KR101107314B1 - 소수성 광감작제가 함입되어 있는 지질 나노 미립구, 그 제조방법, 및 그것을 포함하는 종양 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소수성 광감작제가 포화 지질 및 불포화 지질과 함께 생체 적합성 계면활성제로 유화되어 형성된, 소수성 광감작제가 함입되어 있는 지질 나노 미립구, 및 그 지질 나노 미립구를 포함하는 종양 치료제 및 종양 진단제를 제공한다.

또한, 본 발명은 생체 적합성 수성 고분자에 종양 표적물질을 결합시켜 생체 적합성 계면활성제를 제조하는 단계;

상기 생체 적합성 계면활성제를 물에 녹여 수상을 제조하는 단계;

광감작제와 함께 포화 지질 및 불포화 지질을 휘발성 유기 용매 중에 용해하여 지질상을 제조하는 단계;

상기 수상과 상기 지질상을 혼합하여 o/w 어멀젼을 제조하는 단계;

상기 제조된 에멀젼을 여과하여 함입되지 않은 광감작제나 이물질을 제거하는 단계; 및

상기 여과된 에멀젼을 상기 고체 지질의 녹는점 이하의 온도로 냉각시켜 에멀젼 입자를 고형화하는 하는 단계를 포함하는, 지질 나노 미립구를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

소수성 광감작제가 함입되어 있는 지질 나노 미립구, 그 제조방법, 및 그것을 포함하는 종양 치료제{A lipid nanosphere enclosing a hydrophobic photo-sensitizer, a process for the preparatrion thereof, and an anti-tumor agent comprising the same}

본 발명은 소수성 광감작제가 함입되어 있는 지질 나노 미립구, 그 제조방법, 및 그것을 포함하는 종양치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 나노 지질 미립구 형성에 의한 형광 간섭 현상에 의해 표적 이외의 부위에 대한 부작용이 감소되도록 하면서, 지질 나노 미립구의 제조시 종양 표적을 부가하여 종양 표적에 타게팅할 수 있는 소수성 광감작제가 함입되어 있는 지질 나노 미립구, 그 제조방법, 및 그것을 포함하는 종양 치료제 및 종양 진단제에 관한 것이다.

광역학 치료(PDT, photodynamic therapy)는 체내의 풍부한 산소와 외부에서 공급되는 레이저 빛에 예민한 반응을 보이는 광감작제를 환자에게 투여하고 그 광감작제가 반응을 보이는 특정 파장의 레이저를 조사하는 치료방법이다.

광감작제는 광감작제가 빛 자극에 의해 단분자 산소, 자유라디칼들 또는 과산화물질들과 같은 세포독성물질을 생산하게 되며, 이러한 활성산소종(ROS)은 주변 의 조직을 파괴시키므로, 악성 종양의 치료에 사용될 수 있다. 광감제를 치료하고자 하는 부위에 국소투여하거나, 레이저를 환부에만 국소 조사함으로써 환부에만 선택적으로 치료할 수 있다. 또한, 광감작제는 레이저 조사에 의한 특정 파장의 빛의 발생으로 영상화에 의한 종양 진단에 이용되기도 한다.

종래에는 광감작제는 직접 외부에 도포하거나 정맥 주사함으로써 투여하였다. 그러나, 광감작제는 외부로부터 노출되는 근적외선 등에 의해 반응하여 타겟팅하는 조직이 아닌 정상적인 조직에 까지 손상이 발생될 수 있어 문제가 된다. 또한, 소수성 광감작제는 정맥 주사될 경우 혈액 내에서 우선 단백질과 결합하고 이는 세포 표면에 위치하는 수용체를 통해 세포 내부로 이동하는 것으로 규명되어 있다. 따라서, 이러한 경우에는 그 조직 특이성이 단순히 소수성 특성에 의해 규정되며 또한 조직 또는 세포에서의 잔류시간도 경우에 따라 많은 차이를 나타내게 된다. 이는 광역학 진단 및 치료의 효과를 감소시키며 치료 후 재발 확률을 증가시키는 요인으로 지목되어 왔다. 또한, 광감작제의 정상세포에 대한 작용에 의해 부작용이 나타나서 문제가 된다.

이러한 광감작제의 조직 비특성의 문제를 극복하기 위해, 대부분의 종양 세포에서 과량 발현되는 Ep-CAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule) 단백질에 대한 항체를 커플링 시약에 의해 광감작제와 접합시킨 다음, 항원-항체 반응을 이용하여 조직 특이적으로 전달하는 방법이 개발되었다(한국특허공개 2005-0022797). 그러나, 이러한 방법은 작용기가 없는 광감작제는 이용할 수 없으며 합성된 물질은 화학구조적으로 변화가 일어났기 때문에 세포로의 광독성 효율이 떨어질 수 있고 위 와 같이 항체를 이용 시에는 비용이 많이 든다는 단점이 있다.

