KR100814341B1 - 국내 돼지에 존재하는 내인성 레트로바이러스의 엔밸로프유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 국내 돼지 내인성 레트로바이러스의 신규한 env 뉴클레오타이드, 국내 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커 그리고 국내 돼지 내인성 레트로바이러스의 동정방법에 관한 것이다. 본 발명의 env 유전자는 국내 돼지 내인성 레트로바이러스에 대하여 특이적으로 발현되는 것이며, env 유전자 내의 유전적 마커를 이용하는 경우에는 국내 돼지 내인성 레트로바이러스를 정확하게 동정할 수 있다.

돼지 내인성 레트로 바이러스, PERV, 이종간 장기 이식, 엔벨로프 단백질, env

Description

국내 돼지에 존재하는 내인성 레트로바이러스의 엔밸로프 유전자{Envelope Genes of Porcine Endogenous Retroviruses from Domestic Pigs in Korea}

도 1a 및 1b는 국내 돼지로부터 얻은 돼지 내인성 레트로바이러스 클래스 A (PERV-A) env 단백질의 아미노산 서열의 얼라인먼트이다. 클로닝된 env 단백질의 gp70(envelope surface glycoprotein)과 p15E의 부분 서열을 얼라인먼트 하였다.

도 2는 국내 돼지로부터 얻은 돼지 내인성 레트로바이러스 클래스 B(PERV-B) env 단백질의 아미노산 서열의 얼라인먼트이다. 클로닝된 env 단백질의 gp70(envelope surface glycoprotein)과 p15E의 부분 서열을 얼라인먼트 하였다. PERV-A의 경우, 기준 바이러스주로서 Y12238 및 AY288779를 이용하여 얼라인먼트 하였고(도 1), PERV-B의 경우, 기준 바이러스주로서 Y12239 및 AJ133818을 이용하여 얼라인먼트 하였다(도 2). B 클론은 버크셔-유래이고, D 클론은 듀로크-유래이며, L 클론은 랜드레이스-유래이고, Y 클론은 요크셔-유래이다. 음영 박스 내의 문자는 엔벨로프 표면 당단백질의 당화 위치를 나타낸다. 솔리드 라인 박스의 문자는 gp70과 p15E를 분리하는 절단 위치를 나타낸다. 대쉬는 동일한 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3은 국내 돼지로부터 얻은 PERV env 뉴클레오타이드 서열에 기초한 이웃- 결합 트리(neighbor-joining tree)이다. 트리는 본 발명의 env-서열에 기초하여 Galtier & Gouy 방법(1995)에 따라 Treecon ver 1.3b을 이용하여 작성하였다. 노드의 숫자는 100개의 리샘플링 데이터세트의 부트스트랩(bootstrap) 값을 나타낸다. PERV-A(A312521, AF507940 및 Y12238), PERV-B(AJ288587, AJ288589 및 Y12239), PERV-C(AF038600 및 AF402662) 및 PERV-E(AF356697)은 기준 바이러스주로 이용되었다.

도 4는 국내 돼지의 PERV env 유전자 사이의 뉴클레오타이드 상동성 및 아미노산 서열 상동성(%)을 보여주는 표이다.

도 5a는 본 발명의 PERV-A 또는 PERV-B 특이적 프라이머를 이용하여 실시된 증폭 결과를 보여주는 사진이다.

도 5b는 본 발명의 프라이머를 이용하여 실시된 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석 결과를 보여주는 사진이다.

본 발명은 국내 돼지 내인성 레트로바이러스의 env(엔벨로프) 단백질 및 유전자에 관한 것이다.

장기 이식 기술의 발달에 의하여 이식이 필요한 환자의 증가에 비해 필요한 인간 장기의 절대적 부족현상으로 인하여 돼지의 장기, 조직 또는 세포를 인간에게 이식하는 이종간 장기 이식이 많은 관심 하에 활발히 연구가 진행되고 있다(Dorling 등, 2002; White와 Nicholson, 1999). 최근 조류 인플루엔자, SARS, AIDS 등 동물유래의 바이러스 전염병이 문제화 되면서, 돼지를 이용한 인간으로의 장기 이식 또한 이러한 문제점이 크게 부각 되었다(Magre 등, 2003). 비록 무균돼지의 사육을 통하여 대부분의 외인성 병원균은 제거가 가능하지만, 돼지 유래의 내인성 병원균은 제거가 거의 불가능 하다(Swindle, 1998).

돼지 내인성 레트로바이러스(porcine endogenous retroviruses: PERVs)는 가장 대표적인 돼지의 내인성 바이러스의 하나로서, 1970년에 처음으로 보고 되었다(Breese, 1970). Retroviridae 과 Gammaretrovirus 속으로 분류 되며(Klymiuk 등, 2002), 염기서열 및 아미노산 서열, 형태학적으로 백혈병이나 면역 결핍증을 일으키는 쥐 류케미아 바이러스 및 고양이 류케미아 바이러스와 같이 γ-레트로바이러스에 속하는 것으로 보고 되었다(Tacke 등, 2000). PERVs는 돼지 내에서는 어떠한 병리적 증상을 나타내지 않으며, 돼지 지놈 안에 약 13 종의 PERVs가 존재하는 것으로 보고 되었으며 대부분 프로바이러스는 유전자 결실 또는 돌연변이로 인해 실제 바이러스를 만들 수 없는 형태로 존재하고 있다(Patience 등, 1997).

