JP6585504B2 - ポルフィリン修飾されたテロデンドリマー - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／７３６，０６７号の優先権を主張する、２０１３年３月１４日に出願された米国特許出願第１３／８０３，８７８号の一部継続出願であり、これらの各々はあらゆる目的のためにその全体が本明細書中に組み込まれている。
連邦が支援した研究開発下で行われた発明の権利に関する陳述
本発明は、国立保健研究施設（ＮＩＨ）及び国立癌研究所（ＮＣＩ）により授与された、グラント番号２Ｒ０１ＣＡ１１５４８３−０６、並びにＶＡ Ｃａｒｅｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｗａｒｄ−２の下で米国政府の支援により行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
発明の背景
様々な種類の癌の治療のためのいくつかの有効な化学療法薬は、非常に水に溶けにくく、望ましくない副作用を誘発するような製剤化を必要としている。近年、アブラキサン（登録商標）（パクリタキセル−内包型アルブミンナノ粒子）、ドキシル（登録商標）（ドキソルビシン−内包型リポソーム）などのナノ療法製剤が、これらの薬物の臨床毒性プロファイルは改善するが、それらの抗腫瘍作用は、当初の薬物製剤をわずかに上回るのみであることが示されている。これは一部、ナノ療法製剤の比較的大きいサイズ（一般に＞１００ｎｍ）に起因し、このことは薬物が腫瘍塊に透過することができる程度を制限する。場合によっては、この大きいサイズはまた、ナノ治療薬が肝臓及び細網内皮系（ＲＥＳ）に捕獲されることを引き起こす。従ってインビボにおける抗癌剤の効果的送達のために、より小さい（２０〜８０ｎｍ）ステルス性及び生体適合性のナノ担体を開発することが必要とされている。
本発明者らは最近、パクリタキセル（ＰＴＸ）又は他の疎水性薬物のいくつかの新規ナノ担体を開発した。これらの新規ナノ担体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びオリゴコール酸を含むが、これらは、水性条件下で自己組織化し、ＰＴＸを疎水性内側に運搬することができるコア−シェル（コラン−ＰＥＧ）構造を形成することができる。これらの両親媒性薬物−内包型ナノ粒子は、それら自身が改善された臨床毒性プロファイルを持つことにより治療的である。より重要なことに、癌細胞表面を標的化するリガンド及び／又は腫瘍血管リガンドにより修飾される場合、これらのナノ担体は、毒性のある治療薬を腫瘍部位へ送達することができるであろう。ナノ担体の最終的なサイズ（１０〜１００ｎｍ）は、様々な異なるコラン−ＰＥＧ調製品、又はその組合せを使用することにより、調整可能である。このナノ担体成分であるＰＥＧ及びコール酸は、全て生体適合性であり、且つ大部分は無毒である。実際、ＰＴＸナノ療法は、マウスモデル及びペットのイヌにおける抗癌治療に関して、インビボ投与において安全なプロファイルを示した。しかしこのナノ担体は、インビトロ及びインビボの両方における若干の溶血活性、並びにある種の薬物についての低下した内包能を示した。従って、改善された生体適合性及び多用途性を持つナノ担体を開発する必要性が存在する。
本発明は、構成要素ビルディングブロックの親水性セグメント及び疎水性セグメントへのある種の変化は、ナノ担体の組織体を破壊することなく、その治療的特性を改善し、前述の必要性に対処するという、驚くべき発見を基にしている。
発明の簡単な概要
一部の実施態様において、本発明は、式Ｉの化合物を提供する：
（Ｂ）k−（ＰＥＧ）m−Ａ（Ｙ1）p−Ｌ1−Ｄ−［Ｙ2−Ｌ2−Ｒ］n （Ｉ）
（式中、Ｂは、結合リガンドであることができ；各ＰＥＧは、分子量１〜１００ｋＤａを有する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであることができ；Ａは、少なくとも１個の分岐したモノマー単位Ｘを含み、且つ少なくとも１個のＰＥＧ基に連結されることができ；Ｄは、単独の焦点基、複数の分岐したモノマー単位Ｘ及び複数の末端基を有する樹状分岐高分子であることができ；Ｙ1及びＹ2の各々は、存在しないか、又はボロン酸、ジヒドロキシベンゼン及びチオールでることができる架橋可能な基であることができ；Ｌ1及びＬ2の各々は、独立して、結合又はリンカーあることができ、ここでＬ1は、樹状分岐高分子の焦点基へ連結されることができ；各Ｒは、独立して樹状分岐高分子の末端基、ポルフィリン、疎水基、親水基、両親媒性化合物及び薬物であることができ、ここで少なくとも１個のＲ基は、ポルフィリンであることができ；添字ｋは、０又は１であることができ；添字ｍは、０〜２０の整数であることができ；添字ｎは、２〜２０の整数であることができ、ここで添字ｎは、樹状分岐高分子上の末端基の数と等しいことができ；並びに、添字ｐは、０〜８であることができる。）。
一部の実施態様において、本発明は、内側及び外側を有するナノ担体を提供し、このナノ担体は、複数の本発明のデンドリマーコンジュゲートを含み、ここで各化合物は、水性溶媒中で自己組織化し、ナノ担体を形成、その結果疎水性ポケットが、該ナノ担体の内側に形成され、且つここで各化合物のPEGは、該ナノ担体の外側上に自己組織化する。
一部の実施態様において、本発明は、治療有効量の本発明のナノ担体を、それを必要とする対象へ投与すること、及び該対象を放射線に曝露し、これにより光線力学又は光温熱療法により疾患を治療することを含む、光線力学又は光温熱療法により疾患を治療する方法を提供する。
図１は、本発明のテロデンドリマーの分岐した性質のいくつかの実施態様を示す。 図２は、４時間インキュベーションした後の、非標的化ＮＰ対ＰＬＺ４−ＮＰの、５６３７ヒト膀胱癌細胞への細胞取り込みを示す。（ｂ）Ｋ９ＴＣＣ−Ｐｕ−Ｉｎ細胞は、遊離ＰＬＺ４ペプチドと１時間予めインキュベーションし、引き続き２．２μＭのＰＬＺ４−ＮＰと更に１時間インキュベーションした。遊離ＰＬＺ４非処置細胞を、１００％対照として利用した。細胞は、ホルマリン中に固定し、フローサイトメトリーにより分析した。 図３は、（ａ）ＰＬＺ４−ＮＰ濃度（４時間インキュベーション）、及び（ｂ）時間（２．２μＭのＰＬＺ４−ＮＰ）：の関数としての、Ｋ９ＴＣＣ−Ｐｕ−Ｉｎ膀胱癌細胞による、ＰＬＺ４−ＮＰの細胞取り込みを示している。（ｃ）ヒト膀胱癌細胞株５６３７を、ガラス底ディッシュにおいて、２．２μＭのＰＬＺ４−ＮＰと２０分間インキュベーションした。核染色のためにＤＡＰＩ含有培地を添加した後、高解像度トポグラフィー画像処理システム（Ｄｅｌｔａ ｖｉｓｉｏｎ）を使用し、生存細胞画像を獲得した。矢印は膜分布を示している。（ｄ）５６３７を、２．２μＭのＰＬＺ４−ＮＰにより２時間処理した。洗浄後、次に細胞を、新鮮な完全培地において、更に０、２４、４８、及び７２時間培養した。次に細胞を、トリプシン処理し、１０％ギ酸(formal)中で固定し、その後被験細胞(test and cells)を、フローサイトメトリーにより分析した。 図４は、膀胱癌細胞により特異的に取り込まれたが、正常な尿路上皮細胞により取り込まれない、ＰＬＺ４−ＮＰを示す。（ａ）正常なイヌ尿路上皮細胞（Ｕｒｏ）とプレＤｉＯ標識したヒト膀胱癌細胞株５６３７（ＢＣ）との共培養物を、ＰＬＺ４−ＮＰにより２時間処理した（ポルフィリン(pophryin)：赤色；ＤｉＯ：緑色；Ｈｏｃｈｅｓｔ：青色）（１００×）。 図５は、（ａ）２．２μＭのＰＬＺ４−ＮＰへの２時間曝露、それに続く様々なレベルの光による照射（赤色光、波長６５０ｎｍ）、並びに（ｂ）ＰＬＺ４−ＮＰ又は５−ＡＬＡとの２時間のインキュベーション、それに続く赤色光４．２Ｊ／ｃｍ2への曝露：後の、５６３７膀胱癌細胞の細胞毒性を示している。 図６は、５６３７ヒト膀胱癌細胞のＰＺＬ４−ＮＰ及びＰＤＴ処理後の、ＲＯＳ媒介性細胞死を示している。（ａ）細胞は、２．２μＭのＰＬＺ４−ＮＰを含む又は含まずに２時間処理し、アミノフェニルフルオレセイン（ＡＰＦ；ＲＯＳ指示薬）で３０分間負荷した。その後、細胞を、ＰＤＴにより４．２Ｊ／ｃｍ2で処理し、フローサイトメトリーにより分析した；（ｂ）細胞は、異なる濃度のＰＺＬ４−ＮＰで２時間処理し、引き続きＰＤＴにより処理した。２４時間後、カスパーゼ３／７活性を、ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）キット（Ａｎａｓｐｅｃ社、フリーモント、ＣＡ）により測定した。（ＰＴＸは、アポトーシスの陽性対照としての、パクリタキセル処理である。）。 図７は、５６３７細胞を、９６−ウェル黒色−壁プレートにおいて、２．２μＭのＰＬＺ４−ＮＰと共に２時間インキュベーションし、４０ｎＭ ＤｉＯＣ6（３）（緑色、ΔΨｍhigh）によりインキュベーション終了時から２０分間染色し、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を評価し、引き続きＰＤＴ効果を誘起するために、各ウェルの一部を照射することを示している。２４時間後、細胞死に関して、細胞をヨウ化プロピジウムにより染色した。 図８は、ＰＤＴ後の細胞形態を示している。５６３７細胞を、８−ウェルチャンバースライド上で培養し、無処理、光のみ（４．２Ｊ／ｃｍ2）、ＰＬＺ４−ＮＰのみ、若しくはＰＬＺ４−ＮＰと光（ＰＤＴ）の組合せにより２時間処理処理するか、又はＴ−ＰＮで２時間と後続のＰＤＴにより処理した。その後細胞を固定し、Ｈｅｍａ３（登録商標）により染色した。 図９は、ヌードマウスへの膀胱内投与後の同所性ヒト膀胱癌異種移植片モデルへのＰＬＺ４−ＮＰの選択的取り込みを示す。（ａ）ヒト患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）ＢＬ２６９ｆを、ＮＳＧマウスにおいて樹立した。ＢＬ２６９ｆのマウス同所性モデルは、ＢＬ２６９ｆ細胞浮遊液を膀胱壁へ直接注射することにより作製した。４週間後、固形癌の成長が、減少した膀胱内腔容積と共に、認められた。本発明者らは、ＰＬＺ４−ＮＰ ３０μｌを、膀胱へ２時間、全身麻酔下で注射した。膀胱を、ＰＢＳで洗浄し、インビボ造影のために、体外へ分離した。その後、マウスを直ちに屠殺し、主要臓器を、エクスビボ造影のために、切除した。同様の実験を、膀胱腫瘍を移植しない正常ＮＳＧマウスについて行った。（ｂ）ＢＬ２６９ｆ異種移植片を伴う又は伴わない膀胱を、Ｏ．Ｃ．Ｔ中に固定し、厚さ１０ミクロンの凍結切片を得た。核をＤＡＰＩにより対比染色し（青色）、且つ細胞内ＰＬＺ４−ＮＰは蛍光赤色であった。蛍光造影試験の後、組織を、Ｈｅｍａ３（登録商標）により再度染色した（黄色矢印：曝露された膀胱癌組織、赤色矢印：無傷の正常尿路上皮細胞）（４０×）。 図１０は、非架橋のＰＬＺ４−ＮＰの静脈内（ｉｖ）投与後２４時間での、腫瘍／膀胱及び臓器のエクスビボ近赤外−赤色造影を示す。 図１１は、ドキソルビシンのＰＬＺ４−ＮＰ媒介したＰＤＴとの組合せの細胞毒性作用を示す。（ａ）５６３７細胞を、ＰＬＺ４−ＮＰ、ＰＬＺ４−ＮＰ−Ｄｏｘ又はＰＬＺ４−ＮＭ−Ｄｏｘにより、ドキソルビシン濃度１μｇ／ｍｌ及び／又は２．２μＭポルフィリンで、２時間処理した。洗浄後、細胞を、光曝露しないか又は２．１及び４．２Ｊ／ｃｍ2で光曝露した。細胞生存度を、４８時間後に測定した。＊ ｐ＜０．０５。（ｂ）５６３７細胞を、ＰＬＺ４−ＮＰ、ＰＬＺ４−ＮＰ−Ｄｏｘ、遊離Ｄｏｘ、ドキシル、ＰＬＺ４−ＮＭ−Ｄｏｘ、及びＰＬＺ４−ＮＰとＰＬＺ４−ＮＭ−Ｄｏｘの組合せにより、５分間及び２時間処理した。細胞内ドキソルビシン濃度を、フローサイトメトリーにより評価した。この結果は、３つの異なる独立した実験から、平均±ＳＤで表す。＊ ｐ＜０．０５；＊＊ ｐ＜０．０１。（ｃ）５６３７細胞を、ＰＬＺ４−ＮＰ（ＰＮＰ）、ＰＬＺ４−ＮＭ−ＤＯＸ（ＰＮ−ＤＯＸ）、ＰＮＰとＰＮ−ＤＯＸの組合せ、及びＰＬＺ４−ＮＰ−ＤＯＸ（ＰＮＰ−ＤＯＸ）により、２時間処理した。ポルフィリン（赤色）及びドキソルビシン（緑色）が、蛍光顕微鏡により検出された（１００×）。（ｄ）ＰＬＺ４−ＮＰ−ＤＯＸ（ＰＮＰ−ＤＯＸ）の細胞内分布を、共焦点顕微鏡により（６００×、油浸）、５分、１時間及び３時間で検出した。細胞を洗浄し、固定しなかった。ＰＮＰ（ポルフィリン：赤色）、ドキソルビシン（緑色）。 図１２は、以下を含む、本発明の様々な態様を示す：（ａ）線状ＰＥＧ鎖の末端に結合された４個のピロフェオホルビド−ａ分子及び４個のコール酸を有する、多官能性、自己組織化されたポルフィリン−テロデンドリマー、ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4の概略図；（ｂ）癌治療のためのスマート「エイト−イン−ワン」ナノ医薬品のプラットフォームとしてのナノポルフィリンの概略図；（ｃ）ナノポルフィリンのＴＥＭ画像（リンタングステン酸（ＰＴＡ）により染色）；（ｄ）空のナノポルフィリン及び異なる金属イオンのキレート後のナノポルフィリンの、吸光スペクトル；ＴＥＭ（ＰＴＡにより染色）により可視化した、Ｃｕ（ＩＩ）（ｅ）及びＧｄ（ＩＩＩ）（ｆ）が内包されたナノポルフィリン；（ｇ）ＰＢＳ及びＳＤＳの存在下、励起光４０５ｎｍでの、ナノポルフィリンの蛍光発光スペクトル；（ｈ）励起帯域通過フィルター６２５／２０ｎｍ及び発光フィルター７００／３５ｎｍによる、ＳＤＳ非存在下及び存在下での、ナノポルフィリン溶液（１０μｌ）の近赤外赤色光造影；（ｉ）ＲＯＳ指示薬として２’，７’−ジクロロフルオレセイン二酢酸塩（ＤＣＦ）を使用する、ＰＢＳ及びＳＤＳ中での、ナノポルフィリン（０．１２５ｍｇ／ｍＬ）の一重項酸素生成；以下を含む、ナノポルフィリンの濃度−依存型光熱変換、（ｊ）熱画像、及び（ｋ）定量的温度変化曲線（ｎ＝２）、ここでＳＤＳ非存在下及び存在下での、ナノポルフィリン溶液（１０μｌ）の温度は、ＮＩＲレーザー（６９０ｎｍ）の１．２５ｗ／ｃｍ2での２０秒間照射後、サーマルカメラによりモニタリングした；並びに、（ｌ）ナノポルフィリン溶液（４．０ｍｇ／ｍＬ）の、ＮＩＲレーザー１．２５ｗ／ｃｍ2により、１２０秒間の照射により達成された高温での、ナノポルフィリン溶液の代表的熱画像。 図１３は、ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4テロデンドリマーの化学構造を示す。 図１４は、ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4テロデンドリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。 図１５は、ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4テロデンドリマーの、各々、ＤＭＳＯ−ｄ６（ａ）及びＤ2Ｏ（ｂ）において記録された、lＨ ＮＭＲスペクトルを示す。ＰＥＧ鎖（３．５〜３．７ｐｐｍ）、コール酸（０．５〜２．４ｐｐｍ）及びピロフェオホルビド−ａ（０．９〜２．２ｐｐｍ）の化学シフトは、ＤＭＳＯ−ｄ６（ａ）中のテロデンドリマーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて認めることができた。コール酸中のメチルプロトン１８、１９及び２１の特徴的ピークが、各々、０．５８、０．８０及び０．９５ｐｐｍに認められた。ピロフェオホルビド−ａ中のメチルプロトン８及び１８の特徴的ピークが、各々、１．８及び１．９ｐｐｍに認められた。ＮＭＲスペクトルがＤ2Ｏ中で記録された場合、ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4中のコール酸プロトン及びピロフェオホルビド−ａのプロトンのピークは、高度に抑制され（ｂ）、このことは、コラン及びピロフェオホルビド−ａのプロトンの移動は、水性環境におけるコア−シェルミセルアーキテクチャーの形成により、高度に制限されたことを指摘している。 図１６は、以下を示す：（ａ）スペーサーとしてＥｂｅｓを持つ、線状ＰＥＧ鎖の末端に結合した４個のシステイン、４個のピロフェオホルビド−ａ分子及び４個のコール酸を有する、代表的架橋可能なポルフィリン−テロデンドリマー（ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｐｏｒ4−ＣＡ4）の概略図；（ｂ）ジスルフィド架橋したナノポルフィリンのＴＥＭ画像（ＰＴＡにより染色）；（ｃ）非架橋のナノポルフィリンと比較した、ＰＢＳ及びＳＤＳの存在下の、架橋したナノポルフィリンの蛍光発光スペクトル、ここではグルタチオン（ＧＳＨ）を、ジスルフィド架橋を破壊するための還元剤として使用した（励起光４０５ｎｍ）；（ｄ）最初の内包で添加された薬物のレベルに対する、ジスルフィド架橋したＮＰｓのドキソルビシン内包及びサイズの変化、ここでは最終ＮＰ溶液の容積は１ｍＬに維持し、且つテロデンドリマーの最終濃度は２０ｍｇ／ｍＬであった；（ｅ）ヒト血漿中でのナノポルフィリンからのドキソルビシンのリアルタイム放出試験のための、ＦＲＥＴ−ベースのアプローチの概略図；２４時間及び２８時間での照射（１．２５ｗ／ｃｍ2で５分間）による、ヒト血漿中のドキソルビシン−内包型架橋されたナノポルフィリン（ＣＮＰ−ＤＯＸ）の、ＦＲＥＴシグナル（ｆ）、及びＦＲＥＴ比の変化（ｇ）；並びに、（ｈ）２４時間で、ＧＳＨ（１０ｍＭ）処理されたヒト血漿中のＮＰ−ＤＯＸのＦＲＥＴ比の変化。 図１７は、ＮＩＲレーザー（６９０ｎｍ）の０．１ｗ／ｃｍ2で１２０秒間照射後、サーマルカメラによりモニタリングした、ＳＤＳの非存在下及び存在下での、ＮＰｓ（１０μｌ）の熱画像を示す。ピロフェオホルビド−ａの濃度は、ＮＭ−ＰＯＲについて０．２ｍｇ／ｍＬで維持され、これはＮＰｓの１．０ｍｇ／ｍＬ中でのピロフェオホルビド−ａの濃度と等しかった。 図１８は、ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｐｏｒ4−ＣＡ4テロデンドリマーの化学構造を示す。 図１９は、染色しない、Ｃｕ（ＩＩ）内包型ナノポルフィリンのＴＥＭ画像を示す。 図２０は、ＳＤＳ ２．５ｇ／Ｌの非存在下（ａ）及び存在下（ｂ）での、ＮＰｓの粒子サイズを示す。粒子サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した。ＮＰｓは、ＳＤＳの添加時に完全に破壊された。 図２１は、ＳＤＳの非存在下及び存在下での、ナノポルフィリン溶液の液滴の明視野画像を示す。 図２２は、ＳＤＳ ２．５ｇ／Ｌの非存在下（ａ）及び存在下（ｂ）での、遊離ピロフェオホルビド−ａ内包された標準ＰＥＧ5k−ＣＡ8ミセル（ＮＭ−ＰＯＲ）の粒子サイズを示す。粒子サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した。ＮＭ−ＰＯＲは、ＳＤＳの添加時に完全に破壊された。 図２３は、ナノポルフィリン溶液（下側パネル）と比較した、励起帯域通過フィルター６２５／２０ｎｍ及び発光フィルター７００／３５ｎｍによる、ＳＤＳ非存在下及び存在下での、遊離ピロフェオホルビド−ａ内包された標準ＰＥＧ5k−ＣＡ8ミセル（ＮＭ−ＰＯＲ）７溶液（１０μＬ）（上側パネル）の、近赤外蛍光造影を示す。ピロフェオホルビド−ａの濃度は、ＮＭ−ＰＯＲについて０．２ｍｇ／ｍＬで維持され、これはＮＰｓの１．０ｍｇ／ｍＬ中でのピロフェオホルビド−ａの濃度と等しかった。ＳＤＳ中の平均蛍光強度のＰＢＳ中の強度との比を計算することにより、ＮＰｓは、同じ濃度のＰｏｒを伴うＮＭ−ＰＯＲよりも、１０倍多く自己消光することがわかった。 図２４は、ＮＩＲレーザー（６９０ｎｍ）の１．２５ｗ／ｃｍ2で２０秒間照射後、サーマルカメラによりモニタリングした、ＳＤＳの非存在下及び存在下での、ＮＭ−ＰＯＲ溶液（１０μｌ）の熱画像を示す。ピロフェオホルビド−ａの濃度は、ＮＭ−ＰＯＲについて０．２ｍｇ／ｍＬで維持され、これはＮＰｓの１．０ｍｇ／ｍＬ中でのピロフェオホルビド−ａの濃度と等しかった。 図２５は、（ａ）ドキソルビシン（２．５ｍｇ／ｍＬ）、（ｂ）パクリタキセル（１．０ｍｇ／ｍＬ）、（ｃ）ビンクリスチン（１．５ｍｇ／ｍＬ）、（ｄ）ボルテゾミブ（２．０ｍｇ／ｍＬ）、（ｅ）ソラフェニブ（２．０ｍｇ／ｍＬ）、及び（ｆ）１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）の内包後の、非架橋ナノポルフィリン（２０ｍｇ／ｍＬ）の粒子サイズを示す。粒子サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した。 図２６は、ヒト血漿の５０％（ｖ／ｖ）で存在する、ＤＯＸ−内包型架橋されたＮＰｓ（ＮＰ−ＤＯＸ）の連続粒子サイズ測定を示す。 図２７は、ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｌ8−ＣＡ8テロデンドリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。 図２８は、ＳＤＳ非存在下（ａ）、並びに、２．５ｇ／Ｌ ＳＤＳの存在下（ｂ）、２．５ｇ／Ｌ ＳＤＳ＋２０ｍＭ ＮＡＣの存在下（ｃ）、２．５ｇ／Ｌ ＳＤＳ＋２０ｍＭ ＧＳＨの存在下（ｄ）での、ジスルフィド架橋したＮＰｓの粒子サイズを示す。粒子サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した。ＳＤＳ添加時に、非架橋ＮＰｓは、完全に破壊された。対照的に、架橋されたＮＰｓのサイズは、同じ条件下で、２０〜３０ｎｍで持続された。形成されたジスルフィド架橋されたＮＰｓは、ＳＤＳ存在下では、内在性還元剤グルタチオン（ＧＳＨ、２０ｍＭ）及び外来性還元剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ、２０ｍＭ）の添加後およそ４０分で解離した。 