KR101080990B1 - 운지버섯 자실체 추출물을 포함하는 염증성 질환 및 알러지 질환의 예방 및 치료 조성물 - Google Patents
운지버섯 자실체 추출물을 포함하는 염증성 질환 및 알러지 질환의 예방 및 치료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 염증성 질환의 염증 유도 인자, 염증 인자 및 염증관련 전사인자의 발현 수준을 감소시키는, 운지버섯(Coriolus versicolor) 자실체 추출물을 포함하는 염증성 질환 및 알러지 질환의 예방 및 치료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 운지버섯(Coriolus versicolor) 자실체 추출물을 포함하는 조성물은 염증성 장질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
운지버섯자실체 추출물, 염증성 장질환, 생약재 혼합물, 면역조절
Description
본 발명은 염증성 질환의 염증 유도 인자, 염증 인자 및 염증관련 전사인자의 발현 수준을 감소시키는, 운지버섯(Coriolus versicolor) 자실체 추출물을 포함하는 염증성 질환 및 알러지 질환의 예방 및 치료 조성물에 관한 것이다.
염증성 장질환은(inflammatory bowel disease, IBD)은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC)과 크론병(Crohn's disease, CD)으로 분류되는데 이중 UC는 서구를 중심으로 많이 발생하고 병인이 불분명하며 비특이적인 조직학적 변화를 특징으로 한다.
UC와 CD는 체중 감소, 점막이나 혈액을 동반한 설사, 발열, 장 운동장애, 결장의 단축과 같은 장과 장의 병리학적 징후를 나타낸다고 보고되어있다(Fiocchi C. Gastroenterology. 115:182, 1998; Hendrickson BA et al. Clin. Microbiol. Rev. 15:79, 2002; Krawisz JE, et al. Gastroenterology. 87:1344, 1984).
최근 여러 다양한 실험동물 모델의 개발, 새로운 연구 기술의 발전에 힘입어 유전적, 환경적 인자와 면역학적 이상이 염증성 장질환에 복합적으로 작용한다는 가설이 받아들여지고 있다(Fiocchi C. Gastroenterology. 115:182, 1998). IBD 동물모델 확립 방법에는 여러 가지가 있으나, 5% dextran sulfate sodium(DSS)로 궤양성 대장염을 유발한 동물모델이 유효 성분에 대한 치료 효과를 연구하는데 있어서 가장 좋은 모델임이 보고되고 있다(Elson CO et al. Gastroenterology. 109:1344, 1995).
이러한 DSS 유도 모델은 식수에 DSS를 섞어 투여할 때 투여 용량에 따라 일정 정도의 염증이 유발되는 비교적 간단하고 재현성이 높은 방법이기 때문에 대장염 조절을 위한 새로운 합성 화합물의 효능평가에 많이 사용되는 가장 오래된 실험 모델 중 하나이다(Ohkusa T. Jpn J Gastroenterol. 82:1327, 1985; Kitajima S, et al. Exp. Animal. 48:137, 1999).
운지버섯(Coriolus versicolor)은 담자균류의 민주름버섯목 구멍장이 버섯과에 속하는 버섯으로 균모는 얇고 단단한 가죽질이며 반원형이고, 침엽수나 활엽수의 고목에 군생하는 일년생이며, 한국, 일본, 중국 등의 산악지대에 주로 자생하고 있다(Lee JY. Coloured Korean mushrooms. Academy book co. Seoul. pp241).
운지버섯은 일명 구름버섯이라고도 불리며 전통적으로 건강보조식품이나 민간 치료약으로 이용되었으며, 운지버섯의 일반 성분은 수분 5.62%, 단백질 4.20%, 탄수화물 65.09%, 섬유질 23.24%, 회분 6.37% 및 지방질 1.10%를 함유하고 있다(Mau JL, et al. Food research international. 34:521, 2001).
운지버섯의 다당류가 항암작용(Lee BW, et al. Korean J Appl Microbiol Biotechnol. 20:311, 1992; Cho SM, et al. Korean J Mycol. 24:17, 1996), 항바이러스, 항박테리아와 항종 효과 등의 약리작용이 있는 것으로 알려져 있다(Yang MM, et al. Am J Clin Med. 20:221, 1992).
