CN112955539A - 针对衰老、肌肉和骨骼、肠道、高脂血症、皮肤和大脑的益生菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明内容涉及以下内容，发明的第一项涉及一株Lactobacillus fermentum(发酵乳杆菌)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏号为CGMCC15536，全基因组序列上传于GenBank登录号为CP033371。该菌株在抗衰老，骨骼与肌肉健康，肠道稳态，高血脂，皮肤与脑健康方面具有独特的有益功能。

Description

针对衰老、肌肉和骨骼、肠道、高脂血症、皮肤和大脑的益生菌 菌株
技术领域
本申请要求2018年10月19日提交的马来西亚专利申请PI2018703875的利益，其内容通过引用全部并入本文，在本文中称为“本人的优先申请”(MY priority application)。
本发明涉及的领域为医药、微生物与营养，特别是与益生菌Lactobacillusfermentum DR9相关。该菌株具有一系列有益于健康的有益生物功能，特别是对延缓衰老迹象,预防和治疗肌肉和骨骼退化,调节肠道抵御肠道菌群与代谢物浓度紊乱,预防和治疗高脂血症,肝脏脂质累积,脂代谢和血脂疾病,皮肤变性。
技术背景
科学论文题目为《乳酸菌菌株可以缓解衰老大鼠的衰老症状和衰老引起的代谢紊乱》(“Lactobacillus strains alleviated aging symptoms and aging-inducedmetabolic disorders in aged rats”)已经于2018年12月28日刊发(28.12.2018),因此，在本人的优先申请规定的优先权日之后。所述论文与本专利申请的发明人相同。本出版物的作者是本申请的发明人，他们已经将所有权利转让给了本申请的申请人和本人的优先权申请，也就是说，本申请人的上述公开可以被认为是所谓的“发明人的原始披露”(即，公开披露的主要素材必须是发明人本人，一个或多个联合发明人，或从发明人以及联合发明人的直接或间接得到主要素材的其他人)。本论文的内容已纳入本人的优先申请(因此，在提交优先权申请之日，该内容并未公布)，同时也包含在本申请中。因此，Lactobacillusfermentum DR9菌株在延缓衰老迹象以及预防和治疗肌肉和骨骼退化方面的作用在本人的优先申请的申请日未被知晓(发表)。
论文《乳酸菌可以改善衰老大鼠的微生物群和代谢产物》(“Lactobacillussp.improved microbiota and metabolite profiles of aging rats”)于2019年6月14号在线发表(14.06.2019)，因此，是在本人的优先申请规定的优先权日之后。所述论文与本专利申请的发明人相同。本出版物的作者是本申请的发明人，他们已经将所有权利转让给了本申请的申请人和本人的优先申请，也就是说，本申请人的上述公开可以被认为是所谓的“发明人的原始披露”(公开披露的主要素材必须是发明人本人，一个或多个联合发明人，或从发明人以及联合发明人的直接或间接得到主要素材的其他人)。本人的优先申请中没有包含该论文的内容(因此，该内容在优先权申请提交之日未发表)，并且也包括在本申请中。因此，Lactobacillus fermentum DR9菌株在肠道调节菌群结构与代谢物浓度失衡方面的作用在本人的优先申请的申请日未被知晓(发表)。
通过引用将上述论文的全部内容并入本文。
根据(FAO\WHO,2006)，益生菌定义为“活的微生物，摄取一定量对人体健康有益”。乳杆菌在改善肠道环境，调节代谢紊乱，调节免疫应答等方向具有健康益处。
衰老是一个与年龄相关的多因素过程，与生理衰退相关，导致特定年龄死亡率的增加。预计到2050年，60岁及以上老年人的数量将增加一倍以上，到2100年将增加三倍以上，从2017年全球9.62亿人增加到2050年的21亿人和2100年的31亿人。当然衰老是不可避免的，当前关于衰老研究的目标是在预期寿命不断增加的情况下提高生活质量。