図２９は、ＮＰｓ、Ｐｏｒ負荷されたＰＥＧ5k−ＣＡ8ミセル（ＮＭ−ＰＯＲ）及び遊離ピロフェオホルビド−ａ（Ｐｏｒ）に２時間曝露し、引き続き暗条件下で更に２２時間のインキュベーションした後の、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞における細胞毒性を示す。 図３０は、（ａ）４．４μＭ ＮＰｓへの２時間曝露、それに続く様々なレベルのＮＩＲ光の照射、並びに（ｂ）ＮＰｓ又は５−ＡＬＡとの２４時間のインキュベーション、それに続くＮＩＲ光への０．０７Ｗ／ｃｍ2での６０秒間の曝露：後の、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞における細胞毒性を示す。（ｃ）は、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞のＮＰｓ及び光処理後の、ＲＯＳ媒介した細胞死を示す。細胞は、２．２μＭ ＮＰｓ含有又は非含有で２４時間処理し、ＤＣＦを３０分間負荷した。ＮＩＲ光への０．０７Ｗ／ｃｍ2での６０秒間の曝露による処理後、画像を、蛍光顕微鏡により獲得し、ＲＯＳ生成を検出した。（ｄ）は、９６−ウェル黒色−壁プレートにおいて、２．２μＭのＮＰｓにより２４時間処理し、４０ｎＭ ＤｉＯＣ6（３）（緑色、ΔΨｍhigh）によりインキュベーション終了時から２０分間染色し、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を評価し、引き続きＰＤＴ効果を誘起するために、各ウェルの一部を照射した、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を示す。照射領域は、「Ｌ」により印をつけた。２４時間後、細胞死に関して、細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により染色した。（ｅ）は、様々な濃度のＮＰｓで２４時間処理し、引き続きＰＤＴにより処理した細胞における、カスパーゼ３／７活性を示している。２４時間後、カスパーゼ３／７活性は、ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）キット（Ａｎａｓｐｅｃ社、フリーモント、ＣＡ）により測定した。（ｆ）は、ＰＤＴ後の細胞形態を示している。ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞は、８−ウェルチャンバースライド上で培養し、ＰＢＳ、ＮＰｓ単独、及びＮＰｓと光（０．０７Ｗ／ｃｍ2で６０秒間）の組合せにより、２４時間処理した。その後細胞を固定し、２時間後Ｈｅｍａ３（登録商標）により染色した。ＮＰｓ＋光により処理した細胞は、明らかな核の膨潤、丸みを帯びた細胞、膜の損傷、及び細胞質凝集を示した。（ｇ）は、ドキソルビシンのＮＰ−媒介型光線療法との組合せの、細胞毒性作用を示している。ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞は、ＮＰｓ単独、ドキソルビシン内包型ナノポルフィリン（ＮＰ−ＤＯＸ）又はドキソルビシン内包型標準ミセル（ＮＭ−ＤＯＸ）により、様々な濃度のＤＯＸ及び／又はＮＰｓで２４時間処理した。洗浄後、細胞を光に曝露し、２４時間後に細胞生存度を測定した。＊ ｐ＜０．０５。（ｈ）は、ＮＰ単独及び遊離薬物１７ＡＡＧと比較した、ＮＰ−ＡＡＧのＰＣ３前立腺癌細胞に対する成長阻害作用を示す。ＮＰ濃度は、ＮＰ−ＡＡＧ群及びＮＰ群について同じに維持した。これらの薬物を取り除き、新鮮培地と置き換え、その後細胞を、ＮＩＲ光に２分間曝露した。成長阻害は、７２時間後、ＭＴＴアッセイを使用し測定した。左側カラム、光なし；ボックス付き右側カラム、光あり。ｎ＝３。（ｉ）は、２４時間後、アネキシンＶ及びＰＩ染色を用いて分析されたアポトーシスを示す（ｎ＝３）。（ｊ）は、１２時間後の、対応する抗体によるウェスタンブロッティングを使用する、ＨＩＦ１α、サバイビン、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３及びＳｒｃのレベルの分析を示す。 図３１は、ＮＰ単独及び遊離薬物１７ＡＡＧと比較した、ＮＰ−ＡＡＧのＬＮＣＡＰ前立腺癌細胞及びＲＰＷＥ１正常前立腺細胞に対する成長阻害作用を示す。ＮＰ濃度は、ＮＰ−ＡＡＧ群及びＮＰ群について同じに維持した。これらの薬物を取り除き、新鮮培地と置き換え、その後細胞を、ＮＩＲ光に２分間曝露した。成長阻害は、７２時間後、ＭＴＴアッセイを使用し測定した。左側カラム、光なし；ボックス付き右側カラム、光あり。ｎ＝３。 図３２（ａ）は、１０×ＤＭＳＯ中、架橋されたＮＰｓ及びＮＭ−ＰＯＲ（両方共０．５ｍｇ／ｍＬのＰｏｒを含む）の吸光度を示す。図３２（ｂ）は、ＮＩＲ蛍光シグナルを示し、図３２（ｃ）は、架橋されたＮＰｓ及びＮＭ−ＰＯＲ（Ｐｏｒ投与量：５ｍｇ／ｋｇ）の注射の５分後の、移植された腫瘍異種移植片を保有するヌードマウスから採取した血液液滴の定量的蛍光を示す。画像は、関心対象の領域（ＲＯＩ）の平均シグナルとして分析した。＊＊＊ ｐ＜０．００１。 図３３は、光曝露後、ジスルフィド架橋されたＮＰｓ及びＮＭ−ＰＯＲ（Ｐｏｒ投与量：５ｍｇ／ｋｇ）の注射後の５分の、移植された腫瘍異種移植片を保有するヌードマウスから採取した血液液滴のＲＯＳ生成を示す。光線量：０．１Ｗで６０秒及び３００秒。ＲＯＳ指示薬として２’，７’ジクロロフルオレシンジアセタート（ＤＣＦ）を使用した。＊＊ ｐ＜０．００２、＊＊＊ ｐ＜０．００１。 図３４は、移植された腫瘍異種移植片を保有するヌードマウスからのエクスビボにおける溶血活性を示す。１分間架橋されたＮＰ（ａ、ｂ）及びＮＭ−ＰＯＲ（ｃ、ｄ）注射したマウスから採取された血液２μｌを、ＰＢＳの１００μＬに希釈し、その後０、６０、及び３００秒で、光曝露した（Ｐｏｒ投与量：５ｍｇ／ｋｇ）。光線量：０．１Ｗ／ｃｍ2で光曝露した４時間後、血液細胞を、回転沈降させ、ＮＭ−ＰＯＲ処理マウスからの試料中に溶血を認めた（ａ、ｃ）。細胞形態評価のために、３００秒試料からのＣｙｔｏｓｐｉｎ試料を更に作製した（ｂ、ｄ）（Ｈｅｍａ３（登録商標）染色、１００×油浸）。光曝露後、架橋されたＮＰ試料中に認められる正常血液細胞形態（ｂ）とは対照的に、ＮＭ−ＰＯＲ試料（ｄ）において、ＲＢＣ及びＷＢＣの両方はひどく破壊され、これは恐らく血液細胞に対するＲＯＳが関連した酸化的損傷に起因するであろう。 図３５は、光曝露後、ジスルフィド架橋されたＮＰｓ及びＮＭ−ＰＯＲ（Ｐｏｒ投与量：５ｍｇ／ｋｇ）の注射後５分の、移植された腫瘍異種移植片を保有するヌードマウスから採取した血液液滴の温度を示す。光線量：０．１Ｗで３００秒。温度は、サーマルカメラによりモニタリングした。 図３６は、光曝露後、ＰＢＳ及びジスルフィド架橋されたＮＰｓ又はＮＭ−ＰＯＲ（Ｐｏｒ投与量：５ｍｇ／ｋｇ）の注射後２４時間の、移植された腫瘍異種移植片を保有するヌードマウスの腫瘍でのＲＯＳ生成を示す（ｎ＝５）。光線量：１．２５Ｗ／ｃｍ２で１２０秒。ＲＯＳ指示薬として２’，７’−ジクロロフルオレシンジアセタート（ＤＣＦ）を使用し、測定した。＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１。 図３７は、光曝露後、ＰＢＳ、ジスルフィド架橋されたＮＰｓ及びＮＭ−ＰＯＲ（Ｐｏｒ投与量：５ｍｇ／ｋｇ）の注射後２４時間の、移植された腫瘍異種移植片を保有するヌードマウスの腫瘍での温度変化（ΔＴ）を示す（ｎ＝５）。光線量：１．２５Ｗ／ｃｍ2で１２０秒。温度は、サーマルカメラによりモニタリングした。＊＊＊ ｐ＜０．００１。 図３８（ａ）は、非架橋ＮＰｓ及びジスルフィド架橋されたＮＰｓ（ＮＰ投与量：２５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射後の、ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片の代表的インビボＮＩＲＦ造影を示す。白色矢印は、腫瘍部位を指している。（ｂ）は、非架橋ＮＰｓ（左側）及びジスルフィド架橋されたＮＰｓ（右側）の注射後２４時間の、ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片の代表的エクスビボＮＩＲＦ造影を示す。（ｃ）は、非架橋ＮＰｓ及びジスルフィド架橋されたＮＰｓの注射後２４時間の、腫瘍ＳＫＯＶ−３における定量的ＮＩＲＦ蛍光を示し（ｎ＝４；ＮＰ投与量：２５ｍｇ／ｋｇ）、ここで画像は、腫瘍中の関心対象の領域（ＲＯＩ）の平均シグナルとして分析し、筋肉に対し規準化した（＊＊＊ ｐ＜０．００１）。（ｄ）は、大規模−画像処理（ＬＳＩ）レーザー走査型共焦点顕微鏡により観察された、注射後１、２４、４８時間の、ＳＫＯＶ−３腫瘍中のジスルフィド架橋されたＮＰｓの分布の投影像であり、ＮＰｓは赤色で撮像し、デキストラン−ＦＩＴＣ標識された腫瘍血管は緑色で撮像した（バー＝１００μｍ）。（ｅ）は、ジスルフィド架橋されたＮＰｓの注射（ＮＰ投与量：２５ｍｇ／ｋｇ）後２４時間での、乳癌を伴うトランスジェニックマウス（ＦＶＢ／ｎ Ｔｇ（ＭＭＴＶ−ＰｙＶｍＴ））の代表的インビボ及びエクスビボＮＩＲＦ光造影を示す。（ｆ）は、ＬＳＩレーザー走査型共焦点顕微鏡により観察した、注射後２４時間の、トランスジェニックマウスにおける乳癌の肺転移でのＮＰｓの蓄積を示す。 図３９は、ＳＤＳ及びＧＳＨ（１０ｍＭ）の非存在下及び存在下での、ジスルフィド架橋されたＮＰｓ（Ｐｏｒ投与量：５ｍｇ／ｋｇ）の注射後５分での、異種移植片腫瘍モデルから採取した血液液滴の代表的ＮＩＲ蛍光シグナルを示す。 図４０は、トランスジェニックマウス（ＦＶＢ／ｎ Ｔｇ（ＭＭＴＶ−ＰｙＶｍＴ））由来の乳癌の肺における転移病巣（矢印）を確認する、組織病理学的画像処理を示す（Ｈ＆Ｅ染色、４×及び挿入図４０×）。 図４１（ａ）は、ＦＬＡＳＨ配列を使用するＢｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ ７Ｔ ＭＲＩスキャナー上での、Ｔ１−重み付きＭＲ造影により得られた、ＳＤＳ非存在下及び存在下での、Ｇｄ−ＮＰｓのインビトロＭＲＩシグナルを示す。（ｂ）は、０．１５ｍＬ Ｇｄ−ＮＰｓ（Ｇｄ投与量：０．０１５ｍｍｏｌｅ／ｋｇ）の注射前及び後の、ＦＬＡＳＨ配列を使用する、乳癌を伴うトランスジェニックマウス（ＦＶＢ／ｎ Ｔｇ（ＭＭＴＶ−ＰｙＶｍＴ））の、代表的冠状断面(coronal)及び軸面のＭＲ画像を示す。白色矢印は、腫瘍部位を示している。（ｃ）は、64Ｃｕ−標識されたＮＰｓ（１５０〜２００μＬ、64Ｃｕ投与量：０．６〜０．８ｍＣｉ）の注射後４、８、１６、２４、４８時間での、ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片を保有するヌードマウスのＰＥＴ画像を示し、ここで白色矢印は、腫瘍部位を示す。（ｄ）は、64Ｃｕ及びＧｄ二重標識されたＮＰｓ（１５０〜２００μＬ、64Ｃｕ投与量：０．６〜０．８ｍＣｉ、Ｇｄ投与量：０．０１５ｍｍｏｌｅ／ｋｇ）０．１５ｍＬの注射後４又は２４時間での、ＦＬＡＳＨ配列を使用する、Ａ５４９肺癌異種移植片を保有するヌードマウスの３Ｄ冠状断面ＭＲ画像を示し、ここで白色矢印は、腫瘍部位を示す。（ｅ）は、二重標識されたＮＰｓの注射後４又は２４時間での、Ａ５４９肺癌異種移植片を保有するヌードマウスの腫瘍切片のＰＥＴ−ＭＲ画像を示し、ここで白色矢印は、腫瘍中心における壊死領域を示す。 図４２は、遠心濾過後の、64Ｃｕ−ナノポルフィリン（左側パネル）及びＧｄ−64Ｃｕ−ナノポルフィリン（右側パネル）の、インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）トレースを示す。放射性化学物質の収量（ＲＹＣ）は、９６．５％以上であったのに対し、放射性化学物質の純度は９７％以上であった。ＩＴＬＣ法：Ｂｉｏｄｅｘストリップは、９０ｍＭ ＥＤＴＡ／０．９％ＮａＣｌ（水性）中で呈色し、Ｂｉｏｓｃａｎプレートリーダー上で撮像した。 図４３（ａ）は、架橋されたＮＰｓの注射後２４時間での、光照射後の、乳癌を伴うトランスジェニックマウス（ＦＶＢ／ｎ Ｔｇ（ＭＭＴＶ−ＰｙＶｍＴ）の腫瘍における、代表的熱画像を示す。（ｂ）は、ＰＢＳを注射したマウスの画像を示す。（ｃ）は、照射後、架橋されたＮＰｓ及びＰＢＳが注射されたトランスジェニックマウスの腫瘍における温度変化を示す。（ｄ）はレーザー照射後２４時間での、架橋されたＮＰｓ及びＰＢＳ（対照）で処理された、トランスジェニックマウスの腫瘍部位での、ＲＯＳ生成を示す。ｐ＜０．０２５。（ｅ）は、照射後２４時間での、ＰＢＳ又はＮＰｓ注射されたマウスからの腫瘍の組織病理を示す。図４３ａ−ｅに関して、光線量は、１．２５Ｗ／ｃｍ2で２分間であり、他方ＮＰｓ投与量は、２５ｍｇ／ｋｇ（ポルフィリン５ｍｇ／ｋｇと等量）であった。（ｆ）は、０、７、及び１４日目に（黒色矢印）架橋されたＮＰｓ、ＣＮＰ−ＤＯＸ及びＮＭ−ＤＯＸ（ポルフィリンを伴わない標準ミセル）で処理され、引き続き注射後２４時間（赤色矢印）に全ての群においてマウスの腫瘍上に光曝露された、乳癌のトランスジェニックマウス（ｎ＝８）の腫瘍容積の変化を示す。ｐ＜０．０１。ＤＯＸ投与量：２．５ｍｇ／ｋｇ、ＮＰ投与量：２５ｍｇ／ｋｇ（ポルフィリン５ｍｇ／ｋｇと等量）、光線量：１．２５Ｗ／ｃｍ2で２分間。（ｇ）は、処理３４日目のトランスジェニックマウスの写真を示す（＊：乳腺腫瘍）。（ｈ）は、０、４及び８日目に（黒色矢印）架橋されたＮＰｓ及びＣＮＰ−ＤＯＸで処理され、引き続き１及び９日目に照射された（赤色矢印）、ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片を保有するマウス（ｎ＝８）の腫瘍容積の変化を示す。ＰＢＳ及びＮＭ−ＤＯＸは、比較のために注射した。ＤＯＸ投与量：２．５ｍｇ／ｋｇ、ＮＰ投与量：２５ｍｇ／ｋｇ（ポルフィリン５ｍｇ／ｋｇと等量）、光線量：０．２５Ｗ／ｃｍ2で２分間。ｐ＜０．０１。（ｉ）は、ＭＲＩ−ガイド付きＰＴＴ／ＰＤＴを示す。レーザー照射前及び後に、Ｇｄ−ＮＰｓ（Ｇｄ投与量：０．０１５ｍｍｏｌｅ／ｋｇ）注射したマウスの代表的ＭＲ画像。白色矢印は、腫瘍部位を示している。画像は、注射後０（注射前）、４、２４、４８、７２、９６及び１６８時間に収集した。ＭＲ造影は、線量１．２５Ｗ／ｃｍ2で３分間の照射後２４時間で（注射後４８時間）、腫瘍部位に大きいシグナル空隙（青色矢印）を示し、且つこれらの腫瘍は、注射後１６８時間（７日目）には完全にアブレーションされた。 図４４は、ＮＰ−媒介したＰＤＴ後の、乳房腫瘍組織におけるカスパーゼ３反応性及びＤＮＡ損傷を示している。トランスジェニックマウスは、ＰＢＳ（対照）又はＮＰｓにより処理し、引き続き注射後２４時間で、光処理した。ＤＯＸ投与量：２．５ｍｇ／ｋｇ、ＮＰ投与量：２５ｍｇ／ｋｇ（ポルフィリン５ｍｇ／ｋｇと等量）、光線量：１．２５Ｗ／ｃｍ2で２分間。腫瘍を、更に２４時間後に摘出し、且つホルマリン中に固定した。組織スライド（厚さ４ミクロン）を使用し、切断されたカスパーゼ３に関するＩＨＣを行った。ＤＮＡ損傷は、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−媒介型ｄＵＴＰニック端標識）検出キット（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）を製造業者のマニュアルに従い用い、検出した。切断されたカスパーゼ３（細胞シグナル伝達）の抗体反応性は、免疫化学により検出した。 図４５は、ナノポルフィリン（ＮＰｓ）及びドキソルビシン内包されたナノポルフィリン（ＮＰ−ＤＯＸ）により、０、４及び８日目に処理され（矢印の軸マーカー）、引き続き１日目、９日目にレーザー光（６９０ｎｍ）曝露された（三角の軸マーカー）、ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片を保有するマウスの体重変化を示している（ｎ＝８）。ＰＢＳ及びドキソルビシン内包された標準ミセル（ＮＭ−ＤＯＸ）を、比較のために注射した。ＤＯＸ投与量：２．５ｍｇ／ｋｇ、ＮＰ投与量：２５ｍｇ／ｋｇ（ポルフィリン５ｍｇ／ｋｇと等量）、光線量：０．２５Ｗ／ｃｍ2で２分間。
発明の詳細な説明
I. 定義
本明細書において使用される用語「デンドリマー」及び「樹状分岐高分子」とは、焦点、複数の分岐したモノマー単位、及び複数の末端基を含む、分岐したポリマーをいう。モノマーは、一緒に連結され、焦点から伸び、且つ末端基で終着する腕（又は「デンドロン」）を形成する。デンドリマーの焦点は、本発明の化合物の他のセグメントへ結合されることができ、並びにこれらの末端基は、追加の化学部分により更に官能基化されてよい。
本明細書において使用される用語「テロデンドリマー」とは、親水性ＰＥＧセグメント及びデンドリマーの１個又は複数の末端基に共有結合された１つ又は複数の化学部分を含むデンドリマーをいう。これらの部分は、疎水基、親水基、両親媒性化合物、及び薬物を含むことができるが、これらに限定されるものではない。様々な部分は、オルソゴナル保護基戦略を使用し、所望の末端基で、選択的に挿入されてよい。
本明細書において使用される用語「ナノ担体」とは、本発明のデンドリマーコンジュゲートの凝集から生じるミセルをいう。このナノ担体は、疎水性コア及び親水性外側を有する。
本明細書において使用される用語「モノマー」及び「モノマー単位」とは、ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸及びヒドロキシルアミノカルボン酸をいう。本発明のジアミノカルボン酸基の例は、２，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノブタン酸、２，５−ジアミノペンタン酸（オルニチン）、２，６−ジアミノヘキサン酸（リジン）、（２−アミノエチル）−システイン、３−アミノ−２−アミノメチルプロパン酸、３−アミノ−２−アミノメチル−２−メチルプロパン酸、４−アミノ−２−（２−アミノエチル）酪酸及び５−アミノ−２−（３−アミノプロピル）ペンタン酸を含むが、これらに限定されるものではない。本発明のジヒドロキシカルボン酸基の例は、グリセリン酸、２，４−ジヒドロキシ酪酸、グリセリン酸、２，４−ジヒドロキシ酪酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸及び２，２−ビス（ヒドロキシメチル）酪酸を含むが、これらに限定されるものではない。ヒドロキシルアミノカルボン酸の例は、セリン及びホモセリンを含むが、これらに限定されるものではない。当業者は、他のモノマー単位が、本発明において有用であることを理解するであろう。
本明細書において使用される用語「アミノ酸」とは、アミン官能基を保有するカルボン酸をいう。アミノ酸は、先に記載されたジアミノカルボン酸を含む。アミノ酸は、天然のα−アミノ酸を含み、ここでアミンは、カルボン酸のカルボニル炭素に隣接する炭素に結合される。天然のα−アミノ酸の例は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジン、及びＬ−アルギニンを含むが、これらに限定されるものではない。アミノ酸はまた、天然のα−アミノ酸のＤ−エナンチオマー、並びにβ−アミノ酸及び他の非天然のアミノ酸も含んでよい。
本明細書において使用される用語「リンカー」とは、デンドリマーコンジュゲートの１つのセグメントを別のものへ連結する化学部分をいう。リンカーのデンドリマーのセグメントへの連結に使用される結合の種類は、アミド、アミン、エステル、カルバメート、尿素、チオエーテル、チオカルバメート、チオカーボネート及びチオ尿素を含むが、これらに限定されるものではない。当業者は、他の型の結合も、本発明において有用であることを理解するであろう。
本明細書に使用される用語「オリゴマー」とは、先に説明されたように、一緒に共有的に連結された５個又はそれ以下のモノマーをいう。モノマーは、線状又は分岐した様式で一緒に連結されてよい。オリゴマーは、テロデンドリマーの分岐したセグメントの焦点として、機能することができる。
本明細書に使用される用語「疎水基」とは、水不溶性であるか又は水により撥水される化学部分をいう。疎水基の例は、長鎖アルカン及び脂肪酸、フルオロカーボン、シリコーン、コレステロールなどのある種のステロイド、並びに例えば、ポリスチレン及びポリイソプレンを含む多くのポリマーを含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書に使用される用語「親水基」とは、水溶性であるか又は水に誘引される化学部分をいう。親水基の例は、アルコール、短鎖カルボン酸、第４級アミン、スルホン酸塩、リン酸塩、糖、及びＰＥＧなどのある種のポリマーを含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書に使用される用語「両親媒性化合物」とは、疎水性部分及び親水性部分の両方を有する化合物をいう。例えば、本発明の両親媒性化合物は、該化合物の１つの親水面及び該化合物の１つの疎水面を有することができる。本発明において有用な両親媒性化合物は、コール酸並びにコール酸類似体及び誘導体を含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書に使用される用語「コール酸」とは、（Ｒ）−４−（（３Ｒ，５Ｓ，７Ｒ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｓ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−３，７，１２−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）ペンタン酸をいう。コール酸はまた、３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸；３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５−β−コラン−２４−オイック酸；１７−β−（１−メチル−３−カルボキシプロピル）エチオコラン−３α，７α，１２α−トリオール；コラール酸；及び、コラリンとしても知られている。アロコール酸、フィトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸などのコール酸誘導体及び類似体も、本発明において有用である。コール酸誘導体は、ミセル安定性及び膜活性などの、テロデンドリマー組織化から生じるナノ担体の特性を調節するように、設計することができる。例えばコール酸誘導体は、１又は複数のグリセロール基、アミノプロパンジオール基、又は他の基により修飾された親水面を有することができる。
