 발현결과 (도 3-B) 이다.
도 4는 근원세포(myoblast) 분화에서 p38MAPK 신호전달 경로 활성을 보기 위한 것으로, 카지놀 P의 농도에 따라 MyoD 의존성 전사활성이 증가한 결과이고 (도 4-A), 카지놀 P의 농도에 따른 p38MAPK의 활성화를 p38MAPK의 인산화 형태인 p-p38MAPK (pp38)의 생성 정도로 나타낸 결과이고 (도 4-B 및 도 4-C), 카지놀 P의 처리기간에 따른 p38MAPK의 활성화를 p38MAPK의 인산화 형태인 p-p38MAPK (pp38)의 생성 정도로 나타낸 결과이고 (도 4-D 및 도 4-E), p38MAPK (p38) 억제자인 SB203580는 카지놀 P에 의한 MHC, 미오게닌(Myogenin), 트로포닌-T(Troponin-T)의 발현유도와 p38MAPK의 인산화 (pp38)를 저해하는 결과 (도 4-F 및 도 4-G)이다.
도 5는 10T1/2 섬유아세포(fibroblast)의 MyoD 매개 전환분화정도를 보기 위한 것으로, MyoD 발현 벡터를 형질주입한 섬유아세포(fibroblast)에 카지놀 P를 처리하였을 때, 미오게닌(Myogenin)과 MyoD의 발현정도를 나타낸 결과이고 (도 5-A 및 도 5-B), 섬유아세포에서의 p38MAPK의 인산화 (pp38) 정도를 나타낸 결과이다(도 5-C 및 도 5-D).
닥나무(Broussonetia kazinoki)에서 유래된 플라반 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하고,
상기 플라반 유도체는 카지놀 P, 카지놀 I, 카지놀 C 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 근육위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
닥나무(paper mulberry)는 오랫동안 한국, 중국, 일본에서 종이의 제조에 사용되어 왔다. 동의보감에 따르면, 닥나무는 화상과 여드름 같은 피부과 질환에 사용되어 왔다. 닥나무 추출물이 항당뇨, 항고혈당 효과, 및 멜라닌 합성 억제에 대한 보고가 되었다 하더라도, 근원세포(myoblast) 분화에 대한 생물학적 효과는 아직 보고되지 않았다.
MyoD계 전사인자의 활성화는 부상 후 골격 근육의 재생에 근본적인 근육세포분화(myogenesis)에 매우 중요하다. MyoD 활성에 대한 agonist를 발굴하기 위하여 닥나무 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획물 및 그의 플라반유도체에 대하여 MHC 발현증가를 평가하였다 (도1-A 참조). 이 때 발견된 카지놀 P, 카지놀 I 및 카지놀 C (도 1-A 참조)를 가지고 근원세포(myoblast) 분화에 미치는 영향을 실험한 결과, 이 카지놀들은 MHC인 근원성(myogenic) 마커단백질의 발현증가를 촉진시켰다. 또한 C2C12 근원세포(myoblasts)에 카지놀 P를 처리하는 경우, 중요한 근육분화관련효소(promyogenic kinase)인 p38MAPK의 활성이 투여량 및 분화 시간에 의존적으로 증가하였다. 그리고 카지놀 P 처리는 배아섬유모세포(embryonic fibroblast)의 근원세포(myoblast)로의 MyoD 매개 전환분화를 강화했다. 마지막으로 카지놀 P는 p38MAPK 및 MyoD 전사 활성화를 통해 근육세포(myogenic)의 분화를 촉진했다.
그리하여 플라반 유도체인 카지놀 P, 카지놀 I, 카지놀 C 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물은 근육위축증, 섬유증(fibrosis)의 예방 및 근육 재생, 복구를 위한 치료제가 될 수 있다.
이를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
근육 손실은 질병(cachexia), 불활성화(atrophy) 또는 노화와 같이 다양한 형태로 관찰된다. 근육 감소증(sarcopenia)은 나이가 들어감에 따라 발생하는 근육량의 손실로 정의되며, 강도, 대사율 및 호기성 용량의 감소와 관련된다. 손상에 대응하여 골격 근육은 놀라운 재생 능력을 가지고 있다. 활성화된 근육위성세포(satellite cell)를 근원세포(myoblasts)라고 하는데 이 근원세포는 부상 부위로 이동하며 그곳에서 증식, 분화 및 융합되어 근섬유(myofibers)를 형성한다. 근육세포분화(myogenesis)는 고도로 조직화된 다단계 과정이며, 근육세포분화과정에서 bHLH형 인자(Myf5, MRF4 및 MyoD)들과 p38MAPK 및 AKT 신호전달은 중요한 역할을 한다. 특히, p38MAPK는 E 단백질과 MyoD 이합체화를 조절함에 따라 MyoD계 전사 인자의 활성화를 통해 근원세포(myoblast)의 근관세포(myotube)로의 분화에 필수적인 역할을 한다.
