KR100657012B1 - 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 엔벨로프 단백질 및유전자 - Google Patents

무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 엔벨로프 단백질 및유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 신규한 Env 단백질 및 env 핵산 분자, 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커 그리고 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 동정방법에 관한 것이다. 본 발명의 Env 단백질 및 유전자는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스에 대하여 특이적으로 발현되는 것이며, env 유전자 내의 유전적 마커를 이용하는 경우에는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 정확하게 동정할 수 있다.
돼지 내인성 레트로 바이러스, PERV, 이종간 장기 이식, 엔벨로프 단백질, 무균 돼지, env

Description

무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 엔벨로프 단백질 및 유전자{Envelope Proteins and Genes of Porcine Endogenous Retroviruses of Miniature Pigs}
도 1은 무균 돼지로부터 얻은 돼지 내인성 레트로바이러스 서브그룹 A (PERV-A) Env 단백질의 아미노산 서열의 얼라인먼트이다. Env 단백질의 gp70 (envelope surface glycoprotein)과 p15E의 부분 서열을 기준 바이러스주인 Y12238 (PERV-A에 속함)의 서열과 비교하였다. M 클론들은 무균 돼지 M169로부터 유래된 것이고, T 클론들은 무균 돼지 T1111로부터 유래된 것이다. 쇄도우는 gp70의 글리코실화 위치를 나타내며, 사각형은 gp70과 p15E를 분리시키는 절단 위치를 나타낸다. 대쉬는 동일한 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 무균 돼지로부터 얻은 PERV-A 및 PERV-B Env 단백질의 아미노산 서열의 얼라인먼트이다. 본 발명의 PERV-A 및 PERV-B Env 단백질의 아미노산 서열을 PERV-A의 기준 바이러스주인 Y12238 및 PERV-B의 기준 바이러스주인 Y12239의 서열과 비교하였다. 대쉬는 동일한 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 무균 돼지로부터 얻은 PERV env 뉴클레오타이드 서열에 기초한 이웃-결합 트리 (neighbor-joining tree)이다. 트리는 본 발명의 env-서열에 기초하여 Galtier & Gouy 방법 (1995)에 따라 Treecon ver 1.3b을 이용하여 작성하였다. 노드의 숫자는 100개의 리샘플링 데이터세트의 부트스트랩 (bootstrap) 값을 나타낸다. PERV-A (AY288779, AF435966, Y12238 및 AF435967), PERV-B (AY099324 및 Y12239), PERV-C (AF038600 및 AF0308599) 및 PERV-E (AF356697)은 기준 바이러스주로 이용되었다. M 클론들은 무균 돼지 M169로부터 유래된 것이고, T 클론들은 무균 돼지 T1111로부터 유래된 것이다.
도 4는 PCR 증폭 반응을 통하여 증폭된 PERV env 유전자를 보여주는 젤 사진이다. M은 1 kb 래더이고, 레인 1 및 2는 PERV env 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 레인 3 및 4는 EcoRI으로 절단한 PERV env 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 그리고 레인 5 및 6은 PERV env 유전자의 PCR 증폭 산물에 해당한다.
본 발명은 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 Env (엔벨로프) 단백질 및 유전자에 관한 것이다.
인간 장기의 절대적 부족현상으로 인하여 돼지의 장기, 조직 또는 세포를 인간에게 이식하는 이종간 장기 이식이 많은 관심 하에 활발히 연구가 진행되고 있다(5, 22). 돼지를 이용한 인간으로의 장기 이식은 현재 과학 수준으로 생리학적인 부적합성, 면역학적 거부반응 그리고 다른 종의 여러 가지 질병의 감염 (zoonosis) 등의 문제를 극복해야 한다(9). 특히 돼지 내인성 레트로바이러스 (porcine endogenous retrovirueses: PERVs)가 in vitro 상에서 인간의 세포에 감염될 수 있다는 사실이 보고되면서 이종간 장기 이식에 가장 큰 문제점으로 인식되고 있다(12, 20, 21). 현재까지는 PERVs의 감염에 의한 어떠한 질병도 보고되어 있지 않지만, 이종간 장기 이식용 무균 돼지의 생산에서 대부분의 외인성 병원균 미생물(exogenous microorganism)은 무균 사육 환경을 통해 제어되는 반면 바이러스 유전자가 지놈에 들어 있는 내인성 레트로 바이러스는 생식선 (germline)을 통해 바이러스가 전염되기 때문에 무균 사육 조건으로 해결될 수 없다(16).