本明細書に使用される用語「薬物」又は「治療薬」とは、病態又は疾患を治療及び／又は改善することが可能である物質をいう。薬物は、疎水性薬物であってよく、これは水を撥水する任意の薬物である。本発明において有用な疎水性薬物は、パクリタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、ＳＮ−３８、シクロスポリンＡ、ポドフィロトキシン、カルムスチン、アンホテリシン、イクサベピロン、パツピロン（エポテロンクラス）、ラパマイシン及び白金薬物を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬物はまた、プロドラッグ型も含む。当業者は、他の薬物は本発明において有用であることを理解するであろう。
本明細書に使用される用語「架橋可能な基」又は「架橋基」とは、例えば、第一の樹状分岐高分子上の第一の架橋可能な基が、第二の樹状分岐高分子上の第二の架橋可能な基に連結する、別の分子上の類似基又は相補基と結合することが可能な官能基をいう。本発明の架橋可能な基及び架橋基として好適な基は、チオール、例えばシステイン、ボロン酸、及びカテコールなどの１，２−ジヒドロキシベンゼンを含む１，２−ジオールを含む。架橋可能な基及び架橋基が一体化する場合、これらは、ジスルフィド及びボロン酸エステルなどの、架橋された結合を形成する。他の架橋可能な基及び架橋基が、本発明において適している。
本明細書に使用される用語「結合切断成分」とは、本発明の架橋可能な基及び架橋基を用いて形成された架橋された結合を切断することが可能な物質をいう。この結合切断成分は、架橋された結合がジスルフィドの場合は、グルタチオンなどの還元剤であり、或いは架橋された結合がボロン酸及び１，２−ジオールから形成される場合は、マンニトールであることができる。
本明細書に使用される用語「造影剤」とは、体の臓器、組織又は体系を造影することができる化学物質をいう。造影剤の例は、常磁性物質、光学プローブ、及び放射性核種を含む。
本明細書に使用される用語「治療する」、「治療している」及び「治療」は、軽減；寛解；症状の消失、又は患者の症状、損傷、病理若しくは病態の忍容性の増大；症状又は病態の頻度又は期間の減少；或いは、場合によっては、症状又は病態の開始の阻止などの、任意の主観的又は客観的パラメータを含む、損傷、病理、病態、又は症状（例えば疼痛）の治療又は改善の何らかの成功の兆候をいう。症状の治療又は改善は、任意の主観的又は客観的パラメータを基にすることができ；これは、例えば理学検査の結果を含む。
本明細書に使用される用語「対象」とは、霊長類（例えばヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むが、これらに限定されるものではない、哺乳動物などの、動物をいう。いくつかの実施態様において、対象はヒトである。
本明細書に使用される用語「治療有効量又は投与量」或いは「治療上十分な量又は投与量」或いは「有効な又は十分な量又は投与量」とは、それが投与されるものに関して治療的作用を生じる投与量をいう。正確な投与量は、治療の目的に応じて変動し、且つ公知の技術を用い、当業者により確認可能であろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、「医薬剤形(Pharmaceutical Dosage Forms)」（１−３巻、１９９２）；Ｌｌｏｙｄ、「医薬配合の技巧、化学及び技術(The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding」)（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ、「用量計算(Dosage Calculations)」、（１９９９）；及び、「レミントンの調剤の科学と実践(Remington: The Science and Practice of Pharmacy)」、第２０版、２００３、Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ参照）。増感された細胞において、治療上有効な投与量は、非増感細胞に関する従来の治療上有効な投与量よりも低いことが多い。
本明細書に使用される用語「光線力学療法」とは、光への曝露時に悪性細胞又は疾患細胞にとって毒性となり始める、無毒の光感受性化合物をいう。光線力学療法は、光増感剤、光源、及び酸素が関与している。光への曝露時に、光増感剤は、活性酸素種（一重項酸素、酸素フリーラジカル）を発生させ、これは悪性組織と反応しこれを破壊する。ポルフィリン、クロロフィル及び色素を含む、様々な光増感剤を使用することができる。
本明細書に使用される用語「光温熱療法」とは、光への曝露時に熱を発生する無毒の光感受性化合物の使用をいう。光線力学療法同様、光温熱療法には、光増感剤及び光源、典型的には赤外が関与している。しかし光温熱療法は酸素を必要としない。ポルフィリン、クロロフィル及び色素を含む、様々な光増感剤を使用することができる。
II. テロデンドリマー
本発明は、親水性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）セグメント及び疎水性セグメント、並びに少なくとも１個のポルフィリンを有する、両親媒性テロデンドリマーコンジュゲートを提供する。ＰＥＧセグメントは、１個又は複数のＰＥＧ鎖を含む、分岐した又は線状アーキテクチャーを有することができる。テロデンドリマーの疎水性セグメントは、疎水面及び親水面を有するコール酸により提供され得る。ポルフィリン、コール酸及びＰＥＧは、様々な酸反復単位を含むことができるオリゴマー及び／又はポリマーにより結合される。典型的には、オリゴマー及びポリマーは、ジアミノカルボン酸、リジンを含む。テロデンドリマーは、溶液中で凝集し、疎水性内側及び親水性外側を持つミセルを形成することができる。これらのミセルは、水への溶解度が低い薬物又は他の物質を送達するためのナノ担体として使用することができる。
一部の実施態様において、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー；親水面及び疎水面の両方を有する少なくとも２つの両親媒性化合物；少なくとも１個のポルフィリン；任意に少なくとも２個の架橋基；並びに、ＰＥＧ、両親媒性化合物、ポルフィリン及び架橋基に共有結合された樹状分岐高分子を有するコンジュゲートを提供し、ここで各コンジュゲートは、水性溶媒中で自己組織化し、ナノ担体を形成し、その結果各両親媒性化合物の疎水面の互いへの配向により、疎水性ポケットがナノ担体の内側に形成され、ここで各コンジュゲートのＰＥＧは、ナノ担体の外側上に自己組織化する。
一部の実施態様において、本発明は、下記式Ｉの化合物を提供する：
（Ｂ）k−（ＰＥＧ）m−Ａ（Ｙ1）P−Ｌ1−Ｄ−［Ｙ2−Ｌ2−Ｒ］n （Ｉ）
（式中、Ｂは、結合リガンドであることができ；各ＰＥＧは、分子量１〜１００ｋＤａを有する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであることができ；Ａは、少なくとも１個の分岐したモノマー単位Ｘを含み、且つ少なくとも１個のＰＥＧ基に連結されることができ；Ｄは、単独の焦点基、複数の分岐したモノマー単位Ｘ及び複数の末端基を有する樹状分岐高分子であることができ；Ｙ1及びＹ2の各々は、存在しないか、又はボロン酸、ジヒドロキシベンゼン若しくはチオールであることができる架橋可能な基であることができ；Ｌ1及びＬ2の各々は、独立して、結合又はリンカーであり、ここでＬ1は、樹状分岐高分子の焦点基へ連結されることができ；各Ｒは、樹状分岐高分子の末端基、ポルフィリン、疎水基、親水基、両親媒性化合物及び薬物であることができ、ここで少なくとも１個のＲ基は、ポルフィリンであることができ；添字ｋは、０又は１であることができ；添字ｍは、０〜２０の整数であることができ；添字ｎは、２〜２０の整数であり、ここで添字ｎは、樹状分岐高分子上の末端基の数と等しいことができ；並びに、添字ｐは、０〜８であることができる。）。
いずれか好適な結合リガンドを、本発明の化合物において使用することができる。例えば、結合リガンドは、特定の臓器、健常組織又は疾患組織を標的化することができる。結合リガンドの例は、アミノ酸配列ＱＤＧＲＭＧＦを有する、ＰＬＺ４リガンドを含む。２０１０年９月２３日に出願された米国特許出願第１３／４９７，０４１号で、現時点での米国特許公開第２０１２／０２３０９９４号を参照されたい。
リンカーＬ1及びＬ2は、いずれか好適なリンカーを含むことができる。概して、これらのリンカーは、２つのテロデンドリマーセグメントの各々との反応のための２個の官能基を有する、二官能性リンカーである。一部の実施態様において、リンカーＬ1及びＬ2は、ヘテロ二官能性リンカーであることができる。一部の実施態様において、リンカーＬ1及びＬ2は、ホモ二官能性リンカーであることができる。一部の実施態様において、リンカーＬ1及びＬ2は、独立して、ポリエチレングリコール、ポリセリン、ポリグリシン、ポリ（セリン−グリシン）、脂肪族アミノ酸、６−アミノヘキサン酸、５−アミノペンタン酸、４−アミノブタン酸及びβ−アラニンであることができる。当業者は、リンカーのサイズ及び化学性質は、連結されるべきテロデンドリマーセグメントの構造を基に、変動され得ることを認めるであろう。
一部の実施態様において、リンカーＬ1及びＬ2は、下記式を有する：
任意のサイズ及びアーキテクチャーのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーが、本発明のナノ担体において有用である。一部の実施態様において、ＰＥＧは、１〜１００ｋＤａである。他の実施態様において、ＰＥＧは、１〜１０ｋＤａである。一部の他の実施態様において、ＰＥＧは、約３ｋＤａである。更に別の実施態様において、追加のＰＥＧポリマーは、両親媒性化合物に連結される。例えば、両親媒性化合物がコール酸である場合、最大３個のＰＥＧポリマーが、各コール酸に連結される。両親媒性化合物に連結されたＰＥＧポリマーは、サイズが２００〜１０，０００Ｄａである。更に別の実施態様では、両親媒性化合物に連結されるＰＥＧポリマーは、サイズが１〜５ｋＤａである。当業者は、他のＰＥＧポリマー及び他の親水性ポリマーが本発明において有用であることを理解するであろう。ＰＥＧはいずれか好適な長さであることができる。
樹状分岐高分子は、いずれか好適な樹状分岐高分子であることができる。樹状分岐高分子は、アミノ酸又は他の二官能性ＡＢ２−型モノマー（ここで、Ａ及びＢは、一緒に反応することが可能である２種の異なる官能基であり、その結果生じるポリマー鎖は、Ａ−Ｂ結合が形成される分岐点を有する）を含む分岐したモノマー単位で作製され得る。一部の実施態様において、各分岐したモノマー単位Ｘは、ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸及びヒドロキシルアミノカルボン酸であることができる。一部の実施態様において、各ジアミノカルボン酸は、２，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノブタン酸、２，５−ジアミノペンタン酸（オルニチン）、２，６−ジアミノヘキサン酸（リジン）、（２−アミノエチル）−システイン、３−アミノ−２−アミノメチルプロパン酸、３−アミノ−２−アミノメチル−２−メチルプロパン酸、４−アミノ−２−（２−アミノエチル）酪酸又は５−アミノ−２−（３−アミノプロピル）ペンタン酸であることができる。一部の実施態様において、各ジヒドロキシカルボン酸は、グリセリン酸、２，４−ジヒドロキシ酪酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）酪酸、セリン又はトレオニンであることができる。一部の実施態様において、各ヒドロキシルアミノカルボン酸は、セリン又はホモセリンであることができる。一部の実施態様において、ジアミノカルボン酸は、アミノ酸である。一部の実施態様において、各分岐したモノマー単位Ｘは、リジンである。
テロデンドリマーの樹状分岐高分子は、１、２、３、４、５、又はそれ以上の世代を含む、いずれか好適なデンドリマーの世代であることができ、ここでデンドリマーの各「世代」とは、焦点とデンドリマーの次の１本の枝の末端基の間で遭遇した分岐点の数をいう。テロデンドリマーの樹状分岐高分子は、１．５、２．５、３．５、４．５、５．５などの、部分世代(partial-generations)を含むこともでき、ここでデンドリマーの分岐点は、１本の枝のみを有する。例えば図１の構造を参照されたい。樹状分岐高分子の様々なアーキテクチャーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２末端基を含むが、これらに限定されるものではない、いずれか好適な数の末端基を提供することができる。
テロデンドリマー又はテロデンドリマーセグメントの焦点は、いずれか好適な官能基であることができる。一部の実施態様において、焦点は、テロデンドリマー又はテロデンドリマーセグメントの別のセグメントへの結合を可能にする官能基を含む。焦点官能基は、アルコール、アミン、チオール、又はヒドラジンを含むが、これらに限定されるものではない、求核基であることができる。焦点官能基はまた、アルデヒド、カルボン酸、又は酸クロリド若しくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを含むカルボン酸誘導体などの、求電子的基であってもよい。
テロデンドリマー外縁に導入された基Ｒは、ポルフィリン、親水基、疎水基、又は両親媒性化合物を含む、いずれか好適な部分であることができ、ここで少なくとも１個のＲ基は、ポルフィリンであることができる。いずれか好適なポルフィリンを、本発明のテロデンドリマーにおいて使用することができる。本発明において好適な代表的ポルフィリンは、ピロフェオホルビド−ａ、フェオホルビド、クロリンｅ６、プルプリン又はプルプリニミドを含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様において、ポルフィリンは、ピロフェオホルビド−ａであることができる。代表的構造を、以下に示す：
疎水基の例は、長鎖アルカン及び脂肪酸、フルオロカーボン、シリコーン、コレステロールなどのある種のステロイド、並びに例えば、ポリスチレン及びポリイソプレンを含む多くのポリマーを含むが、これらに限定されるものではない。親水基の例は、アルコール、短鎖カルボン酸、アミン、スルホン酸塩、リン酸塩、糖質、及びＰＥＧなどのある種のポリマーを含むが、これらに限定されるものではない。両親媒性化合物の例は、１つの親水面及び１つの疎水面を有する分子を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明において有用な両親媒性化合物は、コール酸及びコール酸類似体及び誘導体を含むが、これらに限定されるものではない。「コール酸」とは、（Ｒ）−４−（（３Ｒ，５Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｓ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−３，７，１２−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）ペンタン酸で、下記構造を有するものをいう：
コール酸誘導体及び類似体は、アロコール酸、フィトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、及びケノデオキシコール酸を含むが、これらに限定されるものではない。コール酸誘導体は、ミセル安定性及び膜活性などの、テロデンドリマー組織化から生じるナノ担体の特性を調節するように、デザインすることができる。例えば、コール酸誘導体は、１個又は複数のグリセロール基、アミノプロパンジオール基、又は他の基により修飾される親水面を有することができる。
テロデンドリマー末端基はまた、パクリタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、ＳＮ−３８、シクロスポリンＡ、ポドフィロトキシン、カルムスチン、アンホテリシン、イクサベピロン、パツピロン（エポテロンクラス）、ラパマイシン及び白金薬物などの薬物を含んでもよい。当業者は、他の薬物が、本発明において有用であることを理解するであろう。
一部の実施態様において、各残存するＲは、コール酸、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸、（３α，５β，７α，１２α）−７−ヒドロキシ−３，１２−ジ（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸、ギ酸コレステロール、ドキソルビシン、及びレインであることができる。他の実施態様において、各残存するＲは、コール酸であることができる。
テロデンドリマー骨格は、枝の数並びに末端基及びＲ基の数及び化学的性質に応じて、変動することができ、これは、溶液の形態(conformation)、レオロジー特性、及び他の特徴を調節するであろう。テロデンドリマーは、いずれか好適な数ｎの末端基及びいずれか好適な数のＲ基を有することができる。一部の実施態様において、ｎは、２〜７０、又は２〜５０、又は２〜３０、又は２〜１０であることができる。一部の実施態様において、ｎは、２〜２０である。
テロデンドリマーは、外縁上のＲ基の単独の型か、又はいずれか好適な比のＲ基の任意の組合せを有することができる。概して、Ｒ基の数ｎの少なくとも半分は、末端基以外である。例えば、Ｒ基の数ｎの少なくとも半分は、疎水基、親水基、両親媒性化合物、薬物、又はそれらの任意の組合せであることができる。一部の実施態様において、Ｒ基の数ｎの半分は、両親媒性化合物である。
一部の実施態様において、本化合物は、下記構造を有する：
ＰＥＧ−Ａ−Ｄ−［Ｙ2−Ｌ2−Ｒ］n （Ｉａ）
（式中、各Ｒは、独立してポルフィリン、両親媒性化合物又は薬物であり、ここで少なくとも１個のＲ基は、ポルフィリンである。）。
一部の実施態様において、本化合物は、下記構造を有する：
（式中、ＰＥＧは、ＰＥＧ５ｋであることができ；各分岐したモノマー単位Ｘは、リジンであることができ；Ａは、リジンであることができ；各Ｌ2は、結合又はリンカーＥｂｅｓであることができ；各Ｙ2は、存在しないか又はシステインであることができ；並びに、各Ｒは、コール酸又はポルフィリンであることができる。）。
一部の実施態様において、本化合物は、下記構造を有する：
（式中、各Ｒ’は、コール酸（ＣＡ）、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシ−ｌ−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−４０Ｈ）、（３α，５β，７α，１２α）−７−ヒドロキシ−３，１２−ジ（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−５０Ｈ）又は（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−３０Ｈ−ＮＨ2）であることができ；並びに、各Ｒ”ｓは、ピロフェオホルビド−ａ、フェオホルビド、クロリンｅ６、プルプリン及びプルプリニミドからなる群から選択されるポルフィリンであることができる）。他の実施態様において、ポルフィリンは、ピロフェオホルビド−ａであることができる。一部の他の実施態様において、添字ｋは、１である。一部の他の実施態様において、本化合物は、下記であることができる：
（１）各Ｌ2が結合であり、各Ｙ2が存在せず、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａであり、及び添字ｋが０である化合物；
（２）各Ｌ2がリンカーＥｂｅｓであり、各Ｙ2が存在せず、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａであり、及び添字ｋが０である化合物；
（３）各Ｌ2が結合であり、各Ｙ2がシステインであり、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａであり、及び添字ｋが０である化合物；
（４）各Ｌ2がリンカーＥｂｅｓであり、各Ｙ2がシステインであり、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａであり、及び添字ｋが０である化合物；