그러나, 상기 연구내용에서 운지버섯의 자실체에 대하여 다양한 약리작용이 알려져 있고 또한 만성적인 성인병이나 치료제로 이용되고 있으나, 운지버섯이 DSS로 야기되는 염증성 장질환의 염증 조절 작용 효과에 대해서는 어떠한 개시가 교시된 바 없다.
이에 본 발명자들은, 신규 염증성 장질환 치료제 개발을 위하여 각종 기능성 식품과 생약재를 탐색하던 중 운지버섯 자실체를 포함하는 생약 혼합물이 염증으로 인해 발생된 장질환 이상 증상을 억제하여 염증성 장질환 치료 및 예방에 효과가 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 운지버섯(Coriolus versicolor) 자실체 추출물을 포함하는 염증성 질환 및 알러지 질환의 예방 및 치료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 운지버섯(Coriolus versicolor) 자실체 추출물을 포함하는 염증성 질환 및 알러지 질환의 예방 및 치료 조성물을 제 공한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 장질환의 예방 및 치료 조성물은 밀크티슬분말, L-아르기닌, 오미자추출분말, 효모추출물분말, 타우린, 산화마그네슘, L-아스파라긴, 비타민C, 울금추출물분말, 비타민E분말, L-라이신염산염, 산화아연, 옥타코사놀, L-시스틴, 피에이취칼라 Ⅰ 혼합제제, 스테아린산마그네슘, 히드록시- 프로필메틸셀룰로오스 및 글리세린지방산에스테르로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학 조성물은 운지버섯 자실체 추출분말 39%[운지버섯자실체추출분말 50%(운지버섯자실체로서 환산시 80%), 텍스트린 50%], 밀크티슬분말 15%, L-아르기닌 9%, 오미자추출분말(오미자추출물 90%, 덱스트린 10%), 효모추출물분말(효모추출물분말 75%, 말토덱스트린 25%), 타우린 6%, 산화마그네슘 5%, L-아스파라긴 3%, 비타민C(L-Ascorbic acid) 3%, 울금추출물분말 1.5%, 비타민E분말(디엘알파토코페롤초산염 50%, 덱스트린 30%, 피쉬젤라틴 20%), L-라이신염산염1.5%, 산화아연 0.45%, 옥타코사놀(10%) 0.45%, L-시스틴 0.3%, 피에이취칼라 Ⅰ 혼합제제(홍국적색소 65%, 락색소 1.5%, 덱스트린 33.5%) 0.18, 스테아린산마그네슘 0.97%, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 1% 및 글리세린지방산에스테르 0.15%로 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환 및 알러지 질환은 염증성 장질환인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 장질환은 Dextran sulfate sodium(DSS)로 야 기되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 조성물 및 식품학적으로 허용가능한 식품보조 첨가제를 함유하는 염증성 질환 및 알러지 질환 치료 및 예방용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 건조된 운지버섯을 C1~4 저급알콜로 추출한 후 농축하는 단계; 및 (b) 상기 농축된 추출액을 동결건조 하여 회수하는 단계를 함유하는 염증성 질환 및 알러지 질환의 예방 및 치료 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 용매는 에탄올인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 운지버섯(Coriolus versicolor) 자실체 에탄올 추출물은 염증성 장질환의 염증 유도 인자인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현과, 염증 인자인 IFN-γ와 IL-4의 발현 수준을 감소시키는 효과가 있으며, 염증에 관련된 전사인자인 GATA-3와 T-bet의 발현을 감소시키는 효과가 있다.