닥나무(paper mulberry)는 오랫동안 한국, 중국, 일본에서 종이의 제조에 사용되어 왔다. 동의보감에 따르면, 닥나무는 화상과 여드름 같은 피부과 질환에 사용되어 왔다. 닥나무 추출물이 항당뇨, 항고혈당 효과, 및 멜라닌 합성 억제에 대한 보고가 되었다 하더라도, 근원세포(myoblast) 분화에 대한 생물학적 효과는 아직 보고되지 않았다.
본 발명에서, 본 발명자는 근육세포분화 활성체로써 닥나무로부터 정제된 kazinol-P(카지놀 P)를 확인하기 위해 C2C12 근원세포(myoblast)에서 MyoD-반응성 리포터(responsive reporter)와 근육분화 마커 단백질인 미오신 중쇄단백질(myosin heavy chain, MHC) 발현의 활성화를 이용하여 추출한 화합물 라이브러리의 스크리닝을 진행하였다. 그 결과 카지놀 P 처리는 근육세포분화마커 단백질의 발현수준 및 다핵성 근관세포(myotube)의 생성을 증가시켰다. 또한, C2C12 근원세포(myoblasts)에서 MyoD를 활성화하는 중요한 근육분화효소(promyogenic kinase)인 p38MAPK를 활성화하였다. 더욱이, 섬유모세포(fibroblast)의 근원세포(myoblast)로의 MyoD 매개 트랜스-분화는 카지놀 P 처리에 의해 급격히 향상되었다. 이러한 결과는 카지놀 P가 근육분화 및 근육 재생을 개선하고 노화 관련 또는 병리학적인 근육 질병에서 발생하는 근위축증, 근육 재생 또는 섬유증을 억제하기 위한 치료제의 후보 물질로서의 가능성을 가지고 있음을 설명하는 것이다. 또한 카지놀 P와 유사한 플라반유도체인 카지놀 I 및 카지놀 C도 근육분화 마커 단백질인 MHC의 발현 수준을 증가시켰으며, 카지놀 P와 동등한 후보 물질로써의 가능성을 가지고 있다. 이런 플라반유도체를 포함하는 닥나무 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물도 동등한 효과를 확인하였다.
근육위축증은 노화성 근육감소증, 퇴행성 근육감소증, 당뇨병성 근육감소증을 포함할 수 있다.
또한 근육위축증은 지대형근위축증, 베커근위축증(Becker Muscular Dystrophy (BMD)), 뒤세엔트근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy,(DMD)), 근긴장성근위축증(Myotonic Muscular Dystrophy), 에머리-드레이푸스근위축증(Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy (EDMD), 원위 근위축증(Distal Muscular Dystrophy (DD)), 안면겹갑상완근우위축증(Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy (FSHD)), 선천성근위축증(Congenital Muscular Dystrophy (CMD))을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면 닥나무에서 유래된 플라반 유도체인 카지놀 P, 카지놀 I, 카지놀 C 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 1종인 것을 유효성분으로 함유하는 근육세포 분화 또는 재생촉진용 약학적 조성물로 제조될 수 있다.
상기 근육세포 분화는 근육세포로 분화 가능한 근원세포 또는 섬유아세포 등의 근육세포로의 분화일 수 있다.
상기 근육세포분화촉진은 MyoD 전사조절인자의 활성조절에 의한 것일 수 있다.
상기 근육세포재생은 손상된 근육세포의 재생일 수 있다. 상기 손상은 수술, 암, 염증, 감염 등 유전적 인자와 환경적 인자에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 근육위축증의 치료 또는 예방용 조성물은 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 치료 및 예방에 사용하기 위해 본 발명의 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C 자체를 투여하는 것이 가능하나, 약학적 조성물의 활성 성분으로서 상기 카지놀 P,카지놀 I, 카지놀 C 또는 이들의 조합이 포함되는 것이 바람직하다.
상기 약학적 조성물은 카지놀 P,카지놀 I 및 카지놀 C의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유할 수 있다.