또한, 광감작제가 조직 특이적 방법에 의해 전달된다고 하더라고 전달 과정 중에 발생되는 형광에 의해 정상조직이 손상될 수 있으므로, 보다 조직 특이적인 전달이 가능하면서도 부작용을 현저히 경감시킬 수 있는 광감작제에 대한 약물 운반체의 개발이 필요하다.

Bernadette Pegaz 등은 지질이 포함되지 않은 고분자 물질만을 사용하여 제조한 나노 입자에 광감작제를 함입시키는 방법이 개발한 바 있다(Bernadette Pegaz et al. Encapsulation of porphyrins and chlorins in biodegradable nanoparticles: Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology Volume 80, Issue 1, 1 July 2005, Pages 19-27). 그러한, 이러한 방법은 광감작제의 함입 효율이 매우 낮아 효과가 떨어지며 표적지향물질이 없어 종양으로의 지향성이 낮은 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 극복하기 위해 예의 연구한 결과, 소수성 광감작제를 지질 나노 미립구로 제조하고, 지질 나노 미립구 제조 시 종양 표적 물질을 도입함으로써, 광감작제에 의한 부작용을 최소화하면서 광감작제의 효과는 증진시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 광감작제에 의한 부작용을 최소화하면서 광감작제의 효과는 향상된 지질 나노 미립구를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 나노 지질 미립구를를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 지질 나노 미립구를 포함하는 광역학 치료에 의한 종양 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 지질 나노 미립구를 포함하는 광역학 진단에 의한 종양 진단제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소수성 광감작제가 포화 지질 및 불포화 지질과 함께 생체 적합성 계면활성제로 유화되어 형성된, 소수성 광감작제가 함입되어 있는 지질 나노 미립구를 제공한다.

상기 본 발명에 따른 지질 나노 미립구는

생체 적합성 수성 고분자에 종양 표적물질을 결합시켜 생체 적합성 계면활성 제를 제조하는 단계;

상기 생체 적합성 계면활성제를 물에 녹여 수상을 제조하는 단계;

광감작제와 함께 포화 지질 및 불포화 지질을 휘발성 유기 용매 중에 용해하여 지질상을 제조하는 단계;

상기 수상과 상기 지질상을 혼합하여 o/w 어멀젼을 제조하는 단계;

상기 제조된 에멀젼을 여과하여 함입되지 않은 광감작제나 이물질을 제거하는 단계; 및

상기 여과된 에멀젼을 상기 고체 지질의 녹는점 이하의 온도로 냉각시켜 에멀젼 입자를 고형화하는 하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 본 발명에 따른 지질 나노 미립구를 포함하는 광역학 치료에 의한 종양 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 지질 나노 미립구를 포함하는 광역학 진단에 의한 종양 진단제를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 광감작제의 형광 발생으로 인한 부작용을 최소화 하기 위해, 광감작제를 지질 나노 미립구 내에 함입시키는 방법을 도입하였다. 광감작제를 지질 미립구에 함입시키기 위해, 소수성 광감작제를 포화 지질 및 불포화 지질과 함께 생체 적합성 계면활성제로 유화시킴으로써 지질 나노 미립구를 제조하고, 이를 분리함으로써 지질 나노 미립구를 획득하였다.

따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서,

소수성 광감작제가 포화 지질 및 불포화 지질과 함께 생체 적합성 계면활성제로 유화되어 형성된, 소수성 광감작제가 함입되어 있는 지질 나노 미립구를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 지질 나노 미립구는 직경 500 nm 이하의 크기를 갖는다.

소수성 광감작제는 자유로운 상태에서는 형광의 발생에 의해 정상적인 조직에 손상을 가할 수 있지만, 상기 지질 나노 미립구 내에 존재할 경우에는 소수성 광감작제가 물리적으로 지질 나노 미립구 내에 밀접하게 존재하여 광감작제 각각이 발생하는 형광이 서로 간섭을 일으키게 되어 광감작제로부터 세포독성을 나타내는 활성산소종의 발생이 차단된다. 따라서, 상기 본 발명에 따른 지질 나노 미립구는 지질 나노 미립구가 생체 내에 투여되어 파괴되기 전까지 형광 발생으로 인해 정상조직에서 발생할 수 있는 부작용의 발생을 억제할 수 있다.

또한, 상기 지질 나노 미립구는 지질로서 포화 지질 및 불포화 지질을 모두 포함함으로써 광감작제의 함입 효율을 높이는 것을 특징으로 한다. 포화 지질은 상온에서 고체 상태이고, 불포화 지질은 상온에서 액체 상태인 특징으로 인해, 상기 지질 나노 미립구는 미립구 내의 지질이 고체상 지질과 액상 지질이 서로 혼합되어 미립구 구조가 포화 지질 만을 사용할 경우에 비해 간극을 형성할 수 있다. 그 결과로 지질 나노 미립구는 불완전한 격자 결정에 광감작제가 함입될 수 있는 공간을 제공할 수 있게 되어, 광감작제의 나노 미립구로의 함입 효율을 높일 수 있게 된다.