따라서, 본 발명의 운지버섯(Coriolus versicolor) 자실체 추출물을 포함하는 조성물은 염증성 장질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 운지버섯(Coriolus versicolor) 자실체로 구성된 생약 혼합물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 운지버섯 자실체는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 에탄올인 것이 좋다. 이때, 운지버섯 은 운지버섯의 5-20배 중량의 70% 에탄올을 가하여 80-100℃에서 3-5시간 동안 추출하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 운지버섯 자실체 추출물을 유효성분으로 함유하는 항 염증용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 운지버섯 자실체 추출물에 더하여, 밀크티슬분말, L-아르기닌, 오미자추출분말, 효모추출물분말, 타우린, 산화마그네슘, L-아스파라긴, 비타민C, 울금추출물분말, 비타민E분말, L-라이신염산염, 산화아연, 옥타코사놀, L-시스틴, 피에이취칼라 Ⅰ 혼합제제, 스테아린산마그네슘, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 글리세린지방산에스테르로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학 조성물은 운지버섯자실체추출분말 39%[운지버섯자실체추출분말50%(운지버섯자실체로서 환산시 80%),텍스트린 50%], 밀크티슬분말 15%, L-아르기닌 9%, 오미자추출분말(오미자추출물 90%, 덱스트린 10%), 효모추출물분말(효모추출물분말 75%, 말토덱스트린 25%), 타우린 6%, 산화마그네슘 5%, L-아스파라긴 3%, 비타민C(L-Ascorbic acid) 3%, 울금추출물분말 1.5%, 비타민E분말(디엘알파토코페롤초산염 50%, 덱스트린 30%, 피쉬젤라틴 20%), L-라이신염산염1.5%, 산화아연 0.45%, 옥타코사놀(10%) 0.45%, L-시스틴 0.3%, 피에이취칼라 Ⅰ 혼합제제(홍국 적색소 65%, 락색소 1.5%, 덱스트린 33.5%) 0.18, 스테아린산마그네슘 0.97%, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 1%, 글리세린지방산에스테르 0.15% 로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 운지버섯 자실체혼합물은 DSS로 인한 염증성 장질환 상태에서 형성되고 분비되는 염증 발현을 억제함으로써 염증 완화작용을 나타내 DSS로 야기되는 장질환 이상을 개선함으로써 염증성 장질환의 치료 및 예방하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 약학적 조성물은 해당 용도에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 독립적으로 또는 약품 첨가제로 사용되거나, 사람에게 투여하기 적합한 기타 모든 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 함유될 수 있는 담체로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제 및 지질 등이 포함될 수 있으며, 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 질환의 진행 정도, 나이, 성별, 신체 상태, 투여 기간, 투여 방법, 환자의 체중, 식사, 배출 속도 등에 따라 용량을 달리하여 투여될 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 약학적 조성물을 1일 2회, 1회 2정씩 투여하는 것이 좋다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하지 아니한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명은 운지버섯 자실체를 유효성분으로 함유하고, 밀크티슬분말, L-아르기닌, 오미자추출분말, 효모추출물분말, 타우린, 산화마그네 슘, L-아스파라긴, 비타민C, 울금 추출물분말, 비타민E분말, L-라이신염산염, 산화아연, 옥타코사놀, L-시스틴, 피에이취칼라 Ⅰ 혼합제제, 스테아린산마그네슘, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 글리세린 지방산 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 염증성 장질환 개선 및 예방용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 건강기능식품은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 특히 정제인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 운지버섯 자실체 추출물의 제조방법
충북 충주시에 위치한 충주공설시장에서 건조된 운지 버섯을 구입하였다. 구입한 운지 버섯 100g을 둥근바닥 플라스크에 넣고 800㎖의 에탄올을 가한 후, 80℃에서 3시간 동안 환류냉각기로 70% 에탄올을 이용하여 추출하였다. 이 과정을 3회 반복하여 추출한 추출물을 rotary evaporator(Eyela, Japan)를 사용하여 감압농축 하였고, 이 농축액을 -80℃로 동결 건조하여 사용하였다.
실시예 2: 운지버섯 자실체 혼합물의 제조방법
상기 모든 제조에 사용되는 모든 기계 기구 및 설비는 식품용 주정으로 소독하고 건조 후에 사용하였다. 사용되는 모든 원료는 건강기능식품공전, 식품공전 및 식품첨가물공전 등의 기준 규격에 적합한 원료를 구매하여 품질관리 후 적합한 것만 사용하였다.
칭량용 저울에 적당한 용기(PE백 또는 스테인레스 용기)를 사용하여 원료명 및 배합비율에 따라 원료를 칭량하였으며, 본 발명에 사용된 원료 및 배합비율은 하기 표 1과 같다.
칭량한 원료 중 히드록시프로필메틸셀룰로오스와 글리세린지방산에스테르를 제외한 나머지 원료를 혼(연)합기에 혼합하였다. 혼합분을 PE백에 들어있는 플라스틱 용기나 스테인레스 용기에 소분하고 총 중량(수율)을 확인한 후 품질관리부서에 시험의뢰 하였다.