또한 상기 약학적 조성물은 상기 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C를 유효성분으로 함유하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 피부도포 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.01∼1000 ㎎/일, 바람직하게는 1∼500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 근육위축증의 예방 또는 개선용 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 카지놀 P, 카지놀 I, 카지놀 C 또는 이들의 조합을 함유할 뿐만 아니라, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
상기 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C는 닥나무의 추출물에서 얻어진 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 추출물은 물, C1-C4 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 얻어질 수 있다.
닥나무 추출물은 닥나무로부터 침출, 전출하여 얻은 침출액 뿐 아니라 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물 또는 상기의 농축물을 다시 건조시켜 제조한 침체, 전제, 정기, 유동엑기스 및 닥나무 중에 함유되어 주 효과를 발휘하는 화학 물질은 물론 식물 그 자체를 모두 포함한다. 또한 본 발명에서는 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 열매 등 닥나무의 모든 부분으로부터의 추출물을 사용할 수 있으며, 어느 특정 부분의 추출물로 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 닥나무 추출물의 제조방법으로는 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 닥나무를 자연 건조 또는 강제 건조 등 임의의 방법으로 건조하여 잘게 자른 후, 물, 에탄올, 부탄올, 아세톤 등의 극성 용매; 에테르, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트 등의 비극성 용매; 상기 비극성 용매와 극성 용매의 혼합 용매; 알칼리 수 등의 용매, 또는 콩기름, 참기름 등의 식물유 등을 사용하여 냉침, 페르콜레이션(percolation), 온침 등의 임의의 방법에 의해서 침출 처리하여 유효 성분을 함유한 추출물을 얻을 수 있다.
상기 추출물은 물에 현탁시키고, n-헥산, 에틸 아세테이트, 클로로포름 및 부탄올을 사용하여 순차적으로 분획하여 각각의 분획물을 얻어 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C가 함유된 추출물을 분리할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시 예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
1. 실시예
(1) 닥나무 뿌리로부터 플라반 유도체 추출 및 분리
닥나무의 뿌리는 2007 년 2 월에 경동 시장에서 구입하였고 숙명여대 양기숙 교수가 식물 재료를 확인하고 바우처 표본(No. SPH 07002)는 숙명여대 식물 표본실에 기탁했다.
공기 건조된 닥나무 뿌리 껍질 (0.6 kg)를 2 ℓ의 에탄올을 이용하여 실온에서 24시간 동안 추출하였다. 추출물 (51g)을 물에 현탁시키고, n-헥산, 에틸 아세테이트, 클로로포름 및 부탄올을 사용하여 순차적으로 분획하여 각각의 분획물을 얻었다. 에틸 아세테이트 분획물 (31g)을 n-헥산:아세톤 혼합액(20:1→ 1:10 농도 구배)을 전개용매로 하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 11개 분획으로 나누었다. 분획 7 (7.2 g)을 클로로포름:메탄올 혼합액(100:1 → 10:1 농도 구배)을 전개용매로 하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 소분획물 7-3 (3.03g)을 30% 내지 100%의 메탄올을 기울기 용출용매로 이용하여 RP-C18 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 kazinol-P (18 mg)와 kazinol C (260 mg)을 정제하였다. 소분획물 7-4 (1.48 g) 을 40% 내지 100%의 메탄올을 기울기 용출용매로 이용하여 RP-C18 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 kazinol-I (14 mg)를 정제하였다.
분리한 카지놀 화합물들의 순도는 Waters 1525 system (Milford, MA, USA)를 사용하여 HPLC에 의해 평가하였다. 역상 컬럼(ODS-2, 150 * 4.6 mm i.d., GL Sciences Inc., Japan)은 80 % 메탄올로 용출하였고, 용출액은 280 nm에서 UV 검출기로 모니터링하였다. 화학구조는 분광학적 분석에 의해 기존에 알려진 닥나무 유래 kazinol-P(1), kazinol I(2) 및 kazinol C(3)로 각각 확인되었다. (도 1-A 참조)
(2) 세포 배양 및 분화 실험
통상적인 방법으로 C2C12 및 10T1/2 세포주를 배양하였다. C2C12근원세포(myoblast)의 분화를 유도하기 위해, confluency 근처의 세포주를 37℃, CO2 인큐베이터에서 15% FBS (growth medium, GM)를 포함하는 DMEM에서 2% HS (differentiation medium, DM)를 함유하는 DMEM으로 변경하였고, 48 내지 72시간 동안 근관세포(myotube) 분화를 관찰하였다. 근관세포(myotube) 형성의 효율은 transient differentiation assay를 이용하여 정량하였다. p38MAPK 활성억제 연구를 위해, C2C12 세포주를 30분 동안 신선한 배지에서 100 nM SB203580로 미리 배양한 후, 1000 nM 카지놀 P을 처리하였다. 전환분화 연구를 위해, 100 mm 배양 접시에 10T1/2 세포주를 10 % FBS가 함유된 DMEM에서 배양하여 10 ㎍ MyoD 또는 control vector (pSuper)로 형질전환하였다. 24 내지 48시간 동안 배양한 후, 형질전환된 세포주를 2 %의 HS에서 카지놀 P로 48 시간 동안 처리하였다.