상기 소수성 광감작제로는 광역학 진단 또는 치료에 사용되는 광감작제라면 특별히 제한되는 것은 아니나, 근적외선에서 형광을 나타내는 것을 이용할 수 있다. 상기 근적외선에서 형광을 나타내는 광감작제로는 페오포르바이드 a, 파이로페오포르바이드 a, 테트라벤조포르핀, 메조테트라페닐포르핀, 또는 Fe(Ⅲ)메조포르피린Ⅸ클로라이드 등 임의의 소수성 광감작제를 이용할 수 있다. 그 중, 페오포르바이드 a는 클로로필로부터 추출한 것으로서 기존의 광감작제에 비해 활성산소종의 발생 효율이 높으며 근적외선 파장대를 흡수하여 반응한다. 이 물질은 가시광선 영역에서 잘 반응하므로 제조 시 빛에 영향을 받지 않도록 유의하면서 작업을 수행하여야 한다.

상기 지질 나노 미립구를 구성하는 포화 지질은 카카오 버터, 버터, 쇼트닝, 라아드, 야자유, 코코넛유, 팜핵유, 팜유, 또는 이들의 조합 등이 이용될 수 있고, 불포화 지질은 올레산, 올리브유, 동백유, 마카다미아 너트유, 피마자유, 라우린산, 미리스틴산, 팔미틴산, 스테아린산, 이소스테아린산, 아몬드오일, 아보카도 오일, 달맞이유, 맥아유, 호호바오일, 옥수수유, 미강유, 또는 이들의 조합 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 포화 지질 및 불포화 지질을 혼합하여 사용하는 이유는 포화 지질의 결정 구조에 불포화 지질을 첨가함으로 광감작제의 함입효율을 높여주는 역할을 하기 때문이다. 카카오 버터는 상온에서 고체이며 녹는점이 38℃인 포화 지방산이다. 올레산은 이중결합을 하나 가지는 불포화지방산으로 상온에서 액체이며 녹는점이 16.2℃ 이다.

상기 본 발명에 따른 지질 나노 미립구의 형성을 위해 사용되는 생체 적합성 계면활성제는 생체 적합성 수성 고분자에 소수성 종양 표적물질이 결합된 것을 계면활성제로서 사용할 수 있다. 상기 생체 적합성 수성 고분자 및 소수성 종양 표적 물질의 결합은 각각 사용되는 물질의 구조에 따라 당업자에게 널리 공지되어 있는 화학적 결합 방법에 의해 또는 이를 응용하여 이루어질 수 있다. 상기 결합에 의해 생체 적합성 수성 고분자에 의한 친수성 및 상기 소수성 종양 표적 물질에 의한 소수성이 한 분자에 모두 나타나 계면활성제로서 작용할 수 있게 된다.

상기 생체 적합성 고분자는 계면활성제에서 친수성을 부여하는 역할을 하며, 상기 소수성 종양 표적 물질은 계면활성제에서 소수성을 부여한다. 상기 생체 적합성 고분자는 지질 나노 미립구를 제조한 다음에도 지질 나노 미립구의 표면에 여전히 존재하여, 상기 소수성 종양 표적물질은 계면활성제에 소수성을 부여하는 역할 뿐만 아니라, 지질 나노 미립구를 종양으로 표적화하는 역할을 수행한다.

상기 생체 적합성 고분자로는 플루란, 덱스트란, 콘드로이친 설페이트, 헤파린, 플루로닉, 히알루론산, 키토산, 또는 푸코이단 등이 이용될 수 있으며, 상기 소수성 종양 표적물질로는 엽산, 항체, 코발라빈, 비타민 A, 비타민 C, 또는 비타민 B₁₂ 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 생체 적합성 고분자 중 하나인 '풀루란'은 흑효모(Aureobasidium pullulans (DE BARY) ARN.)로부터 생산되는 것으로 중성다당류이다. 물에 잘 녹으며, 알코올류와 유류에는 녹지 않는다. 다른 검류에 비해 점도는 낮은 편에 속하나, 산, 알칼리, 열 등에 안정하다. 특히, 피막성 외에 강력한 점착력을 가지고 있다. 평균 분자량은 200,000과 100,000 2종류가 있고, 점도는 1-2cps이다.

상기 종양 표적 물질 중의 하나인 엽산(葉酸)은 화학식 C₁₉H₁₅N₇O₆으로서, 프테린과 p-아미노벤조산 및 글루탐산으로 이루어지는 프테로일-L-글루탐산이다. 자연계에는 트리 또는 헵타글루타밀펩티드의 형태로 존재한다.

상기 풀루란과 엽산을 이용하여 생체 적합성 계면활성제를 합성하는 과정의 반응식을 도 1에 나타내었다. 이러한 합성방법은 한국특허공개 2007-0092438에 개시되어 있으며, 본 문헌은 전체가 참고로 본 명세서에 통합된다.