시험결과 적합한 혼합분을 타정기로 자가품질관리 하면서 타정하였다. 타정분에 히드록시프로필메틸셀룰로오스와 글리세린지방산에스테르를 정제수와 주정 일정량에 녹여서 코팅(제피)기에 분무하면서 정제수와 주정이 휘산 하도록 건조하여 제피한다. 제피분을 선별하고 총 수량(수율) 확인 후 품질관리부서에 시험의뢰 하고, 시험결과 적합한 제피분을 계정기를 사용하여 해당 용기에 1차 포장(계정)하였다. 1차 포장분을 최종포장단위로 포장하고 품질관리부서에 시험 의뢰하여 최종 품질관리 한다. 최종 품질 관리된 제품을 품질관리인의 출하 승인 하에 출하 하였다.
실험예 1: 실험준비
1-1: 실험동물
BALb/C계 20g 내외의 4주령 웅성 흰쥐를 오리엔트바이오사(성남, 한국)에서 구입하여 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 실험환경(온도 22±2℃, 습도 55-66%, 명암주기 12시간으로 자동조절)에서 적응시킨 다음 실험에 착수하였다.
실험군은 평균체중이 유사하도록 난괴법에 의해 그룹당 10마리씩 4군으로 나누어, 정상대조군(Control), DSS 대조군(DSS), 상기 실시예 2에서 제조한 운지버섯 혼합물을 공급한 군(CVM), DSS로 염증성 장질환을 일으킨 다음 운지버섯 혼합물을 공급한 군(DSS+CVM)으로 분류한 다음 4주간 사육하였다. 실험 기간 동안 실험동물에 대하여 체중 변화를 조사하고, 그 결과를 다음의 표 2에 나타내었다(A: Control, B: DSS, C: Coriolus versicolor mixture, D: DSS+Coriolus versicolor mixture).
| Body wight(g) | ||
| Initial | Final | |
| A | 26.5±2.5a | 28.5±4.5a |
| B | 25.9±0.5b | 28.8±2.0a |
| C | 26.1±2.1a | 27.7±1.5b |
| D | 25.4±1.0b | 27.8±2.0a |
실험결과, 모든 실험동물에서 체중이 전반적으로 늘었으나 뚜렷한 유의차는 보이지 않았다. 식이 섭취량 또한 모든 군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다. DSS로 유도된 mice에서 혈변과 함께 항문이 붓는 현상을 보였으며, 실험 4주차가 되면서 많이 호전되는 것을 관찰할 수 있었다.
1-2: DSS에 의한 염증성 장질환 유발
Dextran sulfate sodium(DSS)로 인한 염증성 장질환은 4주령 웅성 흰쥐에서 DSS를 5% 식수에 첨가하여 자유섭취시켰다. 그로부터, 5일 이후 운지버섯 자실체 혼합물을 체중(㎏)당 70g으로 4주간 경구투여 하였다. 4주간의 실험 사육이 끝난 후에는 실험쥐를 12시간 절식시키고 안와동맥에서 혈액을 채취한 후 원심분리기를 이용하여 상층액으로부터 혈청을 분리하였다. 장의 길이를 측정하였고, 떼어낸 조직 비장(spleen)과 간(liver)은 액체 질소로 급냉하여 실험 전까지 -70℃에서 보관하면서 사용하였다(Cooper HS, et al. Laboratory Investigation. 69:238, 1993).
하기의 표 3은 4주간의 실험 사육 후 본 발명의 운지버섯 자실체혼합물 섭취에 따른 비장(spleen)과 간(liver)의 무게와 염증성 장질환으로 인한 장 길이의 변화를 나타낸 것이다(A: Control, B: DSS, C: Coriolus versicolor mixture, D: DSS+Coriolus versicolor mixture).
| Organs | |||
| Liver(g) | Spleen(g) | Intestine(㎝) | |
| A | 1.124±0.212a | 0.089±0.016a | 36.6±4.1b |
| B | 1.218±0.063a | 0.088±0.009a | 37.6±2.1b |
| C | 1.103±0.061b | 0.072±0.007b | 38.8±2.5a |
| D | 1.097±0.050b | 0.068±0.006b | 41.0±1.5a |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 운지버섯 자실체혼합물 섭취에 의한 장기 무게는 비장의 경우 control군과 DSS군에서 유의적으로 높게 나타났으나, 운지버섯 자실체혼합물 투여군(CVM, DSS+CVM)에서는 낮게 나타났다. 또한, 간의 경우에도 비장과 유사한 결과가 나타났으며, 특히 DSS+CVM 군에서 유의적으로 낮게 나타났다.
