CN104013960B

CN104013960B - 一种靶向光热治疗用水溶性复合物及其制备方法与应用

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Publication number: CN104013960B
Application number: CN201410208088.6A
Authority: CN
Inventors: 蒋邦平; 沈星灿; 张丽
Original assignee: Guangxi Normal University
Current assignee: Guangxi Normal University
Priority date: 2014-05-17
Filing date: 2014-05-17
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-05-17
Also published as: CN104013960A

Abstract

本发明公开一种靶向光热治疗用水溶性复合物，为聚苯胺-透明质酸掺杂态水溶性复合物，以苯胺和透明质酸为原料，采用下述的一步法制备而成：将苯胺及透明质酸混合于水中并搅拌，0~5℃下滴加与苯胺等摩尔量的过硫酸铵水溶液。本发明利用化学氧化聚合法，在无酸条件下一步合成具有醌式结构参杂态聚苯胺纳米粒子，并用透明质酸（带负电的多糖）将带有部分正电荷的掺杂态聚苯胺包裹，形成纳米球，增加聚苯胺水溶性。本发明的复合物同时具有光热治疗与靶向的双重作用，增强了对癌细胞的杀伤效率；制备方法简便，一步合成既解决了聚苯胺的水溶性，又增加光热治疗的靶向性，在光热治疗方面有潜在的应用价值。

Description

一种靶向光热治疗用水溶性复合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及光热治疗剂，属于生物医用材料技术领域。具体涉及一种靶向光热治疗用水溶性复合物及其制备方法与应用。本发明涉及的制备方法以苯胺和透明质酸为材料，采用一步化学氧化聚合法，所得产物用于靶向光热治疗。

背景技术

光热疗法是利用光热材料吸收特定波长的光，通过非辐射衰减将吸收的能量转化为热导致局部环境温度升高，进而实现对病变部位的治疗。而在治疗过程中如果能够赋予光热材料靶向性，使得光热材料能够有针对性地进入病变细胞，进一步，通过吸收具有较好的组织穿透性及对人体伤害小的近红外光对病变细胞进行加热，则可以不损伤正常组织，提高光热疗法的精确性及可控性。与传统的手术、放疗和化疗等技术相比，光热治疗具有过程简便、无创或微创、并发症少、恢复快、住院时间短等优势，因而能有效缓解患者病痛，提高患者治疗效果。

聚苯胺是一种具有特殊的电学、光学性质的高分子材料，常被用作为研究细胞增殖的电活性材料( M.Y Li, Y Guo, Y Wei, A. G. MacDiarmid, P. I. Lelkes, J.Biomaterials. Sci. Polym. Ed. 2006, 27, 2705–2715)。聚苯胺的电活性源于分子链中的P电子共轭结构：随分子链中P电子体系的扩大，P成键态和P*反键态分别形成价带和导带，这种非定域的P电子共轭结构经掺杂可形成P型和N型导电态。经掺杂后在聚苯胺的价带和导带之间产生一个能带，从而迫使电子发生转移，降低了激发态能级，所以当聚苯胺上亚胺基团转变成亚胺盐时，即形成具有醌式结构掺杂态的聚苯胺时，其吸收峰将移到近红外区域。因此，掺杂态的聚苯胺可以很好的应用于光热治疗( Yang, J.; Choi, J.; Bang,D.; Ki m, E.; Lim, E. K.; Park, H.; Suh, J. S.; Lee, K.; Yoo, K. H.; Ki m, E.K.; Huh, Y. M.; Haam , S. Angew. Chem.,Int. Ed. 2011, 50 , 441–444)，该发现将对聚苯胺应用于活体生物纳米技术领域起到非常重要的作用。由于聚苯胺链刚性和链间强相互作用，导致其溶解性极差，在水溶液中几乎不溶，极大地限制了聚苯胺在生物纳米技术领域的应用。因此，改善聚苯胺水溶性近年来受到广泛的关注。而近年来发现通过结构修饰（Yanyin Y, Yong M, Jen-Chieh W, et al. Rapid Commun. 2011, 32, 887-892）、聚合（Dipankar C, Broja M M. . Langmuir. 1996, 12(6): 1585-1588；Jaroslav S, PavelK. Langmuir. 1996, 12, 3389-3392）及制备胶体颗粒（Mohamad A, Gad E H, Sawsan Z.Chemical Engineering Journal. 2013, 217, 460-465）等方法可获得水溶性的聚苯胺。