（５）各Ｌ2が結合であり、各Ｙ2が存在せず、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａであり、及び添字ｋが１である化合物；
（６）各Ｌ2がリンカーＥｂｅｓであり、各Ｙ2が存在せず、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａであり、及び添字ｋが１である化合物；
（７）各Ｌ2が結合であり、各Ｙ2がシステインであり、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａであり、及び添字ｋが１である化合物；又は
（８）各Ｌ2がリンカーＥｂｅｓであり、各Ｙ2がシステインであり、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａであり、及び添字ｋが１である化合物。
一部の実施態様において、本化合物は、下記構造を有する：
（式中、各Ｒ’は、コール酸（ＣＡ）、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−４０Ｈ）、（３α，５β，７α，１２α）−７−ヒドロキシ−３，１２−ジ（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−５０Ｈ）又は（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−３０Ｈ−ＮＨ2）であることができ；並びに、各Ｒ’は、ピロフェオホルビド−ａ、フェオホルビド、クロリンｅ６、プルプリン及びプルプリニミドからなる群から選択されるポルフィリンであることができる）。他の実施態様において、ポルフィリンは、ピロフェオホルビド−ａであることができる。一部の他の実施態様において、添字ｋは１である。一部の他の実施態様において、本化合物は、下記であることができる：
本発明の化合物はまた、ポルフィリンにキレートされた金属陽イオンも含むことができる。いずれか好適な金属は、ポルフィリンにより、キレートされることができる。本発明において有用な金属は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属及び遷移元素後(post-transition)金属を含む。アルカリ金属は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ及びＣｓを含む。アルカリ土類金属は、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ及びＢａを含む。遷移金属は、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｌａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ及びＡｃを含む。遷移元素後金属は、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｂ、Ｓｂ、Ｂｉ、及びＰｏを含む。これらの金属のいずれの放射性核種も、ポルフィリンによりキレートされることができる。一部の実施態様において、金属陽イオンは、ポルフィリンにキレートされることができる。他の実施態様において、金属陽イオンは、放射性金属陽イオンであることができる。一部の他の実施態様において、ポルフィリンにキレートされる放射性金属陽イオンは、64Ｃｕ、67Ｃｕ、177Ｌｕ、67Ｇａ、111Ｉｎ、及び90Ｙｔであることができる。
ＩＩＩ． 分岐したＰＥＧ部分を伴うテロデンドリマー
本発明のテロデンドリマーは、それらの焦点で共に連結されている、２つの分岐したセグメントを含む。一般にテロデンドリマーは、先に記載されたか又は既報（ＷＯ ２０１０／０３９４９６）の任意のテロデンドリマー及びオリゴマー焦点に結合された２個以上のＰＥＧ鎖を含む分岐したＰＥＧセグメントを含む。
テロデンドリマーの樹状分岐高分子は、１、２、３、４、５、又はそれ以上の世代を含む、いずれか好適なデンドリマーの世代であることができ、ここでデンドリマーの各「世代」とは、焦点とデンドリマーの次の１本の枝の末端基の間で遭遇した分岐点の数をいう。テロデンドリマーの樹状分岐高分子は、１．５、２．５、３．５、４．５、５．５などの部分世代を含むこともでき、ここでデンドリマーの分岐点は、１本の枝のみを有する。例えば、図１の構造を参照されたい。樹状分岐高分子の様々なアーキテクチャーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２末端基を含むが、これらに限定されるものではない、いずれか好適な数の末端基を提供することができる。
一部の実施態様において、本化合物は、下記であることができ：
ここで、各分岐したモノマー単位Ｘは、リジンである。
一部の実施態様において、本化合物は、下記であることができ：
ここで、各分岐したモノマー単位Ｘは、リジンである。
テロデンドリマー中のＰＥＧ−オリゴマー単位は、いずれか好適な数のＰＥＧ部分を含んでよい。ＰＥＧ部分は、オルソゴナル保護基を使用し、オリゴマー上の様々な位置で、部位選択的に挿入されることができる。一部の実施態様において、本化合物の（ＰＥＧ）m−Ａ部分は、下記であることができ：
ここで、各Ｋは、リジンである。
一部の実施態様において、本テロデンドリマーは、以下であることができ：
ここで、各Ｋは、リジンであり；各ＰＥＧは、ＰＥＧ２ｋであり；各分岐したモノマー単位Ｘは、リジンであり；各Ｒは、コール酸であり；並びに、リンカーＬは、下記式を有する：
ＩＶ． ナノ担体
本発明のテロデンドリマーは、凝集し、疎水性コア及び親水性外側を持つナノ担体を形成する。一部の実施態様において、本発明は、内側及び外側を有するナノ担体、複数の本発明のデンドリマーコンジュゲートを含むナノ担体を提供し、ここで各化合物は、水性溶媒中で自己組織化しナノ担体を形成し、その結果疎水性ポケットが、ナノ担体の内側に形成され、且つここで各化合物のＰＥＧは、ナノ担体の外側上に自己組織化する。
一部の実施態様において、ナノ担体の各コンジュゲートは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー；親水面及び疎水面の両方を有する、少なくとも２つの両親媒性化合物；少なくとも１個のポルフィリン；任意に少なくとも２個の架橋基；並びに、ＰＥＧ、両親媒性化合物、ポルフィリン及び架橋基に共有結合された、樹状分岐高分子：を有し、ここで各コンジュゲートは、水性溶媒中で自己組織化し、ナノ担体を形成し、その結果疎水性ポケットが、各両親媒性化合物の疎水面の互いへの配向により、ナノ担体の内側に形成され、ここで各コンジュゲートのＰＥＧは、ナノ担体の外側上に自己組織化する。
一部の実施態様において、ナノ担体は、疎水性薬物又は造影剤を含み、その結果疎水性薬物又は造影剤が、ナノ担体の疎水性ポケット内に封鎖されている。本発明のナノ担体において有用な疎水性薬物は、低い水への溶解度を有する任意の薬物を含む。一部の実施態様において、ナノ担体中の疎水性薬物は、ボルテゾミブ、パクリタキセル、ＳＮ３８、カンプトテシン、エトポシド及びドキソルビシン、ドセタキセル、ダウノルビシン、ＶＰ１６、プレドニソン、デキサメタゾン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テムシロリムス及びカルムシンであることができる。
一部の実施態様において、ナノ担体は、光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレート及び薬物に任意に連結される少なくとも１個のモノマー単位を含む。この薬物は、様々な親水性又は疎水性薬物であることができ、且つ本発明のナノ担体の内側に封鎖される疎水性薬物に限定されない。
ナノ担体中に封鎖されるか又は本発明のコンジュゲートに連結され得る薬物は、細胞増殖抑制剤、細胞毒性物質（例えば、非限定的に、ＤＮＡ相互作用薬（シスプラチン又はドキソルビシンなど））；タキサン（例えば、タキソテレ、タキソール）；トポイソメラーゼＩＩ阻害薬（エトポシドなど）；トポイソメラーゼＩ阻害薬（イリノテカン（又はＣＰＴ−１１）、カンプトサー(camptostar)、又はトポテカンなど）；チューブリン相互作用薬（パクリタキセル、ドセタキセル又はエポチロンなど）；ホルモン剤（タモキシフェンなど）；チミジル酸合成酵素阻害薬（５−フルオロウラシルなど）；代謝拮抗薬（メトトレキセートなど）；アルキル化剤（テモゾロミド（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社、ケニルウォース、ＮＪからのテモダール（商標））、シクロホスファミドなど）；アロマターゼ組合せ；ａｒａ−Ｃ、アドリアマイシン、サイトキサン、及びゲムシタビンなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明のナノ担体において有用な他の薬物は、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスフォルアミン(triethylenethiophosphoramine)、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、フロキシウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、オキサリプラチン、ロイコボリン、オキサリプラチン（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、仏国からのエロキサチン（商標））、ペントスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、デオキシコフォルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、テニポシド１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニソン、フルオキシメステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニソロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、ゴセレリン、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミソール、ナベルビン(Navelbene)、アナストロゾール(Anastrazole)、レトロゾール、カペシタビン、レロキサフィン、ドロロキサフィン、又はヘキサメチルメラミンを含むが、これらに限定されるものではない。プロドラッグ形も、本発明において有用である。
本発明において有用な他の薬物は、67Ｃｕ、90Ｙ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、177Ｌｕ、188Ｒｅ、186Ｒｅ及び211Ａｔなどの、放射性核種を含む。一部の実施態様において、放射性核種は、薬物として及び造影剤として治療において作用することができる。
造影剤は、常磁性物質、光学プローブ、及び放射性核種を含む。常磁性物質は、ナノ担体の疎水性ポケット内に封鎖されている鉄ナノ粒子などの、鉄粒子を含む。
一部の実施態様において、これらのコンジュゲートは、架橋基を介して架橋され得る。架橋基は、先に記載されたような、いずれか好適な架橋基であることができる。一部の実施態様において、架橋基は、チオール、ボロン酸又はジヒドロキシベンゼンであることができる。一部の実施態様において、架橋基は、チオールであることができる。一部の実施態様において、コンジュゲートの第一のセットはボロン酸架橋基を含み、及びコンジュゲートの第二のセットはジヒドロキシベンゼン架橋基を含む。一部の実施態様において、ナノ担体の各コンジュゲートは、少なくとも２個のコール酸；少なくとも２個のピロフェオホルビド−ａ基；及び、少なくとも２個の架橋基を含み、ここでナノ担体のコンジュゲートは、架橋基を介して架橋されている。
本ナノ担体は、先に記載されたようないずれか好適なポルフィリン(porphrying)を含むことができる。一部の実施態様において、ポルフィリンは、ピロフェオホルビド−ａであることができる。一部の実施態様において、ポルフィリン基は、先に説明されたように、金属へキレートされることができる。いずれか好適な金属は、先に説明されたように、放射性及び非放射性金属を含み、ポルフィリンにキレートされることができる。一部の実施態様において、ナノ担体は、少なくとも１個のピロフェオホルビド−ａ基にキレートされた金属を含む。
本発明の一部の実施態様は、各両親媒性化合物Ｒが、独立してコール酸、アロコール酸、フィトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、又はケノデオキシコール酸であるナノ担体を提供する。
本発明のナノ担体はまた、標的部分への結合のための結合リガンドを含むこともできる。結合リガンドは、ナノ担体のコンジュゲートの一つへ連結されるか、又は分離されることができる。いずれか好適な結合リガンドを、先に説明されたように、本発明の化合物において使用することができる。例えば、結合リガンドは、特定の臓器、健常組織又は罹患組織を標的化することができる。結合リガンドの例は、アミノ酸配列ｃＱＤＧＲＭＧＦｃを有するＰＬＺ４リガンドを含む。一部の実施態様において、ナノ担体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、ＰＥＧポリマーに連結された結合リガンド、親水面及び疎水面の両方を有する少なくとも２個の両親媒性化合物、ＰＥＧ及び両親媒性化合物に共有的に結合された樹状分岐高分子を含む、少なくとも１個の結合コンジュゲートを含み、ここで各結合コンジュゲートは、水性溶媒中で第一のコンジュゲートと自己組織化し、ナノ担体を形成し、その結果各両親媒性化合物の疎水面の互いへの配向により、疎水性ポケットがナノ担体の内側に形成され、ここで各コンジュゲートのＰＥＧは、ナノ担体の外側上に自己組織化する。
Ｖ． 治療方法
本発明のナノ担体は、ナノ担体の内側に疎水性薬物を封鎖することによるか、又は薬物のナノ担体のコンジュゲートへの共有的結合によるなど、薬物の投与を必要とする任意の疾患を治療するために使用することができる。ナノ担体はまた、ナノ担体の内側に造影剤を封鎖することによるか、又は造影剤のナノ担体のコンジュゲートへ結合することにより、造影のために使用することができる。
一部の実施態様において、本発明は、本発明のナノ担体の治療有効量を、そのような治療を必要とする対象へ投与することを含む、疾患を治療する方法を提供し、ここでナノ担体は、薬物を含む。この薬物は、ナノ担体のコンジュゲートへ共有的に結合されることができる。一部の実施態様において、この薬物は、ナノ担体の内側に封鎖された疎水性薬物である。一部の実施態様において、ナノ担体はまた、造影剤を含むことができる。この造影剤は、ナノ担体のコンジュゲートへ共有的に結合され得るか、又は造影剤は、ナノ担体の内側に封鎖され得る。一部の他の実施態様において、疎水性薬物と造影剤の両方が、ナノ担体の内側に封鎖される。更に別の実施態様において、薬物と造影剤の両方が、ナノ担体のコンジュゲートに共有的に連結される。更に別の実施態様では、ナノ担体はまた、放射性核種を含むこともできる。
本発明のナノ担体を使用し治療する方法はまた、光線力学療法又は光温熱療法により疾患を治療することを含む。これらの方法は一般に、本発明のナノ担体を対象へ投与し、その後対象を特定の波長の放射線に曝露し、光の波長に応じて光線力学又は光温熱療法を誘導することに関与している。放射線又は光への曝露時に、金属に錯化されたか又はされないかのいずれかである、本発明のナノ担体において使用されるポルフィリンは、光線力学療法に好適な反応性一重項酸素を生じるか、又は光温熱療法に十分な熱を生じるかのいずれかである。一部の実施態様において、本発明は、治療有効量の本発明のナノ担体を、それを必要とする対象へ投与し、且つ対象を放射線に曝露し、これにより光線力学又は光温熱療法により疾患を治療することを含む、光線力学又は光温熱療法による疾患治療方法を提供する。一部の実施態様において、この方法は、光線力学療法により疾患を治療する方法である。他の実施態様において、この方法は、光温熱療法により疾患を治療する方法である。
他の実施態様において、本発明は、治療有効量の本発明のナノ担体を、それを必要とする対象へ投与し、且つ対象を音波に曝露し、これにより疾患を音波力学療法により治療することを含む、音波力学療法による疾患治療方法を提供する。
本発明のナノ担体は、例えば、非限定的に、下記などの癌を含む過増殖性疾患の治療のために、対象へ投与することができる：癌腫、神経膠腫、中皮腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、膠芽細胞腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、及びバーキットリンパ腫、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、胆嚢癌、小腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、子宮頸癌、膣癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵臓内分泌腺癌、カルチノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫（追加の癌については「癌：原理と実践(CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE)」（ＤｅＶｉｔａ、Ｖ． Ｔ．ら編集、２００８）参照）。
本発明のナノ担体により治療することができる他の疾患は、以下を含む：（Ｉ）炎症又はアレルギー性疾患、例えば全身アナフィラキシー又は過敏反応、薬物アレルギー、虫刺されアレルギーなど；炎症性腸疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎及び腸炎など；腟炎；乾癬及び炎症性皮膚疾患、例えば皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、じんま疹など；血管炎；脊椎関節症；強皮症；呼吸器アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患など、（２）自己免疫疾患、例えば関節炎（リウマチ性及び乾癬性）、変形性関節炎、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、糖尿病、糸球体腎炎など、（３）移植片拒絶反応（同種移植拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む）、並びに（４）望ましくない炎症反応が阻害されるべきその他の疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、筋炎、脳卒中及び閉鎖性頭部外傷などの神経学的状態、神経変性疾患、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、骨粗鬆症、痛風、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、結膜炎、耳炎、慢性閉塞性肺疾患、静脈洞炎及びベーチェット症候群）。一部の実施態様において、疾患は、癌であることができる。他の実施態様において、疾患は、膀胱癌又は卵巣癌であることができる。
加えて本発明のナノ担体は、ウイルス、細菌、真菌、及び寄生生物などの病原体による感染症の治療のために有用である。他の疾患は、本発明のナノ担体を用いて治療することができる。
いずれか好適なコンジュゲート又はナノ担体を、本発明の方法において使用することができる。一部の実施態様において、ナノ担体の各コンジュゲートは、少なくとも２個のコール酸、少なくとも２個のピロフェオホルビド−ａ基、少なくとも２個の架橋基、及び少なくとも１個のピロフェオホルビド−ａ基にキレートされた金属を含み、ここでナノ担体のコンジュゲートは、架橋基を介して架橋される。
Ａ． 製剤
本発明のナノ担体は、当業者に公知の様々な異なる様式で製剤化することができる。医薬として許容し得る担体は、投与される特定の組成物により、更には組成物を投与するために使用される特定の方法により、一部決定される。従って、本発明の医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば「レミントン薬科学(Remington 's Pharmaceutical Sciences)」、第２０版、２００３年、前掲参照）。有効な製剤は、経口及び経鼻製剤、非経口的投与のための製剤、及び徐放性を持つよう製剤化された組成物を含む。
経口投与に適した製剤は、（ａ）液体溶液、水、食塩水又はＰＥＧ４００などの希釈剤中に懸濁された本発明の化合物の有効量など；（ｂ）液体、固形物、顆粒又はゼラチンとして、活性成分の予め決定された量を各々含有する、カプセル剤、サシェ剤、デポ剤又は錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁剤；（ｄ）好適な乳剤；並びに、（ｅ）貼付剤：からなることができる。先に説明された液体溶液は、滅菌溶液であることができる。医薬形状は、乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、色素、崩壊剤、及び医薬として適合性のある担体の１又は複数を含むことができる。舐剤の形状は、例えばショ糖など香味料中に活性成分を含有することができ、更に香錠は、ゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアカシアゴムなどの不活性基剤中に活性成分を含有し、例えば乳剤、ゲル剤などは、活性成分に加え、当該技術分野において公知の担体を含む。
