KR101111391B1

KR101111391B1 - 돼지 내인성 레트로바이러스 검출용 프라이머 세트

Info

Publication number: KR101111391B1
Application number: KR1020090081850A
Authority: KR
Inventors: 황응수; 최은영; 윤병우; 김정헌; 정은숙
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-09-01
Filing date: 2009-09-01
Publication date: 2012-02-14
Also published as: KR20110024011A

Abstract

본 발명은 돼지 내인성 레트로바이러스(Porcine Endogenous Retrovirus, PERV) 검출에 관한 것으로, 보다 자세하게는 (1) 서열번호: 13에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 14에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드, 또는 (2) 서열번호: 15에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 서열번호: 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PERV 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 PERV 검출용 조성물 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 PERV를 검출하는 방법에 관한 것이다.

PERV, 프라이머, PCR

Description

돼지 내인성 레트로바이러스 검출용 프라이머 세트{Primer Set for Detection of Porcine Endogenous Retrovirus}

본 발명은 돼지 내인성 레트로바이러스(PERV) 검출에 관한 것으로, 보다 자세하게는 (1) 서열번호: 13에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 14에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드, 또는 (2) 서열번호: 15에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 서열번호: 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PERV 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 PERV 검출용 조성물 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 PERV를 검출하는 방법에 관한 것이다.

현재 장기 이식을 위한 장기의 수요는 공급보다 월등히 많으며, 인간의 수명 연장으로 앞으로도 장기의 요구는 늘어날 전망이다. 그렇기 때문에 지금도 이종 장기 이식에 대한 연구가 활발히 진행 중이며, 미래에는 이종 장기에 대한 요구가 늘어날 전망이다.

이종 장기의 이식에 있어서 가장 큰 문제는 동물에서 기인하는 감염이다. 가장 문제가 되는 것이 이식 이후 동물에 있는 바이러스가 사람에게 전염되는 것이다.

돼지의 장기가 이종 장기 이식의 최대의 공급처로 생각되고 있기 때문에, 돼지에 있는 바이러스가 인간에게 이종 장기 이식을 통해서 감염이 되는 것이 가장 큰 문제가 될 것이다. 다행히 외인성 바이러스는 돼지가 무균의 환경에서 자라면 극복할 수 있지만, 돼지 내인성 레트로바이러스(PERV, Porcine Endogenous Retrovirus)는 돼지의 유전자에 내재되어 있기 때문에 이것을 제거하는 특별한 방법이 없으며, 인간의 유전자에 역전사 되어 삽입될 수 있기 때문에 가장 큰 문제가 될 것이라고 우려하고 있다. 인간의 게놈도 인간 내인성 레트로바이러스(HERV, Human Endogenous Retrovirus)가 있기 때문에 PERV에 의한 간접적인 활성화 또한 상당히 우려되고 있다.

이에, 본 발명자는 PERV를 선택적으로 검출할 수 있는 방안을 연구하던 중 본 발명에 따른 프라이머 세트가 PERV를 높은 특이성과 선택성으로 검출할 수 있고, PCR 산물의 크기를 통해서 결손형 또는 비결손형 PERV인지도 판별할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 한 목적은, (1) 서열번호: 13에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 14에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타 이드, 또는 (2) 서열번호: 15에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 서열번호: 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PERV 검출용 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 프라이머 세트를 포함하는 PERV 검출용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, (a) 동물 세포, 조직 또는 기관으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에 상기 PERV 검출용 프라이머 세트를 접촉시키고 유전자 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (c) 상기 단계(b)에서 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 PERV의 검출 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은, (1) 서열번호: 13에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 14에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 또는 (2) 서열번호: 15에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 서열번호: 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PERV 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 (1) 서열번호: 13에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 14에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 PERV 검출용 프라이머 세트는 PERV(Porcine Endogenous Retrovirus)의 gag 영역을 특이적으로 증폭할 수 있으며, 415 bp의 증폭 산물이 생 성된다.