상기 본 발명에 따른 광감작제가 함입된 지질 나노 미립구는 광감작제가 지질 나노 미립구에 둘러싸여 있어 형광간섭 현상이 발생하여, 지질 나노 미립구가 파괴되지 않은 상태에서는 형광을 발생시키지 않는다. 지질 나노 미립구를 정맥 주사에 의해 투여 시 혈액 중의 수성 환경에서는 파괴되지 않으므로, 표적 부위, 예를 들어 종양부위에 도달하여 세포 내로 함입되기 전에는 파괴되지 않고 안정하다. 따라서, 지질 나노 미립구가 표적부위에 도달하기 전에는 형광을 발생시키지 않아 형광에 의한 부작용 발생을 차단시킬 수 있다. 지질 나노 미립구가 표적 부위에 도달하게 되면, 파고사이토시스에 의해 세포 내에로 함입되고 세포 내로 함입된 지질 나노 미립구는 주위 지질 상태에서 분해되어 광감작제가 표적 세포 내부에서 노출되어 형광간섭이 풀리게 된다. 이때, 그 광감작제에 특이적인 레이저를 조사하게 되면, 광감작제가 반응하여 형광을 발생시켜 진단을 가능하게 하거나, 활성 산소종을 발생시켜 표적 조직에 손상을 가할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명에 따 른 지질 나노 미립구는 정상세포에는 형광 발생에 의한 부작용을 주지 않으면서, 표적으로 하는 부위에는 효율적으로 광감작제에 의한 진단 또를 치료를 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면에 있어서,

생체 적합성 수성 고분자에 종양 표적물질을 결합시켜 생체 적합성 계면활성제를 제조하는 단계;

상기 생체 적합성 계면활성제를 물에 녹여 수상을 제조하는 단계;

광감작제와 함께 포화 지질 및 불포화 지질을 휘발성 유기 용매 중에 용해하여 지질상을 제조하는 단계;

상기 수상과 상기 지질상을 혼합하여 o/w 어멀젼을 제조하는 단계;

상기 제조된 에멀젼을 여과하여 함입되지 않은 광감작제나 이물질을 제거하는 단계; 및

상기 여과된 에멀젼을 상기 고체 지질의 녹는점 이하의 온도로 냉각시켜 에멀젼 입자를 고형화하는 하는 단계를 포함하는,

상기 본 발명에 따른 지질 나노 미립구를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 생체 적합성 계면 활성제를 제조하기 위해, 상기 생체 적합성 수성 고분자에 종양 표적물질을 결합시키는 방법은 당해 유기 합성 분야에 공지되어 합성 방법을 이용하여 생체 적합성 수성 고분자 및 종양 표적물질의 구조에 따라 당업자가 적절히 수행할 수 있다. 상기 생체 적합성 수성 고분자 및 종양 표적물질이 결합되는 비율은 제조된 생체 적합성 계면활성제가 물에 녹을 수 있는 정도의 비율이 되도록 해야 한다.

예를 들어, 풀루란 및 엽산을 결합하여 생체 적합성 계면활성제를 제조하기 위해서는, 엽산의 카르복실기(-COOH)를 활성화 시키는 촉매를 이용하여 풀루란의 -OH에 결합시킬 수 있다. 이때 분자량이 큰 풀루란에 그에 비해 분자량이 작은 엽산을 녹여서 한 방울씩 떨어뜨려주는 것이 바람직하다. 이렇게 만들어진 풀루란/폴레이트 결합물은 계면활성제로 이용함에 있어 엽산이 소수성을 증진시켜주기도 하고 암세포로의 표적지향성도 높여주는 역할도 수행할 수 있게 된다.

생체 적합성 계면활성제가 제조된 다음에는, 그 생체 적합성 계면활성제를 물에 녹여 수상을 제조한다. 적절한 양의 물에 용해되는 생체 적합성 계면활성제를 물, 바람직하게는 증류수에 넣고 교반하여 맑은 용액이 되도록 하여 제조할 수 있다. 생체 적합성 계면활성제의 농도가 진하면 이후에 형성되는 나노 미립구의 크기가 작아지는 경향이 있으며, 너무 진할 경우에는 계면 활성제 자체가 뭉쳐 미셀을 형성하게 되므로 지질 나노 미립구의 크기가 오히려 커지게 되므로 적절한 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 생체 적합성 계면활성제의 농도는 약제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 실험을 통해 계면활성제의 종류, 사용되는 지질의 종류 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어, 플루란-엽산의 계면활성제를 사용할 경우에는 1~15 mg/mL의 범위로 사용할 수 있다.