医薬調製品は、単位剤形が好ましい。そのような形状において、調製品は、適量の活性成分を含む単位投与量に分割される。単位剤形は、包装された調製品であることができ、この包装は、バイアル又はアンプル内に包装された錠剤、カプセル剤、及び散剤などの、調製品の個別の量を含む。同じく単位剤形は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、又は舐剤それ自身であることができるか、或いはこれは包装された形状のこれらのいずれかの好適な数であることができる。組成物は、望ましいならば、他の適合性のある治療薬を含むこともできる。好ましい医薬調製品は、本発明の化合物を持続放出製剤において送達することができる。
本発明において有用な医薬調製品は、徐放性製剤を含む。一部の実施態様において、本発明において有用な徐放性製剤は、米国特許第６，６９９，５０８号に説明されており、これは米国特許第７，１２５，５６７号に従い調製することができ、これらの両特許は引用により本明細書中に組み込まれている。
医薬調製品は、典型的には、ヒト及び非−ヒト哺乳動物を含む哺乳動物へ送達される。本方法を用いて治療される非−ヒト哺乳動物は、家庭用動物（すなわち、イヌ、ネコ、マウス、齧歯類、及びウサギ）及び農業用動物（ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ）を含む。
本発明の方法を実践する上で、本医薬組成物は、単独で、又は他の治療薬若しくは診断薬と組合せて使用することができる。
Ｂ． 投与
本発明のナノ担体は、必要に応じ頻繁に投与することができ、これは毎時、毎日、毎週又は毎月を含む。本発明の医薬方法において利用される化合物は、初回量約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇを毎日で投与される。１日投与量の範囲約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇを使用することができる。しかしこれらの用量は、患者の必要性、治療される病態の重症度、及び利用される化合物に応じ、変動することができる。例えば用量は、特定の患者において診断された疾患の型及び病期を考慮し、経験的に決定することができる。本発明の状況において、患者へ投与される投与量は、ある期間にわたり患者において有益な治療反応を作用するのに十分でなければならない。投与量のサイズはまた、特定の患者における特定の化合物の投与に付随する何らかの有害副作用の存在、性質、及び程度により決定されるであろう。特定の状況に関する適量の決定は、熟練開業医の技術の範囲内である。一般に治療は、本化合物の最適量よりも少ない比較的小用量で開始される。その後この用量は、状況下で最適効果に達するまで、少しずつ増加される。便宜上、総１日用量を、望ましいならば、分割し、その日のうちに部分毎に投与することができる。投与量は、治療担当医の決定により、毎日、又は隔日で与えることができる。投与量はまた、皮下カプセル剤、サシェ剤若しくはデポ剤の使用により、又は貼付剤若しくはポンプを介してなどで、長期間にわたり（数週、数ヶ月又は数年）、規則的又は連続して与えることができる。
本医薬組成物は、局所的、非経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経結腸、経直腸、又は腹腔内を含む、様々な様式で、患者へ投与することができる。好ましくは、本医薬組成物は、非経口、局所的、静脈内、筋肉内、皮下、経口、又は例えば吸入により経鼻的に投与される。
本発明の方法の実践において、本医薬組成物は、単独で、又は他の治療薬若しくは診断薬と組合せて使用することができる。本発明の併用プロトコールで使用される追加の薬物は、個別に投与することができるか、又は併用プロトコールにおいて使用される１又は複数の薬物を、混合物中など、まとめて投与することができる。１又は複数の薬物が個別に投与される場合、各薬物の投与の時期及びスケジュールは変動し得る。その他の治療薬又は診断薬は、本発明の化合物と同時に、個別に又は異なる時点で投与することができる。
ＶＩ． 造影方法
一部の実施態様において、本発明は、本発明のナノ担体の有効量を、造影される対象へ投与することを含む、造影方法を提供し、ここで該ナノ担体は、造影剤を含む。他の実施態様において、治療方法及び造影方法は、薬物及び造影剤の両方を有するナノ担体を同時に使用し達成される。
造影剤の例は、常磁性物質、光学プローブ、及び放射性核種を含む。常磁性物質造影剤は、外部印加される場の下で磁気を帯びている。常磁性物質の例は、鉄粒子を含むナノ粒子を含むが、これに限定されるものではない。光学プローブは、１つの放射線波長での励起、及び第二の異なる放射線波長での検出により、検出することができる蛍光化合物である。本発明において有用な光学プローブは、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ ６８０、Ｃｙ５、ＤｉＤ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸塩）及びＤｉＲ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド）を含むが、これらに限定されるものではない。他の光学プローブは、量子ドットを含む。放射性核種は、放射性壊変を受ける元素である。本発明において有用な放射性核種は、3Ｈ、11Ｃ、13Ｎ、18Ｆ、19Ｆ、60Ｃｏ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、68Ｇａ、82Ｒｂ、90Ｓｒ、90Ｙ、99Ｔｃ、99mＴｃ、111Ｉｎ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、129Ｉ、131Ｉ、137Ｃｓ、177Ｌｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、211Ａｔ、Ｒｎ、Ｒａ、Ｔｈ、Ｕ、Ｐｕ及び241Ａｍを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明のナノ担体はまた、腫瘍を検出するために使用することができる。例えば、ナノ担体のポルフィリン基は、第一波長の光に曝露された後、第二波長の光を放出することができる。第二波長の放出された光は次に、当該技術分野において公知の方法により検出することができる。腫瘍の検出に有用なナノ担体は、ポルフィリンにキレートされた金属を含むか、又は金属を含まない。一部の実施態様において、本発明は、有効量の本発明のナノ担体を、対象へ投与すること；対象を、第一波長で放射線へ曝露し、ここで該放射線は、ナノ担体上に存在するポルフィリンを励起し、その結果ポルフィリンが、第二波長の放射線を放出すること；並びに、励起されたポルフィリンにより放出された放射線を検出し、これにより腫瘍を検出すること：を含む、対象の腫瘍を検出する方法を提供する。
ＶＩＩ． 実施例
材料
モノメチル−末端ポリ（エチレングリコール）モノアミン（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ2、Ｍw：５０００Ｄａ）及びα−アミノ−ω−Ｂｏｃ−アミノポリ（エチレングリコール）（Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ2、Ｍw：５０００Ｄａ）は、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社（独国）から購入した。ピロフェオホルビド−ａは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（サンタクルズ）から入手した。塩酸ドキソルビシン（ＤＯＸ・ＨＣ１）（Ｎｏｖａｐｌｕｓ）は、ＵＣ Ｄａｖｉｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｙから入手した。（Ｆｍｏｃ）ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及び（Ｆｍｏｃ）Ｅｂｅｓ−ＯＨは、ＡｎａＳｐｅｃ社（サンノゼ、ＣＡ）から入手した。３，３’−ジヘキサデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＯ）及び４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、青色）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。コール酸、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルジアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］、エルマン試薬［ＤＴＮＢ、５，５９−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）］及び他の全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス）から購入した。
ＰＬＺ４（アミノ酸配列：ｃＱＤＧＲＭＧＦｃ、ここで大文字はＬ−アミノ酸を表し、小文字はＰＬＺ４の環化及び安定化に使用される非天然のＤ−システインを表す）は、既報のように（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２１， １２１６−１２２４ （２０１０）；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３０， ６００６−６０１６ （２００９）；印刷に先立ちＵｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｅｐｕｂ（２０１２））、Ｒｉｎｋ樹脂上での固相ペプチド合成により調製した。
統計解析は、２群についてはスチューデントｔ−検定、及び複数群については一元配置ＡＮＯＶＡにより行った。全ての結果は、別に注記しない限りは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表した。Ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意とみなした。
実施例１． テロデンドリマーの合成
テロデンドリマーは、既報のように（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２１， １２１６−１２２４ （２０１０）；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３０， ６００６−６０１６ （２００９））、ビルディングブロックとしてＭｅｏ−ＰＥＧ−ＮＨ2、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ2、リジン、コール酸及びピロフェオホルビド−ａを使用する、液相縮合反応により合成した。
ＰＬＺ４−テロデンドリマーを合成するために、第一銅イオンにより触媒される水相「クリック化学」を行い、ＰＬＺ４ペプチド上のアルキン基を、先に本発明者らが報告したテロデンドリマー（ＰＥＧ5k−ＣＡ8）上のＰＥＧ末端のアジド基に、モル比１：２（ＰＬＺ４：ＰＥＧ）でカップリングさせた。コンジュゲート後、ＰＬＺ４は検出されず、このことはＰＬＺ４は、テロデンドリマーにうまくコンジュゲートされたことを示唆している。
テロデンドリマーの合成。ポルフィリン／コール酸ハイブリッドテロデンドリマーを、段階的ペプチド化学を利用する液相縮合反応により合成した。ＮＰｓは、これらのテロデンドリマーの溶媒−蒸発法11による自己組織化により形成された。このテロデンドリマーを、構造及び分子量に関して特徴づけた。ＮＰｓは、粒子サイズ、薬物負荷、安定性、ＲＯＳ生成、吸光度、蛍光及び熱特性に関して特徴づけた。
代表的ポルフィリン／コール酸ハイブリッドテロデンドリマー（ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4、図１２ａ、図１３）は、段階的ペプチド化学を利用するＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ2からの液相縮合反応により合成した。簡単に述べると、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（３当量）を、カップリング試薬としてＤＩＣ及びＨＯＢｔを使用し、負のカイザー試験結果が得られるまで、ＰＥＧのＮ末端上にカップリングさせ、これによりカップリング反応の完了が示された。冷エーテルを添加することにより、ＰＥＧ化された分子を沈殿させ、次に冷エーテルにより２回洗浄した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（ｖ／ｖ）４−メチルピペリジン処理により、Ｆｍｏｃ基を除去し、ＰＥＧ化された分子が沈殿し、冷エーテルにより３回洗浄した。白色粉末沈殿を、真空下で乾燥させ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨの１カップリング及び（Ｆｍｏｃ）ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの１カップリングを、各々実行し、ＰＥＧの一方の末端上に４個のＢｏｃ基及びＦｍｏｃ基を末端とした樹状分岐ポリリジンの第三世代を生成した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）中での、各々、Ｆｍｏｃの２０％（ｖ／ｖ）４−メチルピペリジンによる除去及びＢｏｃ基の５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による除去後、コール酸ＮＨＳエステル1及びピロフェオホルビド−ａを、樹状分岐ポリリジンの末端にカップリングさせた。このテロデンドリマー溶液を濾過し、次にＭＷＣＯの３．５ＫＤａの透析チューブ内で水４Ｌに対して透析し；貯留槽水を、２４時間で４回完全に新しくした。最後に、テロデンドリマーを凍結乾燥した。ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4の分子量を、ＡＢＩ ４７００ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（リニアモード）上で、マトリックスとしてＲ−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ酸を使用し、収集した。単分散質量トレースを、テロデンドリマーについて検出したところ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳからのテロデンドリマーの分子量（図１４）は、理論値とほぼ等しかった。このテロデンドリマーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを、Ａｖａｎｃｅ ５００ 核磁気共鳴分光計（Ｂｒｕｋｅｒ社）上で、溶媒としてＤＭＳＯ−ｄ６及びＤ2Ｏを使用し、記録した。テロデンドリマーの濃度は、ＮＭＲ測定について、５×１０-4Ｍに維持した（図１５）。
チオール化されたピロフェオホルビド−ａテロデンドリマー（ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｐｏｒ4−ＣＡ4と称す、図１６ａ、図１７）を、同じ戦略を用い1,2、本発明者らの既報のチオール化テロデンドリマー（ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｌ8−ＣＡ8）の８個のコール酸を４個に置き換えることにより合成した。ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｐｏｒ4-ＣＡ4合成の代表的手順は、以下である：（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（３当量）を、カップリング試薬としてＤＩＣ及びＨＯＢｔを使用し、負のカイザー試験結果が得られるまで、ＰＥＧのＮ末端上にカップリングさせ、これによりカップリング反応の完了が示された。冷エーテルを添加することにより、ＰＥＧ化された分子を沈殿させ、次に冷エーテルにより２回洗浄した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（ｖ／ｖ）４−メチルピペリジン処理により、Ｆｍｏｃ基を除去し、ＰＥＧ化された分子が沈殿し、冷エーテルにより３回洗浄した。白色粉末沈殿を、真空下で乾燥させ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨの１カップリング及び（Ｄｄｅ）ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨの１カップリングを、各々実行し、ＰＥＧの一方の末端上に４個のＤｄｅ基及びＦｍｏｃ基を末端とした樹状分岐ポリリジンの第三世代を生成した。次に、Ｆｍｏｃ基を除去した。（Ｆｍｏｃ）Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）Ｅｂｅｓ−ＯＨ及びコール酸ＮＨＳエステル（１２当量）を、樹状分岐ポリリジンの末端に段階的にカップリングさせた。ＤＭＦ中の２％（ｖ／ｖ）ヒドラジンによるＤｄｅ保護基の除去後、（Ｆｍｏｃ）Ｅｂｅｓ−ＯＨ及びピロフェオホルビド−ａ（１２当量）を、引き続き、樹状分岐ポリリジンの末端上の使い残し(leftover)のアミノ基にカップリングさせた。システイン上のＴｒｔ基を、ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ／エタンジチオール（ＥＤＴ）／トリエチルシラン（ＴＩＳ）（９４：２．５：２．５：１、ｖ／ｖ）により除去し、ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｐｏｒ4−ＣＡ4チオール化されたテロデンドリマーを生じた（図１６ａ、図１７）。チオール化されたテロデンドリマーを、この混合物から、各々、ＤＭＦ及びエーテルによる溶解／再沈殿の３サイクルにより、回収した。最後に、このチオール化されたテロデンドリマーを、アセトニトリル／水に溶解し、凍結乾燥した。ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｐｏｒ4−ＣＡ4の分子量を、ＡＢＩ ４７００ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（リニアモード）上で、マトリックスとしてＲ−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ酸を使用し、収集した。単分散質量トレースを、出発ＰＥＧ及びこのテロデンドリマーについて検出したところ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳからのテロデンドリマーの分子量（図１８）は、理論値とほぼ等しかった。
実施例２． 金属性テロデンドリマーの生成
金属性ナノポルフィリンの調製。キレートされた金属を伴うテロデンドリマーを生成するために、既報の方法6,49に従い、過剰な遊離金属イオン（例えば１０倍過剰）を、テロデンドリマーと一緒に、メタノール／クロロホルム中で、１〜５時間、窒素下で、インキュベーションした。遊離金属は、分子量カットオフ値３，５００のカラム濾過により除去した。その後この金属ポルフィリン−脂質を、アリコートとし、乾燥させ、アルゴン下、−２０℃で貯蔵した。
実施例３． ナノポルフィリンミセルの調製
金属性ＮＰｓを、音波処理により、ＰＢＳ中に金属−テロデンドリマーを溶解することにより、作製した。チオール遊離ポルフィリン−テロデンドリマー２０ｍｇを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１ｍＬ中に溶解し、引き続き１０分間音波処理し、非架橋のナノポルフィリンを形成した。標的化ミセルを作製するために、ＰＬＺ４−コンジュゲートされたテロデンドリマー（ＰＬＺ４−ＰＥＧ5k−ＣＡ8）を、ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4と混合した。自己組織化後、より親水性の標的化ＰＬＺ４リガンドが、ミセルの表面上に提示された。
ジスルフィド架橋されたミセルを作製するために、ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｐｏｒ4−ＣＡ4及びＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｌ8−ＣＡ8の総量２０ｍｇを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１ｍＬ中に溶解し、ミセルを形成し、次に１０分間音波処理した。このテロデンドリマー上のチオール基を、過酸化水素により酸化させ、ジスルフィド結合を形成した。遊離チオール基のレベルは、エルマン試験により経時的にモニタリングした。遊離チオール基のレベルを、低い値で一定に保った後、このミセル溶液を、透析せずに、更なる特徴決定に使用した。
