KR101309227B1 - 광역동 치료에 사용되는 아미노레불리닉산이 공유결합된 히아루론산 나노입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 광역동치료(photodynamic therapy PDT)에 사용되는 광증감제에 관한 것으로, 암세포 조직에 선택적으로 잘 반응할 수 있는 페하(pH)응답성을 가지며, 필요로 하는 세포 혹은 특정조직에 보다 약물의 침투가 잘 이루어지도록 히아루론산-히스티딘 (HAhs) 공유결합체가 아미노레블리닉산에 공유결합되어 이루어지는 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA) 공유결합체로 이루어지는 광역동 치료에 사용되는 아미노레불리닉산이 공유결합된 히아루론산 나노입자를 제공한다. 본 발명에 따르면 종양조직 및 암세포에 변형된 아미노레블리닉산 광증감제의 흡수효율이 높아짐에 따라 보다 적은 양의 약제 사용으로 인체 부작용의 최소화 및 빠른 환자치료가 가능해지는 효과를 가질 수 있다.

Description

광역동 치료에 사용되는 아미노레불리닉산이 공유결합된 히아루론산 나노입자 {5-aminolevulinic acid-conjugated hyaluronic acid nanoparticles for photodynamic therapy}
본 발명은 광증감제를 사용하는 광역동치료(photodynamic therapy PDT)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암세포 조직에 선택적으로 잘 반응할 수 있는 페하(pH)응답성을 가지며, 필요로 하는 세포 혹은 특정조직에 보다 약물의 침투가 잘 이루어지도록 하는 아미노레불리닉산이 공유결합된 히아루론산 나노입자에 관한 것이다.
광증감제를 사용하는 광역동치료 (photodynamic therapy, PDT)는 기존의 암 치료법인 수술, 방사선요법, 약물요법의 부작용 및 암치료 이후의 후유증 문제를 해결할 수 있는 대체치료법으로 주목받고 있다. PDT에 사용되는 광증감제 (photosensitizer)는 빛에 노출되지 않으면 높은 농도에서도 세포 독성을 거의 나타내지 않다가 특정 파장의 빛에 의해 여기 되어 반응성 산소종 (일항산소, 산소라디칼, 수퍼옥사이드, 폐록사이드)을 생성하여 세포의 사멸을 유도한다. 일항 산소는 세포내 구성성분들 (예를 들어, 불포화 지방산, 콜레스테롤, 단백질, guanine 등)과 화학적으로 반응하여 손상을 입힘에 따라 암세포는 아포토시스(apoptosis)나 네오크로시스(necrosis)를 보이는데, 손상의 정도가 커질수록 아포토시스(apoptosis)보다는 네오크로시스(necrosis)를 통하여 죽는 세포의 비율이 증가하게 된다. 즉 광증감제를 정맥 주사 후 일정 시간이 지나면 암조직에 광증감제가 선택적으로 축적되고, 이 후 특정 파장의 빛을 조사하면 암세포만 선택적으로 사멸되며 빛을 쪼여주지 않은 다른 조직은 영향을 받지 않는다.
항암제의 경우 암세포뿐만 아니라 정상세포에서 심각한 강한 독성효과를 보이는 반면, 광역동치료(PDT)에 사용되는 광증감제는 암에 선택적으로 축적되는 암세포 특이성을 지니며 빛을 쪼여준 부위에서만 독성을 나타내므로 광역동치료(PDT) 후 항암제 치료시 보이는 머리카락 빠짐, 면역기능 저하, 구토 등의 부작용이 나타나지 않는다. 또한 광역동치료(PDT) 시술시 고통이 거의 수반되지 않으며 부작용이 거의 없기 때문에 광역동치료(PDT)는 반복 시술이 가능하여 말기 전이암 환자에게도 반복치료를 통해 최소한의 고통으로 생명을 연장시킬 수 있다. 따라서 광역동치료(PDT)는 환자의 생명연장과 삶의 질을 향상시킬 수 있는 장점이 있다. 광역동치료(PDT)는 또한 수술이 불가능한 환자의 치료에도 효과적이다. 폐암, 담관암 등에서 수술을 할 수 없는 암환자나 체력이 허약하여 수술이나 항암제 치료가 불가한 노약자, 또는 수술을 거부하는 환자의 경우에도 수술을 대체하여 광역동치료(PDT)를 수행할 수 있다.