端粒长度常用作衰老与衰老相关病症的生物标记物。端粒是真核染色体末端核蛋白复合物，在细胞每次分裂中缩短。端粒的长度随着细胞的分裂而缩短，直至达到临界长度开始启动细胞衰老。除了端粒之外，p53基因也是衰老的生物标记。P53编码一个肿瘤抑制蛋白，作为端粒应激诱导衰老的关键标志物。它影响细胞周期停滞，DNA修复，细胞凋亡，细胞衰老。
衰老与氧化应激有关。DNA，蛋白质，脂质的氧化损伤逐渐累积也是促进衰老过程的因素。此外，氧化损伤影响线粒体DNA的复制与转录，进而使得线粒体功能衰退，加速了衰老的过程。线粒体功能障碍与衰老相关疾病如阿尔茨海默病与帕金森病等密切相关。氧化应激可能导致一些代谢紊乱如肥胖，糖尿病，心脑血管疾病等。
衰老影响肌肉骨骼系统。肌肉衰老通常归为肌肉减少，表现为骨骼肌量与强度的自动流失。在人体，肌肉量从40岁开始衰竭。将近25％的成人在60岁之后会经历肌肉流失，60％的人群到80岁时会经历。患有肌肉减少症的患者要遭受较低的肌肉强度与肌肉功能表现不佳。他们同时还面临着瘫痪，生活质量低或死亡的风险。慢性炎症，衰老导致的激素变化(更年期)，线粒体功能紊乱与肌肉细胞退化，都是肌肉减少症的发病根源。
男性女性均在30岁左右开始发生骨骼衰老，骨密度开始下降。该现象在女性更年期时会加速。骨量和骨密度的减少以及摔倒和骨折的风险增加被称为骨质疏松症。据报道，全球50岁以上的女性，每三名中就有一位会发生因骨质疏松导致的骨折。目前没有有效的治疗措施针对肌肉流失，除了力量训练之外，而力量训练也仅能作为预防措施。因此，迫切需要研究新的治疗方法，可以在衰老过程中提升肌肉骨骼系统的健康状态。
肠道是人体最大的淋巴器官，其中定殖将近4万亿细菌。肠道菌群控制着宿主的生理与生命活动，因此其在衰老过程中的角色不可或缺。人体肠道微生物在3岁左右趋于平稳，并受到饮食与健康状况的影响。老年人肠道菌群组成与多样性都会发生改变，表现为核心菌群如拟杆菌，瘤胃球菌，毛螺菌等减少，而某些健康相关物种也变得更加普遍。肠道微生物改变据报道受到肠道屏障完整性，肠免疫稳态以及多种老年疾病的影响。肠道相关的失调症可以依靠健康平衡的生活方式得到预防和阻碍。其中一种方法是通过饮食干预和/或功能性食物补充来维持肠道菌群的平衡。益生菌有益于健康的肠道，是众所周知的功能性食品，用于改善和恢复失调和胃肠道疾病，调节肠道菌群组成，进而调节肠道屏障功能。肠道完整性的增强将导致氧化应激和炎症标志物的降低。粪便微生物组学和代谢组学分析可为揭示疾病尤其是代谢性疾病的粪便生物标志物提供可靠和全面的信息。
代谢性疾病如高血脂症会增加患心血管疾病(CVD)的风险。根据世界卫生组织的数据，在全球范围内，心血管疾病占所有死亡的31％，心血管并发症被认为是发病率和死亡率的主要因素。到2030年，CVD的估计成本将达到10440亿美元。血液中脂质水平升高，高脂血症，经证明都是CVD发病的重要因素。高脂血症大致可分为单胆固醇升高、单甘油三酯(TG)升高和两者同时升高。高血脂症也被证明影响不同器官的抗氧化状态以及它们的脂蛋白水平，这反过来会加剧代谢紊乱，增加心血管疾病以及非酒精性脂肪肝(NAFLD)的风险。在动物实验中，益生菌已被证明能改善血脂状况。
皮肤将身体与外界环境隔离开来，防止身体过度失水和感染。此外，皮肤在美容方面也起着至关重要的作用，年轻漂亮的皮肤会对社会行为产生积极的影响。由于衰老，当人体变老时，皮肤老化迹象最明显。消费者每天为护肤品投入大量的开支。这吸引了化妆品和制药公司开发产品，试图延缓或逆转皮肤老化。
老龄化过程通过许多方面影响大脑和情绪，其中焦虑的患病率在老龄人口中居高不下。这可能与阿尔茨海默病等神经退行性疾病导致的认知能力下降有关。此外，在衰老过程中，通过细胞呼吸产生的细胞损伤反应分子的积累常常导致蛋白质和其他细胞分子的氧化，导致脑退化的发生。