다른 양태로서, 본 발명에 따른 (2) 서열번호: 15에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 서열번호: 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PERV 검출용 프라이머 세트는 PERV의 gag-pol 영역을 특이적으로 증폭할 수 있으며, gag와 pol의 일부 서열이 결손된 경우(결손형, defective form)에는 320 bp의 증폭 산물이, gag와 pol의 서열이 완전한 경우(비결손형, nondefective form)에는 1357 bp의 증폭 산물이 생성된다. 비결손형 PERV가 감염력을 보유하고 있으므로 결손형 또는 비결손형인지 여부를 구별함으로써 PERV의 감염력도 확인할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 본 분야에서 올리고뉴클레오타이를 합성할 수 있는 것으로 공지된 임의의 방법, 예를 들면 자동 DNA 합성기 (예, 바이오서치, 어플라이드 바이오시스템^TM 등으로 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수도 있다.

본 발명은, 상기된 PERV 검출용 프라이머 세트를 포함하는 PERV 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 PERV 검출용 조성물은 당 분야에서 널리 사용되는 다른 구성 성분 또는 장치를 추가로 포함하여 PERV 검출용 키트로 응용, 제작될 수 있다.

구체적인 예로서, 프라이머 세트 및, 추가적으로 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, 멸균수 등을 포함하여 PCR용 키트로 제작될 수 있다. 또 다른 예로서, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 DNA 칩용 키트로 제작될 수 있다.

본 발명은, (a) 동물 세포, 조직 또는 기관으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에 본 발명의 PERV 검출용 프라이머 세트를 접촉시키고 유전자 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (c) 상기 단계(b)에서 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 PERV의 검출 방법을 제공하는데 있다.

구체적으로, 생물학적 시료를 대상으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시한 후 목적한 PCR 산물의 생성 여부를 확인함으로써 PERV를 검출할 수 있다. 또한, 앞서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따른 서열번호: 15에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 서열번호: 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PERV 검출용 프라이머 세트를 이용한 경우에는, PCR 산물의 크기를 확인함으로써 결손형 또는 비결손형인지 여부를 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 검출방법의 단계 (a)에서는, 동물, 특히 돼지 세포 등으로부터 DNA, 바람직하게는 gDNA를 분리하여 생물학적 시료를 준비한다. gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다.

본 발명에 따른 검출방법의 단계 (b)에서는, 당업계에 공지된 PCR (Polymerase Chain Reaction)방법을 모두 이용할 수 있다. PCR은 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호; 미국특허 제4,683,194호; Saiki et al. Science, 1985, vol.230, pp.1350-1354; Scharf et al. Science, 1986, vol.324, pp.163-166; Kogan et al. New Engl. J. Med., vol.317, pp.986-990 등에 개시되어 있다.

PCR은 통상적으로 (1) DNA의 변성 (denaturation); (2) 프라이머의 결합 (annealing); (3) DNA의 합성 (polymerization or elongation) 단계로 이루어져 있다. 본 발명에서 DAN의 변성은 당업계에 공지된 바와 같이 약 80 내지 96℃에서 가열함으로써 달성될 수 있으며 높은 온도일수록 단일 가닥 DNA 로의 분리(변성)가 용이하지만, 온도가 지나치게 높으면 DNA 중합효소의 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 적합한 온도를 설정하여야 한다. 이렇게 분리된 단일가닥 DNA (즉, 주형)에 대한 프라이머의 결합은 통상적으로 37 내지 65℃에서 진행되지만, 상기 온도는 프라이머의 GC 함량 및 크기 등 여러 가지 요인에 따라 달라질 수 있다. 주형에 프라이머가 결합하게 되면 상기 프라이머의 말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드가 순차적으로 결합하여 DNA 합성이 일어나게 되는데, 통상적으로 60 내지 75℃에서 실행한다. 본 발명에서 DNA의 변성, 어닐링, DNA의 합성 단계를 25 내지 40회, 바람직하게는 30회 수행하는 것이 적합하다.