(3) 실험예 (웨스턴 블럿)
세포주를 extraction buffer(50 mM Tris [pH7.4], 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, complete protease inhibitor cocktail)에서 용해시키고 SDS PAGE를 수행하였다. 일차 항체로는 항-Cdo, 항-pan-Cadherin, 항-p38, 항-p-p38 (p38MAPK의 활성인산화형), anti-MHC, anti- 미오게닌(Myogenin), anti-트로포닌-T(Troponin-T) 및 anti-MyoD를 사용하였다. 신호는 Amersham ECL system (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)를 사용하여 검출하고 FUJIFILM Luminescent Image Analyzer LAS-3000로 정량하였다.
(4) 면역 세포 화학 및 현미경 검사
C2C12 세포주를 웰플레이트 웰당 3 X 104 세포 밀도를 갖도록 접종하였다. 24 시간 후, 세포주를 근관세포(myotube) 형성을 도모하기 위해 DM에서 72시간 동안 배양하였다. 분화 세포주는 4% paraformaldehyde로 고정시켜 0.1% Triton X-100을 포함하는 인산완충식염수(phosphate buffered saline)에 투과시킨 후 밀봉하여 항-MHC로 염색하였다. 이어서 Alexa Fluor 568-conjugated 2차 항체(Molecular Probes)로 처리하였다. 이미지는 Nikon ECLIPSE TE-2000U microscope, NIS-Elements F software (Nikon), Photoshop CS5 (Adobe)로 촬영 및 처리하였다.
(5) 루시퍼라아제 어세이 (Luciferase assay)
5 × 104 C2C12 세포주를 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양시킨 후 프로토콜에 따라 Lipofectamin 2000을 사용하여 4RTK reporter gene 및 MyoD plasmids로 형질전환하였다. 세포 배양, 근원세포(myoblast) 분화, 그리고 카지놀 처리는 전술한 바와 동일하게 수행하였다. 배양한 C2C12 세포주를 프로토콜에 따라 luciferase kit (Promega, Madison, WI)를 사용하여 루시퍼라아제 어세이를 진행하였다. 루시퍼라아제 어세이 활성은 20 초에 걸쳐 발광과 함께 Berthold luminometer를 사용하여 측정하였다. 형질전환 효율을 균일하게 평가하기 위해 β-갈락토시데이즈 플라즈미드 plasmid pCH110 (Amersham Pharmacia Biotech)를 동시에 처리하였다. 모든 형질전환은 적어도 3회 반복하여 수행하였다.
2. 실험예
(1) C2C12 세포에서 근관세포 형성을 촉진하는 카지놀 P
MyoD 및 근원세포(myoblast) 분화의 조절인자(regulator)의 가능성을 확인하기 위해, 닥나무로부터 여러 카지놀(kazinol) 화합물들을 정제하였고, C2C12 근원세포(myoblast)에서 MHC 발현 유도(도 1 참조) 정도를 기준으로 스크리닝하였다. 여러 후보 물질 중에서, 카지놀 P, 카지놀 I 또는 카지놀 C 는 상기 기준에 대한 스크리닝 실험에서 선택되었다.
본 발명자는 먼저 카지놀 P가 근관세포(myotube) 형성 유도에 의해 근원세포(myoblast) 분화에 길항 효과가 있는지 여부를 확인했다. C2C12 근원세포(myoblast)는 48시간 동안 DM에서 분화하도록 유도, 고정 및 항-MHC 항체로 면역염색되었고 이어서 핵을 관찰하기 위해 DAPI로 염색되었다.
그 결과 이들 세포주의 현미경 사진은 DMSO 처리한 C2C12 세포주에 비해 카지놀 P로 처리한 경우 근관세포(myotube)당 더 많은 핵을 가진 더 큰 근관세포(myotube)를 형성함을 보여주었다(도 2A 참조). MHC-positive 세포는 단일 핵을 가지는 것, 2 내지 5개의 핵을 가지는 것, 그리고 6개 이상의 핵을 가지는 것으로 분류하여 계산하였다(도 2B 참조).