한편 광역동치료(PDT)를 위해 사용되는 일반적인 광증감제는 크게 포피린을 기반(porphyrin-based)으로 한 것과 그 외의 것으로 나눌 수 있는데, 임상 사용이 허가된 광증감제의 거의 모두가 포피린을 기반으로 한 것이다. 프로토포피린IX(Protoporphyrin IX (PpIX))는 포피린 기반 광증감제로 아미노레불리닉산(5-Aminolevulinic acid (ALA))로부터 생합성된다. 아미노레불리닉산은 미토콘드리아내에서 헴(heme) 생합성 과정의 중간 물질인 프로토포피린IX(PpIX)로 전환되며, 이물질은 임상에서 좋은 결과를 보여 왔기 때문에 지난 20년 동안 커다란 관심의 대상이었다.
암세포의 경우, 프로토포피린IX(PpIX) 생합성에 필요한 레이트리미팅 효소(rate-limiting enzyme)인 포르포빌리노겐 디아미나제(porphobilinogen deaminase)가 증가되어 있을 뿐 아니라 프로토포피린IX(PpIX)를 헴(heme)으로 전화시켜주는 효소인 페로킬라타제(ferrochelatase)가 정상세포에 비해서 감소되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 외부에서 고농도의 아미노레불리닉산을 투여하게 되면 정상세포보다는 암세포에서 효율적으로 프로토포피린(PpIX)의 생성이 촉진되고, 이후에 특정 파장의 빛을 쪼여주면 암세포를 선택적으로 죽일 수 있는 것으로 추정된다. 아미노레불리닉산의 경우 포피린 계열의 다른 광증감제와는 달리, 아미노레불리닉산으로 부터 생성된 프로토포피린IX(PpIX)가 24-48시간 이후에는 전부 제거되기 때문에 장기간 피부 광 민감성의 위험이 적다는 큰 장점이 있다.
그러나, 이러한 아미노레불리닉산은 광역동 치료 효과는 뛰어나지만 아미노레불리닉산의 친수성 성질 때문에 세포 혹은 조직내로의 흡수가 방해되는 단점이 있기 때문에 아미노레불리닉산의 세포, 조직내 흡수를 증가시키기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들자면, 지방친화성을 도입한 에스테르(ester)-아미노레불리닉산, 약물의 흡수를 도와주는 증강제(enhancer), 리포좀과 같은 약물전달체 등을 사용하거나 파고사이토시스(pagocytosis) 혹은 엔도사이토시스(endosytosis)를 통해 아미노레불리닉산을 흡수시키고자 아미노레불리닉산-덴드리머(dendrimer)를 대상으로 활발히 연구가 진행되고 있다.