상기 지질상을 제조하는 단계에서는, 포화 지질 및 불포화 지질을 적절한 비율로 광감작제와 함께 유기 용매중에 용해하여 지질상을 제조한다. 상기 포화 지질 및 불포화 지질은 각각 전제 지질 중량에 대해 10~90%의 비율로 사용할 수 있 다. 불포화 지질의 비율이 많게 되면 지질 나노입자를 제조 후 회수 단계에서 끈적끈적한 물질이 남게 되는 문제가 있으며, 포화 지질의 비율이 많게 되면 보관 시에 굳어버려 광감작제가 표면으로 새어나오는 문제가 생길 수 있다. 상기 휘발성 유기 용매는 휘발성이 강한 유기용매를 사용하는 것이 바람직하며, 이는 지질 나노 미립구의 제조를 위해 에멀젼을 제조 후 유기용매가 제거되어야 하기 때문이다. 상기 휘발성 유기용매로는 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토나이트릴, 톨루엔, 에탄올, 또는 이들의 조합 등이 이용될 수 있으며, 이후에 제거되어야 하므로 가능한 적은 양을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 수상과 지질상이 준비되면, 수상과 지질상을 혼합하여 o/w 에멀젼을 제조하는 단계를 수행한다. 상기 수상에 지질상을 적가하여 계면이 커지지 않도록 하면서 제조하는 것이 바람직하다. 상기 혼합 시 온도는 포화 지질의 융점 이상으로 하여 포화 지질이 유화되기 전에 고체상으로 변화되지 않도록 해야 한다. 상기 에멀젼을 제조하기 위해서, 수상 및 지질상의 혼합물에 초음파 기계를 이용하여 초음파를 가함으로써 지질 입자를 일정한 크기로 분산시켜 줄 수 있다. 지질 입자가 초음파에 의해 잘게 나누어지면 수상 중에 존재하던 생체 적합성 계면활성제가 지질 미립구를 둘러싸 재응집을 막아주게 되어, o/w 에멀젼을 생성하게 된다. 상기 초음파 기계는 작동중 열을 발생시키게 되는데, 이 열은 휘발성 유기용매를 휘발에 의해 제거시키는데 도움을 준다. 초음파 기계를 너무 오래 작동하게 되면 계면활성제도 깨져 계면활성제끼리 서로 응집하는 현상이 발생되기도 한다. 따라서, 적절한 세기와 시간동안 사용하는 것이 바람직하다.

상기 o/w 에멀젼을 생성시킨 후에는 여과하여 함입되지 않은 광감작제나 이물질을 제거하는 과정을 수행한다. 상기 여과는 800 nm 이하의 입자를 여과할 수 있는 여과장치를 이용할 수 있다.

상기 여과된 에멀젼을 상기 포화 지질의 융점 이하로 냉각시켜 에멀젼의 지질입자를 고형화할 수 있다. 지질입자를 고형화하는 것이 분산을 유지하기에 유용하므로 에멀젼 생성 후 빠른 시간 안에 낮은 온도에서 보관해주거나 냉동시키는 것이 바람직하다. 지질 입자의 고형화 과정에서 함께 존재하던 불포화 지질은 고형화된 지질 입자에 간극을 형성시켜주는 역할을 하여, 광감작제의 지질 나노 미립구 내의 함입 효율이 더욱 높아지게 된다. 그리하여 제조된 지질 나노 미립구는 동결건조를 이용하여 쉽게 회수될 수 있으며, 동결건조 시 액체질소를 이용하여 빠르게 동결건조를 수행할 수 있다. 액체 질소 상에서 단시간에 완전히 얼려준 다음에 진공건조기를 이용하여 수분을 승화시켜서 날려줌으로써 동결건조를 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 지질 나노 미립구를 포함하는 광역학 치료에 의한 종양 치료제 및 광역학 진단에 의한 종양 진단제를 제공한다. 상기 광역학 치료 및 진단은 종래의 광역학 요법과 동일한 방법으로 수행할 수 있으며, 상기 지질 나노 미립구의 투여량에 대해서는 임상을 수행하는 의사의 판단 하에 환자의 상태를 고려하여 적절히 결정할 수 있다. 상기 지질 나노 미립구는 주사에 의해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 주사에 의해 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 지질 나노 미립구는 정상세포에는 형광 발생에 의한 부작용을 주지 않으면서, 표적으로 하는 부위에는 효율적으로 광감작제에 의한 진단 또를 치료를 가능하게 할 수 있다.

하기 실시예에서는 본 발명의 일 구현예에 따른 광감작제가 함입된 지질 나노 미립구를 제조한 다음, 혈액순환 시에는 형광간섭을 일으키다가 표적물질에 의해 암세포로 유입이 되면 세포기작에 의해 형광간섭이 풀리는 특징을 확인하였다. 그리고, 공초점 현미경으로 세포 내에서 광감작제가 핵까지 유입이 되는 것을 확인하였으며 머무는 위치와 양도 확인하였다. 또한, 이미지 스테이션이라는 영상화 기계를 이용한 분석을 통해 광감작제 물질의 영상화에도 이용할 수 있음을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 지질 나노 미립구가 암세포의 진단뿐 아니라 치료도 함께 할 수 있다는 것을 예상할 수 있었다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 지질 나노 미립구는 표적부위에 도달하기 전에는 형광간섭에 의해 형광을 발생시키지 않아 형광에 의한 부작용 발생을 차단시킬 수 있으며, 표적 부위에 도달하게 되면 세포 내부로 함입되고 분해되어 광감작제에 의한 진단 및 치료를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 지질 나노 미립구는 정상세포에는 형광 발생에 의한 부작용을 주지 않으면서, 표적으로 하는 부위에는 효율적으로 광감작제에 의한 진단 또를 치료를 가능하게 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 지질 나노 미립구는 광감제의 함입 효율이 높아 효율적으로 광감작제에 의한 치료 및 진단을 가능하게 한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이 들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1-3: 광감작제가 함입된 지질 나노 미립구의 제조