따라서, 본 발명의 운지버섯 자실체혼합물은 DSS mice모델에 있어서 비장, 간 등의 장기에 대한 부담을 감소시켜 주며, 장질환 보호 개선에도 관여하는 것을 알 수 있었다. 또한, 운지버섯 자실체혼합물 섭취에 따른 장 길이의 변화를 관찰한 결과, 운지버섯 자실체혼합물 투여군(CVM, DSS+CVM)에서 증가하는 현상이 관찰되었다.
표 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 운지버섯 자실체 혼합물 섭취에 의한 장기 무게는 비장의 경우 DSS군에서 유의적으로 높게 나타났으나, 운지버섯 자실체 혼합물 투여군(CVM, DSS+CVM)에서는 낮게 나타났다. 또한, 간의 경우에도 비장과 유사한 결과가 나타났으며, 특히 DSS+CVM 군에서 유의적으로 낮게 나타났다. 또한, 운지버섯 자실체 혼합물 섭취에 따른 장 길이의 변화를 관찰한 결과, 운지버섯 자실체 혼합물 투여군(CVM, DSS+CVM)에서 증가하는 현상이 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 운지버섯 자실체 혼합물은 DSS mice모델에 있어서 비장, 간 에 대한 부담을 감소시켜 주며, 장질환 보호 개선에도 관여하는 것으로 생각된다.
실험예 2: 면역 글로불린 측정
상기 실험예 1-2와 동일한 방법으로 4주간 실험 사육이 끝난 실험쥐에서 혈청을 분리하여 -70℃에 보관 후 사용하였으며, IgA 및 IgE의 농도는 BETHYL LABORISE, INC.사의 제품을 사용하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA) 방법으로 측정하였다.
구체적으로, 96 웰 플레이트, 각각의 웰을 코팅하기 위해 1㎕의 항체를 희석한 후 코팅 완충용액 100㎕를 첨가하고, 37℃에서 60분간 배양하여 세척 용액으로 3번 세척한 다음, blocking solution(차단용액) 200㎕를 각각의 웰에 첨가하여 37℃에서 30분간 배양하였다. 배양이 끝나면 동일한 방법으로 세척하였다.
시료는 각 웰에 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 60분간 배양한 후 처음과 동일한 방법으로 3번 세척하였다. HRP 결합항체를 결합 희석액에 1:1000(v/v)으로 희석하여 각각의 웰에 100㎕ 첨가한 후 37℃에서 60분간 배양하고 동일한 방법으로 3번 HCL을 100㎕씩 첨가하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 4a 및 4b에 나타내었다(A: Control, B: DSS, C: Coriolus versicolor mixture, D: DSS+Coriolus versicolor mixture)
| Serum | ||
| IgA(ng/㎖) | IgE(ng/㎖) | |
| A | 221.381±0.130c | 78.087±0.078b |
| B | 280.429±0.193b | 94.299±0.227a |
| C | 223.048±0.019c | 89.451±0.108a |
| D | 337.095±0.147a | 87.254±0.010b |
| IgE(ng/㎖) | ||
| Spleen | MLN | |
| A | 3.239±0.006b | 7.943±0.026b |
| B | 3.761±0.009b | 22.125±0.332a |
| C | 2.511±0.008c | 6.148±0.048b |
| D | 4.784±0.007a | 4.290±0.010c |
상기 표 4a에 나타난 바와 같이, 면역글로불린을 측정한 결과, 혈액 내 IgA 생산량은 DSS+CVM군에서 높게 나타났고, IgE 생산량은 DSS+CVM군에서 낮게 나타났다.
또한, 표 4b에 나타난 바와 같이, 비장과 장관내 임파구(MLN) 내 IgE 생산량을 측정한 결과, 비장에서는 DSS군에서 낮게 나타났고, 장관내 임파구에서는 DSS군에서 높게 나타났다. 운지버섯 자실체혼합물 투여군에서 혈청과 MLN에서 염증에 관여하는 IgE의 생산량 감소로 면역저하의 예방뿐만 아니라 알러지 반응도 예방이 가능한 것을 알 수 있었다.