천연고분자로 선형 다당류인 히아루론산 (Hyaluronic acid, HA)은 독특한 다당류 구성 단위인 클루코닉 산(D-glucuronic acid) 와 아세틸클루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 단위체가 반복되는 구조이며, 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycan) 구성요소 중 하나이다. 히아루론산(HA)는 세포부착, 성장, 이동에서 핵심적인 역할을 담당하기 때문에 세포운동성, 염증 반응, 상처치유 그리고 암세포의 침투와 전이의 신호 분자로 알려져 있다. 장간막에 발생한 암세포에서 히아루론산이 과발현되기 때문에, 히아루론산(HA)는 암세포의 확산, 이동, 침투, 전이에 대한 기질(matrix)역할을 하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 암세포의 히아루론산 수용체인 CD44와 RHAMM의 발현은 세포 이동과 침투에 밀접하게 연관되어있다. 즉, 악성의 암세포는 히아루론산(HA)가 많은 환경으로 침투한다. 이런 관점에서, 많은 연구자들이 히아루론산을 항암제의 전달 시 암세포 표적 분자로 사용하였다. 침투적이고 전이적인 암세포에서 CD44가 과발현되기 때문에 히아루론산(HA)와 항암제, 그리고 고분자의 결합체는 수용체 매개를 통해 이러한 암세포의 수용체를 표적으로 할 수 있다. 게다가 히아루론산의 생체적합성, 생분해성, 면역을 유도하지 않는 성질 때문에 히아루론산은 우수한 생체 삽입 물질로 여겨진다. 그러므로 히아루론산은 강력한 항암제 전달체 후보 중 하나이다. 따라서 이러한 히아루론산(HA)에 아미노레블리닉산이 결합된다면 생체내 암세포와 같은 특정세포나 또는 조직에 보다 효과적으로 전달되어 광역동치료(PDT)에 도움이 됨이 명백할 것이다.
한편, 일반적으로 정상조직과 혈액은 대부분 pH 7.4 이상으로 약알칼리성을 띠는 반면 종양 조직 및 암세포는 pH 6.0 ~ 7.0 사이의 약산성 도는 강산성조건인 것으로 알려져 있다. 이러한 산성조건에서만 선택적으로 필요로 하는 약물들이 방출된다면 종양에 선택적으로 약물을 전달할 수 있어 보다 요율적인 치료가 가능해 질것이다.
따라서 광증감제인 아미노레블리닉산을 이용한 광역동치료(PDT)를 위해서는, 암세포 혹은 종양조직내로의 아미노레블리닉산이 효율적인 침투가 이루어지도록 하고, 암세포 및 종양조직에서 나타나는 약산성의 조건에서 이루어지는 것이 가장 효율적임을 알 수 있다.
수많은 펩타이드 중 히스티딘(histidine)은 산성에서 잘 녹는 성질을 가지고 있으므로 본연구에서는 히아루론산에 히스티딘을 도입한 다음 아미노레블리닉산을 공유결합시켜 암세포의 pH에 선택적으로 약물을 전달하여 표적성 광역동치료가 가능한 pH응답성 나노광역동치료제를 제조하고자 한다.
따라서 본 발명은 상기 요구에 부응하기 위하여 고안된 것으로서, 본 발명의 목적은 암세포 및 종양조직에 광역동치료(PDT)를 위한 아미노레블리닉산을 광증감제로 사용하기 위하여 친수성을 보유하고 생체내 분해가 가능한 고분자에 결합시키고, 종양조직 및 암세포가 나타내는 약산성의 조건에서 보다 효율적인 침투가 이루어지도록 하는 아미노레불리닉산이 공유결합된 페하(pH)-응답성 히아루론산 나노입자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 이러한 나노입자를 이용한 광증감 치료제를 를 제공하는 것이다.
이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태에 따르면, 광역동치료(photodynamic therapy PDT)에 사용되는 아미노레블리닉산의 광증감제에 있어서, 광역동치료(photodynamic therapy PDT)에 사용되는 아미노레블리닉산의 광증감제에 있어서,
천연고분자인 히아루론산에 아민기를 가지는 중간유도체를 결합시켜 히아루론산에 아민기를 도입하고, 상기 중간유도체 아민기에 히스티딘이 결합되도록 하여 히아루론산-히스티딘 (HAhs) 공유결합체를 형성하고, 상기 히아루론산-히스티딘 공유결합체의 잔여 중간유도체 아민기에 아미노레블리닉산이 공유결합되어 이루어지는 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA) 공유결합체의 광증감제를 형성하여 광역동 치료에 사용되는 아미노레불리닉산이 공유결합된 히아루론산 나노입자를 제공하는데 그 기술적 특징이 있다.