이들 중 γ1 패밀리 내 서브패밀리 A, B 및 C 세 클래스가 바이러스를 만들고 감염능이 있는 것으로 알려져 있다(Magre 등, 2003). 많은 인간 세포는 PERV-A와 PERV-B에 특이적인 수용체를 가지고 있으며 PERV-C에 특이적인 수용체는 HT1080 세포주를 제외하고 아직까지 보고된 바 없다(Mollnes 등, 1999; Patience 등, 1997). 가장 최근에 발생한 것으로 보이는 PERV-C는 PERV-A와 재조합 반응을 일으키면서 그 감염성이 500배나 증가하는 것으로 밝혀져 주목을 받았다(Harrison 등, 2004).

감염성 PERVs는 in vitro 상에서는 넓은 범위의 감염성을 보이지만 in vivo 상에서는 면역능력을 결핍시킨 쥐 외에 아직까지 알려진 예는 없다(Heneine 등, 1998; Patience 등, 1998). 그러나 실제 장기 이식을 받는 환자는 지속적으로 면역 억제제를 투여하기 때문에 PERV에 대한 위험성이 더욱 부각된다. 또한 사람의 유전자 안에도 PERVs와 유사한 인간 내인성 레트로바이러스(HERVs)가 존재하고 있으며, 이는 분류상 PERV와 비슷한 γ 레트로바이러스에 속한다. 현재까지 밝혀진 HERVs중 실제 감염성이 있는 바이러스는 알려져 있지 않으나, 이종간 장기 이식에 의해 PERVs가 HERVs와 재조합을 일으켜 새로운 형태의 바이러스가 생성될 가능성은 무시될 수 없으며, AIDS를 유발하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같이 인류에 재앙을 가져올 수 있는 위험성을 내포하고 있다(Klymiuk 등, 2002, 2003).

본 발명자들은 국내 돼지 내인성 레트로바이러스의 지놈 연구의 일환으로써, env 유전자에 대한 연구를 하였고 결국 국내 돼지 내인성 레트로바이러스에 특이적인 env 유전자를 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지 내인성 레트로바이러스의 env 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 국내 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 국내 돼지 내인성 레트로바이러스의 동정방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 국내 돼지 PERV-A와 B를 구별하여 동정할 수 있는 프라이머를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제92서열로 구성된 군으로부터 선택되는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 env 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 env 뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 env 뉴클레오타이드는 국내 돼지에 존재하는 돼지 내인성 레트로바이러스에서 발현되는 신규한 서열의 뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서, 용어“국내 돼지(domestic pigs)”는 국내에서 육종, 번식 및 생산되는 돼지를 의미한다. 바람직하게는, 국내에서 사육되는 요크셔(Yorkshire) 품종, 랜드레이스(Landrace) 품종, 듀로크(Duroc) 품종 및 버크셔(Berkshire) 품종의 돼지를 의미 한다.

한편, 국내 돼지 내인성 레트로바이러스를 연구하는 데 있어서, 본 발명에서 env 단백질 및 유전자를 타깃으로 설정한 이유는, env 단백질의 표면 당단백질 부분이 돼지 내인성 레트로바이러스(porcine endogenous retrovirus: PERV)의 서브그룹(클래스) 및 호스트의 범위와 특이성을 결정할 뿐만 아니라 중화항체(neutralizing antibody) 생성에 필수적인 항원의 역할을 하기 때문이다.

본 발명의 env 뉴클레오타이드, 즉 엔벨로프를 코딩하는 뉴클레오타이드는 돼지 내인성 레트로바이러스, 바람직하게는 국내 돼지 내인성 레트로바이러스, 보다 바람직하게는 국내 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ-레트로바이러스, 보다 더 바람직하게는 국내 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ1-레트로바이러스, 가장 바람직하게는 국내 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ1-레트로바이러스의 서브그룹(클래스) A 또는 B에 속하는 레트로바이러스의 엔벨로프 뉴클레오타이드이다.

본 발명의 env 뉴클레오타이드는 상술한 국내 돼지 내인성 레트로바이러스에서 특이적으로 발현되는 뉴클레오타이드이다.

서열목록 제1서열 내지 제92서열에 기재된 본 발명의 env 뉴클레오타이드 중 30%에 해당되는 뉴클레오타이드 서열은 올바른 오픈 리딩 프레임을 갖는다. 이러한 올바른 오픈 리딩 프레임을 갖는 env 뉴클레오타이드가 있는 PERV는 이종간 장기 이식 시 감염의 위험성이 있다. 따라서, 서열목록 제1서열 내지 제92서열에 기재된 본 발명의 env 뉴클레오타이드 중 올바른 오픈 리딩 프레임을 갖는 제3서열, 제7서열, 제9서열, 제11서열, 제12서열, 제17서열, 제23서열, 제25서열, 제27 서열, 제29서열, 제30서열, 제31서열, 제37서열, 제42서열, 제43서열, 제46서열, 제49서열, 제50서열, 제57서열, 제60서열, 제69서열, 제70서열, 제72서열, 제128서열, 제131서열, 제83서열, 제89서열 및 제92서열이 중요한 의미를 갖는다.

본 발명에서 클로닝된 엔벨로프 유전자들은 중화 항체 생산을 통한 PERV 제어에 적용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제9서열, 제11서열, 제17서열, 제25서열, 제29서열, 제31서열, 제42서열, 제46서열, 제57서열, 제60서열, 제69서열, 제70서열, 제72서열, 제83서열, 제89서열 또는 제92서열에서 418번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제9서열, 제11서열, 제17서열, 제25서열, 제29서열, 제31서열, 제42서열, 제46서열, 제57서열, 제60서열, 제69서열, 제70서열, 제72서열, 제83서열, 제89서열 또는 제92서열에서 672번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제9서열, 제29서열, 제31서열, 제42서열, 제57서열, 제72서열, 제83서열 또는 제92서열에서 1133번째 뉴 클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제11서열, 제25서열, 제46서열, 제49서열 또는 제60서열에서 917번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 46번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열, 제83서열 또는 제89서열에서 56번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 140번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또 는 제83서열에서 196번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 209번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 340번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 491번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 589번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또 는 제83서열에서 685번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 700번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제11서열, 제17서열 또는 제60서열에서 745번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 845번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 866번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또 는 제83서열에서 874번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 886번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제29서열, 제31서열 또는 제83서열에서 995번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제12서열, 제30서열 또는 제43서열에서 28번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제23서열, 제27서열 또는 제50서열에서 829번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제12서열, 제30서열 또 는 제43서열에서 902번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.