실험예 3: 염증조절, 면역조절 측정
3-1. Western bolt Analysis
웨스턴 블롯팅을 이용한 TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ, STAT1, T-bet, IL-4, STAT6 및 GATA-3의 발현 측정 - 분리한 비장은 500㎕의 lysis buffer(150mM NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholic acid, 0.1% sodium Dodecyl sulfate, 50mM Tris, 1 tablet/20㎖ protease inhibitor)에 넣어 얼음 위에서 10분 동안 방치한다. 이를 12,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 buffer에 녹아있는 단백질을 얻었고, BSA 단백질 분석 키트(BSA protein assay kit)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 각각의 단백질을 SDS sample buffer(4% SDS, 20% glycerol, 0.2% bromophenol blue, 2.8% 2-mercaptoethanol, 125mM Tris-HCl pH6.8)와 섞어 6%, 8%, 10%, 12% 그리고 15%의 SDS-PAGE 겔에 전기 영동하여 단백질을 분리하였다.
또한, 상기 겔을 전기적으로 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 전이(transfer)한 다음 이를 면역탁본(immunoblot)에 사용하였다. 니트로셀룰로오스상의 비 특이적 반응을 막기 위해 막을 5% 탈지분유가 함유된 TBS-T(0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl pH7.2, 0.2% tween 20)로 60분간 blocking시키고, TBS-T로 5분간 6번 씻어준 다음 일차항체를 1㎎/㎖의 BSA가 들어있는 TBS-T에 1㎍/㎖의 농도로 희석하여 하룻밤 방치하였다(overnight).
그 후 막을 TBS-T로 5분간 6번 씻어준 후 이차 항체를 1:1000의 비율로 5% 탈지분유가 함유된 TBS-T에 희석하여 1시간 반응시킨 다음 TBS-T로 5분간 6번 씻어주었다. ECL용액 A, B를 1:1로 섞어 막을 발광시킨 후 LAS-3000 기계를 이용하여 단백질(protein) 발현량을 보았다.
3-2. 염증 조절 실험결과
TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6는 염증 작용에 관여되는 전형적인 사이토카인으로 널리 알려져 있다. LPS 반응의 주요 매개체로서 innate immune response에 있어서 중요한 역할을 한다. Macrophage와 mast cell에서 분비되는 TNF-α는 tumor cell에서 세포독성을 나타내며, 염증 반응과 관련되어 있다(도 1). 도 1은 본 발명의 염증성 장질환 예방 및 치료용 조성물의 섭취에 따른 염증관련 cytokine인 TNF-α의 비장에서의 발현량을 나타낸 것이다(A: Control, B: DSS, C: Coriolus versicolor mixture, D: DSS+Coriolus versicolor mixture).
도 1은 본 실험에서 DSS군에서 높은 발현율을 보여주어 여러 선행 연구와 일치되는 결과를 보여주고 있다. 특히 운지버섯 자실체 혼합물을 투여한 군에서 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6의 발현이 낮게 관찰되었다. 이러한 결과로부터 운지버섯 자실체 혼합물이 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6의 발현을 억제하고, 이로 인해 염증반응을 억제하는 역할을 하였음을 확인할 수 있었다.
3-3: 염증 조절 실험결과
IFN-γ는 전체적인 T세포의 발현을 Th1 반응 쪽으로 유도하여 진행시키고, 이러한 IFN-γ는 세포막에 있는 특이적 수용체인 IFN-γ 수용체에 결합하고 이어 세포 내 전사인자인 signal transducer and activator of transcription 1(STAT1) 등을 활성화시키고 면역반응에 필요한 유전자의 발현을 증가시켜 그 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다. Th2 사이토카인인 IL-4는 IgE의존적 염증반응에 중심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, IL-4 receptorα를 공유하고 STAT6를 활성화시킨다.
염증성 장질환 동물모델을 유발하는 방법으로 가장 좋은 모델인 DSS로 대장염을 유발시킨 동물모델은 사람의 궤양성 대장염과 유사한 증상을 나타내는 것으로 보고된 바 있다. DSS에 의한 대장염의 정확한 발병 기전은 밝혀지지 않았으나 장 점막의 상피세포에 유해한 영향을 미쳐 점막의 투과성이 증가하여 장벽 기능의 손상을 가져와 장관내 세균과 그들의 산물의 흡수가 증가되어 염증을 유발하는 것으로 보고된바 있다. 현재, 궤양성 대장염의 치료제로 주로 glucocorticoid와 sulfasalazine 등이 사용되고 있으나 이들은 심각한 부작용을 야기하는 것으로 보고되고 있다.