그리고 바람직 하기로는,상기 광증감제는, 50 ~ 300nm 크기의 나노입자 형태로 이루어지도록 하고, 상기 광증감제는, 히아루론산의 카르복실그룹에 하이드라지드(hydrazid)를 공유결합시켜 아민기를 도입시키고, 이에 하이드라지드 아민기에 히스트딘을 공유결합시켜 히아루론산-히스티딘(HAhs) 공유결합체를 형성시킨 후, 상기 공유결합체의 잔여 하이드라지드 아민기에 아미노레블리닉산이 공유결합되어 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA) 공유결합체를 이루도록 한다.
삭제
본 발명에 있어서는 종양조직 및 암세포에 변형된 아미노레블리닉산 광증감제의 흡수효율이 높아짐에 따라 보다 적은 양의 약제 사용으로 인체 부작용의 최소화 및 빠른 환자치료가 가능해지는 효과를 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 적은 양으로 보다 높은 효율을 달성할 수 있으므로 환자치료의 비용부담을 절감할 수 있는 다른 효과도 있다.
도 1은 본 발명에 따른 히아루론산-히스티딘(HAhs)의 합성과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA)의 합성과정을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA)의 수소 핵자기 공명스펙트럼의 모습을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA) 나노입자의 투과전자 주사현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA)의 세포독성 평가 그래프를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA)을 담도암세포인 HuCC-T1 세포에 처리한 뒤 생합성된 프로토포피린IX(PpIX)의 양의 변화를 나타내는 그래프를 보인 도이다.
도 7은 본 발명의 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA) 나노입자가 담도암세포인 HuCC-T1 세포에 처리한 뒤 광역동치료(PDT) 효과를 그패프로 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA)을 HuCC-T1 암세포의 CD44를 인지하여 리셉터인식성 식세포작용에 의한 세포내 이입과 엔도솜의 산성환경에서 아미노레블리닉산의 방출과정을 나타낸 도이다.
실시예
1. 히아루론산과 히스티딘의 합성
먼저, 본 발명에 따라, 광증감제인 아미노레블리닉산의 세포 및 조직내로 침투효율을 높이고, 약산성 조건내에서 충분히 적합한 활성을 나타내기 위하여 히아루론산을 처치한다. 통상적으로 수많은 펩타이드 중 히스티딘(histidine)은 산성에서 잘 녹는 성질을 가지고 있으므로 본 발명에서는 히아루론산(HA)에 히스티딘을 도입하여 약산성 조건에 적합하도록 한다.
도 1은 HAhs-ALA의 합성방법을 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, 히아루론산의 카르복실그룹에 hydrazide (ADH)를 공유결합시키고, 이에 다시 히스티딘을 공유결합하여 히아루론산-히스티딘 공유결합체 (이하 이를 “HAhs”라 약칭하기로 한다)를 합성하는 과정을 거쳤다. 이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 히아루론산 400 mg을 pH 6.8 버퍼 용액에 녹이고 여기에 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′ethylcarbodiimidehydrochloride(EDC)) 200 mg, 그리고 하이드록시벤조트리아졸(1-Hydroxybenzotriazole (HOBT)) 140 mg 를 첨가하고 dir 6시간 동안 교반한 뒤 애디픽 액시드 디하이드라지드(adipic acid dihydrazide (ADH)) 1.74 g을 첨가한 뒤 약 1일 동안 교반한 뒤 증류수에 대하여 투석하여 동결건조 한 뒤 분말을 수득하여 히아루론산의 카르복실 그룹에 하이드라지드 (ADH)를 얻었다. ADH의 결합비율은 약 100개의 이당체 (D-glucuronic acid 와 Nacetyl-D-glucosamine)중 93개 즉 약 93%의 공유결합수율을 얻을 수 있었다.