PERVs는 1970년에 처음으로 보고되어(3), Retroviridae 과 Gammaretrovirus 속으로 분류되어 있다(8). 염기서열 및 아미노산 서열, 형태학적으로 백혈병이나 면역 결핍증을 일으키는 쥐 류케미아 바이러스 (murine leukemia virus)와 고양이 류케미아 바이러스 (feline leukemia virus)와 같이 γ-레트로바이러스에 속하는 것으로 보고 되었다(17).
PERVs는 생식선 전이 (germline transmission)을 하며, 돼지 내에서는 어떠한 증상도 보이지 않는다. 돼지 지놈 안에 존재하는 PERVs는 약 13 종류가 보고되었으며 대부분은 유전자 결실 또는 돌연변이로 인해 실제 바이러스를 만들 수 없는 형태로 존재하고 있다(12). 이들 중 γ1 패밀리 내 서브패밀리 A, B 및 C 3 그룹이 바이러스를 만들고 감염능이 있는 것으로 알려져 있다(9). 많은 인간 세포는 PERV-A와 PERV-B에 특이적인 수용체를 가지고 있으며 PERV-C에 특이적인 수용체는 HT1080 세포주를 제외하고 아직까지 보고 된 바 없다(11, 13).
감염성 PERVs는 in vitro 상에서는 넓은 범위의 감염성을 보이지만, in vivo 상에서는 면역능력을 결핍시킨 쥐 외에 아직까지 알려진 예는 없다(6,13). 하지만 실제 장기 이식을 받는 환자는 지속적으로 면역 억제제를 투여하기 때문에 PERV에 대한 위험성을 더욱 부각시킨 결과라 할 수 있겠다. 또한 PERV와 유사한 인간 내인성 레트로바이러스 (human endogenous retroviruses: HERVs)의 존재는 재조합에 의한 새로운 형태의 바이러스 출현 등의 여러 가지 문제점을 내포하고 있다고 할 수 있겠다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 지놈 연구의 일환으로써, env 유전자에 대한 연구를 하였고 결국 무균 돼지 내인성 레트로바이러스에 특이적인 env 유전자 및 단백질을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 Env 단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 env 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 동정방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열, 제4서열, 제6서열, 제8서열, 제10서열, 제12서열, 제14서열, 제16서열 및 제18서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 Env 단백질을 제공한다.
본 발명의 Env 단백질은 무균 돼지 내인성 레트로바이러스에서 특이적으로 발현되는 단백질이다. 본 명세서에서, 용어 "무균 (miniature) 돼지"는 이종간 장기이식 (xenotransplantation)을 목적으로 생산된 돼지로서, SPF (specific pathogen free) 상태에서 육종, 번식, 생산 및 관리되는 돼지를 의미한다. 본 발명의 목적이 이종간 장기이식에 이용되는 무균 돼지에 내재하는 레트로바이러스를 연구하는 데 있고, 본 발명을 완성하기 위하여 실험 출발물질로서 무균 돼지의 말 초 혈액 단핵구 세포 (Peripheral Blood Mononuclear Cells: PBMCs)를 이용하였기 때문에, 본 발명의 Env 단백질 및 유전자를 특정하는 데, 용어 "돼지" 대신에 용어 "무균 돼지"를 사용한다. 따라서, 무균 돼지 이외에 다른 일반적인 돼지의 내인성 레트로바이러스로부터 유래되고 본 발명의 Env 단백질 또는 유전자와 동일한 서열을 가지는 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
한편, 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 연구하는 데 있어서, 본 발명에서 Env 단백질 및 유전자를 타깃으로 설정한 이유는, Env 단백질의 표면 당단백질 부분이 돼지 내인성 레트로바이러스 (porcine endogenous retrovirus: PERV)의 서브그룹 및 호스트의 범위와 특이성을 결정할 뿐만 아니라 중화항체 (neutralizing antibody) 생성에 필수적인 항원의 역할을 하기 때문이다.
본 발명의 Env 단백질, 즉 엔벨로프 단백질은 돼지 내인성 레트로바이러스, 바람직하게는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스, 보다 바람직하게는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ-레트로바이러스, 보다 더 바람직하게는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ1-레트로바이러스, 가장 바람직하게는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ1-레트로바이러스의 서브그룹 A 또는 B에 속하는 레트로바이러스의 엔벨로프 단백질이다. 보다 상세하게는, 서열목록 제2서열, 제4서열, 제6서열, 제8서열, 제10서열, 제12서열, 제14서열 및 제16서열의 Env 단백질은 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ1-레트로바이러스의 서브그룹 A (PERV-A)로부터 유래된 것이고, 서열목록 제18서열의 Env 단백질은 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ1-레트로바이러스의 서브그룹 B (PERV-B)로부터 유래된 것이다.