본 발명에 있어서, PCR은 DNA의 합성에 적합한 조건에서 수행하는 것이 바람직할 것이다. 일반적으로 PCR은 약 pH 7 내지 9, 바람직하게는 약 pH 8의 완충용액에서 수행한다. 본 발명에서는 HEPES 또는 글리신-NaOH를 포함하는 완충용액 및 인산완충용액 등이 이용될 수 있으며, Tris-HCl을 10 내지 100mM의 농도로 함유하는 완충용액을 이용하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에서 상기 완충용액은 1가 의 염(salt)을 약 10mM 내지 60mM의 농도로 함유할 수도 있다. 일반적으로 이용되는 1가의 염에는 KCl, NaCl 및 (NH₄)₂SO₄ 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PCR 반응물의 한 성분으로서 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP는 목적한 특정 유전자의 서열을 목적한 양까지 증폭하기에 충분한 양으로 PCR 반응물에 첨가되어야 한다. dNTPs는 바람직하게는 약 0.75 내지 4.0mM의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 2.0 내지 3.0mM의 농도로 PCR 반응물에 첨가할 수 있다.

상기 PCR 반응물에는 프라이머의 말단으로부터 주형 DNA의 염기서열에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 순차적으로 연결시키는 반응을 촉매하는 DNA 중합효소가 포함되어야 할 것이다. 본 발명에서는 당업계에 공지된 DNA 중합효소가 모두 이용될 수 있으며, 그러한 예에는 E.coli DNA 중합효소, E.coli DNA 중합효소의 Klenow 단편, T4 DNA 중합효소 등이 포함된다. 그러나 통상적으로 PCR은 고온에서 실행되기 때문에 본 발명에서 이용되는 DNA 중합효소는 고온에서 안정한 성질을 보유한 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 PCR에서는 당업계에 공지된 열에 안정한 DNA 중합효소가 모두 이용될 수 있으며, Taq 중합효소, 예를 들면 Amplitaq-gold 효소를 이용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 검출방법의 단계 (c)에서는, (b) 단계의 PCR을 통해서 수득한 PCR 산물을 바람직하게는 전기영동을 이용하여 검출한다. '전기영동'은 전기장 에서 특정 물질을 크기 및 전하에 따라 분리하는 방법을 의미하는 것으로, 통상적으로 특정 물질을 음극에 로딩하고 전기장을 적용시켜서 상기 물질이 양극으로 이동하면서 분리되도록 유도한다. 뉴클레오타이드로 이루어진 물질의 전기영동에는 일반적으로 아가로스, 아가로스-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.

전술한 전기영동에 이용되는 겔의 제조 및 염색방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어서 에티듐 브로마이드(Ethidium Bromide)를 이용한 아가로스 겔의 염색방법은 Boerwinkle et al. PNAS, 1989, vol.86, pp.212-216에 개시되어 있다. 또한, 은을 이용한 폴리아크릴아미드 겔의 염색방법은 (1) Goldman et al. Electrophoresis, 1982, vol.3, pp.24-26; (2) Marshall, Electrophoresis, 1983, vol.4, pp.269-272; (3) Tegelstrom, Electrophoresis, vol.7, pp.226-229 및 (4) Allen et al. Bio Technique, 1989, vol.7, pp.736-744 등에 개시되어 있다.