본 실험에서 JAK-STAT을 매개한 Th1/Th2 cell의 사이토카인 발현에서 역시 DSS군에서 뚜렷한 증가를 보여주었고, 운지버섯 자실체 혼합물을 투여한 DSS+CVM군에서 유의적으로 발현이 줄어들었다. 이로 인해 운지버섯 자실체 혼합물이 DSS로 염증성 장질환을 유발시킨 mice에서 JAK-STAT을 매개한 Th1/Th2 cell의 각 사이토카인의 발현을 억제, 조절하였고 Th1/Th2 cell의 균형조절에 기여를 함으로써 면역반응의 균형을 맞춰주는 역할을 하였음을 알 수 있었다(도 2 및 도 3). 도 2는 본 발명의 염증성 장질환 예방 및 치료용 조성물의 섭취에 따른 Th 1 cell 조절 cytokine의 비장에서의 발현량을 나타낸 것이며, 도 3은 본 발명의 염증성 장질환 예방 및 치료용 조성물의 섭취에 따른 Th 2 cell 조절 cytokine의 비장에서의 발현량을 나타낸 것이다(A: Control, B: DSS, C: Coriolus versicolor mixture, D: DSS+Coriolus versicolor mixture).
본 실험에서 JAK-STAT을 매개한 Th1/Th2 cell의 사이토카인 발현에서 역시 DSS군에서 뚜렷한 증가를 보여주었고, 운지버섯 자실체 혼합물을 투여한 DSS+CVM군에서 유의적으로 발현이 줄어들었다. 이로 인해 운지버섯 자실체 혼합물이 DSS로 염증성 장질환을 유발시킨 mice에서 JAK-STAT을 매개한 Th1/Th2 cell의 각 사이토카인의 발현을 억제, 조절하였고 Th1/Th2 cell의 균형조절에 기여를 함으로써 면역반응의 균형을 맞춰주는 역할을 하였음을 알 수 있다.
실험예 4: 통계처리
모든 실험결과는 평균±SE으로 나타내었으며, 각 group간의 통계적 유의성은 SPSS program(ver. 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 p<0.05 수준에서 던칸(Duncan)의 다중비교법에 의해 분석하였다.
결론적으로 본 발명은 DSS로부터 염증성 장질환이 유도된 동물모델로부터 운지버섯 자실체 혼합물에 TNF-α, JAK-STAT을 경유한 Th1/Th2 responses 조절 억제를 규명함으로써 운지버섯 자실체혼합물이 앞으로 염증성 장질환에 관련된 사이토카인 조절로 인한 분자생물학적 연구에 많은 도움을 줄 것이다. 또한 운지버섯 자실체혼합물에 더하여, 관련된 사이토카인들의 기전을 규명하는데 있어 본 발명에서의 실험기법과 결과들이 많은 도움을 줄 것으로 생각된다.
따라서, 상기 결과들로부터 본 발명의 운지버섯 자실체혼합물은 혈장과 림프구내의 면역 글로불린뿐만 아니라, 염증과 관련된 사이토카인의 발현을 효과적으로 조절함으로써 염증성 장질환의 치료 및 예방에 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명의 염증성 장질환 예방 및 치료용 조성물의 섭취에 따른 염증관련 cytokine인 TNF-α의 비장에서의 발현량을 나타낸 것이다(A: Control, B: DSS, C: Coriolus versicolor mixture, D: DSS+Coriolus versicolor mixture).
도 2는 본 발명의 염증성 장질환 예방 및 치료용 조성물의 섭취에 따른 Th 1 cell 조절 cytokine의 비장에서의 발현량을 나타낸 것이다(A: Control, B: DSS, C: Coriolus versicolor mixture, D: DSS+Coriolus versicolor mixture).
도 3은 본 발명의 염증성 장질환 예방 및 치료용 조성물의 섭취에 따른 Th 2 cell 조절 cytokine의 비장에서의 발현량을 나타낸 것이다(A: Control, B: DSS, C: Coriolus versicolor mixture, D: DSS+Coriolus versicolor mixture).