본 발명의 Env 단백질은 상술한 레트로바이러스에서 특이적으로 발현되는 단백질이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 Env 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제2서열의 단백질에 대해서는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열, 서열목록 제4서열의 단백질에 대해서는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열, 서열목록 제6서열의 단백질에 대해서는 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열, 서열목록 제8서열의 단백질에 대해서는 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드 서열, 서열목록 제10서열의 단백질에 대해서는 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열, 서열목록 제12서열의 단백질에 대해서는 서열목록 제11서열의 뉴클레오타이드 서열, 서열목록 제14서열의 단백질에 대해서는 서열목록 제13서열의 뉴클레오타이드 서열, 서열목록 제16서열의 단백질에 대해서는 서열목록 제15서열의 뉴클레오타이드 서열, 서열목록 제18서열의 단백질에 대해서는 서열목록 제17서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자, 상세하게는 env 유전자는 돼지 내인성 레트로바이러스, 바람직하게는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스, 보다 바람직하게는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ-레트로바이러스, 보다 더 바람직하게는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ1-레트로바이러스, 가장 바람직하게는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스로서 γ1-레트로바이러스의 서브그룹 A 또는 B에 속하는 레트로바이러스에 특이적으로 존재하고 발현되는 유전자이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열, 제3서열, 제5서열, 제7서열, 제9서열, 제11서열, 제13서열 또는 제15서열에서 418번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열, 제3서열, 제5서열, 제7서열, 제9서열, 제11서열, 제13서열 또는 제15서열에서 672번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열, 제5서열, 제7서열 또는 제13서열에서 229번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼 지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열, 제5서열, 제7서열 또는 제13서열에서 766번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열, 제5서열, 제7서열 또는 제13서열에서 953번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열, 제5서열, 제7서열 또는 제13서열에서 1133번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커를 제공한다.
본 발명자들은, 종래의 PERV의 Env 단백질 또는 유전자에는 없고, 무균 돼지 내인성 레트로바이러스에서 특이적으로 존재하는 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열을 발견하였다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 특이한 유전적 마커로서 이용될 수 있다.
상술한 유전자 마커들 중, 418번째 뉴클레오타이드는 "g"로서, 코돈 "gta"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 Val을 코딩한다. 종래의 PERV에서 이 코 돈은 "ata"로 되어 있고, "Ile"을 코딩한다. 또한, 672번째 뉴클레오타이드는 "g"로서, 코돈 "atg"의 세 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 Met을 코딩한다. 종래의 PERV에서 이 코돈은 "ata"로 되어 있고, "Ile"을 코딩한다. 229번째 뉴클레오타이드는 "a"로서, 코돈 "aag"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 Lys을 코딩한다. 종래의 PERV에서 이 코돈은 "gag"로 되어 있고, 이 코돈은 "Glu"을 코딩한다. 766번째 뉴클레오타이드는 "a"로서, 코돈 "att"의 첫 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 Ile을 코딩한다. 종래의 PERV에서 이 코돈은 "gtt"로 되어 있고, 이 코돈은 "Val"을 코딩한다. 953번째 뉴클레오타이드는 "a"로서, 코돈 "aag"의 두 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 Lys을 코딩한다. 종래의 PERV에서 이 코돈은 "acg"로 되어 있고, 이 코돈은 "Thr"을 코딩한다. 한편, 1133번째 뉴클레오타이드는 "g"로서, 코돈 "agg"의 두 번째 뉴클레오타이드이며, 이 코돈은 Arg을 코딩한다. 종래의 PERV에서 이 코돈은 "atg"로 되어 있고, 이 코돈은 "Met"을 코딩한다.
한편, 본 발명은 상술한 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 env 뉴클레오타이드 서열에서 상술한 각각의 위치가 특정의 염기로 되어 있는 변이체에 대한 대립형에 관한 것이지만, 이러한 대립형 뉴클레오타이드가 이중가닥의 gDNA (genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 예를 들어, 상보적인 뉴클레오타이드 서열에서 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 나타내는 418번째 뉴클레오타이드 "g"는 "c"가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서의 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, gDNA에서 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 무균 돼지로부터 핵산 분자를 분리하는 단계; 및 (b) 상술한 유전적 마커의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 동정방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산 분자는 돼지의 다양한 조직으로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 보다 바람직하게는 말초 혈액 단핵구 세포 (Peripheral Blood Mononuclear Cells: PBMCs)로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에서 출발물질, 핵산 분자가, gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Rogers & Bendich (1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 총 RNA를 분리하여 실시된다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA의 mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다 (참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.
다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 유전적 마커를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.
예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 유전적 마커를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 돼지 조직으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.
혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 유전적 마커를 포함하는 서 열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 존재 여부를 결정한다.
본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 유전적 마커를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
본 발명의 동정방법에 따르면, 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 보다 정 확하게 동정할 수 있으며, 결국 장기이식에 이용되는 무균 돼지가 내인성 레트로바이러스에 의해 감염되었는 지 여부를 점검할 수 있다.