본 발명에 따른 프라이머 세트는 PERV(Porcine Endogenous Retrovirus)를 높은 특이성과 선택성으로 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시한 후 PCR 산물의 크기를 확인함으로써 결손형 또는 비결손형인지 여부를 검출할 수 있고, 이로써 바이러스의 전파력을 간접적으로 진단할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: DNA 추출

실험한 대상 세포의 DNA는 10 종류의 인간 세포(T47D, Tera-2, Jurkat, Raji, THP-1, 293, HEL299, Astrocyte U373, ECV340, 인간 말초 혈액(Human PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells))와 4 종류의 돼지의 세포(PK-15, 돼지 말초 혈액(Pig PBMC), ST, SEC(Swine Endothelial cell)이었다. DNA는 QIAGEN(40724 Hilden, Germany) QIAamp DNA Mini Kit을 사용하여 각 세포로부터 추출되었다. 추출한 DNA의 농도는 30~50 μmol/㎕로 맞추었다.

실시예 2: PCR

PCR는 Bioneer(대전시 대덕구 문평동 49-3, 대한민국)의 AccuPower^(TM) PCR premix Cat. No. K-2016을 사용하였다. PCR premix의 권장 실험 방법에 따라, Diluted Water(Sigma W4502) 17.5㎕, DNA 시료 1 ㎕(30 μmol/㎕), 그리고 PCR 프라이머 1.5㎕를 사용하여, PCR의 총 용량을 20㎕로 맞췄다. PCR의 온도 조건은 인 용 논문의 온도 조건에 따라 PCR를 실행했으며, PCR는 Bio-Rad(1000 Alfred Nobel Drive Hercules, CA, USA)의 C1000^(TM) Thermal Cycler를 사용하였다. PM7, PM8 프라이머의 경우 온도 조건은 95℃에서 5분 후에, 95℃에서 1분, 56℃에서 1분, 72℃에서 1분을 30회 진행한 다음 72℃에서 10분을 진행하였다. 사용한 PCR 프라이머는 표 1에 정리하였다.

PCR 프라이머

프라이머 명칭	염기서열	서열 번호	PCR region	산물 크기	TA	참고문헌
PM1F	5'-ATGTGGATGAGCGTAAGG-3'	1	PERV pol	473 (Nested)	49	Kim N. Y. et al. (2008)
PM1R	5'-TGCTTCCGTCAGTGAACC-3'	2
PM2F	5'-CCATACTGGTCAAGGACG-3'	3	PERV pol	217	60	Kim N. Y. et al. (2008)
PM2R	5'-TCATCAGTCTCTTCAGGC-3'	4
PM3F	5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGGGACAGACAGTGACTACC-3'	5	PERV gag	-	60	Herring et al. (2002)
PM3R	5'-CCCTCCACCTTCAAAGTTAC-3'	6
PM4F	5'-GAGAGGTCAATAAACGGGTGCAGG-3'	7	PERV pol	424	64	Kuddus et al. (2003)
PM4R	5'-TGCCTTCGTGCCTTCTAAGCAGTC-3'	8
PM5F	5'-GGCCATCAGAGTCTAAACCACG-3'	9	HERV env	636	58	Armbruester et al. (2002)
PM5R	5'-GCAGCCCTATTTCTTCGGACC-3'	10
PM6F	5'-ATGAACCCATCGGAGATGCAA-3'	11	HERV gag	256	56	Armbruester et al. (2002)
PM6R	5'-ACAGAATCTCAAGGCAGAAG-3'	12
PM7F	5'-TGGAGAGAAAAACAAACACTCGGC-3'	13	PERV gag	415	56
PM7R	5'-AGTAGGCTGGTGAGAGAACATAAG-3'	14
PM8F	5'-TTCACCCCTTTTGATCCTACCTCA-3'	15	PERV gag-pol	1357	56
PM8R	5'-CTCTCCATTCGAAGGCAAAAAGTG-3'	16

상기 표 1에 나타낸 참고문헌을 보다 상세하게 기재하면 다음과 같다.

1. 대한민국등록특허 10-0814344

2. Herring, C., et al., Mapping full-length porcine endogenous retroviruses in a large white pig. J Virol, 2001. 75(24): p. 12252-65.

3. Kuddus, R.H., et al., Some morphological, growth, and genomic properties of human cells chronically infected with porcine endogenous retrovirus (PERV). Genome, 2003. 46(5): p. 858-69.