다음으로 히아루론산-하이드라지드(HA-ADH) 공유결합체를 를 pH 8.5의 0.1M 탄산수고나트륨(NaHCO3) 버퍼용액에 녹이고 디메칠술폭사이드 (dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹인 아세틸-히스티딘(N-acetyl-L-histidine (HS)), EDC, NHS혼합물을 첨가하여 하루동안 교반한다. 그 후 반응물을 증류수에 대하여 투석하여 동결건조한 다음 최종적으로 히아루론산-히스티딘 공유결합체(HAhs)를 고체분말 형태로 제작하였다.
2. 히아루론산-히스티딘 (HAhs) 공유결합체에 아미노레불리닉산의 도입
2는 도 1에서 합성한 히아루론산-히스티딘에 아미노레불리닉산을 결합과정의 모식도로써, 도시된 바와 같이 아미노레불리닉산을 아민그룹에 공유결합시켜 본 발명에서 요구하는 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA)를 합성하였다.
이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 히아루론산-히스티딘 공유결합체(HAhs)인 고체분말을 pH 4.5 버퍼용액 또는 DMSO/H2O에 녹이고, DMSO에 녹인 아미노레불리닉산과 EDC, NHS를 첨가하였다. 약 1일 동안 교반한 뒤 증류수에 대하여 투석하고 동결건조하여 최종 고체 분말을 얻었다.
3. 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA)의 확인
상기 과정을 거쳐 제조된 고체 분말이 본 발명에서 요구하는 물질인지를 확인하기 위하여 분석을 수행하였다. 도 3은 도1, 2에서 합성한 HAhs-ALA의 수소 핵자기 공명 스펙트럼으로써, 도시된 바와 같이 1.8 ppm, 5.0~5.5ppm에서 히아루론산의 특성피크를 확인하였고, 1.5 ppm, 7.7 ppm, 8.7 ppm에서 히스티딘의 특성피크를 확인하였다. 또한 2.5~2.8 ppm, 3.8 ppm에서 아미노레불리닉산의 특성피크가 확인되므로 이상 없이 히아루론산에 히스티딘이 공유결합되었으며, 이러한 히아루론산-히스티딘 공유결합체(HAhs)가 아미노레블리닉산에 공유결합 되었음을 알 수 있었다.
Figure 112011014610738-pat00001
*100개의 이당체(D-glucuronic acid 와 Nacetyl-D-glucosamine)당 결합된 개수
또한, 표1(HAhs-ALA의 합성물 및 그 나노입자의 입자크기)에서 나타난 바와 같이, 히스티딘의 양을 달리하여 100개의 이당체당 5개, 9개, 14개, 28개, 45개의 히스티딘이 붙은 합성물을 합성할 수 있었다.
표 1은 상기의 과정을 거쳐 합성한 HAhs-ALA의 특성 분석표이다. 표에서 보는 바와 같이 다양한 비율의 히스티딘과 아미노레불리닉산이 공유결합된 화합물을 합성하였다. HAhs-ALA를 이용하여 증류수에서 나노입자를 형성한 결과 약 10 nm이상의 나노입자를 제조할 수 있었다.
도4는 상기에서 제조한 HAhs-ALA 나노입자의 형태이다 그림에서 보는 바와 같이 약 50 nm~100nm 전후의 나노입자가 형성된 것을 알 수 있었다.
. 4. 나노입자의 제조 및 분석
상기 3에서 얻은 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA)를 pH 4.5의 버퍼 용액 또는 증류수에 녹인 후 (또는 증류수 +DMSO) pH 8.5의 버퍼용액에 떨어뜨려 나노입자를 제조하였고, 필요에 따라 증류수에 대하여 투석을 하여 염을 제거하였다. 이러한 나노입자의 제조는 당업계에서 일반적인 제조과정이므로 이하 자세한 설명은 생략하기로 한다. 나노입자가 제대로 제조되었는지 확인하기 위하여히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA)화합물을 High performance liquid chromatography와 1H nuclear magnetic resonance로 분석하였다 (500 MHz Superconducting FT-NMR Spectrometer, Unity-Inova 500). 나노파티클의 모양 (형태)은 주사 전자 현미경을 사용하여 분석하였다 (TEM, JEOL JEM-2000 FX Ⅱ, Japan). 나노파티클 용매 한 방울을 copper grid위가 코팅된 탄소 필름에 올려놓는다. Phosphotungstic acid (0.05 % (w/w))를 음성 염색에 사용하였다. 나노파티클의 관찰은 80 kV에서 측정하였다. 나노파티클의 크기는 dynamic laser scattering (DLS-7000, Otsuka Electonics Co. Japan)로 측정되었고, 입자 크기(concentration: 1 mg/ml)를 결정하기 위해서 샘플용액은 투석방법을 통해 준비하였다.