PERV-A와 B는 인간 세포에 감염능을 가지고 있는 돼지 바이러스로서 여러 종류의 PERV 중에서 가장 중요하다. 따라서 이 두 가지 타입의 바이러스를 구별해 내는 방법을 구축하는 것은 매우 중요하다. 본 발명자들은 상술한 무균돼지의 PERVs 연구에 기초하여, PERV-A와 B를 구별해낼 수 있는 방법을 개발하였다.
따라서 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 PERV-A와 B를 구별하여 동정할 수 있는 프라이머를 제공한다.
본 발명의 PERV-A와 B에 대한 선별 동정용 프라이머는 서열목록 제19서열 내지 제32서열에 기재되어 있다. 서열목록 제19서열 내지 제30서열에 기재된 것은 PCR 용 프라이머이고, 제31서열과 제32서열은 RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 분석용 프라이머 세트이다. 본 발명의 PCR 용 프라이머에 있어서, 프라이머 세트는 다음 번호의 프라이머이다. 예를 들어, 제19서열은 제20서열과 프라이머 세트를 이룬다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
1. 공시재료 및 지놈 DNA의 추출
본 연구에 사용된 공시재료로는 경기도 평택 소재 PWG Genetics Korea 회사로부터 제공받은 두 종류의 무균돼지 (M149 및 T1111)를 사용하였다. M149는 중간 체형 미니 돼지로 체중 470 g으로 태어나 성체인 지금 18 kg이며, T1111은 작은 체형으로 태어날 때 210 g으로 성체인 현재 11 kg인 미니 돼지이다.
선정된 공시동물에서 혈액을 채취하여 피콜 농도구배 (Ficoll gradient) 방법에 의하여 말초 혈액 단핵구 세포 (Peripheral Blood Mononuclear Cells: PBMCs)를 분리하고, 이 PBMC를 QIAmp Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출된 지놈 DNA는 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인한 후, 스펙트로포토미터를 이용하여 농도를 측정하였다. 정제된 지놈 DNA는 -20℃에 보관 후 PCR을 위한 주형으로 사용되었다.
2. PERV 프로바이럴 DNA의 증폭
증폭에 이용한 프라이머 세트는 기존에 보고된 GenBank의 모든 서열의 데이터를 수집하여 모든 클래스의 env 유전자를 클로닝 하고자, env의 표면 당단백질의 출발 코돈 앞과 p15E의 상동성이 높은 부위를 이용하여 축퇴성 프라이머 (degenerate primer)를 디자인하였다: 센스 프라이머, 5'- ACCTGGATCCATGCATCCCACGTTAA-3'; 안티센스 프라이머, 5'-(A/G)TCTGAAGTG GTTCTACAGAAC(A/C)G(A/G)A-3'. 이는 약 1.5 kb 정도를 증폭하게 한다. PCR 반응은 50 ng 지놈 DNA를 사용하였다. PCR 반응에 사용된 반응 혼합물은 10 × 완충액, 1.5 mM MgCl2, dNTPs 1 mM, 프라이머는 각각 10 pM 및 Taq (Super-Bio) 2 유니트로 구성하였으며, PCR 조건은 GeneAmp PCR system 9700 (Perkin-Elmer Cetus)를 이용하여 94℃ 3 분으로 핫 스타트를 1 cycle 수행 한 후, 94℃에서 30초 간 변성반응을 시킨 후, 55℃에서 30초간 어닐링반응, 그리고 72℃에서 1분간 연장 반응을 30 사이클 실시하고, 72℃에서 최종적으로 7분간 반응시켰다. 증폭된 산물은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
3. 클로닝
증폭된 약 1.5 kb의 PCR 산물은 gel extraction kit (Qiagen)를 이용하여 아가로스 겔로부터 분리/정제하였으며, 정제된 PCR 산물은 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen)에 라이게이션 반응으로 삽입하였고, E. coli Top10F에 형질전환을 수행하여 클로닝하였다.
4. env 염기서열 분석
M13 전방향 및 M13 역방향 시퀀싱 프라이머, 증폭에 사용된 프라이머 세트를 이용하여 클로닝된 PERV env 유전자의 염기서열을 확인하였다 (ABI sequencer). 염기서열 결과를 이용하여 약 1.5 kb의 염기서열을 콘티그하였으며, Genbank에 등록되어 있는 PERVs env를 참조 스트레인으로 하고 ClustalX ver. 1.81을 이용하여 얼라인먼트를 실시하였다.