정제된 풀루란(1g, 글루코즈유니트당 6.173mmol)을 30ml의 수분을 제거한 DMSO 용매에 60℃로 20분간 용해시킨 다음, 적절량의 엽산과 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)를 첨가해주었다. 엽산이 깨끗하게 용해될 때까지 하루 밤 동안 실온에서 교반시켜 주었다. 그 후 조금 많은 양의 1,3-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)를 넣어준 다음, 25℃에서 이틀 동안 반응시켜 주었다. 반응이 완료되면 800nm의 여과막으로 걸러준 용액을 바로 투석막을 이용해 투석하였다. 투석된 용액을 얼린 후 진공건조시켜 가루형태로 하였다. 이 물질을 빛이 닿지 않게 하여 -20℃에서 보관하였다(수율 89~93%). 제조된 플루란-엽산 계면활성제에 대해 NMR 분석한 결과를 도 2에 나타내었다.

그리고 나서, 개별적으로 각각 2(실시예 1), 5(실시예 2), 10 mg(실시예 3)의 페오포르바이드 a를 1mL 아세톤에 녹이고, 포화 지질인 카카오버터 130 mg과 불포화 지질인 올레산 60 mg을 가하고 카카오버터의 녹는점 정도(50℃)로 올려서 혼합하여 유상 용액을 제조하였다.

상기 혼합된 용액을 상기 제조해 놓았던 풀루란-폴레이트 계면활성제 0.1g를 물 20ml에 용해한 수상 용액에 한 방울씩 떨어뜨려 주었다. 이렇게 만들어진 에멀젼 용액을 초음파 기계로 8분간 (5초동작, 5초정지 400W) 가한 다음, 포어 사이 즈(pore size) 0.8um 실린지 필터를 이용하여 미세여과장치로 여과하였다. 그리고 나서 0℃에 가깝게 냉각시켰다.

비교예 1: 광감작제가 미함입된 지질 나노 미립구의 제조

상기 유상 용액의 제조시 광감작제를 함유시키지 않고 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 과정을 수행하여 광감작제 미함입 지질 나노 미립구를 제조하였다.

실험예 1: 지질 나노 미립구의 입자 크기 분석

상기 실시예 1-3 및 비교예 1에서 제조된 지질 나노 미립구에 대해 제타 전위 zeta sizer SZ(Malvern, UK)를 이용하여 입자의 크기를 분석하였다. 지질 나노 미립구를 1 mg/mL의 농도로 탈이온수에 분산시켜 측정하였다.

그 결과를 하기의 도 3에 나타내었다.

A: 비교예 1, B: 실시예 1(광감작제 2 mg), C: 실시예 2(광감작제 5 mg), C: 실시예 3(광감작제 10 mg)

실험예 2: 유상 및 수상 중에서의 광감작제의 형광간섭의 유무

광감작제와 상기 실시예 1-3에서 제조된 광감작제가 함입된 지질 나노 미립구를 형광분석기를 이용해 광감작제의 농도를 계산하여 동일한 농도의 광감작제를 가지게 하고 두 물질을 유기용매 또는 인산완충용액(PBS)에서 희석한 다음 형광분 석기를 이용하여 희석배수별로 분석해보았다. 희석배수에 따른 결과는 하기의 도 4에 나타내었다.

실험예 3: 형광영상분석 기술을 이용한 유기용매와 PBS에 따른 광감작제의 형광간섭의 유무

형광간섭의 유무는 이미지 스테이션(Image station, Kodak, Japan)이라는 기계를 통해 영상으로 나타낼 수 있다. 이미지 스테이션 기계는 근적외선 파장으로 빛을 쏘아주고 그 파장대를 흡수하는 물질이 형광을 나타낼 때 그 영상을 사진으로 나타낼 수 있는 장치이다. 상기 실시예 1-3에서 제조된 지질 나노 미립구 각각을 DMSO 또는 PBS 중에 1mg/ml 의 농도로 희석하고 이미지 스테이션 기계를 이용하여 영상화 하였다. 비교를 위해, 페오포르바이드 a를 DMSO 또는 PBS 중에 1mg/ml 의 농도로 희석한 것과, DMSO 및 PBS 각각에 동일한 영상화를 수행하였다. 이미지 스테이션 기계로 영상화한 것을 촬영한 사진을 도 5에 나타내었다. 도 5에 따르면, 본 발명에 따른 지질 나노 미립구는 수성인 PBS 중에서는 형광간섭이 일어나 형광을 나타내지 않았으나, 유성인 DMSO 중에서는 형광간섭을 나타내지 않아 형광이 발생하는 것으로 확인되었다.