도 4는 상기에서 제조한 HAhs-ALA 나노입자의 형태이다 그림에서 보는 바와 같이 약 50 nm~300nm 전후의 나노입자가 형성된 것을 알 수 있었으며, 표1에 나타난 바와 같이, 원하는 적정한 형태의 크기의 나노입자가 형성됨을 알 수 있었다.
5. 세포독성 실험
먼저, HSRRB (일본)에서 구입한 담도암 세포주인 HuCC-T1세포를 사용하여 세포 실험을 진행하였다. 세포는 RPMI1640배지를 이용하여 CO2 배양기에서 37oC에서 배양하였다.
HuCC-T1 세포를 6웰에 각 웰당 10,000 개의 세포를 깔고 하루 밤 동안 배양한 뒤, serum이 없는 배지로 교환한 뒤 대조군으로 아미노레불리닉산을 사용하고, 본 발명에 의해 제조된 HAhs-ALA를 각 농도에 따라 처리하였다. 24시간 동안 암조건에서 배양한 후 10 % FBS가 들어 있는 RPMI배지로 교환해주고 24시간동안 배양한 후 MTT분석방법으로 세포의 생존율을 구하였다.
도 5는 실험에 사용된 아미노레불리닉산과 HAhs-ALA의 세포독성을 평가한 그래프로써, 2mM 의 농도 까지 약물을 HuCC-T1 세포에 처리한 결과 대조군인 아미노레불리닉산과 본 발명에 의한 HAhs-ALA를 처리한 군에서 별다른 세포독성의 차이를 볼 수 없었으며, 이는 본 발명에 의한 HAhs-ALA가 충분히 사용가능함을 알 수있다.
6. 프로토포피린IX(PpIX) 측정
대조군인 아미노레불리닉산과 본 발명에 따른 HAhs-ALA의 처리에 따른 HuCC-T1세포 내에 PpIX의 축적은 다음과 같이 실험하였다. 아미노레불리닉산과 HAhs-ALA를 각 농도에 따라 처리하고 24시간 암조건에서 배양한 뒤, cell lysis buffer (세포용해버퍼)로 세포를 용해시킨 후 세포내에 축적된 PpIX양을 마이크로플레이트 리더(microplate reader (Infinite M200 pro, Tecan, Austria))로 측정하였다. PpIX에 대한 여기파장길이(excitation wavelength)는 485nm였고, 방출파장길이(emission wavelength)는 635nm 였고, 측정된 PpIX양은 단백질양에 대하여 보정하였다.
도 6는 아미노레불리닉산과 HAhs-ALA를 HuCC-T1 세포에 동일 농도로 처리한 후 세포내에서 전환된 PpIX의 양을 정량한 것으로, 1mM의 농도에서 본 발명에 의한 HAhs-ALA를 처리한 세포군에서 약 20 % 증가한 PpIX 생성량을 보였다. 이 결과로 같은 농도의 대조궁인 아미노레불리닉산만을 세포에 처리했을 때 자유로운 형태의 아미노레불리닉산에 비해 HAhs-ALA의 경우 세포내 흡수가 증가된 것을 간접적으로 알 수 있었으며, 이는 본 발명자들이 원하는 결과를 나타냄을 의미한다. 즉, 종양조직 및 암세포에 본 발명에 의한 HAhs-ALA를 처리시 단독의 아미노레블리닉산보다 효과적임을 입증하는 것이다.