본 발명자들은, 종래의 PERV의 env 단백질 또는 유전자에는 없고, 국내 돼지 내인성 레트로바이러스에서 특이적으로 존재하는 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열을 발견하였다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 국내 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 특이한 유전적 마커로서 이용될 수 있다.

상술한 유전자 마커들 중, 418번째 뉴클레오타이드는 “g"로서, 코돈 “gta"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 Val을 코딩한다. 종래의 PERV에서 이 코돈은 ”ata"로 되어 있고, “Ile"을 코딩한다. 672번째 뉴클레오타이드는 “g"로서, 코돈 “atg"의 세 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 Met을 코딩한다. 종래의 PERV에서 이 코돈은 “ata"로 되어 있고, ”Ile"을 코딩한다. 1133번째 뉴클레오타이드는 "g"로서, 코돈 "agg"의 세 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 Arg을 코딩한다. 종래의 PERV에서 이 코돈은 "atg"로 되어 있고 “Met"을 코딩한다. 917번째 뉴클레오타이드는 ”a"로서, 코돈 “aac"의 두 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 Asn을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "agc"로 되어 있고 “Ser"을 코딩한다. 46번째 뉴클레오타이드는 ”g"로서, 코돈 “gag"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Glu"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "aag"로 되어 있고 “Lys"을 코딩한다.

56번째 뉴클레오타이드는 ”a"로서, 코돈 “aaa"의 첫 번째 뉴클레오타이드 이며, 이 코돈은 "Lys"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "aga"로 되어 있고 “Arg"을 코딩한다. 140번째 뉴클레오타이드는 ”c"로서, 코돈 “gcg"의 두 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Ala"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "gtg"로 되어 있고 “Val"을 코딩한다. 196번째 뉴클레오타이드는 ”a"로서, 코돈 “agt"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Ser"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "ggt"로 되어 있고 “Gly"을 코딩한다. 209번째 뉴클레오타이드는 ”c"로서, 코돈 “act"의 두 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Thr"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "aat"로 되어 있고 “Asn"을 코딩한다. 340번째 뉴클레오타이드는 ”a"로서, 코돈 “aat"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Asn"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "tat"로 되어 있고 “Tyr"을 코딩한다. 196번째 뉴클레오타이드는 ”a"로서, 코돈 “agt"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Ser"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "ggt"로 되어 있고 “Gly"을 코딩한다.

491번째 뉴클레오타이드는 ”g"로서, 코돈 “agt"의 두 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Ser"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "aat"로 되어 있고 “Asn"을 코딩한다. 589번째 뉴클레오타이드는 ”a"로서, 코돈 “aat"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Asn"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "cat"로 되어 있고 “His"을 코딩한다. 685번째 뉴클레오타이드는 ”a"로서, 코돈 “atg"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Met"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "gtg"로 되어 있고 “Val"을 코딩한다. 700번째 뉴클레오타 이드는 ”a"로서, 코돈 “act"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Thr"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "tct"로 되어 있고 “Ser"을 코딩한다. 745번째 뉴클레오타이드는 ”a"로서, 코돈 “aaa"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Lys"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "gaa"로 되어 있고 “Glu"을 코딩한다. 845번째 뉴클레오타이드는 ”t"로서, 코돈 “gtt"의 두 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Val"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "gat"로 되어 있고 “Asp"을 코딩한다. 866번째 뉴클레오타이드는 ”t"로서, 코돈 “tta"의 두 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Leu"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "tca"로 되어 있고 “Ser"을 코딩한다. 874번째 뉴클레오타이드는 ”c"로서, 코돈 “cct"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Pro"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "act"로 되어 있고 “Thr"을 코딩한다.

886번째 뉴클레오타이드는 ”t"로서, 코돈 “ttc"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Phe"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "atc"로 되어 있고 “Ile"을 코딩한다. 995번째 뉴클레오타이드는 ”t"로서, 코돈 “ttg"의 두 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Leu"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "tcg"로 되어 있고 “Ser"을 코딩한다. 28번째 뉴클레오타이드는 ”g"로서, 코돈 “gtc"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Val"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "ctc"로 되어 있고 “Leu"을 코딩한다. 829번째 뉴클레오타이드는 ”a"로서, 코돈 “agt"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Ser"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "ggt"로 되어 있고 “Gly"을 코딩한다. 902번 째 뉴클레오타이드는 ”c"로서, 코돈 “ccc"의 두 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 "Pro"을 코딩하고, 종래의 PERV에서 이 코돈은 "ctc"로 되어 있고 “Leu"을 코딩한다.

한편, 본 발명은 상술한 국내 돼지 내인성 레트로바이러스의 env 뉴클레오타이드 서열에서 상술한 각각의 위치가 특정의 염기로 되어 있는 변이체에 대한 대립형에 관한 것이지만, 이러한 대립형 뉴클레오타이드가 이중가닥의 gDNA(genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 예를 들어, 상보적인 뉴클레오타이드 서열에서 국내 돼지 내인성 레트로바이러스를 나타내는 418번째 뉴클레오타이드 “g"는 ”c"가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서의 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, gDNA에서 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 돼지로부터 핵산 분자를 분리하는 단계; 및 (b) 상술한 유전적 마커의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스의 동정방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산 분자는 돼지의 다양한 조직으로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 혈액 또는 모발, 보다 바람직하게는 모발로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 방법에서 출발물질, 핵산 분자가, gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 유전적 마커를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.