5. 계통발생학적 분석
클론들의 계통분석학적 관계를 비교해 보기 위하여, 51개 전체 클론의 염기서열을 컴퓨터 프로그램 (Treecon ver. 1.3b)을 사용하여 계통분석도를 작성하였다(19). 계통 분석도는 이웃 연결 (neighbor-joining), Galtie와 Gouy 그리고 Maximum parsimony 방법을 이용하여 작성하였다. 계통도의 토폴로지는 100회 리샘플링하여 부트스트랩 (boostrap) 값을 구하였다.
6. PERV -A와 B의 선별 동정 방법의 개발
PERV-A와 B는 인간 세포에 감염능을 가지고 있는 돼지 바이러스로서 여러 종류의 PERV 중에서 가장 중요하다. 하기 표 1은 돼지, 인간 그리고 다른 포유동물 들에 PERV-A와 PERV-B의 감염성을 보여준다.
PERV-A와 B의 다양한 숙주세포에서의 감염능
종 세포명 바이러스 역가
PERV-A PERV-B
돼지 PK15 <4 2,100
ST-IOWA 30,000 940
PAE 6 <2
MPK 164 <4
인간 293 12,000 <2
TE671 5,800 <2
HeLa 24,000 <2
HT1080-1 82 890
HT1080-2 16 10
FLYRD18 48 12
HOS <2 <2
U87 830 <2
MRC-5 150 <2
SupT1 <2 <2
Raji 2 <2
Molt4 2 <2
아프리카 그린 원숭이 Vero <2 <2
COS-7 <2 <2
붉은털 원숭이(Rhesus) FRhK <2 <2
비비(Baboon) 26CB1 <2 <2
침팬지 CP132 <2 미실험
밍크 Mv-1-Lu 7,800 <2
마우스 NIH3T3 <4 <2
M.dunnai <4 <2
래트 NRK <4 <2
HSN <4 <2
햄스터 CHO 32 <2
BHK <2 <2
토끼 SIRC <4 <2
박쥐 Tb-1-Lu <2 <2
개 Th2CfS+L- <2 <2
D17 760 <2
고양이 CCCS+L- 190 <2
따라서 이 두 가지 타입의 바이러스를 구별해 내는 방법을 구축하는 것은 매우 중요하다. 본 발명자들은 상술한 무균돼지의 PERVs 연구에 기초하여, 본 발명에 의해 규명되고 분류된 무균돼지의 다양한 뉴클레오타이드 서열들을 얼라인먼트하고, 이들로부터 PERV-A와 B에 특이적인 염기서열을 선택하였다.
PERV-A와 B 각각의 특이 염기서열
염기서열 위치 염기서열
PERV-A 280-305 GTAATCCCTGGTCTCAATGACCAGGC
489-581 TCCTACCAGTTATAATCAATTTAATTATGGCCATGGGAGATGGAAAGATTGGCAACAGCGGGTACAAAAAGATGTACGAAATAAGCAAATAAG
684-720 GTACTATGGAGGCTCTGGGAGAAAGAAAGGATCTGTT
807-886 AATCCAAGAACAGAGGCCATCTCCTAACCCCTCTGATTACAATACAACCTCTGGATCAGTCCCCACTGAGCCTAACATCA
1158-1183 TAACCACACTGAAGCCTTTAATCGAA
PERV-B 278-299 TGATTAACCCCGCTGTTAAAAG
480-539 TTCCGGCCCGGGCAAGTACAAAGTGATGAAACTATATAAAGATAAGAGCTGCTCCCCATC
630-669 TTTTTATAAATATGGCGGGGGAGCAGGGTCCACTTTAACC
750-831 GGCCCTGGAGCCACCGCATAACTTGCCGGTGCCCCAATTAACCTCGCTGCGGCCTGACATAACACAGCCGCCTAGCAACGGT
842-883 TGATTCCTACCAACACGCCTAGAAACTCCCCAGGTGTTCCTG
1152-1177 CTATAGTACTGTGGTTTATGAGCAGG
이러한 특이적 염기서열에 기초하여 PCR 프라이머를 제작하였다.