실험예 4: 광감작제, 및 광감작제가 함입된 지질 나노 미립구의 MTT 어세이

페오포르바이드 a만을 HeLa 세포에 각각 0.1㎍/ml, 0.5㎍/ml, 2.5㎍/ml, 12.5㎍/ml의 농도로 처리해준 다음 바로 빨간 빛(42 kJ/m²(light exposuretime 10 min,)VA-II DPSS LASER DRIVER 010888)을 쬐어준 것과 6 시간이 경과된 후에 빨간 빛(42 kJ/m²(light exposuretime 10 min,)VA-II DPSS LASER DRIVER 010888) 을 쬐어준 것에 대해 MTT 정량을 수행하였다. 그 결과를 도 6a에 나타내었다.

상기 실시예 1-3에서 제조된 광감작제가 함입된 지질 나노 미립구를 상기와 동일한 농도로 동일한 세포에 처리해준 다음, 상기와 동일한 방법으로 빛을 쬐어준 후 MTT 정량 하였다. 그 결과를 각각 도 6b, 6c, 6d에 나타내었다.

참고로, MTT 정량법은 세포독성도 조사라고 하고 어떤 화합물(또는 물질)이 세포에 어느 정도 독성을 나타내는지 확인하는 실험이다. 살아있는 세포에 MTT를 처리하게 되면, MTT가 미토콘드리아에 있는 리덕타제에 의해 환원되어 포르마잔이라 불리는 결정을 형성하게 된다. 죽은 세포에서는 미토콘드리아가 이미 깨져 없기 때문에 리덕타제도 존재하지 않기 때문에 포르마잔도 형성되지 않는다. 따라서, 어떤 화합물을 농도별로 일정 시간 처리해서 세포의 사멸을 충분히 유도한 뒤 MTT를 처리하면 세포독성이 나타나지 않는 낮은 농도에서는 포르마잔이 형성되고 높은 농도에서는 포르마잔이 형성되지 않는 것을 확인할 수 있는 방법이다.

실험예 5: 세포에 의한 광감작제가 함입된 지질 나노 미립구의 형광을 통한 유입 위치 및 양 그리고 기작의 시각화

Hela 세포를 6-웨 배양접시에 10000 개 정도로 접종한 후 배양접시로의 부착 을 위해 24 시간동안 배양하였다(5% CO₂, 37℃). 그 후에 상기 실시예 1 또는 2에서 제조된 페오포르바이드 a가 함입된 지질 나노 미립구(각각 NLC2 및 NLC5로 표시)와 광감작제 페오포르바이드 a 단독(PPb로 표시) 광감작제의 농도가 0.2 ug/ml 정도의 농도가 되도록 분주하였다. 그리고 나서, 6 시간이 경과한 후, 5% 파라포름알데히드 용액이 포함된 PBS 2 mL를 첨가해주어 10 분 동안 세포를 고정시켜 준 후 핵 염색을 위해 DAPI 염색을 2 분동안 해주었다(1㎕; 3.63 mM). 그런 다음, 유리 덮개로 각 배양접시를 덮어주고 공초점 현미경으로 형광을 관찰하였다. 공초점 현미경으로 형광을 관찰한 결과를 촬영한 사진들 도 7에 나타내었다.

도 7의 결과로부터 광감작제가 함입된 지질 나노 미립구의 경우 광감작제가 암세포 내부로, 특히 암세포의 핵으로 유입되어 머무는 것을 확인할 수 있었다. 나노 미립구에 함입된 광감작제가 광감작제 단독 보다 더 많이 핵으로 유입되었다는 것을 알 수 있다. 이로부터, 본 발명에 따른 광감작제가 함입된 지질 나노 미립구는 그 광감작제가 암세포의 핵에 잘 유입되어 작용한다는 것을 알 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 풀루란과 엽산을 이용하여 생체 적합성 계면활성제를 합성하는 과정의 반응식을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 플루란-엽산의 계면활성제에 대해 NMR 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 지질 나노 미립구를 광감작제가 함입되지 않은 지질 나노 미립구와 함께 제타 전위 zeta sizer SZ(Malvern, UK)를 이용하여 입자의 크기 분포를 분석한 그래프이다.

도 4a는 일 실시예에 따라 페오포르바이드 a 2 mg을 이용하여 제조된 지질 나노 미립구를 DMSO 또는 인산완충용액(PBS)에서 희석한 다음 형광분석기를 이용하여 희석배수별로 분석한 결과를 촬영한 사진이다.

도 4b는 일 실시예에 따라 페오포르바이드 a 5 mg을 이용하여 제조된 지질 나노 미립구를 DMSO 또는 인산완충용액(PBS)에서 희석한 다음 형광분석기를 이용하여 희석배수별로 분석한 결과를 촬영한 사진이다.

도 4c는 일 실시예에 따라 페오포르바이드 a 10 mg을 이용하여 제조된 지질 나노 미립구를 DMSO 또는 인산완충용액(PBS)에서 희석한 다음 형광분석기를 이용하여 희석배수별로 분석한 결과를 촬영한 사진이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 지질 나노 미립구를 DMSO 또는 PBS 중에 1mg/ml의 농도로 희석하고 이미지 스테이션 기계를 이용하여 영상화한 것을 촬영한 사진이다.