예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 유전적 마커를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 돼지 조직으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 유전적 마커를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 국내 돼지 내인성 레트로바이러스의 존재 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 유전적 마커를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 동정방법에 따르면, 국내 돼지 내인성 레트로바이러스를 보다 정확하게 동정할 수 있으며, 결국 장기이식에 이용되는 돼지가 내인성 레트로바이러스에 의해 감염되었는지 여부를 점검할 수 있다.

PERV-A와 B는 인간 세포에 감염능을 가지고 있는 돼지 바이러스로서 여러 종류의 PERV 중에서 가장 중요하다. 따라서 이 두 가지 타입의 바이러스를 구별해 내는 방법을 구축하는 것은 매우 중요하다. 본 발명자들은 상술한 국내 돼지 내인성 레트로바이러스 연구에 기초하여, 국내 돼지 PERV-A와 B를 구별해낼 수 있는 방법을 개발하였다.

따라서 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 국내 돼지 PERV-A와 B를 구별하여 동정할 수 있는 프라이머를 제공한다.

본 발명의 국내 돼지 PERV-A와 B에 대한 선별 동정용 프라이머는 서열목록 제93서열 내지 제106서열에 기재되어 있다. 서열목록 제93서열 내지 제104서열에 기재된 것은 PCR 용 프라이머이고, 제105서열과 제106서열은 RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 분석용 프라이머 세트이다. 본 발명의 PCR 용 프라이머에 있어서, 프라이머 세트는 다음 번호의 프라이머이다. 예를 들어, 제93서열은 제94서열과 프라이머 세트를 이룬다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

1. 공시재료 및 지놈 DNA(gDNA)의 추출

본 연구에 사용된 공시재료로는 경기도 K 종돈 농장에서 사육되고 있는 요크셔(Yorkshire)종 5두와 랜드레이스(Landrace)종 5두, 그리고 충남 C 종돈장에서 사육하고 있는 듀로크(Duroc)종 5두 그리고 버크셔(Berkshire)종 5두 총 20두이다.

선정된 공시동물에서 모발을 채취하여 4℃ 아이스박스로 실험실에 운송한 후, QIAmp Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출된 지놈 DNA는 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인한 후, 스펙트로포토미터를 이용하여 농도를 측정하였다. 정제된 지놈 DNA는 -25℃에 보관 후 PCR을 위한 주형으로 사용되었다.

2. PERV 프로바이럴 DNA의 증폭

증폭에 이용한 프라이머 세트는 기존에 보고된 GenBank의 모든 서열의 데이터를 수집하여 모든 클래스의 env 유전자를 클로닝 하고자 하였다. 수집된 데이터를 기준으로 env 유전자의 표면 당단백질의 개시 코돈 앞과 p15E의 상동성이 놓은 지역을 이용하여 축퇴성 프라이머(degenerate primer)를 디자인하였다: 센스 프라이머, 5'-ACCTGGATCCATGCATCCCACGTTAA-3'; 안티센스 프라이머, 5'-(A/G)TCTGAAGTG GTTCTACAGAAC(A/C)G(A/G)A-3'. 이는 약 1.5 kb 정도를 증폭하게 한다. PCR 반응에는 50 ng 지놈 DNA를 사용하였다. PCR 반응에 사용된 반응 혼합물은 10 × 완충액, 1.5 mM MgCl₂, dNTPs 1 mM, 프라이머는 각각 10 pM 및 Taq(Super-Bio) 2 유니트로 구성하였으며, PCR 조건은 GeneAmp PCR system 9700(Perkin-Elmer Cetus)를 이용하여 94℃ 3 분으로 핫 스타트를 1 cycle 수행 한 후, 94℃에서 30초 간 변성반응을 시킨 후, 55℃에서 30초간 어닐링반응, 그리고 72℃에서 1분간 연장 반응을 30 사이클 실시하고, 72℃에서 최종적으로 7분간 반응시켰다. 증폭된 산물은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.

3. 클로닝

증폭된 약 1.5 kb의 PCR 산물은 gel extraction kit(Qiagen)를 이용하여 아가로스 겔로부터 분리/정제하였으며, 정제된 PCR 산물은 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen)에 라이게이션 반응으로 삽입하였고, E. coli Top10F에 형질전환을 수행하여 클로닝하였다.

4. env 염기서열 분석

M13 전방향 및 M13 역방향 시퀀싱 프라이머, 증폭에 사용된 프라이머 세트를 이용하여 클로닝된 PERV env 유전자의 염기서열을 확인하였다(ABI sequencer). 염기서열 결과를 이용하여 약 1.5 kb의 염기서열을 콘티그하였으며, Genbank에 등록되어 있는 PERVs env를 참조 스트레인으로 하고 ClustalX ver. 1.81을 이용하여 얼라인먼트를 실시하였다.

5. 계통발생학적 분석

클론들의 계통분석학적 관계를 비교해 보기 위하여, 염기서열 분석이 완료된 91개 전체 클론의 염기서열을 컴퓨터 프로그램(Treecon ver. 1.3b)을 사용하여 계통분석도를 작성하였다(Van de Peer 와 De Wachter 1994). 계통 분석도는 이웃 연결(neighbor-joining), Galtie와 Gouy 그리고 Maximum parsimony 방법을 이용하여 작성하였다. 계통도의 토폴로지는 100회 리샘플링하여 부트스트랩(boostrap) 값을 구하였다.