PERV-A와 B를 구별가능하게 하는 PCR 프라이머 세트
항목 프라이머 명칭 시작 위치 PCR 산물크기 PCR 프라이머 염기서열
PERV-A PERV-A1-F 281 438 bps 5'-TAATCCCTGGTCTCAATGACCA-3'
PERV-A1-R 697 5'-CAGATCCTTTCTTTCTCCCAGA-3'
PERV-A2-F 508 377 bps 5'-TTTAATTATGGCCATGGGAGAT-3'
PERV-A2-R 864 5'-ATGTTAGGCTCAGTGGGGACT-3'
PERV-A3-F 684 498 bps 5'-GTACTATGGAGGCTCTGGGAGA-3'
PERV-A3-R 1160 5'-CGATTAAAGGCTTCAGTGTGGT-3'
PERV-B PERV-B1-F 278 394 bps 5'-TGATTAACCCCGCTGTTAAAAG-3'
PERV-B1-R 650 5'-ATGGTTAAAGTGGACCCTGCTC-3'
PERV-B2-F 489 377 bps 5'-GGGCAAGTACAAAGTGATGAAA-3'
PERV-B2-R 844 5'-TTCTAGGCGTGTTGGTAGGAAT-3'
PERV-B3-F 803 373 bps 5'-CTGACATAACACAGCCGCCTA-3'
PERV-B3-R 1152 5'-TGCTCATAAACCACAGTACTATAG-3'
상기 프라이머를 이용하여 다음과 같이 PCR을 실시하였다: PCR 반응에 사용된 반응 혼합물은 10 × 완충액, 1.5 mM MgCl2, 1 mM dNTPs, 프라이머는 각각 10 pM 및 Taq (Super-Bio) 2 유니트와 50 ng의 지놈 DNA로 구성하였으며, PCR 조건은 GeneAmp PCR system 9700 (Perkin-Elmer Cetus)를 이용하여 94℃ 3 분으로 핫 스타트를 1 cycle 수행 한 후, 94℃에서 30초 간 변성반응을 시킨 후, 55℃에서 30초간 어닐링반응, 그리고 72℃에서 30초간 연장 반응을 30 사이클 실시하고, 72℃에서 최종적으로 7분간 반응시켰다. 증폭된 산물은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 PERV-A와 B를 구별하여 동정할 수 있는 RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 분석 방법에 적합한 프라이머를 디자인 하였다.
RFLP 분석에 사용되는 프라이머
프라이머 명칭 PCR 프라이머 염기서열
PERV-F 5'-CAAAAGTGGGTAAATGGTATG-3'
PERV-R 5'-CAAAGGTGTTGGTGGGATGG-3'
상기 프라이머를 이용하여 다음과 같이 RFLP를 실시하였다: PCR 반응에 사용된 반응 혼합물은 10 × 완충액, 1.5 mM MgCl2, 1 mM dNTPs, 프라이머는 각각 10 pM 및 Taq (Super-Bio) 2 유니트와 50 ng의 지놈 DNA로 구성하였으며, PCR 조건은 GeneAmp PCR system 9700 (Perkin-Elmer Cetus)를 이용하여 94℃ 3 분으로 핫 스타트를 1 cycle 수행 한 후, 94℃에서 30초 간 변성반응을 시킨 후, 55℃에서 30초간 어닐링반응, 그리고 72℃에서 30초간 연장 반응을 30 사이클 실시하고, 72℃에서 최종적으로 7분간 반응시켰다. 증폭된 산물은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하면 PERV-A는 509 bps의 산물과 PERV-B는 557bp의 산물을 확인할 수 있다. 이렇게 얻어진 증폭 산물을 젤 추출 키트 (Qiagen)를 이용하여 아가로스 젤로부터 분리/정제하였으며, 분리 정제 된 증폭 산물을 제한 효소 처리하여 RFLP를 관찰 하였다. RFLP를 관찰 하기 위하여 위의 증폭 산물은 10X 완충액, 5 유니트의 BamHI을 이용하여 반응 혼합물을 조성하였으며, 37℃에서 3시간 동안 제한효소 반응을 수행하여 1.5% 아가로즈 젤에서 정기영동을 수행하였다.
실험 결과
1. 무균 돼지 PBMCs로부터의 지놈 DNA 추출
채취한 돼지 전혈로부터 피콜 농도구배를 이용하여 PBMCs를 분리한 후, 분리 정제한 지놈 DNA는 M169 2.04 ㎍/㎕, T1111 2.48 ㎍/㎕의 농도로, PCR을 수행하는데 충분한 양을 확보하였다.
2. PERV env 유전자 클로닝 및 분포 조사
PCR 증폭 반응을 통하여 PERV env 유전자의 출발 코돈을 포함하여 p15E의 일부를 포함하는 약 1.5 kb의 산물을 얻을 수 있었다 (참조: 도 4). 얻어진 산물을 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터에 클로닝하여 M149 돼지에서 24개, T1111 돼지에서 27개로 총 51개의 클론들을 확보하였다.
확보된 클론은 M13 전방향 및 M13 역방향 시퀀싱 프라이머와 클로닝에 사용한 프라이머를 이용하여 4회 이상 염기서열 분석을 수행하여 산물의 염기서열을 결정하였다. GenBank에 등록된 바이러스 주를 기준으로 염기서열을 얼라인먼트한 결과 계통분석학적 계통도를 그리기 전에 크게 서브그룹 A 및 B로 나누어짐을 알 수 있었다.