또한 카지놀 P 처리는 투여량에 비례하여 6개 이상의 핵을 가지는 근관세포(myotube)의 상당한 증가와 함께 단핵 세포의 비율을 크게 감소시켰다(도 2B 참조). 이러한 결과는 카지놀 P 처리가 근원세포(myoblast) 분화 및 근관세포(myotube) 형성을 향상시킬 수 있음을 의미한다.
(2) 근육 특이적 단백질의 발현을 증가시키는 카지놀 P
다음으로 본 발명자는 MHC, 미오게닌(Myogenin) 및 트로포닌-T(Troponin-T)를 포함하는 근육세포분화와 관련된 근육 특정 단백질의 발현에 카지놀 P의 영향을 조사하였다. C2C12 세포주는 카지놀 P(10 내지 1000 nM)의 존재 하에서 48시간 동안 DM에서 배양하였다.
그 결과, DMSO 처리한 대조군에 비해 카지놀 P 처리된 C2C12 세포주는 투여량에 비례하여 증가된 MHC, 미오게닌(Myogenin) 및 트로포닌-T(Troponin-T) 발현을 보였다(도 3A 참조).
또한 분화 과정 동안 이러한 단백질의 발현 수준을 분석하면, DMSO 처리한 대조군에 비해 최종 농도 1000 nM 카지놀 P로 처리한 C2C12 세포주는 48시간에서 전술한 단백질들의 발현이 매우 증가함을 나타내었다(도 3B 참조). 이러한 결과는 카지놀 P 처리가 근원세포(myoblast) 분화 촉진을 일으켜 근육 특정 단백질의 발현 수준을 상승시킨다는 것을 의미한다.
(3) 근원세포(myoblast) 분화에서 p38MAPK의 활성을 상향 조절시키는 카지놀 P
p38MAPK 신호 전달 경로는 골격 근육 분화에 중요한 역할을 하고 p38MAPK 전달 경로의 장애는 근육 특정 단백질 및 근육세포분화의 유도를 저해한다. 여러 증거가 p38MAPK가 MyoD의 활성제임을 의미한다. 카지놀 P가 초기(D0 내지 D1)에 C2C12 근원세포(myoblast) 분화를 촉진시키기 때문에 카지놀 P가 MyoD 활성화를 일으키는 주요한 promyogenic kinase인 p38MAPK를 활성화시키는지 여부를 연구하였다. MyoD-responsive reporter에 대한 카지놀 P의 효과를 확인하기 위해, C2C12 세포주를 4RTK reporter, MyoD expression vector 또는 control vector로 형질전환하였고 DMSO, 카지놀 P로 DM에서 48시간 동안 처리한 뒤 이어서 luciferase assay를 수행하였다.
그 결과 스크리닝 데이터와 동일하게 카지놀 P는 투여량에 비례하여 MyoD-의존 전사 활성을 촉진시켰다(도 4A 참조).
카지놀 P가 근육세포분화 중에 p38MAPK 신호 전달 경로를 활성화시키는지를 확인하기 위해 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
그 결과 카지놀 P 처리는 투여량(도. 4B 및 4C 참조)과 분화 일수(도 4D 및 4E 참조)에 비례하여 p38MAPK의 활성화된 인산화된 형태 수준(pp38)을 상당히 증가시켰다.
카지놀 P 매개 근육세포분화에 대한 p38MAPK 활성화의 조건을 평가하기 위해, C2C12 세포주를 카지놀 P 및 p38MAPK 저해제인 SB203580로 처리하였다. C2C12 세포주를 100 nM SB203580로 30분 동안 미리 처리한 후 DM에서 48시간 동안 1000 nM 카지놀 P로 처리하였다.
그 결과 도 4F에 나타낸 바와 같이, SB203580로 처리한 경우 근육 특정 단백질의 발현이 억제되었고 카지놀 P 추가에도 해당 단백질들의 발현이 회복되지 않았다. 또한, 도 3F와 일관되게 카지놀 P 처리는 SB203580로 사전 처리한 조건 하에서는 p38MAPK의 인산화가 복원되지 않았다(도 4G 참조). 이러한 결과는 카지놀 P가 MyoD 활성화 및 근원세포 (myoblast) 분화를 유도하여 p38MAPK 신호 전달의 활성화에 필요함을 나타낸다.