4. Armbruester, V., et al., A novel gene from the human endogenous retrovirus K expressed in transformed cells. Clin Cancer Res, 2002. 8(6): p. 1800-7.

실시예 3: 전기영동

PCR 증폭의 결과를 관찰하기 위해서 전기영동의 과정을 거쳤다. 전기영동을 위한 겔로는 0.9% 아가로스 겔을 만들어 사용하였으며(아가로스 분말은 SeaKem^(？)LE Agarose Cat No. 50004, 용매는 0.5X TAE 완충액), 0.5X TAE 완충액에서 100 V로, 30분간 전기영동을 실행하였다.

실시예 4: 실험결과

도 1(a)는 현재 연구중인 PERV의 밝혀진 6종류의 서열을 나타낸 것이다. Group 1은 완전한 서열을, Group 2는 env가 없는 서열, Group 3은 gag, pol, env 일부가 결손 (splicing: 삭제)된 형태, Group 4는 gap의 일부가 결손된 것으로 추정하는 경우이고, Group 5는 gag와 pol의 일부가 삭제되어 결손된 것으로 추정되는 경우이고, Group 6은 pol의 일부가 결손된 것으로 추정된다. (b) Sequencing의 결과 유전자 서열이 없어서 결손된 것을 확인하는 방법으로 PCR 프라이머를 만들어서 PCR 산물이 320 bp이면, 참고 서열 AY099324를 기준으로 2246부터 3601까지의 서열이 결손되어 나온 결손형 결과이며, 비결손형의 경우는 2246부터 3601까지의 서열이 존재하기 때문에 참고 서열 AY099324를 기준으로 2102부터 3458까지의 서열이 증폭되어 1357 bp의 PCR 산물이 나오게 된다.

도 2는 PM1F, PM1R, PM2F, PM2R을 사용하여 nested PCR을 실시한 경우의 결과이고, 도 3은 PM2F, PM2R만을 사용한 경우의 PCR 결과이다. 도 4부터 도 9까지는 PM3부터 PM8까지 사용할 때의 PCR 결과를 보여준 것이다.

도 2 내지 도 9에서 아가로스 겔의 둘째 줄은 증류수에 해당하고, 셋째 줄부터 열둘째 줄까지 인간의 세포에 해당한다. 열셋째 줄부터 열여섯째 줄은 돼지의 세포에 해당한다. 양 끝인 첫째와 열일곱째 줄은 표지자(Marker)에 해당한다.

도 2는 PM1F, PM1R을 사용한 다음에 PM2F, PM2R을 사용하여 nested PCR을 실시한 결과로, 정상적인 PCR 산물의 크기는 217 bp이고, PCR region은 PERV pol이다. 양성 결과는 사람세포인 Tera-2, THP-1, 293, Astrocyte U373과 돼지세포인 ECV304, SEC에서 나타났다.

도 3은 PM2F, PM2R만을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 217 bp이고, PCR region은 PERV pol이다. 양성 결과는 Human PBMC, PK-15, Pig PBMC, ST, SEC에서 나타났다.

도 4는 PM3F, PM3R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 1.6 kb로 추정되며, PCR region은 PERV gag이다. 양성 결과는 PK-15, Pig PBMC, ST, SEC에서 나타났다.

도 5는 PM4F, PM4R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 424 bp이고, PCR region은 PERV pol이다. 양성 결과는 돼지 세포로부터 추출한 DNA에서 나타났다.

도 6은 PM5F, PM5R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 636 bp이고, PCR region은 HERV env이다. 양성 결과는 인간의 세포로부터 추출한 DNA에서 나타났다.

도 7은 PM6F, PM6R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 256 bp이고, PCR region은 HERV gag이다. 양성 결과는 없었다.

도 8은 PM7F, PM7R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 415 bp이고, PCR region은 PERV gag이다. 양성 결과는 돼지의 세포로부터 추출한 DNA와 HEL299에서 나타났다.