M149 돼지로부터 분리된 클론 24개 중 10개는 PERV-A에 14개는 PERV-B에 속하였으며, T1111 돼지로부터 분리된 클론 27개 중 13개가 PERV-A, 14개가 PERV-B로 분류되었다. 서브그룹 간의 분포를 보면, PERV-A가 45%, PERV-B가 55%로 두 서브그룹 사이의 분포는 큰 차이를 보이지 않았다. 무균돼지 내에서의 분포도 M149 내 PERV-A와 PERV-B는 각각 41%와 59%, T1111 내에서는 48%와 52%의 분포를 보였다 (표 1).
무균 돼지에서 얻은 PERV env 클론
항목 무균돼지 종류
M149 T1111
서브그룹 PERV-A PERV-B PERV-A PERV-B
클론 10(1) 14 13(7) 14(1)
상기 표 1에서 괄호 내의 숫자는 올바른 오픈 리딩 프레임을 갖는 클론의 수를 나타낸다.
3. PERV env 유전자 염기 서열 분석 및 아미노산 서열 분석
분석된 염기 서열을 토대로 아미노산 염기서열을 분석한 결과, 대부분의 클론들이 결실, 삽입 및 점 돌연변이 등에 의해 올바른 바이러스를 생성하지 못하는 비기능성 클론들이었으나, M149 무균 돼지의 PERV-A로 분류된 1개의 클론과, T1111 무균 돼지의 PERV-A로 분류된 클론 중 7개와 PERV-B로 분류된 1개의 클론이 올바른 오픈 리딩 프레임을 가지고 있었다 (표 1).
하기 표 2는 ORF가 맞는 클론과 대표적인 기준 주간 intra/inter-서브그룹 간 유전자와 아미노산 서열간 상동성 비교를 한 것이다.
무균 돼지에서 얻은 PERV env 유전자들 사이의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열의 상동성(%)
바이러스주 Y12238 M4 T3 T8 T10 T19 T20 T26 T12 Y12239 AJ33818 AJ288589
Y12238 - 99.4 99.1 99 94.8 99.4 99.6 99.5 66 65.9 65.9 58.9
M4 99.3 - 98.7 98.9 94.9 99.3 99.3 99.4 65.9 66.2 66.2 59.1
T3 98.5 98.5 - 99.7 95.2 98.8 99 98.8 65.9 65.9 65.8 58.8
T8 98.5 98.5 99.6 - 95.4 98.7 98.9 98.8 66.1 66.2 66.2 63.5
T10 95.9 95.9 96.6 96.6 - 94.5 94.8 94.5 70 70.6 70.6 67.9
T19 98.7 99.1 97.9 97.9 95.5 - 99.4 99.4 66.2 66.2 66.2 58.9
T20 99.3 99.3 98.5 98.5 96.1 98.7 - 99.4 66.2 66.1 66.1 63.2
T26 98.9 99.3 98.1 98.1 95.5 98.7 98.9 - 65.9 65.9 65.9 58.8
T12 66.5 66.7 66.2 66.2 69.2 66.5 67.1 66.4 - 99 98.9 97.5
Y12239 67.1 67.3 66.7 66.7 69.7 67.1 67.7 66.9 98.9 - 99.9 98.5
AJ33818 66.9 67.1 66.5 66.5 69.5 66.9 67.5 66.7 98.5 99.6 - 98.34
AJ288589 65.2 65.4 64.8 64.8 67.7 65.2 65.8 65 96.4 97.4 97 -
상동성은 4 종류의 기준 바이러스주 (reference strain) 및 무균돼지로부터 분리된 8 종류의 클론 사이의 상동성을 이용하여 계산하였고, Y12238은 PERV-A에 대한 기준 바이러스주로 이용하였고, Y12239, AJ133818 및 AJ288589는 PERV-B에 대한 기준 바이러스주로 이용하였다.
상기 표 2에서 뉴클레오타이드 서열의 상동성은 위쪽 삼각형 지역에, 아미노산 서열의 상동성은 아래쪽 삼각형 지역에 기재되어 있다. 상동성 계산은 1539개의 뉴클레오타이드 서열 및 513개의 아미노산 서열에 기초하여 계산하였다.
돼지 개체간 차이를 제외한 서브그룹 내의 염기서열 상동성은 94.5%에서 99.7%로 높은 상동성을 확인할 수 있었다. 서브그룹 A 및 B 에서는 58.8%에서 70.6%로 많은 차이를 지님을 알 수 있었으며, 아미노산 서열간의 상동성도 염기 서열 상동성과 비슷한 차이를 확인 할 수 있었다 (표 2).