金属性ナノポルフィリンの特徴決定。ナノポルフィリンのサイズ及びサイズ分布を、動的光散乱（ＤＬＳ）装置（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ社）により測定した。濃度は、ＤＬＳ測定に関して１．０ｍｇ／ｍＬに維持した。全ての測定は２５℃で行い、データは、Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ ＦＬＥＸソフトウェア１０．５．３により解析した。ナノポルフィリンの形態は、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＭ−１２０透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）において観察した。簡単に述べると、水性ナノ粒子溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を、リンタングステン酸（ＰＴＡ）による２秒間の染色あり又はなしで、銅グリッド上に沈着させ、且つ室温で測定した。ナノポルフィリンの吸光度及び蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国）で測定した。ナノポルフィリン溶液（１０μｌ）の近赤外蛍光を、Ｋｏｄａｋマルチモーダル造影システムＩＳ２０００ＭＭを使用し、走査した。ナノポルフィリン溶液（１０μｌ）の熱特性は、Ｆｌｉｒサーマルカメラを用いて試験した。ナノポルフィリンのＲＯＳ生成は、指示薬として２’，７’−ジクロロフルオレシンジアセタート（ＤＣＦ）を使用し試験し、ＰＢＳと比較した。
放射標識。０．１Ｍ ＨＣｌ中の64ＣｕＣｌ2（ワシントン大学、ＭＯ、米国）を、１．０Ｍ酢酸アンモニウムにより、ｐＨ７へ緩衝した。ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4テロデンドリマーを、メタノールに溶解し、その後少量の緩衝された64ＣｕＣｌ2を添加した。放射標識した溶液を、室温で３０分間インキュベーションした。メタノールを蒸発させ、テロデンドリマーのフィルムを、ＰＢＳと再水和させ、64Ｃｕ標識されたＮＰｓを作製した。遊離64Ｃｕは、カットオフ値３５００ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、ＭＡ、米国）、又は代わりにＭｉｃｒｏ Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ ６カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ハーキュリーズ、ＣＡ、米国）を使用する遠心濾過により除去した。放射化学的純度及び収量は、インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）を用いて評価した。二重標識されたＧｄ／64Ｃｕ ＮＰｓを調製するために、予め調製したＧｄ−テロデンドリマーを、メタノール中の64Ｃｕ−ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4テロデンドリマー放射標識溶液に添加し、引き続き乾燥し、ＰＢＳ中に再構成し、精製した。
結果
ＮＰｓの合成及び特徴決定。ＮＰｓは、線状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）並びにピロフェオホルビド−ａ（Ｐｏｒ、ポルフィリン類似体）の樹状オリゴマー及びコール酸（ＣＡ）で構成された、新規クラスのハイブリッド両親媒性ポリマー（テロデンドリマーと称す）の自己組織化により形成した（図１２〜図１５）。代表的テロデンドリマーであるＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4を、図１２ａに示す。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、このＮＰｓが、サイズ２０ｎｍの球形であることを示した（図１２ｃ）。このＮＰｓは、２つの吸収ピークを有し、一つは４０５ｎｍで、及び一つは近赤外（ＮＩＲ）範囲６８０ｎｍであった（図１２ｄ）。ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4は、銅（Ｃｕ（ＩＩ））、パラジウム（Ｐｄ（ＩＩ））、ガドリニウム（Ｇｄ（ＩＩＩ））及びガリウム（Ｇａ（ＩＩＩ））などの様々な金属イオンをキレートする固有の能力を有する。ＰＢＳ中のこれらの金属−テロデンドリマーの自己組織化により作製される、金属イオン−内包型ＮＰｓは、吸光度ピーク（６５０〜６９０ｎｍ）に独自のシフトを示すことがわかった（図１２ｄ）。金属イオンが、ＮＰｓのポルフィリン成分に内包された場合、これらの重原子は、電子を大きい角度で散乱させ、このことはより大きい位相シフトにつながり、ＴＥＭのコントラストを増大する。従って金属イオン層は、ＴＥＭ下で、染色なしでも、観察することができる（図１９）。リンタングステン酸による染色及びＴＥＭによる観察後、金属層が、ＮＰｓの疎水性コアと親水性コロナの境界面に認められた（図１２ｅ、ｆ）。
４０５ｎｍで励起した場合、ＰＢＳ中に配合されたＮＰｓは、ピーク値６６０ｎｍの非常に弱い赤色蛍光発光を示した（図１２ｇ、赤色曲線）。π−π相互作用及び疎水性特徴のために、Ｐｏｒ分子は、ＮＰｓのコア内に高度に秩序付けられた構造を容易に形成することができ、これは水性媒体中での励起状態の強力な自己消光作用に寄与する10ので、これは予想外のことではない。対照的に、ＮＰｓが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により破壊される場合11（図２０）、４０５ｎｍで励起されると、６６０ｎｍで強力な蛍光が認められた（図１２ｇ、青色曲線）。図１２ｈは、ＳＤＳ添加あり又はなしで（図２１）、ＮＰ濃度の関数として、ＮＰｓのＮＩＲ蛍光を比較した。ＮＰｓのＮＩＲ蛍光シグナルは、腫瘍部位及び／又は腫瘍細胞内部で起こると予想されるミセル解離時に大きく増幅されることは明らかである。本発明者らは、比較のためのＰｏｒを物理的に封入するための、簡便なミセル−ベースのナノ担体として、ＰＥＧ5k−ＣＡ8ミセルを、先に報告した11-17。ＮＰｓは、同じ濃度のＰｏｒを持つＰｏｒ内包型ＰＥＧ5k−ＣＡ8ミセル（ＮＭ−ＰＯＲ）よりも１０倍より強く自己消光することを示し（図２２、図２３）、このことは、ナノポルフィリン構築体のコア内に独特に組織化されたＰｏｒ分子の明確な特徴であることを指摘している。蛍光特性同様、ＮＰｓは、アーキテクチャー−依存型「オン／オフ」光線力学変換も有する。光照射後ＰＢＳ中でＮＰｓにより生成された一重項酸素は、最低であるが、ＳＤＳの添加時には回復することができる（図１２ｉ）。
ＮＰｓはＰＢＳ中で高度に自己消光するので、エネルギーは、レーザー照射時に、蛍光及び／又は一重項酸素生成の代わりに、熱の形で放出される（図１２ｊ、ｋ）。ＮＰ濃度が、０から１．０ｍｇ／ｍＬまで増加する場合に、ＮＰ溶液の温度は、２４℃から６２℃まで上昇する。ＮＰｓがＳＤＳ存在下で解離され同じ線量の光が照射される場合、強力な蛍光であるが、溶液温度のより有意性の低い上昇が認められた（図１２ｊ、ｋ）。対照的に、ＮＭ−ＰＯＲは、同じ照射レベルでＳＤＳ中のものと比べ、ＰＢＳ中において軽度の温度上昇のみを示し（図２４）、このことは、光熱変換は、Ｐｏｒが、ＮＰｓの独自のアーキテクチャー内に閉じ込められる場合にのみ有効であることを指摘している。本発明者らは更に、光線量及びＮＰ濃度を変動することにより、ＮＰｓの光熱変換を細かく調整することができる。本発明者らは、４．０ｍｇ／ｍＬ ＮＰｓに関して、１．２５Ｗ／ｃｍ2で１２０秒間の照射により、超高温（１２０℃）を達成することができ（図１２１）、これは基板プラスチックフィルムの溶融に繋がることを明らかにした。低線量の光（０．１Ｗ／ｃｍ2）で１２０秒間の照射の場合、ＮＰ溶液の温度は、数度上昇したのみであった（図１７）。
実施例４． 薬物内包型ナノポルフィリンの調製
薬物内包されたミセルの調製
ドキソルビシンを、先に説明した溶媒蒸発法により、ミセルへ内包させた。ＤＯＸの高分子ミセルへの封入前に、ＤＯＸ・ＨＣｌを、クロロホルム（ＣＨＣｌ3）／メタノール（ＭｅＯＨ）（１：１、ｖ／ｖ）中のトリエチルアミン３モル当量と共に一晩攪拌し、ＤＯＸ・ＨＣｌからＨＣｌを除去した。テロデンドリマー２０ｍｇを、異なる量の中和したＤＯＸと一緒に、最初にＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨに溶解し、混合し、回転蒸発器上で蒸発させ、均質な乾燥ポリマーフィルムを得た。このフィルムを、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）１ｍＬ中に再構成し、引き続き３０分間音波処理し、試料フィルムを、ミセル溶液に分散させた。それらのインビボでの運命を追跡するために、疎水性ＮＩＲＦ色素ＤｉＤを、同様の方法を用い、一部のミセルに封入した。最後に、これらのミセル製剤を、０．２２μｍフィルターにより濾過し、試料を滅菌した。ＤＯＸ量を決定するために、ＤＯＸ−内包型ミセルを、ＤＭＳＯ（ミセル溶液／ＤＭＳＯ：１：９、ｖ／ｖ）に希釈し、ミセルナノ粒子を解離し、蛍光を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により測定し、ここで様々な濃度の一連のＤＯＸ／ＤＭＳＯ標準溶液を使用し、較正曲線を得た。ＤＯＸ内包型ジスルフィド架橋されたミセルは、同じ方法により調製し、その後、過酸化水素によりチオールを酸化し、ミセル内ジスルフィド結合を形成した。
ドキソルビシン、パクリタキセル、ビンクリスチン、ボルテゾミブ、ソラフェニブ及び１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンなどの、疎水性薬物を、同様の方法を使用し、ナノポルフィリンへ内包させた。封入された薬物の量を決定するために、薬物−内包型ナノポルフィリンを、ＤＭＳＯ（ナノポルフィリン溶液／ＤＭＳＯ：１：９、ｖ／ｖ）で希釈し、ナノ粒子を解離した。薬物内包を、ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ社）上で分析し、ここで様々な濃度の一連の薬物／ＤＭＳＯ標準溶液を使用し、較正曲線を得た。薬物内包型ジスルフィド架橋されたナノポルフィリンを、同じ方法により調製し、引き続きチオールを酸化し、ミセル内ジスルフィド結合を形成した2。
ヒト血漿中のＤＯＸ放出。ＮＰ−ＤＯＸ溶液を調製し、血漿中のインビトロ薬物放出プロファイルを決定した。最初のＤＯＸ濃度は１．０ｍｇ／ｍＬであったのに対し、ＮＰ濃度は１０ｍｇ／ｍＬであった。同じ薬物含量でＤＯＸを伴うＮＰ単独及び本発明者らの報告した標準ミセル（ポルフィリンを伴う）11も、比較のために調製した。ＤＯＸがＮＰｓのコア内に封入される場合、ＤＯＸとＰｏｒの間の近接は、ＦＲＥＴ範囲内であり、４８０ｎｍで、ＤＯＸの励起時に、ＤＯＸ分子からＰｏｒ分子への十分なエネルギー転移が可能であった（図１６ｅ、ｆ）。４８０ｎｍでの励起時に、ＮＰｓ単独のシグナルは、対応するＦＲＥＴシグナルと比べ、はるかに小さかった。従って、ＦＲＥＴ比の動的変化をモニタリングすることにより、本発明者らはリアルタイムでＮＰｓからのＤＯＸの放出をモニタリングすることができた。これらのナノ粒子溶液のアリコートを、ヒト血漿により、９回希釈し、インキュベーター内で３７℃で、速度１００ｒｐｍで攪拌しながら、インキュベーションした。これらのナノ粒子溶液の蛍光スペクトルを、予め決められた時点で、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により測定した。一部の実験において、ＤＯＸ内包型ＮＰｓに対する光又は温度の作用を試験するために、ナノ粒子溶液に、光を５分間照射し、固定された温度の水浴中でインキュベーションした。
安定性試験は、高分子ミセルを効率的に破壊することができることが報告されている4ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下、ナノポルフィリン及びジスルフィド架橋されたナノポルフィリンの、蛍光及び粒子サイズの変化をモニタリングすることにより行った。ＳＤＳ溶液（７．５ｍｇ／ｍＬ）を、ナノポルフィリン（１．５ｍｇ／ｍＬ）の水溶液へ添加した。最終のＳＤＳ濃度は、２．５ｍｇ／ｍＬであり、且つミセル濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬに維持した。これらの溶液の蛍光シグナルは、蛍光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国）において測定した。ナノポルフィリン溶液のサイズ及びサイズ分布は、ＤＬＳにより、予め決められた時間間隔で、モニタリングした。ミセルの安定性はまた、ＳＤＳと一緒にグルタチオン（ＧＳＨ、２０ｍＭ）の存在下においても評価した。ＤＯＸ−内包型ＮＰｓの安定性は、健常ヒト志願者由来の５０％（ｖ／ｖ）血漿中において更に試験した。この混合物は、生理的体温（３７℃）でインキュベーションし、引き続き予め決められた時間間隔で、最大４８時間まで、サイズ測定した。
結果
本発明者らは更に、ＰＥＧ5k−Ｐｏｒ4−ＣＡ4によって形成されたＮＰｓは、様々な水に溶けにくい化学療法薬物及び分子標的化された薬物を効率的に運搬することができることを明らかにした。例えば、化学療法薬（ドキソルビシン、パクリタキセル及びビンクリスチン）並びに分子標的化された薬物、例えばプロテアソーム阻害薬（ボルテゾミブ）、チロシンキナーゼ阻害薬（ソラフェニブ）及び熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）阻害薬（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７ＡＡＧ）などは、ＮＰｓへ容易に取り込まれ、水への溶解度の有意な増加を生じる。薬物−内包型ＮＰｓの最終粒子サイズは、全ておよそ１２〜２０ｎｍであり、これは空のＮＰｓのサイズに類似していた（図２５）。
本発明者らは、ＤＯＸは、内包能３．７ｍｇ／ｍＬの架橋されたＮＰｓの内側に封入されることができることを明らかにした（図１６ｄ）。ＤＯＸ−内包型架橋されたＮＰｓ（ＣＮＰ−ＤＯＸ）の最終粒子サイズは、およそ２０ｎｍであり、ＤＯＸを最大２．５ｍｇ／ｍＬまで内包した。次に本発明者らは、ＣＮＰ−ＤＯＸのヒト血漿との相互作用は、インビボ適用において血液中の状態を脱安定化するように刺激することを調べた。ＣＮＰ−ＤＯＸの粒子サイズは、ヒト血漿中で高度に安定していた（図２６）。本発明者らは、ドキソルビシンとＮＰｓの間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用し、ヒト血漿中のリアルタイム薬物放出をモニタリングした（図１６ｅ）。図１６ｆ−ｇに示したように、ＣＮＰ−ＤＯＸが、ヒト血漿中で、３７℃で２４時間インキュベーションされた場合、ＦＲＥＴシグナルは非常に安定しており、これは、架橋されたＮＰｓからのドキソルビシン放出は最小であることを示している。しかし、２４時間及び２８時間の光曝露により、各々、劇的なＦＲＥＴシグナルの減少が存在した（図１６ｆ−ｇ）。前述の結果は、ジスルフィド架橋されたＮＰｓは、光曝露により、薬物放出の引き金がひかれることを指摘している。或いは、ＤＯＸ放出は、細胞内レベルでのＧＳＨ（〜１０ｍＭ）により引き金がひかれ、且つこれはＦＲＥＴによりモニタリングした（図１６ｈ）。
血液は、静脈内投与によるナノ粒子−ベースの薬物送達システムに関する最初の生物学的障壁である。血液タンパク質とリポタンパクの相互作用は、ナノ粒子の解離を引き起こすことがあり、これは早期の薬物放出に繋がり得る。血液循環中のＮＰｓの構造安定性を更に増大するために、本発明者らは、ＮＰプラットフォームに、可逆的ジスルフィド架橋戦略を適用した。４個のシステインを、テロデンドリマーのオリゴリジン骨格に導入し、ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｐｏｒ4−ＣＡ4を形成した（図１６ａ、図１８、図２７）。次に得られるＮＰｓを、システイン上のチオール基の酸化により、ジスルフィド結合により架橋した。ＴＥＭは、これらのジスルフィド架橋されたＮＰｓは、直径２０〜３０ｎｍの球形小胞であることを示し（図１６ｂ）、これはそれらの非架橋の対応物に類似している。非架橋ＮＰｓ同様、架橋されたＮＰｓの蛍光も、ＰＢＳ中において高度に消光された。
それに対応して、蛍光は、ＳＤＳ及びグルタチオン（ＧＳＨ）などの内在性還元試薬の存在下で、細胞内レベルで、回復した11（図１６ｃ）。図１６ｃに示したように、ジスルフィド架橋されたＮＰｓも、４０５ｎｍで励起された場合に、６６０ｎｍにピーク値のある非常に弱い赤色蛍光発光を示した（緑色曲線）。架橋されたＮＰｓの蛍光発光スペクトルをＳＤＳ存在下で記録した場合、６６０ｎｍでのピーク発光の増加が存在した（黒色曲線）。しかしこのピーク値は、同じポルフィリン濃度で、ＳＤＳの存在下で非架橋のＮＰｓのものよりも、有意に低かった。ＧＳＨの添加時に、ジスルフィド架橋されたＮＰｓは、完全に破壊され、且つ蛍光発光スペクトルの６６０ｎｍでのピークは、ＳＤＳ存在下での非架橋ＮＰｓのそれの類似の値まで更に増加した（桃色曲線）。架橋されたＮＰｓはまた、ＳＤＳ中でそれらの粒子サイズを保持することができるが、還元剤の添加により解離することができる（図２８）。
実施例５． インビトロにおける細胞毒性
方法
インビトロにおける細胞毒性及び機序。ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞株及びＰＣ３前立腺癌細胞株を使用し、ＮＰｓの光増感機能を評価した。細胞を、ＮＰｓにより２４又は７２時間処理し、引き続き処理後２４時間の時点で光照射した。細胞生存度を、ＷＳＴ−８キットを使用し決定した。熱及びＲＯＳ生成を、照射時点で調べた。
ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞株を使用し、ＮＰｓの光増感機能を評価した。本発明者らは、最初に、これらの癌細胞を様々な濃度のＮＰｓ又は従来の光線力学診断／治療薬である５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）により、２４時間処理した。完全に洗浄後、細胞を、指定されたように、ＮＩＦ光に曝露した。細胞生存度を、照射後２４時間、ＷＳＴ−８増殖キットを用いて決定した。別の実験において、架橋されたＮＰｓ又はＤＯＸ内包型架橋されたＮＰｓ、遊離ＤＯＸ、及びＤＯＸ内包型架橋されたミセル（ポルフィリン含まず）5を使用し、癌細胞を２４時間処理した。３回洗浄した後、細胞に、光を１分間照射した。細胞生存度を、２４時間のインキュベーション後、ＷＳＴ−８により決定した。別の試験において、ＬＮＣＡＰ細胞、ＰＣ３細胞及びＲＰＷＥ１細胞に対するＮＰ−ＡＡＧの成長阻害作用を、ＮＰ単独と遊離薬物１７ＡＡＧにより比較した。細胞は、５０００個細胞／５０μｌ／ウェルで播種し、指定された薬物で２４時間処理した。これらの薬物を除去し、新鮮な培地と置き換え、次に細胞をＮＩＲ光に２分間曝露した。成長阻害は、７２時間後に、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。アポトーシスは、アネキシンＶ及びＰＩ染色を使用し、２４時間後に分析した。ＨＩＦ１α、サバイビン、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３及びＳｒｃレベルを、ウェスタンブロット及び対応する抗体を用い、１２時間後に分析した。
本発明者らは、最初に、ＳＫＯＶ−３細胞を、２．２μＭのＮＰｓあり又はなしで２４時間処理し、引き続き９６ウェルプレート中で２’，７’−ジクロロフルオレシンジアセタート（ＤＣＦ）を３０分間負荷し、ＲＯＳ生成をモニタリングした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な培地と置き換えた。ウェルの一部に、ＮＩＲ光を照射し（例えば、０．０７Ｗ／ｃｍ2で６０秒間）、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈプログラムを使用し、細胞画像を、蛍光顕微鏡下で獲得した。次に、ＮＰｓによる前処理後のＳＫＯＶ−３細胞のミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の喪失を評価するために、本発明者らは、細胞に、４０ｎＭ ＤｉＯＣ６（３）を２０分間負荷し、ウェルの一部に、ＮＩＲ光を照射した。２４時間後、細胞を、ヨウ化プロピジウム（死滅した細胞）及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核）により標識し、画像を蛍光顕微鏡により獲得した。最後に、ＮＰｓ及び光線療法に対する細胞反応を調べるために、本発明者らは、カスパーゼ３／７活性を評価し、これは、アポトーシス経路活性化の部分のマーカーとして役立った。ＳＫＯＶ−３細胞を、２．２μＭのＮＰｓあり又はなしで２４時間処理した。洗浄後、細胞を、０．５、１及び２分間、光に曝露するか又は曝露しなかった。２４時間インキュベーション後、カスパーゼ３／７活性を、更に４５分間にわたる更に５０μＬの作業溶液の添加により、測定した。このプレートを、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国）により読み取った。最後に形態試験のために、ＳＫＯＶ−３細胞を、８−ウェルチャンバースライド上で培養し、ＮＰｓのあり又はなしで２４時間処理した。光による処理の２時間後に、スライドを、Ｈｅｍａ３（登録商標）により染色した。