透明质酸, 别名玻璃酸、糖醛酸、玻尿酸，其英文缩写：HA，是一种酸性粘多糖。它是肌肤水嫩的重要基础物质，本身也是人体的一种成分，为具有较高临床价值的生化药物，广泛应用于各类眼科手术，如晶体植入、角膜移植和抗青光眼手术等。还可用于治疗关节炎和加速伤口愈合。透明质酸是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的线状的带有负电荷的酸性多糖，内侧由于存在大量的羟基而产生强亲水性，溶于水，不溶于有机溶剂。具有良好的生物相容性、生物可降解性、水溶性、无毒性等，在细胞的增殖和转移等方面发挥重要用。在大多肿瘤细胞表面有过度表达的透明质酸受体CD44(典型的有HCT-116，MCF-7，Hela细胞)，而通过与CD44的作用，其可以有效的选择性键合细胞(Culty M, NguyenH A, Underhill C B. J Cell Biol . 1992, 116(4):1055–1062）。因此，透明质酸可以作为抗恶性肿瘤药物的载体，实现靶向治疗目的(Hyukjin L, Kyuri L, Tae G P.Bioconjugate Chem. 2008,19, 1319-1325)。

发明内容

本发明应用化学氧化法合成聚苯胺-透明质酸复合物纳米粒子，利用纳米粒子中聚苯胺的光热转换效应和透明质酸的良好水溶性及对癌细胞的靶向特性，增加了聚苯胺水溶性，研究其对特定癌变部位的光热治疗效果。

本发明基于上述背景技术，第一个目的就是提供一种靶向光热治疗用水溶性复合物。

这种靶向光热治疗用水溶性复合物，为聚苯胺-透明质酸掺杂态水溶性复合物，以苯胺和透明质酸为原料，采用下述的一步法制备而成：将苯胺及透明质酸混合于水中并搅拌，0~5℃下滴加与苯胺等摩尔量的过硫酸铵水溶液。

本发明的第二个目的是提供一种一步法制备上述靶向光热治疗用水溶性复合物的方法。

所述的靶向光热治疗用水溶性复合物的制备方法，包括：将1份苯胺及1~4倍苯胺质量的透明质酸混合于水中，搅拌20~40分钟充分物理混合，在0~5℃继续搅拌保持20~60分钟；与苯胺等摩尔量的过硫酸铵溶于水中，滴加到上述混合液中，保温反应16~30小时；过滤并水洗后干燥。

上述的方法还可以包括将所得物研磨至细粉状。这样使得粒子更加微细，便于分散，以及提高收的率。

上述的方法还可以包括将所得物分散到去离子水中超声处理，静置后取上清液。这个过程是为了更好地除去大颗粒聚集物，超声处理的作用是可以分开聚集的粒子，避免微细粒子被抛弃。所述超声处理时间为30~180 分钟。

所述的制备方法中，所述透明质酸的混合量为苯胺质量的2~3倍为佳；

所述水为去离子水，这其中最为常用的就是蒸馏水；

为使反应进行的更加充分和彻底，以及易于控制，过硫酸铵水溶液需要慢慢滴加，一般来说所述过硫酸铵水溶液滴加速度为：1~2 ml/min；

保温反应是需要控制温度依然在0~5℃范围，最好是使得保温反应于冰水浴中（也就是0℃）进行，反应24小时；

所述干燥为真空干燥，真空干燥温度为40~60℃，真空干燥时间为24~48小时。

为了确保产物质量，尽量减少其中残剩的反应物，在过滤水洗时最好用蒸馏水洗三次。

本发明的第三个目的是提供一种一种药物组合物。

该组合物包含至少一种药学上可接受的载体和上述所述的靶向光热治疗用水溶性复合物。

本发明还提供上述所述的靶向光热治疗用水溶性复合物和上述的所述药物组合物在制备抗肿瘤药物的应用。

抗肿瘤药物的剂型包括注射剂、口服剂、外用搽剂以及其它药学上的适宜剂型。适宜采用光热治疗的剂型，都是可以的。

所述肿瘤包括典型的宫颈癌、乳腺癌及结肠癌。也包括其它的适宜采用光热治疗的实体瘤。

在本发明的靶向光热治疗用水溶性复合物的复合体系中，一方面，聚苯胺作为光热治疗剂参与疾病的治疗；另一方面，透明质酸既改善了聚苯胺的水溶性，其自身也具有靶向癌细胞的效果。该多功能治疗复合体系，在红外光照射下可有效地有针对性地杀死癌细胞。