도 9는 PM8F, PM8R을 사용한 PCR로, PCR region은 PERV gag-pol이다. 비결손형인 경우 PCR 산물의 크기는 1357 bp이고(좌측 도면), 결손형인 경우 320bp의 PCR 산물이 증폭된다(우측 도면). 양성 결과는 돼지세포로부터 추출한 DNA에서 나타났다.

도 2와 도 3의 결과를 비교하면 PM1F, PM1R, PM2F, PM2R로 2번의 PCR 과정을 치르는 nested PCR보다 PM2F, PM2R을 가지고 1번의 PCR를 수행하는 것이 더 민감하고, 특이적인 결과를 가지는 것을 볼 수 있었다. 여기서, 도 7을 제외하고, 대부분 표 1에서 제시한 것과 같은 PCR 산물의 크기를 가지는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고, 도 8에 의하면 PM7F, PM7R을 프라이머로 이용할 경우 HEL299에서 약하게 PCR 산물이 있는 것을 볼 수 있어 특이도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.

실험 결과인 도 2부터 도 9까지의 10 종류의 인간 세포와 4 종류의 돼지 세포로부터 추출한 DNA를 가지고 표 1에 있는 PCR 프라이머를 이용하여 PCR를 실시한 결과의 민감도와 특이도를 표 2에 정리하였다.

PCR 프라이머를 이용한 PERV와 HERV의 검출의 민감도 및 특이도

프라이머 명칭	PCR 영역	민감도	특이도
PM1F, PM1R, PM2F, PM2R	PERV pol	25%	50%
PM2F, PM2R	PERV pol	100%	80%
PM3F, PM3R	PERV gag	100%	100%
PM4F, PM4R	PERV pol	100%	100%
PM5F, PM5R	HERV env	100%	75%
PM6F, PM6R	HERV gag	-	-
PM7F, PM7R	PERV gag	100%	90%
PM8F, PM8R	PERV gag-pol	100%	100%

도 2부터 도 9까지의 결과와 표 2로 PM8F, PM8R과 같은 특이성 및 선택성이 높은 PCR 프라이머로 PERV를 검출할 수 있다는 것 외에도 PCR 산물의 크기를 통해서 산물의 크기가 320 bp일 때는 결손형(defective form)으로, 산물의 크기가 1357 bp일 때는 비결손형(non defective form)으로 PERV를 스크리닝할 수 있는 방법을 개발했다는데 의의가 있다.

그리고 PM1F, PM1R, PM2F, PM2R과 같이 nested PCR를 할 필요가 없어서 비용과 시간을 절감할 수 있으며, PM3F, PM3R과 같이 비대칭적인 PCR 프라이머를 제작할 필요가 없기 때문에 비용도 절감할 수 있다.

추가적으로, 각각의 PCR 프라이머를 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 통해서 검색한 결과 PM3F, PM3R과 PM6F, PM6R을 제외하고 표 1에 나온 것과 같은 PCR 산물이 나오는 것을 확인하였다. PM3F, PM3R의 경우 특허에서 PCR 산물의 크기를 밝히지 않았으며, BLAST로 검사해보아도 유전자 서열이 등록되지 않아서 크기를 명확하게 알 수 없지만 도 4를 통해서 1.6 kb라고 짐작해 보았다. PM5, PM6 프라이머 세트는 PERV와 HERV를 구별하여 검출할 수 있는지 알아보기 위해서 이용하였다. PM6F, PM6R의 경우 BLAST로 검사해보면 1876 bp의 크기를 가졌고 도 8에서 이 정도의 PCR 산물의 크기를 가지는 것을 확인하였으며 이것이 PCR 산물의 크기라고 하면 특이성과 선택성 또한 상당히 높지만, 이 값은 논문에서 제시한 크기인 256 bp와 다른 것을 확인하였다.