7. 광역동치료 (Photodynamic therapy, PDT)
광역동치료를 위해 LED램프 (SH system, Korea)를 사용하였으며 파장은 635 nm였고 빛의 강도는 0.25 J/cm2,였다 (photo-radiometer로 측정 (DeltaOhm, Italy)). HuCC-T1세포에 대조군인 아미노레불리닉산 단독과 본 발명에 의한 HAhs-ALA를 농도에 따라 처리한 후 24시간동안 암조건에서 배양하고 635 nm, 0.25J/cm2 로 처리하였다. 배지를 10 % FBS 배지로 교환하고 24시간 동안 배양한 뒤 MTT 분석방법으로 세포의 생존능을 분석하였다.
그 결과는 도 7는 아미노레불리닉산과 HAhs-ALA를 HuCC-T1 세포에 농도별로 처리한 뒤 빛을 조사하여 세포사멸을 평가한 도에 나타난 바와 같이, 생성된 PpIX의 양이 증가할수록 세포 사멸 또한 증가하는 양상을 HAhs-ALA를 처리한 실험군에서 확인할 수 있었다.
8. 정리
도 8은 HAhs-ALA의 PpIX생성 향상효과 및 세포사멸 증가 효과를 설명한 그림이다. 도시된 바와 같이, 히아루론산의 리셉터인 CD44를 통하여 나노입자가 세포내로 리셉터인지 식세포작용(receptor-mediated endocytosis)에 의하여 세포내로 들어가되, 히아루론산의 작용으로 아미노레블리닉산 단독보다 효율적으로 흡수되며, 조직내 흡수된 다음 엔도솜의 산성 환경에서 히스티딘의 역할에 의해 아미노레불리닉산이 효율적으로 가수분해됨으로서 프로토포피린IX(PpIX)의 생성이 증대되고, 이에 빛이 조사될 경우 보다 효율적으로 세포에 작용됨을 알 수 있는 것이다.
그리고, " 본 연구는 보건복지부 보건의료연구개발사업의 지원에 의하여 이루어진 것임을 밝힙니다. (과제 고유번호 : A091047) "

Claims (3)

  1. 광역동치료(photodynamic therapy PDT)에 사용되는 아미노레블리닉산의 광증감제에 있어서,
    천연고분자인 히아루론산에 아민기를 가지는 중간유도체를 결합시켜 히아루론산에 아민기를 도입하고, 상기 중간유도체 아민기에 히스티딘이 결합되도록 하여 히아루론산-히스티딘 (HAhs) 공유결합체를 형성하고, 상기 히아루론산-히스티딘 공유결합체의 잔여 중간유도체 아민기에 아미노레블리닉산이 공유결합되어 이루어지는 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA) 공유결합체의 광증감제를 특징으로 하는 광역동 치료에 사용되는 아미노레불리닉산이 공유결합된 히아루론산 나노입자.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 광증감제는, 50 ~ 300nm 크기의 나노입자 형태로 이루어짐을 특징으로 하는 광역동 치료에 사용되는 아미노레불리닉산이 공유결합된 히아루론산 나노입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 광증감제는, 히아루론산의 카르복실그룹에 하이드라지드(hydrazid)를 공유결합시켜 아민기를 도입시키고, 이에 하이드라지드 아민기에 히스티딘을 공유결합시켜 히아루론산-히스티딘(HAhs) 공유결합체를 형성시킨 후, 상기 공유결합체의 잔여 하이드라지드 아민기에 아미노레블리닉산이 공유결합되어 히아루론산-히스티딘-아미노레블리닉산(HAhs-ALA) 공유결합체를 이루는 것을 특징으로 하는 광역동 치료에 사용되는 아미노레불리닉산이 공유결합된 히아루론산 나노입자.
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