本发明的优点在于：

该复合物的制备方法简便，在无酸条件下合成具有醌式结构的聚苯胺-透明质酸复合纳米粒子纳米粒子并改善了聚苯胺的水溶性；

利用聚苯胺的光热治疗及透明质酸的癌细胞靶向性增强对癌细胞的杀伤率；

试验证实，本发明所得的靶向光热治疗用水溶性复合物可以在水体系中均匀分散并稳定存在至少 2 个月以上。

附图说明

附图为本发明的靶向光热治疗用水溶性复合物水溶液的温度随光照时间变化图。

具体实施方式

制备实施例 1

（1）0.652g苯胺溶于30 ml蒸馏水，按苯胺与透明质酸质量比为1:1加入透明质酸，搅拌20分钟充分物理混合，在冰水浴下继续搅拌保持30分钟。1.597g过硫酸铵溶于70 ml蒸馏水中，慢慢滴加到上述混合溶液中，滴加时间为1小时。再在冰水浴中反应24小时，停止反应。过滤并用蒸馏水洗三次。50 ℃真空干燥一昼夜，取出研磨成细粉。

（2）将上述样品分散到蒸馏水中并用超声仪超声60分钟。将所得溶液静置，取上清液，以除去大颗粒聚集物。得到靶向光热治疗用水溶性复合物水溶液。

制备实施例 2

（1）0.652g苯胺溶于30 ml蒸馏水，按苯胺与透明质酸质量比为1:1.25加入透明质酸，搅拌20分钟充分物理混合，在冰水浴下继续搅拌保持30分钟。1.597g过硫酸铵溶于70ml蒸馏水中，慢慢滴加到上述混合溶液中，滴加时间为1小时。再在冰水浴中反应24小时，停止反应。过滤并用蒸馏水洗三次。50 ℃真空干燥一昼夜，取出研磨成细粉。

（2）将上述样品分散到蒸馏水中并用超声仪超声120分钟。将所得溶液静置，取上清液，以除去大颗粒聚集物。得到靶向光热治疗用水溶性复合物水溶液。

制备实施例 3

（1）0.652g苯胺溶于30 ml蒸馏水，按苯胺与透明质酸质量比为1:4加入透明质酸，搅拌20分钟充分物理混合，在冰水浴下继续搅拌保持30分钟。1.597g过硫酸铵溶于70 ml蒸馏水中，慢慢滴加到上述混合溶液中，滴加时间为1小时。再在冰水浴中反应30小时，停止反应。过滤并用蒸馏水洗三次。50 ℃真空干燥一昼夜，取出研磨成细粉。

（2）将上述样品分散到蒸馏水中并用超声仪超声40分钟。将所得溶液静置，取上清液，以除去大颗粒聚集物。得到靶向光热治疗用水溶性复合物水溶液。

测试实例 1

实验方法如下：

将制备实施例 2所得的靶向光热治疗用水溶性复合物水溶液配制75μg/mL。取1mL该溶液，用808 nm激光（1W，光斑直径5 mm）照射，用红外热像仪记录溶液的温度随光照时间的变化。见附图1。

由图看出，随着光照时间的增加，靶向光热治疗用水溶性复合物水溶液的温度也显著升高，并在10分钟内升高了25 ℃，而纯水在相同光照条件下仅升高0.2 ℃。证实本发明的靶向光热治疗用水溶性复合物水溶液具有良好的光热效果。

应用实施例1

利用制备实施例2的靶向光热治疗用水溶性复合物作为光热治疗试剂，其体外细胞测试方法如下：

分别配置一系列浓度分别为140、150、160、170μg/mL的靶向光热治疗用水溶性复合物水溶液。将人结肠癌细胞（HCT-116细胞）、人宫颈癌细胞（HeLa细胞）及人乳腺癌细胞（MCF-7细胞）在96孔板（每孔10⁴个细胞）中培养。一昼夜后，加入所配制的系列浓度的溶液，再培养24小时。分别用808 nm激光（1W，光斑直径5 mm）照射10 min。再培养24小时，用噻唑蓝比色法测细胞抑制率（抑制率(%)=(1-试验孔OD值/对照孔OD值) ×100% ）。