6. PERV -A와 B의 선별 동정 방법의 개발

PERV-A와 B는 인간 세포에 감염능을 가지고 있는 돼지 바이러스로서 여러 종류의 PERV 중에서 가장 중요하다. 이 바이러스는 돼지에서 생산되지만 돼지 이외에도 인간을 포함한 여러 원숭이 종류, 햄스터, 개, 쥐, 고양이, 박쥐, 햄스터를 비롯한 여러 포유동물과 심지어 곤충 세포에 까지 감염성을 보여준다. 한편, 이 두 가지 바이러스는 인간세포에 대해서 조금 다른 감염성을 보여 준다. 아래의 표는 다양한 인간 세포에서의 PERV-A와 B의 감염능을 비교한 표로서 인간세포에서 PERV-A가 보다 감염성이 큰 것을 확인할 수 있다.

PERV-A와 B의 다양한 인간 숙주세포에서의 감염능

인간 세포 명	바이러스 역가
	PERV-A	PERV-B
293	12,000	<2
TE671	5,800	<2
HeLa	24,000	<2
HT1080-1	82	890
HT1080-2	16	10
FLYRD18	48	12
HOS	<2	<2
U87	830	<2
MRC-5	150	<2
SupT1	<2	<2
Raji	2	<2
Molt4	2	<2

따라서 이 두 가지 타입의 바이러스를 구별해 내는 방법을 구축하는 것은 매우 중요한 문제이며 두 바이러스를 구별하는 방법을 셋업 하는 것 또한 중요한 의미를 가진다. 본 발명자들은 상술한 국내 재래 돼지의 PERVs 연구에 기초하여, 본 발명에 의해 규명되고 분류된 국내 재래 돼지의 다양한 뉴클레오타이드 서열들을 얼라인먼트하고, 이들로부터 PERV-A와 B에 특이적인 염기서열을 발견 하였다.

PERV-A와 B 각각의 특이 염기서열

	염기서열 위치	염기서열
PERV-A	280-305	GTAATCCCTGGTCTCAATGACCAGGC
	489-581	TCCTACCAGTTATAATCAATTTAATTATGGCCATGGGAGATGGAAAGATTGGCAACAGCGGGTACAAAAAGATGTACGAAATAAGCAAATAAG
	684-720	GTACTATGGAGGCTCTGGGAGAAAGAAAGGATCTGTT
	807-886	AATCCAAGAACAGAGGCCATCTCCTAACCCCTCTGATTACAATACAACCTCTGGATCAGTCCCCACTGAGCCTAACATCA
	1158-1183	TAACCACACTGAAGCCTTTAATCGAA
PERV-B	278-299	TGATTAACCCCGCTGTTAAAAG
	480-539	TTCCGGCCCGGGCAAGTACAAAGTGATGAAACTATATAAAGATAAGAGCTGCTCCCCATC
	630-669	TTTTTATAAATATGGCGGGGGAGCAGGGTCCACTTTAACC
	750-831	GGCCCTGGAGCCACCGCATAACTTGCCGGTGCCCCAATTAACCTCGCTGCGGCCTGACATAACACAGCCGCCTAGCAACGGT
	842-883	TGATTCCTACCAACACGCCTAGAAACTCCCCAGGTGTTCCTG
	1152-1177	CTATAGTACTGTGGTTTATGAGCAGG

I. PCR 을 이용한 방법

위에 명기된 PERV-A와 B 각각의 특이적 염기서열에 기초하여 PCR 프라이머 세트를 다음과 같이 제작하였다.

PERV-A와 B를 구별가능하게 하는 PCR 프라이머 세트

항목		프라이머 명칭	시작 위치	PCR 산물크기	PCR 프라이머 염기서열
PERV-A		PERV-A1-F	281	426 bps	5'-TAATCCCTGGTCTCAATGACCA-3'
		PERV-A1-R	685		5'-TTCTCCCAGAGCCTCCATAGTA-3'
		PERV-A2-F	812	370 bps	5'-AAGAACAGAGGCCATCTCCTAA-3'
		PERV-A2-R	1160		5'-CGATTAAAGGCTTCAGTGTGGT-3'
		PERV-A3-F	697	485 bps	5'-TCTGGGAGAAAGAAAGGATCTG-3'
		PERV-A3-R	1160		5'-CGATTAAAGGCTTCAGTGTGGT-3'
PERV-B		PERV-B1-F	278	547 bps	5'-TGATTAACCCCGCTGTTAAAAG-3'
		PERV-B1-R	824		5'-CTAGGCGGCTGTGTTATGTCAG-3'
		PERV-B2-F	489	395 bps	5'-GGGCAAGTACAAAGTGATGAAA-3'
		PERV-B2-R	862		5'-CAGGAACACCTGGGGAGTTTCT-3'
		PERV-B3-F	648	528 bps	5'-GGGAGCAGGGTCCACTTTAAC-3'
		PERV-B3-R	1152		5'-TGCTCATAAACCACAGTACTATAG-3'

위의 PERV-A에 특이적인 프라이머를 사용하면 PERV-A만 증폭되어지고 PERV-B는 증폭되지 않는다. 마찬가지로 PERV-B에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭하면 PERV-A는 증폭되지 않고 PERV-B만 증폭 가능하여 PERV-A와 B를 구별할 수 있다.

각각의 제작된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 방법은 다음과 같다. PCR 반응에 사용된 반응 혼합물은 10 × 완충액, 1.5 mM MgCl₂, dNTPs 1 mM, 프라이머는 각각 10 pM 및 Taq (Super-Bio) 2 유니트와 50 ng의 지놈 DNA로 구성하였으며, PCR 조건은 GeneAmp PCR system 9700 (Perkin-Elmer Cetus)를 이용하여 94℃ 3 분으로 핫 스타트를 1 사이클 수행 한 후, 94℃에서 30초 간 변성반응을 시킨 후, 55℃에서 30초간 어닐링반응, 그리고 72℃에서 30초간 연장 반응을 30 사이클 실시하고, 72℃에서 최종적으로 7분간 반응시켰다. 증폭된 산물은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.

II. RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 분석

다음 프라이머는 PERV-A와 B를 동시에 증폭할 수 있는 프라이머이다. 이를 이용하여 PCR 반응을 수행 한 후 제한효소 처리를 통하여 PERV-A와 B를 판별 할 수 있다.

RFLP 분석에 사용되는 프라이머

프라이머 명칭	PCR 프라이머 염기서열	비고
PERV-F	5'-ATATTCAAAAGTGGGTAAATG-3'	PCR 산물 크기 PERV-A: 509 bps PERV-B: 557 bps
PERV-R	5'-GTGTTGGTGGGATGGGGGAAC-3'

위의 프라이머를 이용하여 증폭을 수행한 후 BamHI으로 제한효소 처리를 해 주면 PERV-A는 절단이 일어나서 81 bps와 420 bps로 나뉘어 지게 되고 PERV-B는 절단이 일어나지 않아 557 bps를 유지하게 된다. 따라서 증폭 반응을 수행 한 후에 BamHI으로 처리 하여 1.5% 아가로즈 겔에서 정기영동을 수행하면, PERV-A는 420 bps와 81 bps로 PERV-B는 557 bps의 밴드를 확인할 수 있다.

PCR 반응에 사용된 반응 혼합물은 10 × 완충액, 1.5 mM MgCl₂, dNTPs 1 mM, 프라이머는 각각 10 pM 및 Taq (Super-Bio) 2 유니트와 50 ng의 지놈 DNA로 구성하였으며, PCR 조건은 GeneAmp PCR system 9700 (Perkin-Elmer Cetus)를 이용하여 94℃ 3 분으로 핫 스타트를 1 사이클 수행 한 후, 94℃에서 30초 간 변성반응을 시킨 후, 55℃에서 30초간 어닐링반응, 그리고 72℃에서 30초간 연장 반응을 30 사이클 실시하고, 72℃에서 최종적으로 7분간 반응시켰다. 증폭된 산물은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하면 PERV-A는 509 bps의 산물과 PERV-B는 557bp의 산물을 확인 할 수 있다. 이렇게 얻어진 증폭 산물을 gel extraction kit (Qiagen)를 이용하여 아가로스 겔로부터 분리/정제하였으며, 분리 정제 된 증폭 산물을 제한 효소 처리하여 RFLP를 관찰 하였다. RFLP를 관찰하기 위하여 위의 증폭 산물은 10X 완충액, 5 유니트의 BamHI을 이용하여 반응 혼합물을 조성하였으며, 37℃에서 3시간 동안 제한효소 반응을 수행하여 1.5% 아가로즈 겔에서 정기영동을 수행하였다.

실험 결과

1. 국내 돼지의 모근으로부터 지놈 DNA 추출

돼지로부터 지놈 DNA를 분리하는 일반적인 방법은 전혈로부터 백혈구를 분리한 후 gDNA를 추출하는 방법을 이용하고 있다. 그러나 도살장이 아닌 일반 농장에서 여러 종의 돼지로부터 혈액을 채혈하는 경우 안전사고 및 기술적인 문제가 동반되기 때문에 모근을 채취하여 모근으로부터 gDNA를 추출하였다. 평균 12개의 모발에 붙어있는 모근으로부터 분리된 gDNA는 약 0.5 ㎍으로 PCR을 수행하는데 충분한 양으로 존재하였다. 이러한 방법은 이미 돼지의 PERV pol 유전자를 이용한 분포 측정에 사용된바 있으며 돼지뿐만 아니라 여러 가축으로부터 유전자 증폭용 검체를 회수하여 유전자 검사를 요하는 시험에 적절히 이용되어질 수 있으리라 판단된다.

PERV env 유전자 클로닝 및 분포 조사

돼지로부터 분리한 지놈 상에 존재하는 PERV env 유전자를 클로닝하기 위해, 클래스 A, B 및 C에 공통적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 반응을 통하여 PERV env 유전자의 개시 코돈을 포함하여 p15E의 일부를 포함하는 약 1.5 kb의 산물을 얻을 수 있었다.

얻어진 산물을 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터에 클로닝하여 버크셔 17개, 듀로크 22개, 랜드레이스 21개 및 요크셔 31개로 총 91개의 클론을 확보하였다. 확보된 클론은 M13 전방향 및 M13 역방향 시퀀싱 프라이머와 클로닝에 사용한 프라이머를 이용하여 4회 이상 염기서열 분석을 수행하여 산물의 염기서열을 결정하였다.

GenBank에 등록된 바이러스 주를 기준으로 염기 서열을 얼라인먼트한 결과 계통 분석학적 계통도를 그리기 전에 크게 클래스 A 및 클래스 B로 나누어짐을 알 수 있었다. 버크셔로부터 분리된 클론 17개 중 11개는 클래스 A에 6개는 클래스 B에 속하였으며, 듀로크로부터 분리된 클론 22개 중 10개는 클래스 A 그리고 11개는 클래스 B로, 랜드레이스로부터의 클론 21개 중 13개가 클래스 A에 8개가 클래스 B, 요크셔의 31개 클론 중 18개가 클래스 A, 13개가 클래스 B로 분류 되었다. 클래스 간의 분포를 보면 클래스 A가 57%, 클래스 B가 43%로 두 클래스 사이의 분포는 큰 차이를 보이지 않았으며, 개체내의 분포도 버크셔 클래스 A와 클래스 B는 각각 64%와 36%, 듀로크 45%와 55%, 랜드레이스 61%와 39%, 요크셔 58%와 42%의 분포를 보였다(표 5).