PERV의 엔벨로프 단백질은 당단백질로 서브그룹 A에서 모두 9개의 잠재적인 글리코실화 위치 (Asn-X-Thr/Ser)를 발견할 수 있었으며, 서브그룹 B (T12 클론)에서는 4개의 글리코실화 위치를 확인할 수 있었다 (참조: 도 1 및 2). gp70와 p15E로 분리하는 절단위치는 Arg/Lys-X-Lys-Arg으로(4), 459에서 462까지의 아미노산 서열에 위치하고 있었으며, gp70 부위에서 서브그룹 A와 B는 아미노산 서열에서 많은 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다 (참조: 도 2). http://swissmodel. expasy.org//SWISS-MODEL.html 웹사이트의 단백질 2차원 구조 예측 서비스를 통하여, 아미노산서열 465에서 490까지의 부분이 막투과 도메인 (transmembrane domain)으로 소수성 아미노산이 많이 분포하며, 서브그룹 A와 B 모두 잘 보전되어 있음을 알 수 있었다.
4. PERV env 유전자 염기 서열을 이용한 계통 분석
염기 서열 분석이 된 총 51개 클론의 염기서열과 GenBank에 등록된 PERV-A (AY288779, AF435966, Y12238, AF435967), PERV-B (AY099324, Y12239), PERV-C (AF038600, AF0308599) 그리고 outgroup으로 PERV-E (AF356697)를 기준 바이러스주로 사용하여, Neighbor-Joining 방법을 이용하여 계통 분석학적 관계를 알아보았다. 서브그룹 B는 100 %의 bootstrap 값으로 클레이드 (clade)를 이루고 여기에 포함되어 다른 분리주와 거리를 보인 T18과 M22는 변이, gross deletion 등에 의한 것임을 알 수 있었다. 서브그룹 A는 C와 함께 98%의 boostrap 값을 지니며 서브그룹 C 자체는 100%로 구분이 되었다. 이는 GenBank에 등록된 서브그룹 C 엔벨로프 정보가 2개의 분리주만 보고되었기에 계통분석에 한계가 있었다.
각각 M과 T 분리 주가 혼재함을 통해 무균 돼지 개체간의 특징은 존재하지 않음을 알 수 있었으며 알려진 3개의 서브그룹 A, B 및 C에 대한 공통 프라이머를 이용하여 프로바이럴 DNA를 증폭하였지만 분석된 모든 엔벨로프 유전자 클론이 PERV-A와 PERV-B로 분류되었으며 PERV-C는 나오지 않았다 (참조: 도 3).
5. PERV -A와 B의 선별 동정
상술한 프라이머를 이용하여 PCR을 실시한 결과, PERV-A 또는 PERV-B에 특이적인 기대되는 크기의 증폭 산물이 형성되었다. 따라서, 본 발명자들에 의해 개발된 프라이머들은 PERV-A 또는 B에 특이적인 것으로서, 이를 이용하면 PERV-A 및 PERV-B를 특이적으로 동정할 수 있음을 알 수 있다.
또한, RFLP 분석을 실시한 결과, BamHI으로 증폭산물을 제한효소 처리를 해 주면 PERV-A는 절단이 일어나서 81 bps와 420 bps로 나뉘어 지고, PERV-B는 절단이 일어나지 않아 557 bps를 유지하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 Env 단백질 및 유전자는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스에 대하여 특이적으로 발현되는 것이며, env 유전자 내의 유전적 마커를 이용하는 경우에는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 정확하게 동정할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (10)

  1. 서열목록 제2서열, 제4서열, 제6서열, 제8서열, 제10서열, 제12서열, 제14서열, 제16서열 및 제18서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 Env 단백질.
  2. 상기 제 1 항의 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 Env 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제1서열, 제3서열, 제5서열, 제7서열, 제9서열, 제11서열, 제13서열, 제15서열 및 제17서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  4. 서열목록 제1서열, 제3서열, 제5서열, 제7서열, 제9서열, 제11서열, 제13서열 또는 제15서열에서 418번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
  5. 서열목록 제1서열, 제3서열, 제5서열, 제7서열, 제9서열, 제11서열, 제13서열 또는 제15서열에서 672번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
  6. 서열목록 제3서열, 제5서열, 제7서열 또는 제13서열에서 229번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
  7. 서열목록 제3서열, 제5서열, 제7서열 또는 제13서열에서 766번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
  8. 서열목록 제3서열, 제5서열, 제7서열 또는 제13서열에서 953번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
  9. 서열목록 제3서열, 제5서열, 제7서열 또는 제13서열에서 1133번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커.
  10. (a) 무균 돼지로부터 핵산 분자를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 유전적 마커의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는 무균 돼지 내인성 레트로바이러스의 동정방법.
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논문
염기서열

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