도 6a는 페오포르바이드 a 단독에 대해 MTT 어세이한 결과를 나타낸 것이다.

도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 페오포르바이드 a 2 mg을 이용하여 제조된 지질 나노 미립구에 대해 MTT 어세이한 결과를 나타낸 것이다.

도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따라 페오포르바이드 a 5 mg을 이용하여 제조된 지질 나노 미립구에 대해 MTT 어세이한 결과를 나타낸 것이다.

도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따라 페오포르바이드 a 10 mg을 이용하여 제조된 지질 나노 미립구에 대해 MTT 어세이한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 각각 페오포르바이드 a 2 mg 및는 5 mg을 이용하여 제조된 지질 나노 미립구를 Hela 세포에 적용하고 DAPI 염색한 후 공초점 현미경으로 형광을 관찰한 결과를 페오포르바이드 a를 단독으로 적용한 경우와 비교하여 촬영한 사진이다.

<도면의 부호의 설명>

PPb: 페오포르바이드 a 단독

PF: 페오포르바이드 a

NLC 2: 페오포르바이드 a 2 mg으로 제조된 지질 나노 미립구

NLC 5: 페오포르바이드 a 5 mg으로 제조된 지질 나노 미립구

NLC 10: 페오포르바이드 a 10 mg으로 제조된 지질 나노 미립구

non-internalized: 광감작제가 세포내에 유입되지 않은 상태

internalized: 광감작제가 세포내에 유입된 상태

cell viability : 세포생존율

Claims (14)

1. 소수성 광감작제가 포화 지질 및 불포화 지질과 함께 생체 적합성 계면활성제로 유화되어 형성된, 소수성 광감작제가 함입되어 있는 지질 나노 미립구로서,

   상기 생체 적합성 계면활성제는 생체 적합성 수성 고분자에 소수성 종양 표적물질이 결합된 것인 지질 나노 미립구.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성 광감작제는 근적외선에서 형광을 나타내는 것을 특징으로 지질 나노 미립구.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 소수성 광감작제는 페오포르바이드 a, 파이로페오포르바이드 a, 테트라벤조포르핀, 메조테트라페닐포르핀, 또는 Fe(Ⅲ)메조포르피린Ⅸ클로라이드인 것을 특징으로 지질 나노 미립구.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 포화 지방은 카카오버터, 버터, 쇼트닝, 라아드, 야자유, 코코넛유, 팜핵유, 팜유, 또는 이들의 조합이고, 상기 불포화 지방은 올레산, 올리브유, 동백유, 마카다미아 너트유, 피마자유, 라우린산, 미리스틴산, 팔미틴산, 스테아린산, 이소스테아린산, 아몬드 오일, 아보카도 오일, 달맞이유, 맥아유, 호호바 오일, 옥수수유, 미강유, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 지질 나노 미립구.
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서, 상기 생체 적합성 수성 고분자는 플루란, 덱스트란, 콘드로이친 설페이트, 헤파린, 플루로닉, 히알루론산, 키토산, 또는 푸코이단인 것을 특징으로 하는 지질 나노 미립구.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성 종양 표적물질은 엽산, 항체, 코발라민, 비타민 A, 비타민 C, 또는 비타민 B12인 것을 특징으로 하는 지질 나노 미립구.
8. 생체 적합성 수성 고분자에 소수성 종양 표적물질을 결합시켜 생체 적합성 계면활성제를 제조하는 단계;

   상기 생체 적합성 계면활성제를 물에 녹여 수상을 제조하는 단계;

   광감작제와 함께 포화 지질 및 불포화 지질을 휘발성 유기 용매 중에 용해하여 지질상을 제조하는 단계;

   상기 수상과 상기 지질상을 혼합하여 o/w 어멀젼을 제조하는 단계;

   상기 제조된 에멀젼을 여과하여 함입되지 않은 광감작제나 이물질을 제거하는 단계; 및

   상기 여과된 에멀젼을 상기 고체 지질의 녹는점 이하의 온도로 냉각시켜 에멀젼 입자를 고형화하는 하는 단계를 포함하는,

   제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항, 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 지질 나노 미립구를 제조하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 휘발성 유기 용매는 아세톤, 메틸렌클로라이드,아세토나이트릴, 톨루엔, 에탄올, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 상기 o/w 어멀젼을 제조하는 단계에서 상기 수상에 상기 지질상을 적가하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항, 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 지질 나노 미립구를 포함하는 광역학 치료에 의한 종양 치료제.
12. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항, 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 지질 나노 미립구를 포함하는 광역학 진단에 의한 종양 진단제.
13. 제 11 항에 있어서, 주사제인 것을 특징으로 하는 종양 치료제.
14. 제 12 항에 있어서, 주사제인 것을 특징으로 하는 종양 진단제.

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