한국내 돼지에서 얻은 PERV env 클론

항목	돼지 종류
	버크셔		듀로크		랜드레이스		요크셔
클래스	PERV-A	PERV-B	PERV-A	PERV-B	PERV-A	PERV-B	PERV-A	PERV-B
클론 수	11(4)	6(2)	10(3)	11(4)	13(7)	8(2)	18(6)	13(2)

상기 표 1에서 괄호 내의 숫자는 올바른 오픈 리딩 프레임을 갖는 클론의 수를 나타낸다.

PERVs는 종에 따라 10에서 50개 프로바이러스 유전자가 돼지 지놈에 존재하며, env 유전자의 염기서열 특히 당단백질의 변이부위 A(variable region A: VRA)의 차이에 의해 최소한 3 종류의 클래스(A, B 및 C)의 PERVs가 감염성 바이러스로 존재하는 것으로 알려져 있다(Akiyoshi 등, 1998). 지놈 상에 존재하는 PERV 프로바이러스는 대부분이 결실, 삽입 혹은 점 돌연변이 등에 의하여 대부분 올바른 바이러스 입자를 생성하지 못하지만, 클론 중 버크셔에서 클래스 A 4개와 클래스 B 2개, 듀로크에서 클래스 A와 B 각각 3개와 4개, 랜드레이스 5개와 2개, 요크셔 6개와 2는 올바른 ORF을 갖는 바이러스가 생산 될 수 있는 클론임을 확인하였다. 이는 전체 조사된 클론 중에 30%라는 상당히 높은 수치로서 이종간 장기 이식 시 바이러스가 생성될 수 있어 절대 간과해서는 안 될 중요한 인수 공통 감염 요인임을 알 수 있었다.

프라이머의 제작에 있어 클래스 A, B 및 C 모두에 대한 공통 프라이머를 이용하여 프로바이러스 DNA를 증폭하였지만 클래스 C는 나오지 않았다. 클래스 C는 non-humantropic으로 조직과 세포의 종류에 따라 발현량이 다르며, 그 발현량 역시 현저히 낮은 것으로 보고 되어 있다(Stefan 등, 2003; Steffi 등, 2000). 하지만, 최근 연구에 의해서 클래스 A와 C의 재조합체가 인간세포 감염성에 큰 영향을 미친다는 보고와 함께 중요한 클래스로 부각되고 있다(Wood 등, 2004). 본 실험의 공시재료로 사용된 돼지의 증폭산물에서 클래스 C가 발견되지 않은 이유는 프라이머의 부적절성이라기 보다는 클론들의 N 값이 작아서 클래스 C가 나오지 않은 것이라 생각되며 더 많은 클론의 분석이 요구된다.

PERV env 유전자 염기 서열 분석 및 아미노산 서열 분석

분석된 염기 서열을 토대로 아미노산 서열과 염기 서열을 분석한 결과, 대부분의 클론들이 결실, 삽입 및 점 돌연변이 등에 의해 올바른 바이러스를 생성하지 못하는 비기능성 클론들이었으나, 클론 중 클래스 A로 분류된 18개 클론과 클래스 B로 분류된 10개, 총 28개의 클론은 올바른 오픈 리딩 프레임(ORF)을 가지고 있었다.

도 4의 표는 ORF가 맞는 클론과 대표적인 기준 주간 intra/inter-클래스 간 유전자와 아미노산 서열간 상동성 비교를 한 것이다. 표에서 위쪽 및 아래쪽 삼각형은 각각 뉴클레오타이드 서열 상동성 및 아미노산 서열 상동성을 나타낸다. Y12238은 PERV-A에 대한 기준 바이러스주로 이용하였고, Y12239는 PERV-B에 대한 기준 바이러스주로 이용하였다. 상동성 계산은 1539개의 뉴클레오타이드 서열 및 513개의 아미노산 서열에 기초하여 계산하였다.

돼지 개체 간 차이를 제외한 클래스 내의 염기 서열 상동성은 95.9%에서 99.9%로 높은 상동성을 확인할 수 있었으며, 클래스 A와 B에서는 64.3%에서 66.6%로 많은 차이를 지님을 알 수 있었고, 아미노산 서열간의 상동성도 염기 서열 상동성과 비슷한 차이를 확인할 수 있었다.

PERV env 유전자는 발현되면 세포막으로 이동되어 바이러스의 코어 부분을 세포막과 함께 둘러쌈으로서 바이러스를 생성하게 된다. 이 엘벨로프 단백질은 막투과 도메인 내에 절단 위치(Arg/Lys-X-Lys-Arg)가 존재하여, 숙주 세포의 수용체에 결합하게 되는 표면 당단백질로 HIV-1의 경우 gp120에 해당하는 gp70부분과 인지질 이중막 사이에 묻혀 있게 되는 막투과 도메인(p15E)으로 나뉘게 된다. gp70은 8개의 잠재적 당화 위치를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며 감염성에 큰 영향을 주는 것으로 보고 되어 있다(Kenji 등, 2003; Oldmixon 등, 2002). http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html 웹 사이트의 단백질 구조 예측 서비스를 통하여 PERV의 엘벨로프 단백질은 당단백질로 클래스 A에서 모두 8개의 잠재적인 당화 위치(Asn-X-Thr/Ser)를 발견할 수 있었으며, 클래스 B 에서는 5개의 당화 위치를 확인할 수 있었다(참조: 도 1 및 도 2).

gp70과 p15E로 분리하는 절단 위치는 Arg/Lys-X-Lys-Arg으로(Cianciolo 등, 1984), 459에서 462까지의 아미노산 서열에 위치하고 있었으며, 아미노산 서열 465에서 490까지의 부분이 막투과 도메인으로 나선 구조를 가지고 소수성 아미노산인 Leu, Ala 및 Val이 많이 분포하며, 클래스 A와 B 모두 잘 보전 되어 있음을 알 수 있었다.