Claims (9)
- 운지버섯(Coriolus versicolor) 자실체 추출물과, 밀크티슬분말, L-아르기닌, 오미자추출물, 효모추출물분말, 타우린, 산화마그네슘, L-아스파라긴, 비타민 C, 울금추출물분말, 비타민 E 분말, L-라이신염산염, 산화아연, 옥타코사놀, L-시스틴, 피에이취칼라 Ⅰ 혼합제제, 스테아린산마그네슘, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스 및 글리세린지방산에스테르로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
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- 제 1항에 있어서,상기 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물은 운지버섯 자실체 추출분말 39중량%[운지버섯자실체추출분말 50중량%(운지버섯자실체로서 환산시 80중량%), 텍스트린 50중량%], 밀크티슬분말 15중량%, L-아르기닌 9중량%, 오미자추출분말(오미자추출물 90중량%, 덱스트린 10중량%) 6중량%, 효모추출물분말(효모추출물분말 75중량%, 말토덱스트린 25중량%) 6중량%, 타우린 6중량%, 산화마그네슘 5중량%, L-아스파라긴 3중량%, 비타민C(L-Ascorbic acid) 3중량%, 울금추출물분말 1.5중량%, 비타민E분말(디엘알파토코페롤초산염 50중량%, 덱스트린 30중량%, 피쉬젤라틴 20중량%) 1.5중량%, L-라이신염산염 1.5중량%, 산화아연 0.45중량%, 옥타코사놀(옥타코사놀 함유 10% 용액) 0.45중량%, L-시스틴 0.3중량%, 피에이취칼라 Ⅰ 혼합제제(홍국적색소 65중량%, 락색소 1.5중얄%, 덱스트린 33.5중량%) 0.18중량%, 스테아린산마그네슘 0.97중량%, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 1중량% 및 글리세린지방산에스테르 0.15중량%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
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- 운지버섯(Coriolus versicolor) 자실체 추출물과, 밀크티슬분말, L-아르기닌, 오미자추출물, 효모추출물분말, 타우린, 산화마그네슘, L-아스파라긴, 비타민 C, 울금추출물분말, 비타민 E 분말, L-라이신염산염, 산화아연, 옥타코사놀, L-시스틴, 피에이취칼라 Ⅰ 혼합제제, 스테아린산마그네슘, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스 및 글리세린지방산에스테르로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 증상 개선용 건강기능식품.
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- 제 6 항에 있어서,상기 알러지 증상 개선용 건강기능식품은 운지버섯 자실체 추출분말 39중량%[운지버섯자실체추출분말 50중량%(운지버섯자실체로서 환산시 80중량%), 텍스트린 50중량%], 밀크티슬분말 15중량%, L-아르기닌 9중량%, 오미자추출분말(오미자추출물 90중량%, 덱스트린 10중량%) 6중량%, 효모추출물분말(효모추출물분말 75중량%, 말토덱스트린 25중량%) 6중량%, 타우린 6중량%, 산화마그네슘 5중량%, L-아스파라긴 3중량%, 비타민C(L-Ascorbic acid) 3중량%, 울금추출물분말 1.5중량%, 비타민E분말(디엘알파토코페롤초산염 50중량%, 덱스트린 30중량%, 피쉬젤라틴 20중량%) 1.5중량%, L-라이신염산염 1.5중량%, 산화아연 0.45중량%, 옥타코사놀(옥타코사놀 함유 10% 용액) 0.45중량%, L-시스틴 0.3중량%, 피에이취칼라 Ⅰ 혼합제제(홍국적색소 65중량%, 락색소 1.5중얄%, 덱스트린 33.5중량%) 0.18중량%, 스테아린산마그네슘 0.97중량%, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 1중량% 및 글리세린지방산에스테르 0.15중량%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 알러지 증상 개선용 건강기능식품.
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| KR1020090119542A KR101080990B1 (ko) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | 운지버섯 자실체 추출물을 포함하는 염증성 질환 및 알러지 질환의 예방 및 치료 조성물 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR101460237B1 (ko) | 2012-09-19 | 2014-11-10 | 건국대학교 산학협력단 | 히스피딘을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학조성물 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US20090181047A1 (en) * | 2008-01-14 | 2009-07-16 | Michael Bishop | Anti-inflammatory hydrolysate of C. versicolor |
-
2009
- 2009-12-04 KR KR1020090119542A patent/KR101080990B1/ko not_active IP Right Cessation
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 조희정 외 3인. Kor. J. Mycol. 1988년 9월 30일, Volume 16, Issue 3, 제162면 내지 제174면* |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101460237B1 (ko) | 2012-09-19 | 2014-11-10 | 건국대학교 산학협력단 | 히스피딘을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학조성물 |
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