結果
本発明者らは、ＮＰｓの独自のアーキテクチャー−依存性ＲＯＳ生成（図１２ｉ）は、光増感剤それ自身の光毒性を軽減するために使用することができることを認めた。光照射がないと、無傷のＮＰｓは、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞に対し１．０ｍｇ／ｍＬまで観察可能な細胞毒性を示さないのに対し、遊離Ｐｏｒは、投与量−依存様式で有意な細胞毒性を示した（図２９）。光曝露後のＮＰｓのインビトロ抗腫瘍作用は、光−線量及びＮＰ−投与量に依存し（図３０ａ、ｂ）、且つ同じ線量の照射時に、細胞毒性は、５−アミノレブリン酸（図３０−ＡＬＡ、ＰＤＴに関するＦＤＡ承認薬）よりもはるかに強力であった（図３０ｂ）。細胞生存度の喪失は、細胞内ＲＯＳ生成に関連し（図３０ｃ）、ミトコンドリア膜電位の喪失、細胞損傷、及びカスパーゼ３／７活性化により証明される細胞アポトーシスを生じた（図３０ｄ−ｆ）。更に本発明者らは、ＮＰ−ＤＯＸ媒介性の化学療法と光線療法の併用は、ＮＰｓ媒介した光線療法単独、遊離ＤＯＸ、又はＮＭ−ＤＯＸ（ポルフィリンを伴わないＤＯＸ内包型標準ミセル）11よりも、同じ光曝露後に有意により効果的であることを発見した（図３０ｇ）。本発明者らは更に、ＮＰ−媒介型光線療法は、Ｈｓｐ９０阻害薬１７ＡＡＧなどの分子標的化された薬物と、相乗的に組み合わせることができることを明らかにした。強力な相乗作用が、アンドロゲン依存性ＰＣ３前立腺癌細胞（図３０ｈ、下側）及びアンドロゲン依存性ＬＮＣＡＰ前立腺癌細胞（図３１、左下側）の両方で、１７ＡＡＧ内包型ＮＰｓ（ＮＰ−ＡＡＧ）により認められた。不死化された正常前立腺細胞ＲＷＰＥ１は、この療法に対し比較的抵抗性であった（図３１、右側）。ＮＰ−ＡＡＧは、アネキシンＶ及びＰＩ染色により測定した場合（図３０ｉ）、ＰＣ３細胞におけるアポトーシスの誘導のより大きい作用を有する。興味深いことに、ＨＩＦ１α、Ａｋｔ、サバイビン及びＭＭＰ２は、ＰＤＴ上でＮＰｓにより増大し、この誘導並びにＳｒｃは、ＮＰ−ＡＡＧにより枯渇され（図３０ｊ）、これはＮＰ−ＡＡＧの強力な相乗作用の機序を暗示している。
ここで本発明者らの知る限りでは、インビボにおいて最初に、携帯可能な単波長ＮＩＲレーザーを使用し、同時のＰＴＴ／ＰＤＴに関して、「軟」有機ＮＰｓは、血液循環中では不活性で留まるが、腫瘍部位では熱及びＲＯＳを放出するように活性化されることができるスマートナノトランスデューサーとして使用することができることを明らかにした。留まっている架橋されたＮＰｓの蛍光は、移植された腫瘍異種移植片を保有するマウスへ、静脈内注射した後、血液中で消光された（図３２）。同様に、血液中の架橋されたＮＰｓのＲＯＳ生成は、低線量の光（一日の生活で受け取る６９０ｎｍの太陽光に類似、０．１Ｗ／ｃｍ2）による曝露時に最低であった（図３３）。光曝露後、血液中で、架橋されたＮＰｓについて、明らかな溶血は、認められなかった（図３４）。架橋されたＮＰｓの熱発生も、同じ線量の光への曝露後には、無視できた（図３５）。対照的に、Ｐｏｒ封入された従来のＰＥＧ5k−ＣＡ8ミセルであるＮＭ−ＰＯＲは、架橋されたＮＰｓよりも、マウスの血液中で５倍より高い蛍光を示し、有意に高量のＲＯＳを生成し、これは重度の溶血を生じた（図３２−図３４）。これは恐らく、物理的に封入された内側ミセルの場合の、Ｐｏｒ分子のより少ない消光作用によるものであろう（図２３）。これらの腫瘍は、ＰＢＳ、架橋されたＮＰｓ及びＮＭ−ＰＯＲの注射の２４時間後、治療的線量の光により（１．２５Ｗ／ｃｍ2で１２０秒間）照射された。ＮＰｓは、ＮＭ−ＰＯＲと比べ、腫瘍部位で、有意により高い量のＲＯＳを生成し、２．５倍の温度変化を引き起こしたことが認められた（図３６、図３７）。腫瘍部位でＮＰｓの同時に起こるＲＯＳ及び熱の発生は、腫瘍部位でのＮＰｓの有意な蓄積及び注射後２４時間での部分的解離の結果であろう（図３８ｄ）。図１２ｉ、ｊの結果を基に、無傷のＮＰｓは、活性化され、熱を生じるのに対し、解離されたＮＰｓは、活性化され、光照射時にＲＯＳを生じると予想される。前記結果は、ＮＰｓのアーキテクチャー依存性光特性は、血液中の光増感剤の意図されない毒性を最小化し、且つ同等のナノ担体よりも腫瘍へ有意に高量のＲＯＳ及び熱を送達するために利用され得るであろうことを示唆している。
実施例６． ヒト卵巣癌及び膀胱癌細胞の治療
ＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞株及び５６３７ヒト膀胱癌細胞株を、ＡＴＣＣから購入し、推奨培地において維持した。イヌの膀胱癌細胞株Ｋ９ＴＣＣ−Ｐｕ−Ｉｎは、２００９年７月に、Ｄｒ． Ｄｅｂｏｒａｈ Ｋｎａｐｐ（Ｐｕｒｄｕｅ大学）により最初に開発され、博士から直接提供された。これらの細胞株は、Ｄｒ． Ｋｎａｐｐ研究室において、２００９年に、形態学、免疫組織化学、遺伝子発現及び腫瘍原性アッセイを使用し、試験され、及び正当性が認証された。これらの細胞は、細胞株の特徴決定を行ったＤｒ． Ｋｎａｐｐから直接得られ、且つ蘇生(resuscitation)後６ヶ月未満使用者の研究室において継代したので、再認証は不要であった。
ナノポルフィリンの細胞取り込み
癌細胞を、８ウェル組織培養チャンバースライド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ベッドフォード、ＭＡ、米国）において播種し、引き続き１０％ＦＢＳを含有する細胞培養培地において２４時間インキュベーションした。培地を交換し、ナノ−ポルフィリンミセルを、各ウェルへ添加した。予め決定した時点で、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞核をＤＡＰＩにより染色した。スライドにカバースリップを載せ、且つＤｅｌｔａ Ｖｉｓｉｏｎ画像処理システム（ＡｐｐｌｉｅｄＰｒｅｃｉｓｉｏｎ社、ＣＡ）により、製造業者のプロトコールに従い、観察した。
別の実験セットにおいて、イヌの尿路上皮細胞を、完全培地（抗生物質を含有するＲＰＭＩ１６４０中１０％ＦＢＳ）において３日間、集密度６０％まで培養した。ヒト膀胱細胞株５６３７を、ＤｉＯ（４００ｎＭ）により２０分間予め染色し、尿路上皮細胞と同じプレートで一晩共培養した。ＰＬＺ４−ＮＰ ２．２μＭを添加し、細胞画像を、Ｄｅｌｔａ Ｖｉｓｉｏｎ画像処理システムにより獲得した。
実施例７． インビトロにおける光線力学療法（ＰＤＴ）
Ｋ９ＴＣＣ−Ｐｕ−Ｉｎ及び５６３７膀胱癌細胞株並びにＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞株を使用し、ナノ−ポルフィリンの光増感機能を評価した。本発明者らは、癌細胞を、２．２μＭナノ−ポルフィリンにより２時間処理した。完全に洗浄した後、細胞を赤色光（６５０ｎｍ）に曝した。細胞生存度を、ＷＳＴ−８増殖キット（Ｃａｙｍｅｎ社）を用い、照射後２４時間決定した。従来の光線力学診断／治療薬である５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を、対照として使用した。別の実験において、ＤＯＸ内包型ナノポルフィリンを使用し、これらの癌細胞を処置し、引き続き光曝露した。暗毒性及びテロデンドリマー関連毒性を評価するために、これらの細胞はまた、テロデンドリマー及び空の架橋されたミセルにより、異なる希釈で処理し、且つ光曝露せずに合計７２時間インキュベーションした。
動物及び腫瘍異種移植片モデル
６〜８週齢の雌の無胸腺ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ系統）を、Ｈａｒｌａｎ社（リバーモア、ＣＡ）から購入した。全ての動物を、ＡＡＡＬＡＣ指針に従い、無病原体−条件下で維持し、実験前に少なくとも４日間馴化させた。全ての動物実験は、施設の指針を順守し、並びにカリフォルニア大学デービス校の動物の使用と飼養に関する管理諮問委員会(Animal Use and Care Administrative Advisory Committee)により承認されたプロトコール第０７−１３１１９号及び第０９−１５５８４号に従い、実施した。卵巣癌の皮下異種移植片モデルを、ＰＢＳ及びマトリゲル（１：１ｖ／ｖ）の混合液１００μＬ中のＳＫＯＶ−３卵巣細胞７×１０6個を、雌ヌードマウスの右脇腹に皮下注射することにより、樹立した。
患者−由来の異種移植片の樹立：本動物プロトコールは、実験実施前に、ＵＣデービス校施設の動物の飼養と使用に関する委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認された。皮下の患者−由来の異種移植片（ＰＤＸ）を樹立するために、ＮＯＤ ＳＣＩＤγ（ＮＳＧ；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、ウェストサンクレメント、ＣＡ）の４〜５週齢のマウスを使用した。新たな操作していない臨床の腫瘍断片（３〜５ｍｍ3）を、滅菌鉗子により、トロカールに負荷した。次に負荷されたトロカールを、ゆっくり脇腹皮膚へ押し出し、トロカールプランジャーを押し下げ、腫瘍断片を吐出させた。トロカールをゆっくり取り外し、注射領域を滅菌した。
ＮＳＧマウスの同所性異種移植片モデルを作製するために、継代＃１ ＰＤＸ標本を収集し、小片に切断した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、サンディエゴ、ＣＡ）１ｍｌにより３７℃で３０分間処理した後、比較的大きい組織を除去するために細胞ストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社、カナーン、ＣＴ）を通した後、単独の細胞浮遊液を得た。次に全身麻酔下で膀胱の位置を肉眼で調べながら、５〜１０μＬ ＰＢＳ中の細胞を、マウス膀胱壁に注射した。この手術後、マウスを毎日モニタリングした。
実施例８． ナノポルフィリンの生体分布
直径およそ８〜１０ｍｍの皮下腫瘍を持つ、Ｋ９ＴＣＣ−Ｐｕ−Ｉｎ及び５６３７膀胱癌並びにＳＫＯＶ−３卵巣癌の異種移植片マウスモデルに、インビボＮＩＲＦ光学造影を施した。ナノ−ポルフィリンミセルの注射後異なる時点で、Ｋｏｄａｋマルチモーダル造影システムＩＳ２０００ＭＭを、励起帯域通過フィルター６２５ｎｍ及び発光７００ｎｍで用い、マウスを走査した。マウスは、各造影前に、ペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔をかけた。インビボ造影後、動物を注射の２４、４８及び７２時間後にＣＯ2過剰投与量により安楽死させた。腫瘍及び主要臓器を摘出し、Ｋｏｄａｋ画像処理ステーションにより画像処理した。
ＮＩＲＦ造影試験は、ＮＳＧマウスの同所性異種移植片モデルにおいても行った。簡単に述べると、同所性ヒト膀胱癌を保持する雌のＮＳＧマウス又は正常ＮＳＧマウスに、ＰＬＺ４−ＮＰ ３０μＬを、全身麻酔下、尿道を介して、膀胱内注射した。２時間インキュベーションした後、Ｋｏｄａｋ画像処理システムを使用する全身のインビボ造影のために、膀胱を摘出した。
実施例９． ＮＰｓ媒介性マルチモーダル画像処理
方法
動物モデル。６〜８週齢の雌の無胸腺ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ系統）を、Ｈａｒｌａｎ社（リバーモア、ＣＡ）から購入した。これらのマウスは、４〜４０月齢で、乳癌を自然発症することがわかっている。全ての動物を、ＡＡＡＬＡＣ指針に従い、無病原体−条件下で飼育し、実験前に少なくとも４日間馴化させた。全ての動物実験は、施設の指針を順守し、並びにカリフォルニア大学デービス校の動物の使用と飼養に関する管理諮問委員会により承認されたプロトコール第０７−１３１１９号及び第０９−１５５８４号に従い、実施した。卵巣癌の皮下異種移植片モデルを、ＰＢＳ及びマトリゲル（１：１ｖ／ｖ）の混合液１００μＬ中のＳＫＯＶ−３卵巣細胞又はＡ５４９肺癌細胞２×１０6個を、雌ヌードマウスの右脇腹に皮下注射することにより、樹立した。乳癌のトランスジェニックマウス（ＦＶＢ／ｎ Ｔｇ（ＭＭＴＶ−ＰｙＶｍＴ））は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社に発注した。
ＮＩＲＦ光学造影。トランスジェニックマウス（１０〜１２週間）及びヌードマウスが樹立された腫瘍（直径６〜１０ｍｍ）を発症した後、これらに、尾静脈からＮＰｓ １００μＬを注射することにより、インビボＮＩＲＦ光学造影を施した。ＮＰｓの注射後異なる時点で、マウスを、麻酔下で、Ｋｏｄａｋマルチモデル造影システムＩＳ２０００ＭＭを、励起帯域通過フィルター６２５／２０ｎｍ及び発光７００／３５ｎｍで用い、走査した。インビボ造影後、動物を安楽死させた。腫瘍及び主要臓器を摘出し、Ｋｏｄａｋ画像処理ステーションにより画像処理した。組織レベルでの生体分布のキネティックをモニタリングするために、ＳＫＯＶ−３腫瘍−保有するマウスに、架橋されたＮＰｓ １００μＬを、尾静脈を介して投与し、１、２４、又は４８時間に安楽死させた。安楽死の直前に、デキストラン−ＦＩＴＣ溶液を、静脈内に注射し、血管を位置づけた(locate)。腫瘍を収集し、氷中の冷ホルマリン中で固定した。新たな横断面を、大規模画像処理（ＬＳＩ）レーザー走査型共焦点顕微鏡造影のために作製した。加えて、転移性病巣を伴う肺も、比較的高齢のトランスジェニックマウス（２０〜２４週間）から収集し、冷ホルマリン中に１時間固定した。肺表面を、ＬＳＩレーザー走査型共焦点顕微鏡法により撮像した。撮像後、肺に、組織病理学的評価を施した。場合によっては、マウスの血液を、予め決められた時点で、採取し、測定した。
ＭＲＩ及びＰＥＴ画像処理。ＳＤＳの非存在下及び存在下での、Ｇｄ−ＮＰｓのインビトロＭＲＩシグナル増強を、１２８×１２８マトリックスサイズを使うＴ１−重み付きファストローアングルショット（ＦＬＡＳＨ）配列（エコー時間（ＴＥ）／繰り返し時間（ＴＲ）＝４／２００ｍｓ）を用いる、Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ ７Ｔ ＭＲＩスキャナーを使用して得た。ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片を保有するヌードマウス、Ａ５４９肺癌異種移植片を保有するヌードマウス及び乳癌を伴うトランスジェニックマウス（ＦＶＢ／ｎ Ｔｇ（ＭＭＴＶ−ＰｙＶｍＴ）を、Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ ７Ｔ ＭＲＩスキャナー上で撮像した。スピンエコー画像を獲得し、固形癌の位置及び容積を決定した。体内及び腫瘍内のＧｄ−ＮＰｓキネティック、並びにナノ粒子−増強されたＭＲＩシグナル強度を評価するために、１２８×１２８マトリックスサイズを使う動的Ｔ１−重み付きＦＬＡＳＨ配列を使用し（ＴＥ／ＴＲ＝４／２００ｍｓ）、注射直前に、及びＧｄ−ＮＰｓの注射（Ｇｄ投与量：Ｇｄ投与量：０．０１５〜０．０２ｍｍｏｌｅ／ｋｇ）後予め決められた時点で、画像を獲得した。ＭＲＩはまた、同じパラメータを使用し、ＰＴＴ／ＰＤＴの前及び後に、ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片を保有するヌードマウス内の腫瘍成長をモニタリングするために使用した。ＰＥＴは、小動物用マイクロＰＥＴシステム（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｉｎｖｅｏｎ Ｄ−ＰＥＴ）上で、64Ｃｕ−標識したＮＰｓ（１５０〜２００μＬ、64Ｃｕ投与量：０．６〜０．８ｍＣｉ）の注射後、ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片を保有するヌードマウスについて行った。ＰＥＴ−ＭＲＩを、小動物用マイクロＰＥＴシステム（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｉｎｖｅｏｎ Ｄ−ＰＥＴ）及びＢｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ ７Ｔ ＭＲＩスキャナー上で行った。Ａ５４９肺癌異種移植片を保有するヌードマウスは、ＰＥＴ画像とＭＲ画像の同時記録を促進するために、両スキャナーにはめ込まれた可動式ベッド上に配置した。64Ｃｕ及びＧｄ二重−標識したＮＰｓ（１５０〜２００μＬ、64Ｃｕ投与量：０．６〜０．８ｍＣｉ、Ｇｄ投与量：０．０１５〜０．０２ｍｍｏｌｅ／ｋｇ）の尾静脈注射後、マウスを、麻酔下（酸素中の２％イソフルラン２Ｌ／分）で、注射後４時間又は２４時間に撮像した。ＰＥＴ画像及びＭＲ画像の同時記録のために、Ａｍｉｄｅソフトウェアを使用した。
結果
ＮＰｓ及びジスルフィド架橋されたＮＰｓの粒子サイズは、およそ２０〜３０ｎｍであり（図１２ｃ、図１６ｂ）、これは、腫瘍を標的化し透過するのに最適な範囲である11,14,20。それらの可逆的に架橋する性質及び独特なアーキテクチャー−依存性蛍光特性を基に、架橋されたＮＰｓは、血液中のバックグラウンド抑制及び腫瘍部位での優先的蓄積及びシグナル増幅により、改善された癌検出に関するＮＩＲＦＩ感度を増大するための、活性化可能な光学ナノプローブとして使用するのに特に適している。架橋されたＮＰｓは、血液循環中で最小バックグラウンド蛍光シグナルを伴い、サイレント（又は「オフ」状態）で存在することができる（図３８ａ、下側パネル）。血液中の架橋されたＮＰｓの消光状態は更に、ＳＤＳ及びＧＳＨの添加による、蛍光の回復により明らかにされた（図３９）。予想されたように、ＳＫＯＶ−３卵巣癌マウスモデルにおいて、全身内の全体的蛍光シグナルは、静脈内注射後、架橋されたＮＰｓについて、非架橋のＮＰｓよりも、劇的に低下した（図３８ａ）。サイズにより媒介された増強された透過性亢進及び残存（ＥＰＲ）効果による腫瘍部位での蓄積時に、これらの架橋されたナノプローブは、腫瘍部位での又は癌細胞内の、内在性還元剤ＧＳＨによるジスルフィド結合の切断により、「オン」に変化し、その後ミセル解離及び蛍光シグナル増幅が続く。架橋したＮＰｓは、注射後２４時間で、非架橋のＮＰｓよりも、有意に高い腫瘍蓄積を示した（図３８ａ）。注射後２４時間でのエクスビボ造影は、非架橋ＮＰｓ及び架橋されたＮＰｓの両方が、正常臓器と比べ勝った腫瘍における蛍光シグナルを有することを示した（図３８ｂ）。腫瘍部位での架橋されたＮＰｓの平均蛍光は、同じ群のマウスの筋肉における値よりも１５倍高く、且つ腫瘍部位の非架橋のＮＰｓの値よりも３倍高かった（図３８ｃ）。架橋されたＮＰｓと非架橋のＮＰｓの間の示差的蛍光シグナルは、循環内の架橋されたＮＰｓの構築体の安定性、従ってより高い腫瘍への取り込みにより説明することができる。
図３８ｄは、架橋されたＮＰｓ（赤色）の腫瘍内分布の投影像を示す。腫瘍血管（ＢＶ）は、デキストラン−ＦＩＴＣにより標識した（緑色）。ＮＰｓからの全体のＮＩＲＦシグナルは、注射後１時間で、腫瘍組織の内側で非常に低かった（図３８ｄ、左側）。２４時間で、有意なＮＩＲＦシグナルが、血管（緑色）の周囲に認められ（図３８ｄ、中央）、これは、ＢＶの周囲の腫瘍組織へのＮＰｓの蓄積及び部分的解離を示している。４８時間時点で、ＮＰｓシグナルは、腫瘍全体を通じて散在性に分布し、それらの優れた組織透過能及び解離能を暗示している（図３８ｄ、右側）。これらの結果は、動物モデルにおいて下記の光線療法のデザインを導く上で非常に有益であることを証明した。
次に本発明者らは、静脈内注射により自然発症した乳癌を伴うトランスジェニックマウス（１０〜１２週齢）（ＦＶＢ／ｎ Ｔｇ（ＭＭＴＶ−ＰｙＶｍＴ））において、架橋されたＮＰｓのＮＩＲＦＩの能力を調べた。これらのトランスジェニックマウスは自然発症的に異なるサイズの複数の乳癌を発症し、且つ腫瘍細胞及び内皮細胞の両方が、同じマウスに由来するので、同系又は異系腫瘍インプラントモデルにおいて起こり得る腫瘍血管の人工物(artifact)の懸念は存在しない。２４時間後、ＮＰｓが腫瘍内及び腫瘍細胞の内側に蓄積したので、高い蛍光が、全ての自然発症乳癌において認められ（図３８ｅ）、ＮＰｓは解離し、且つ消光し始めた。図３８ｅにおいて、白色矢印は、腫瘍部位を指している。腫瘍容積は、（Ｌ×Ｗ2）／２により算出した（式中、Ｌは腫瘍直径（ｍｍ）の最長部分、及びＷは最短部分である）。エクスビボ造影は、２４時間後の、９つの摘出した乳房腫瘍全てにおいて、正常臓器と比べＮＰｓの優先的取り込みを更に確認した。乳房脂肪体上の小さい腫瘍であっても（容積およそ１８ｍｍ3）、ＮＰｓからの非常に強力なＮＩＲＦシグナルを有する（図３８ｅ）ことは言及されるべきであり、これは、ＮＰｓは初期乳癌の検出における使用可能性があることを指摘している。次に本発明者らは、大規模造影（ＬＳＩ）レーザー走査型共焦点顕微鏡を用い、より高齢のトランスジェニックマウス（２０〜２４週間）におけるＮＰｓの分布を調べ、肺内の転移性病巣の小さい限局性の蓄積をうまく位置づけした（容積およそ０．００６ｍｍ3及び０．５ｍｍ3）（図３８ｆ、図４０）。図３８ｆにおいて、白色矢印は、転移部位を指している。赤色：ナノポルフィリン；緑色：デキストラン−ＦＩＴＣ標識した腫瘍血管（バー＝２５０μｍ）。これらの結果は、ＮＰｓは、原発性腫瘍に加え、小さい転移性病巣を検出する大きい機会をもたらし得ることを指摘している。