在808 nm激光（1W，光斑直径5 mm）照射条件下，板中显示对细胞的杀死率可达65%~80%；而无光照的显示细胞存活率均大于80%。实验证实本发明的靶向光热治疗用水溶性复合物结合光热治疗对人结肠癌细胞（HCT-116细胞）、人宫颈癌细胞（HeLa细胞）及人乳腺癌细胞（MCF-7细胞）具有良好的杀死率。

应用实施例2

利用制备实施例2的靶向光热治疗用水溶性复合物作为光热治疗试剂，其体外细胞靶向测试方法如下：

分别配置一系列浓度分别为140、150、160、170μg/mL的靶向光热治疗用水溶性复合物水溶液。将HCT-116细胞、HeLa细胞、MCF-7细胞及人包皮成纤维细胞（HFF细胞）在96孔板（每孔104个细胞）中培养。一昼夜后，加入所配制的系列浓度的溶液，再培养24小时。分别用808 nm激光（1W，光斑直径5 mm）照射10 min，再培养24小时。分别用噻唑蓝比色法测细胞抑制率。（抑制率(%)=(1-试验孔OD值/对照孔OD值) ×100% ）。

将HCT-116细胞、HeLa细胞、MCF-7细胞及人包皮成纤维细胞（HFF细胞）在24孔板（每孔104个细胞）中培养。一昼夜后，加入浓度为170μg/mL的溶液，再培养24小时。分别用808 nm激光（1W，光斑直径5 mm）照射10 min，再培养24小时。用PI染色，进行共聚焦成像。

在808 nm激光（1W，光斑直径5 mm）照射条件下，MTT实验显示对三种癌细胞细胞的杀死率可达60%~85%；而正常细胞存活率均大于80%。共聚焦成像证明了癌细胞较正常细胞介导本发明的靶向光热治疗用水溶性复合物进入的多，细胞凋亡成像明显。实验证实本发明的靶向光热治疗用水溶性复合物结合光热治疗对人结肠癌、人宫颈癌和人乳腺癌等细胞表面有过度表达透明质酸受体CD44的癌细胞相对正常成纤维细胞具有良好的靶向性。

应用实施例3

制备实施例2制备的靶向光热治疗用水溶性复合物作为光热治疗试剂剂，其体内裸鼠测试方法如下：

把人乳腺癌细胞皮下移植到裸鼠体内，培养6~7天。静脉注射本发明的靶向光热治疗用水溶性复合物溶液到裸鼠体内，随后每天用808 nm激光（1W/cm2）照射肿瘤部位10分钟，持续照射10天。

激光照射明显抑制肿瘤细胞的生长，并且肿瘤体积在以肉眼可见的速度减小。持续照射10天后，肿瘤消失。证实本发明的靶向光热治疗用水溶性复合物可有效杀伤体内人乳腺癌细胞。

Claims

1.一种靶向光热治疗用水溶性复合物，其特征在于：为聚苯胺-透明质酸掺杂态水溶性复合物，以苯胺和透明质酸为原料，采用下述的一步法制备而成：将苯胺及透明质酸混合于水中并搅拌，0~5℃下滴加与苯胺等摩尔量的过硫酸铵水溶液；

其中苯胺与透明质酸的质量比为1：1~1：4。

2.权利要求1所述的靶向光热治疗用水溶性复合物的制备方法，其特征在于：包括：将1份苯胺及1~4倍苯胺质量的透明质酸混合于水中，搅拌20~40分钟充分物理混合，在0~5℃继续搅拌保持20~60分钟；与苯胺等摩尔量的过硫酸铵溶于水中，滴加到上述混合液中，保温反应16~30小时；过滤并水洗后干燥。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：还包括将所得物研磨至细粉状。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：还包括将所得物分散到去离子水中超声处理，静置后取上清液。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述透明质酸的混合量为苯胺质量的2~3倍；

所述水为去离子水；

所述过硫酸铵水溶液滴加速度为：1~2 ml/min；

所述保温反应于冰水浴中进行，反应24小时；

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述超声处理时间为30~180 分钟。

7.一种药物组合物，包含至少一种药学上可接受的载体和权利要求1所述的靶向光热治疗用水溶性复合物。

8.权利要求1所述的靶向光热治疗用水溶性复合物或权利要求7的所述药物组合物在制备抗肿瘤药物的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：抗肿瘤药物的剂型包括注射剂、口服剂、外用搽剂以及其它药学上的适宜剂型。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括：宫颈癌、乳腺癌及结肠癌。