(4) 배아 섬유모세포(fibroblast)의 근원세포(myoblast)로의 트랜스-분화에 잠재력을 갖는 카지놀 P
10T1/2 섬유모세포(fibroblast)와 같은 근육세포가 아닌 유형에서 MyoD의 이소성(ectopic) 발현은 후속 근육세포분화 조절인자를 활성화할 수 있고 이러한 세포들의 근육세포유형으로의 전환분화를 유도할 수 있다. 추가적으로 MyoD 활성화에 대한 카지놀 P의 효과를 확인하기 위해, MyoD에 대응하여 10T1/2 섬유모세포(fibroblast)의 근원세포(myoblast)로의 트랜스-전환 효율을 평가하였다. 10T1/2 세포주는 MyoD 및 pBp(대조군)에 대한 발현 벡터로 형질전환하였고 DMSO, 카지놀 P로 처리하여 48 시간 동안 분화를 유도하였고 이어 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
그 결과 도 5A 및 도 5B에 나타낸 바와 같이 근육 특이적 단백질의 발현이 대조군인 pBp로 형질전환한 10T1/2 세포주에서는 전혀 나타나지 않았다. 반면에 MyoD로 형질전환한 10T1/2 세포주에 카지놀 P 처리한 경우 동일하게 형질전환한 10T1/2 세포주에 DMSO 처리한 경우에 비해 MyoD 및 미오게닌(Myogenin)의 발현 수준이 상당히 증가하였다. 또한, MyoD로 형질전환한 10T1/2 세포주의 트랜스-분화에 대해서도 pp38의 수준이 향상되었고 이에 더해서 카지놀 P로 처리한 경우 한층 더 증가하였다(도. 5C 및 5D 참조). 카지놀 P는 pBp로 형질전환된 10T1/2 세포주에서도 pp38의 수준을 증가시켰고 이는 MyoD로 형질전환되었을 때 더욱 향상되었다. 결국 카지놀 P가 p38MAPK 활성화를 통해 MyoD의 활성화를 향상시키고 그렇게 함으로써 근원세포(myoblast)의 분화촉진뿐 아니라 섬유아세포(fibroblast)의 근원세포(myoblast)로의 MyoD 매개 전환분화를 향상시킬 수 있다고 사료된다.
Claims (9)
- 닥나무(Broussonetia kazinoki)에서 유래된 플라반 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하고,
상기 플라반 유도체는 카지놀 P, 카지놀 I, 카지놀 C 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 근육위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 근육위축증은 노화성 근육감소증, 퇴행성 근육감소증, 당뇨병성 근육감소증,지대형근위축증, 베커근위축증 (Becker Muscular Dystrophy, BMD), 뒤세엔트근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD), 근긴장성근위축증(Myotonic Muscular Dystrophy), 에머리-드레이푸스근위축증(Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy, EDMD), 원위 근위축증(Distal Muscular Dystrophy, DD), 안면겹갑상완근우위축증(Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy, FSHD) 또는 선천성근위축증(Congenital Muscular Dystrophy, CMD)을 포함하는 근육위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
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- 청구항 1에 있어서, 상기 플라반 유도체는 닥나무의 추출물에서 얻어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 추출물은 물, C1-C4 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 얻어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 닥나무에서 유래된 플라반 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하고,
상기 플라반 유도체는 카지놀 P, 카지놀 I, 카지놀 C 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 근육위축증 예방 및 개선용 건강기능성 식품.
- 청구항 7에 있어서, 상기 플라반 유도체는 닥나무의 추출물에서 얻어진 것을 특징으로 하는 근육위축증 예방 및 개선용 건강기능성 식품.
- 청구항 8에 있어서, 상기 추출물은 물, C1-C4 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 얻어진 것을 특징으로 하는 근육위축증 예방 및 개선용 건강기능성 식품.
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| KR1020150069471A KR101671713B1 (ko) | 2015-05-19 | 2015-05-19 | 닥나무 유래 플라반 유도체를 유효성분으로 함유하는 근육위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물 |
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| KR (1) | KR101671713B1 (ko) |
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|---|---|---|---|---|
| KR20220014187A (ko) | 2020-07-28 | 2022-02-04 | 한국한의약진흥원 | 위릉채 추출물 또는 쪽 추출물을 함유하는 근위축 개선, 예방 또는 치료용 조성물 |
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| KR101165248B1 (ko) * | 2010-06-04 | 2012-07-18 | 숙명여자대학교산학협력단 | 플라반계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증후군 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 |
-
2015
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