특이할 만 한 사항으로는 분석한 클론들 중 랜드레이스로부터 얻은 L9 클론은 절단 위치의 아미노산 잔기가 Arg/Lys-X-Lys-Arg에서 Arg/Lys 잔기 대신에 트립토판으로 대체 되어 있음을 알 수 있었다. 이 클론은 올바른 절단이 일어나지 못하여 올바른 엔밸로프의 기능을 수행하지 못하리라 추측된다. 당화 위치 Asn-X-Thr/Ser에서, L9 클론의 318번째 잔기는 Thr/Ser 대신 Lys으로 바뀌어 있으며, Duroc으로부터 얻은 D8 클론 역시 388 번째 아미노산 잔기가 Asn 잔기 대신에 Ser으로 바뀌어져 있어서 N-당화가 되지 않을 것으로 예측된다. N-당화가 만약 올바로 이루어지지 않으면 감염능 등의 이상 등 변화가 예상된다.

PERV env 유전자 염기서열을 이용한 계통 분석

염기 서열 분석된 총 91개 클론의 염기서열과 GenBank에 등록된 PERV-A(AY312521, AF507940, Y12238), PERV-B(AJ288587, AJ288589, Y12239), PERV-C(AF038600, AF402662) 그리고 outgroup으로 PERV-E(AF356698)를 기준 바이러스주로 사용하여 Neighbor-Joining 방법을 이용하여 계통 분석학적 관계를 알아보았다. PERV-E는 유전학적으로 사람에 존재하는 인간 내인성 레트로바이러스와 유사하며 양적으로 PERV-A, B 및 C와 비슷하게 존재하나 유전적 거리가 멀어 이를 outgroup으로 선정 하였다. 도 3은 전체 91개 바이러스 주를 포함한 Tree를 만든 후 유사한 것을 제외하여 나타낸 것이다. 클래스 B는 100%의 bootstrap 값으로 클레이드(clade)를 이루는 반면 클래스 A와 C는 95%의 값으로 같은 클레이드를 이루며, 클래스 C만이 100%로 나뉘어 졌다. 클래스 C는 지금까지 2 바이러스주(AF038600, Af402662)만이 GenBank에 등록되어 있기에 제한적으로 분석될 수밖에 없었다.

클래스 A와 B의 염기서열이 약 35% 이상 다르기 때문에(참조: 도 4), 실제 계통분석 전에 이 두 서브그룹 간 바이러스 주 구분을 할 수 있었으며, 계통분석을 통한 서브그룹 분석은 표 1의 결과와 동일하게 나왔으며 C 형은 나오지 않았다.

PERV -A와 B의 선별 동정

상술한 프라이머를 이용하여 PCR을 실시한 결과, PERV-A 또는 PERV-B에 특이적인 기대되는 크기의 증폭 산물이 형성되었다. 따라서, 본 발명자들에 의해 개발된 프라이머들은 PERV-A 또는 B에 특이적인 것으로서, 이를 이용하면 PERV-A 및 PERV-B를 특이적으로 동정할 수 있음을 알 수 있다(참조: 도 5a).

RFLP 분석을 실시한 결과, BamHI으로 증폭산물을 제한효소 처리를 해 주면 PERV-A는 절단이 일어나서 81 bps와 420 bps로 나뉘어 지게 되고, PERV-B는 절단이 일어나지 않아 557 bps를 유지하게 된다. 따라서 증폭 반응을 수행 한 후에 BamHI으로 처리 하여 1.5% 아가로즈 젤에서 전기영동을 수행하면, PERV-A는 420 bps와 81 bps로 PERV-B는 557 bps의 밴드를 확인할 수 있었다(참조: 도 5b).

상술한 바와 같이, 본 발명의 env 단백질 및 유전자는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스에 대하여 특이적으로 발현되는 것이며, env 유전자 내의 유전적 마커를 이용하는 경우에는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 정확하게 동정할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조 문헌

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서열목록 전자파일 첨부

Claims (25)

1. 서열목록 제1서열 내지 제28서열 및 제30서열 내지 제92서열로 구성된 군으로부터 선택되는, 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 env 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 env 뉴클레오타이드.
2. 서열목록 제9서열, 제11서열, 제17서열, 제25서열, 제31서열, 제42서열, 제46서열, 제57서열, 제60서열, 제69서열, 제70서열, 제72서열, 제83서열, 제89서열 또는 제92서열에서 418번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
3. 서열목록 제9서열, 제11서열, 제17서열, 제25서열, 제31서열, 제42서열, 제46서열, 제57서열, 제60서열, 제69서열, 제70서열, 제72서열, 제83서열, 제89서열 또는 제92서열에서 672번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
4. 서열목록 제9서열, 제31서열, 제42서열, 제57서열, 제72서열, 제83서열 또는 제92서열에서 1133번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
5. 서열목록 제11서열, 제25서열, 제46서열 또는 제49서열에서 917번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
6. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 46번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
7. 서열목록 제31서열, 제83서열 또는 제89서열에서 56번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
8. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 140번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
9. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 196번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
10. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 209번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
11. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 340번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
12. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 491번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
13. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 589번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
14. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 685번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
15. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 700번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
16. 서열목록 제17서열 또는 제60서열에서 745번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
17. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 845번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
18. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 866번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
19. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 874번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
20. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 886번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
21. 서열목록 제31서열 또는 제83서열에서 995번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
22. 서열목록 제30서열 또는 제43서열에서 28번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
23. 서열목록 제27서열 또는 제50서열에서 829번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
24. 서열목록 제12서열 또는 제30서열에서 902번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
25. (a) 돼지로부터 핵산 분자를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 제 2 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항의 유전적 마커의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는 돼지 내인성 레트로바이러스의 동정방법.

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