ＮＰｓは、Ｇｄ（ＩＩＩ）をキレートする固有の能力を有し（図１２ｄ、ｆ）、且つアーキテクチャー−依存性磁気共鳴特性を有し、このことは、ＮＰｓを高感度及び腫瘍−特異性ＭＲＩのための活性化可能な造影剤としてそれらを使用することを可能にする。図１２ｇ、ｈの蛍光測定同様、Ｇｄ−ＮＰｓがＰＢＳ中でそれらの完全性を保持する場合、最小ＭＲＩシグナル増強が存在する（図４１ａ）。これは恐らく、疎水性コアと親水性コロナの間の境界面でのＧｄ／Ｐｏｒのスタッキング（図１２ｆ）に起因し、その結果Ｇｄ（ＩＩＩ）を水中のプロトンとの相互作用から遮蔽するのであろう。ＳＤＳ中での解離時に、ＰｏｒによりキレートされたＧｄイオンは、隣接プロトンのスピン−格子緩和時間を短縮するように接近し、その結果ＭＲＩシグナルの増強を生じる（図４１ａ）。循環ＮＰｓのバックグラウンドシグナルは低いので、このＧｄ−ＮＰｓの独自のアーキテクチャー上の性質は、腫瘍の高感度のＭＲＩ検出の機会をもたらす。本発明者らは、「自然発症」乳癌を伴うトランスジェニックマウスにおけるＭＲＩのためのＧｄ−ＮＰｓの適応の正当性を確認した。注射後異なる時点での代表的切片のセットを、図４１ｂに示した。本発明者らは、Ｇｄ−ＮＰｓは、注射後１．５時間で、腫瘍のコントラストを有意に増強することができ、正常組織においては非常に低いシグナル増強であることを明らかにした。この腫瘍のコントラストは、２６時間以上持続された。これらの試験において使用したＧｄ投与量は、ヒトに関する臨床推奨Ｇｄ投与量21の１／７と等しかった。これらの結果は、Ｇｄ−ＮＰｓが血液プール中を循環する場合には、全身におけるＭＲＩシグナル増強は低いことを確認した。腫瘍部位又は腫瘍細胞に到達した後、Ｇｄ−ＮＰｓは解離し、Ｇｄイオンの周囲のプロトンとの相互作用が可能になり、結果的に腫瘍部位でのみ有意なＭＲＩコントラストを生じる（図１２ｂ）。
更にＮＰｓは、ＰＥＴ用ナノプローブとしての適用のための放射性追跡子を組み込む固有の能力を有する。例えば、本発明者らは、簡便で迅速なワンポット式の高収率の放射標識戦略による、ＰＥＴ造影のために、ＮＰｓへ放射性追跡子（64Ｃｕ（ＩＩ））を組み込んだ（放射性化学物質の収率（ＲＹＣ）＞９６．５％）（図１２ｄ、図４２）。64Ｃｕ（ＩＩ）を直接キレートすることは、それらの生体分布のみではなく、薬物動態も、ＰＥＴによりインビボにおいて非侵襲的に追跡することを可能にするという、ＮＰｓの固有の能力である（図４１ｃ）。ＰＥＴ造影は、64Ｃｕ−ナノポルフィリンは、注射後４時間から腫瘍部位に蓄積し始め、１６時間で最高レベルに到達したことを示した。２４時間後、この放射標識は、移植された腫瘍において主に認められ、体の残りの部分においては非常に低いバックグラウンドであることがわかった（図４１ｃ）。本発明者らはここでは実施しなかったが、67Ｃｕのキレート化及び癌−特異的送達は、全身のインサイチュ放射線治療のために使用する可能性がある。
ＰＥＴとＭＲＩの相乗的組合せは恐らく、正確な診断を提供するための、次世代のデュアル−モダリティスキャナーとなり始めるであろう22,23。結果的に、ＰＥＴ画像（高感度及び定量化可能性）及びＭＲ画像（高軟組織解像度）の相補的強みを活用するデュアル−モダリティ薬剤を開発する大きな必要性が存在する24,26。Ｇｄ（ＩＩＩ）及び放射性追跡子を同時にキレートする固有の能力を有する外来性キレート剤−非含有ナノプラットフォームとして、ＮＰｓは、ＰＥＴ−ＭＲＩのためのデュアル−モダリティナノプローブの開発の大きな将来性を示している。本発明者らは、64Ｃｕ（ＩＩ）及びＧｄ（ＩＩＩ）の両方を、ＮＰｓへ効率的に組み込むことができることを示した（図１２ｄ、図４２）。二重標識されたＮＰｓは、注射後２４時間で、腫瘍部位において、ＭＲＩコントラスト及びＰＥＴシグナルを有意に増強することができる（図４１ｄ、ｅ）。興味深いことに、腫瘍の不均一性と腫瘍内のＮＰｓの同質でない分布が、ＰＥＴ−ＭＲＩにより非侵襲性に明らかにされた（図４１ｅ）。
実施例１０． ＮＰｓ媒介型マルチモーダル療法
方法
インビボ治療試験。乳癌のトランスジェニックマウス（ＦＶＢ／ｎ Ｔｇ（ＭＭＴＶ−ＰｙＶｍＴ）及びＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片を保有するヌードマウスを、インビボ治療試験のために使用した。トランスジェニックマウスにおいて腫瘍容積が４〜５ｍｍに到達した時点で、架橋されたＮＰｓを、２．５ｍｇ／ｋｇ ＤＯＸを伴う又は伴わずに、尾静脈を介して毎週１回、３投与量を注射した。２４時間後、全身麻酔下で、腫瘍を、ダイオードレーザーシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ社、ニューポート、ＣＴ）により６９０ｎｍで照射した。光線量は、全腫瘍をおおう０．８ｃｍ2ビームスポットを生じる光ファイバーを通じて、１．２５Ｗ／ｃｍ2で２分間であった。腫瘍温度を、赤外カメラ（Ｆｌｉｒ）により記録した。照射後の腫瘍内のＲＯＳ生成を、ＮＰｓ及びＰＢＳで処理した腫瘍に由来する組織溶解液１００μＬと混合した２’，７’−ジクロロフルオレシンジアセタート（ＤＣＦ）を用いて測定した。場合によっては、マウスの血液を採取し、照射後の血液中のＲＯＳ及び熱発生を、予め決められた時点で測定した。引き続き溶血した。腫瘍容積を、週２回測定し、一旦腫瘍サイズが１０００ｍｍ3に到達したならば、マウスを屠殺した。腫瘍を、照射後２４時間の組織病理学的評価のために摘出した。ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片モデルは、１００万個の細胞を、下方脇腹部位に皮下に注射することにより、樹立した。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ3に到達した後、マウスに、ＰＢＳ、２．５ｍｇ／ｋｇ ＤＯＸ、並びに２．５ｍｇ／ｋｇ ＤＯＸ内包型又は非内包型架橋されたＮＰｓを、３日毎に、３投与量与えた。レーザー光０．２Ｗ／ｃｍ2を、投薬の１及び３回目後に２分間あてた。腫瘍サイズ及び体重を、週２回測定し、同時に毒性の潜在的徴候について毎日マウスをモニタリングした。最終投薬の２日後、ＣＢＣ及び血清化学試験を行った。また各群から１匹のマウスを屠殺し、組織病理学的評価のために、主要臓器を摘出した。
統計解析。統計解析は、２群についてはスチューデントｔ−検定、及び複数群については一元配置ＡＮＯＶＡにより行った。全ての結果は、別に注記しない限りは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表した。Ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意とみなした。
結果
ＰＤＴ及びＰＴＴなどの光−ベースの技術は、癌治療の有望な機会をもたらす27-36。光線療法の臨床使用は、以下の点により妨げられている：１）光増感剤は、腫瘍と正常組織の間の選択性が悪く、その結果限定された有効性及び正常組織への光毒性をもたらす37-41；２）光線療法が媒介した酸化的ストレスは、腫瘍微小環境において、サバイビン、Ａｋｔ、低酸素症誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの、生存促進性及び血管新生性シグナル伝達分子の発現を誘導し、このことは治療効果に負の影響を及ぼし且つ腫瘍再発に繋がり得る27,42,43。ミセル及びリポソームなどのナノ担体は、光線療法に関して、腫瘍への光増感剤の標的化された送達のために使用されている6,44。しかしインビボにおける結果は、これらのナノ担体の腫瘍標的化特異性は、恐らくインビボにおける不安定性及び正常組織における非特異的標的化のために、予想されたほど良好ではないことを示している44。より最近になって、有機ポルフィソーム(porphysome)ナノ小胞の新規クラス6が、PTTのための光を熱に効率的に変換する、多機能性生体光工学薬剤として報告された。残念ながら、ポルフィソームは、それらのかなり大きいサイズ（〜１００ｎｍ）のために、一部高い肝臓及び脾臓蓄積を有し、結果的に細網内系（ＲＥＳ）による非特異的クリアランスを有する傾向がある11,14,20。対照的に、架橋されたＮＰｓは、極めて低い肝臓及び脾臓取り込み、並びに高い腫瘍標的化特異性を示した（図３８ｂ、ｃ）。架橋されたＮＰｓの使用は、光増感剤の光−毒性を最小化し、且つ光線療法の有効性を大きく増強することができることが予想される。
ＰＴＴは、ＰＤＴと相乗作用を有し、且つ増感剤及び薬物の局所的透過性を亢進することにより、ＰＤＴ及び化学療法の転帰を増強することができることを示す研究が存在する33,45,46。いくつかの無機ナノ粒子錯体、例えば光増感剤にコンジュゲートされた金ナノロッド33、グラフェンオキサイドナノ粒子45、及びシリカ-コートされたパラジウム/銀ナノ粒子46などが、ＰＴＴ／ＰＤＴデュアル療法のために開発された。しかし、これらの錯体の合成は、複雑であり、且つこれらのナノ粒子の活性化には、複数波長のレーザー（例えば、８０８ｎｍ及び６７５ｎｍ）を使用する２つの個別の照射が必要である33,45,46。また、これらの無機ナノ粒子の長期安全性に関する懸念も存在する。
本発明者らはまた、トランスジェニックマウスの腫瘍部位での温度は、ＮＰｓの注射後２４時間で、光照射（１．２５Ｗ／ｃｍ2で２分間）後、５７℃まで上昇したことも明らかにした（図４３ａ、ｃ）。この温度は、癌細胞に不可逆的損傷を引き起こすのに十分である6。対照的に、ＰＢＳ対照群での腫瘍部位の温度は、同じ光曝露により、わずか４１℃まで上昇した（図４３ｂ、ｃ）。照射後ＮＰｓにより生成されたＲＯＳも、ＰＢＳ対照群での組織バックグラウンドよりも、有意に高かった（図４３ｄ）。組織病理学試験は、照射後２４時間で、細胞破壊及びアポトーシスなどの重篤な組織損傷の大きい領域を明らかにし（図４３ｅ）、これらはＴＵＮＥＬ陽性結果及び切断されたカスパーゼ３免疫反応性により証明された（図４４）。これらの変化は、熱及びＲＯＳ生成の両方の作用に起因するであろう（図４３ａ、ｃ、ｄ）。
本発明者らは、架橋されたナノポルフィリンは、ヒト血漿中の薬物放出は最小化するが、光曝露及び細胞内還元剤により、薬物内容物を放出する引き金をひくことができる、プログラム可能に放出するナノ担体として使用することができることを、図１６に示した。同時のＰＴＴ／ＰＤＴ及び化学療法に関して、近赤外光の照射時に、薬物負荷され及び架橋されたＮＰｓは、腫瘍部位において、一重項酸素、熱及び薬物を同時に放出するように活性化されると予想される。本発明者らは次に、トランスジェニック及び異種移植片マウスモデルにおける架橋されたＮＰｓの抗癌効果を評価するために、インビボ治療試験を行った。トランスジェニックマウス試験において、ＮＰ−媒介したＰＴＴ／ＰＤＴは、光線量１．２５Ｗ／ｃｍ2で２分間、１週間に１回により、ＰＢＳ対照群及びＮＭ−ＤＯＸ群と比べ、腫瘍成長を有意に阻害することができる。治療された腫瘍は、潰瘍化を伴い、１２日目に完全に除去された（図４３ｆ）。触手可能な腫瘍は、３２日目であっても検出されなかった（図４３ｇ）。ＰＴＴ／ＰＤＴのＤＯＸとのＣＮＰ−ＤＯＸ媒介型併用療法は、同様の有効性を示した（図４３ｆ、ｇ）。ＮＰ媒介型併用療法の有効性を効果的に比較するためには、本発明者らは、より低いＮＰｓ投与量及び／又はより少ない光線量を使用することが必要であろう。これは、今後の研究対象であろう。興味深いことに、ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片モデルにおいて、ＮＰ媒介型光線療法、遊離ＤＯＸ、及びＮＭ−ＤＯＸ媒介型化学療法は、ＳＫＯＶ−３において、ＰＢＳ対照群よりもより遅い腫瘍成長を生じた（図４３ｈ）。同じ投与量のＤＯＸ、光増感剤（ポルフィリン）及び光（０．２５Ｗ／ｃｍ2で２分間）が投与される場合、ＣＮＰ−ＤＯＸ媒介性併用療法は、これらの群間で最良の抗腫瘍活性を示し、本試験を通じて腫瘍成長を全体的に阻害した。治療の３回投薬後には、体重、全血球数、及び血清化学において、有意な変化は認められなかった（図４５、表１）。マウスは、実験室において環境光を遮らずに取り扱い、皮膚の光−毒性は示されなかった。
ＮＰｓの独自の造影能力を基に、ＭＲＩの深部組織浸透を利用する非侵襲的リアルタイム造影戦略を利用し、好都合なことにＮＰｓの同時送達及び検出に加え、ＰＴＴ／ＰＤＴ後の腫瘍サイズ及び腫瘍内部の壊死を含む、治療後のそれらの治療的有効性をモニタリングすることができる。概念実証として、本発明者らは、ＭＲＩを使用し、光照射を伴う又は伴わずに、Ｇｄ−ＮＰｓの投与後の、ＳＫＯＶ−３卵巣癌マウスモデルにおける腫瘍成長を観察した（図４３ｉ）。ＭＲ画像は、Ｇｄ−ＮＰｓは、腫瘍部位での有意な蓄積を有し、これは注射後４時間で始まることを示した。治療群に関して、腫瘍は、注射後２４時間で照射した。注射後４８時間（照射後２４時間）のＭＲ画像は、腫瘍の退縮及び腫瘍部位の壊死容積の増加を示した。ＭＲＩは、注射後７日目に完全な腫瘍除去を示した。対照的に、照射しない対照マウスの腫瘍成長は、ＭＲ画像により明らかなほど影響されなかった（データは示さず）。
前述の発明は、理解を明確にする目的で例証及び実施例により一部詳細に説明されているが、当業者は、ある種の変更及び改変を、添付された請求項の範囲内で実行することができることを理解するであろう。加えて、本明細書に提供される参考文献の各々は、各参考文献が個別に引用により組み込まれているのと、同じ程度にその全体が引用により組み込まれている。本出願と本明細書に提供される参考文献の間に矛盾が存在する場合は、本出願が支配するものとする。

Claims (12)

  1. 以下：
    （式中、
    ＰＥＧは、分子量１〜１００ｋＤａを有する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり；
    Ａは、少なくとも１個の分岐したモノマー単位Ｘを含み、且つ少なくとも１個のＰＥＧ基に連結され；
    各分岐したモノマー単位Ｘはリジンであり；
    各Ｙ2は、存在しないか、又はシステインであり；
    各Ｌ2は、独立して、結合又はリンカーであり；
    各Ｒは、ポルフィリン、コール酸、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−４ＯＨ）、（３α，５β，７α，１２α）−７−ヒドロキシ−３，１２−ジ（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−５ＯＨ）、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−３ＯＨ−ＮＨ2）、ギ酸コレステロール、ドキソルビシン、及びレインからなる群から独立して選択され、ここで少なくとも１個のＲ基は、ポルフィリンである。）
    の構造を有する化合物。
  2. リンカーＬ2が、存在する場合には、ポリエチレングリコール、ポリセリン、ポリグリシン、ポリ（セリン−グリシン）、脂肪族アミノ酸、６−アミノヘキサン酸、５−アミノペンタン酸、４−アミノブタン酸及びβ−アラニンからなる群から独立して選択される、請求項１記載の化合物。
  3. 各リンカーＬ2が、下記式：
    を有する、請求項１記載の化合物。
  4. 各残存するＲが、コール酸である、請求項１記載の化合物。
  5. ＰＥＧは、ＰＥＧ５ｋであり；
    Ａは、リジンであり；
    各Ｌ2は、結合又はリンカーＥｂｅｓ（８−アミノ−３，６−ジオキサオクチルコハク酸）であり；及び 各Ｒは、コール酸又はポルフィリンである、請求項１記載の化合物。
  6. 下記：
    （式中、
    各Ｒ’は、コール酸（ＣＡ）、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−４ＯＨ）、（３α，５β，７α，１２α）−７−ヒドロキシ−３，１２−ジ（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−５ＯＨ）及び（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−３ＯＨ−ＮＨ2）からなる群から選択され；並びに
    各Ｒ”は、ピロフェオホルビド−ａ、フェオホルビド、クロリンｅ６、プルプリン及びプルプリニミドからなる群から選択されるポルフィリンである。）
    からなる群から選択される、請求項５記載の化合物。
  7. ポルフィリンが、ピロフェオホルビド−ａである、請求項６記載の化合物。
  8. 化合物が、下記：
    （１）各Ｌ2が結合であり、各Ｙ2が存在せず、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａである化合物；
    （２）各Ｌ2がリンカーＥｂｅｓ（８−アミノ−３，６−ジオキサオクチルコハク酸）であり、各Ｙ2が存在せず、各Ｒ’がコール酸であり、
    各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａである化合物；
    （３）各Ｌ2が結合であり、各Ｙ2がシステインであり、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａである化合物；
    （４）各Ｌ2がリンカーＥｂｅｓであり、各Ｙ2がシステインであり、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａである化合物；
    （５）各Ｌ2が結合であり、各Ｙ2が存在せず、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａである化合物；
    （６）各Ｌ2がリンカーＥｂｅｓであり、各Ｙ2が存在せず、各Ｒ’がコール酸であり、
    各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａである化合物；
    （７）各Ｌ2が結合であり、各Ｙ2がシステインであり、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａである化合物；並びに
    （８）各Ｌ2がリンカーＥｂｅｓであり、各Ｙ2がシステインであり、各Ｒ’がコール酸であり、各Ｒ”がピロフェオホルビド−ａである化合物
    からなる群から選択される、請求項６記載の化合物。
  9. 内側及び外側を有するナノ担体であって、該ナノ担体が、複数の第一のコンジュゲートを含み、ここで各コンジュゲートは、請求項１記載の化合物であり、
    ここで各コンジュゲートは、水性溶媒中で自己組織化し、ナノ担体を形成し、その結果疎水性ポケットが、各両親媒性化合物の疎水面の互いへの配向により、ナノ担体の内側に形成され、ここで各コンジュゲートのＰＥＧは、ナノ担体の外側上に自己組織化している、ナノ担体。
  10. ナノ担体が、
    （a）疎水性薬物又は造影剤を更に含み、その結果疎水性薬物又は造影剤が、ナノ担体の疎水性ポケット内に封鎖され、前記疎水性薬物が、ボルテゾミブ、パクリタキセル、ＳＮ３８、カンプトテシン、エトポシド及びドキソルビシン、ドセタキセル、ダウノルビシン、ＶＰ１６、プレドニソン、デキサメタゾン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テムシロリムス、カルムシン、ソラフィニブ、ラパチニブ、及びボルテゾミオブからなる群から選択される、
    （b）ポルフィリンにキレートされた金属陽イオンを含み；
    （c）64Ｃｕ、67Ｃｕ、177Ｌｕ、67Ｇａ、111Ｉｎ、及び90Ｙｔからなる群から
    選択される放射性−金属陽イオンを含み、ここで前記放射性金属が、ポルフィリンへキレートされている、
    （d）コンジュゲートが、架橋基を介して架橋され、
    （e）各コンジュゲートが、
    少なくとも２個のコール酸；
    少なくとも２個のピロフェオホルビド−ａ基；及び
    少なくとも２個の架橋基を含み、
    ここで、ナノ担体のコンジュゲートが、架橋基を介して架橋される、
    （f）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー；
    ＰＥＧポリマーに連結された結合リガンド；
    親水面及び疎水面の両方を有する、少なくとも２個の両親媒性化合物；
    ＰＥＧ及び両親媒性化合物へ、共有結合された、樹状分岐高分子、を含む、少なくとも１個の結合コンジュゲートを含み、
    ここで、各結合コンジュゲートは、水性溶媒中で第一のコンジュゲートと自己組織化し、ナノ担体を形成し、その結果疎水性ポケットが、各両親媒性化合物の疎水面の互いへの配向により、ナノ担体の内側に形成され、ここで各コンジュゲートのＰＥＧが、ナノ担体の外側上に自己組織化している、請求項９記載のナノ担体。
  11. 治療有効量の請求項９又は１０記載のナノ担体を含む、音波力学療法により疾患を治療するための医薬組成物であって、該医薬組成物はそれを必要とする対象へ投与され、且つ該対象は音波に曝露される、医薬組成物。
  12. 対象における腫瘍検出を補助する方法であって、
    投与された有効量の請求項９又は１０記載のナノ担体に第一波長の放射線を曝露した対象由来の試料を準備し、
    ここで該放射線は、ナノ担体上に存在するポルフィリンを励起し、その結果ポルフィリンが、第二波長の放射線を放出すること；並びに
    励起されたポルフィリンにより放出された放射線を検出すること
    を含む、腫瘍検出方法。
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