본 발명에 따라 설계된 PM8F, PM8R PCR 프라이머가 PERV의 서열만을 증폭할 수 있는 PCR 프라이머로도 작용할 수 있으며, 장기 이식 이후에 완전한 gag과 pol을 가진 PERV의 감염을 알아낼 수 있는 다목적용 PCR 프라이머로도 작용할 수 있다. 특히 gag과 pol의 DNA가 완전해야 감염력이 있기 때문에, PCR 산물의 크기를 통해서 바이러스 전파력을 간접적으로 판단할 수 있다.

도 1(a)는 현재 연구 중인 PERV의 밝혀진 6 종류의 서열이고, (b)는 서열분석의 결과 유전자 서열이 없어서 삭제된 것을 확인하는 방법을 나타낸 것이다.

도 2는 PM1F, PM1R을 사용한 다음에 PM2F, PM2R을 사용한 nested PCR로, 정상적인 PCR 산물의 크기는 217 bp이고, PCR region은 PERV pol이다.

도 3은 PM2F, PM2R만을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 217 bp이고, PCR region은 PERV pol이다.

도 4는 PM3F, PM3R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 1.6 kb로 추정되며, PCR region은 PERV gag이다.

도 5는 PM4F, PM4R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 424 bp이고, PCR region은 PERV pol이다.

도 6은 PM5F, PM5R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 636 bp이고, PCR region은 HERV env이다.

도 7은 PM6F, PM6R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 256 bp이고, PCR region은 HERV gag이다.

도 8은 PM7F, PM7R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 415 bp이고, PCR region은 PERV gag이다.

도 9는 PM8F, PM8R을 사용한 PCR로, PCR 산물의 크기는 비결손형인 경우 1357 bp이고(좌측 도면), 결손형인 경우 320 bp이며(우측 도면), PCR region은 PERV gag-pol이다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Primer Set for Detection of Porcine Endogenous Retrovirus <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atgtggatga gcgtaagg 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgcttccgtc agtgaacc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccatactggt caaggacg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcatcagtct cttcaggc 18 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggatcctaat acgactcact ataggaacag accaccatgg gacagacagt gactacc 57 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccctccacct tcaaagttac 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gagaggtcaa taaacgggtg cagg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tgccttcgtg ccttctaagc agtc 24 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggccatcaga gtctaaacca cg 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gcagccctat ttcttcggac c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atgaacccat cggagatgca a 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 acagaatctc aaggcagaag 20 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tggagagaaa aacaaacact cggc 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 agtaggctgg tgagagaaca taag 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ttcacccctt ttgatcctac ctca 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ctctccattc gaaggcaaaa agtg 24

Claims

(1) 서열번호: 13 에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 14 에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 또는 (2) 서열번호: 15 에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 서열번호: 16 에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스 (Porcine Endogenous Retrovirus, PERV) 검출용 프라이머 세트.
제 1항에 있어서, 서열번호: 15 및 서열번호: 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PERV 검출용 프라이머는 PERV가 결손형 또는 비결손형인지 여부를 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
제 1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스 (Porcine Endogenous Retrovirus, PERV) 검출용 조성물.
(a) 인간을 제외한 동물 세포, 조직 또는 기관으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에 제 1 항에 따른 프라이머 세트를 접촉시키고 유전자 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (c) 상기 단계(b)에서 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스 (Porcine Endogenous Retrovirus, PERV)의 검출 방법.
제 4항에 있어서,

단계 (b)에서 증폭 반응은 95℃에서 5분 후에, 95℃에서 1분, 56℃에서 1분, 72℃에서 1분을 30회 진행한 다음 72℃에서 10분을 진행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서,

단계 (b)에서 서열번호: 15 및 서열번호: 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트를 접촉시키고 유전자 증폭 반응을 실시하였을 때,

단계 (c)에서, 증폭된 산물의 크기를 확인함으로써 PERV가 결손형 또는 비결손형인지 여부를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.