生物体内的生物化学过程和机体代谢受磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)的调控。AMPK是一种调节合成代谢和分解代谢途径的细胞内能量传感器，特别是作为细胞能量稳态的主要调节者。尤其当AMPK检测到低三磷酸腺苷(ATP)水平时，信号通路被激活，其中AMPK促进分解代谢通路以产生用于各种细胞代谢活动的更多ATP。另一方面，AMPK负调节ATP的消耗生物合成过程，例如糖异生、脂质和蛋白质合成，通过直接参与这些过程的许多酶的直接磷酸化，以及通过磷酸化转录因子、共激活物和共抑制物对代谢的转录控制。因此，AMPK调节ATP水平，使机体功能维持在最佳状态，是控制机体代谢的生物开关。
食用益生菌后，宿主肠道内许多代谢物浓度增加，促使包括激活AMPK在内的诸多代谢增强。其中一些代谢物对健康有益，特别是对宿主的新陈代谢有益。例如其中一种代谢物5-羟脯氨酸，或也称为焦谷氨酸。5-羟脯氨酸是由多种肽经酶水解产生。促甲状腺素释放激素(TRH)又称普罗瑞林，是一种由5-羟脯氨酸、组氨酸和脯氨酸组成的三肽，用于治疗脊髓小脑共济失调。在因衰老导致的相关记忆衰退的受试者中，5-羟脯氨酸可改善某些言语记忆功能。5-羟脯氨酸也被发现是许多神经肽和激素的N末端修饰物，其中也包括阿尔茨海默病和家族性痴呆症中积累的肽。因此，5-羟脯氨酸具有抗衰老作用。另一种重要的肠道代谢物是抗坏血酸，它是维生素C生物合成的前体。维生素C是一种存在于皮肤水平的天然抗氧化剂，具有一定的抗氧化、抗炎、光保护特性，是已知的胶原合成的生物刺激剂。因此，抗坏血酸具有促进新陈代谢和皮肤健康的潜力。
益生菌可以产生一系列有益于健康的代谢物。其中一种代谢物是琥珀酸，据报道，琥珀酸具有抗衰老作用，可维持衰老状态下的下丘脑的内环境平衡，在不使用激素替代疗法的情况下逆转更年期症状，逐渐恢复因细胞衰老和系统衰退而丧失的功能，具有抗氧化特性，具有抵抗皮肤老化的潜力，在肌肉的呼吸/氧化中起重要作用。琥珀酸据报道可以调节肠道微生物，而近期发现琥珀酸还是骨质的一种组分。另一种代谢产物是，由一些益生菌菌株代谢苯基丙氨酸而产生的苯甲醛。苯甲醛是一种重要的风味物质，例如在奶酪生产中，通常用于食物，饮料，药物，香水，香皂以及染料工业中。苯甲醛据报道具有潜在的抗肿瘤，抗病毒健康功效。苯甲醛还是抗真菌化合物，广泛应用于食品防腐，天然存在于许多植物源中，如浆果、水果和腌制食品。它可以在肝脏中与甘氨酸结合并以马尿酸的形式排出，通常用于治疗真菌性皮肤病。它是一种常见的化合物，用于医药产品，如局部防腐剂和吸入性消肿剂。在动物中，苯甲酸主要存在于杂食动物体如雷鸟(岩雷鸟，Lagopus mutus)内脏和肌肉中。有些乳杆菌能将牛奶中的马尿酸转化为苯甲酸，因此酸奶中通常含有苯甲酸。据报道，苯甲酸有利于股骨重量，减少氯化物和增加骨骼中的镁，同时增加钙和磷的存留。
因此需要提供解决方案，尤其是益生菌，用以改善以上所提到的状况。
发明公开
技术问题
本发明要解决的问题是以安全有效的方式，提供可用于改善上述状况的新组合物和治疗方法。
解决方案
该解决方案基于提供益生菌菌株Lactobacillus fermentum(发酵乳杆菌)，菌株保藏号为CGMCC 15536，也称为Lactobacillus fermentum DR9。本发明者已发现该菌株具有相关的生物功能性，可用于改善，特别是下文所述的不同状况和疾病。
相应地，发明的第一项是Lactobacillus fermentum菌株或其代谢产物，其中菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏号为CGMCC15536，全基因组序列上传于GenBank登录号为CP033371，所述代谢产物包括琥珀酸，苯甲醛与苯甲酸。
本发明的一项涉及Lactobacillus fermentum DR9或其代谢产物用作治疗或作为药剂。本项也可作为一种益生菌治疗方法，包含根据需要给予有效量的Lactobacillusfermentum DR9或其代谢产物。术语“益生菌”在此文中，指活的微生物，在摄入一定数量之后，对宿主的健康有利。
本发明的一项涉及菌株Lactobacillus fermentum DR9或其代谢产物用于减缓衰老迹象。
本发明的一项涉及菌株Lactobacillus fermentum DR9或其代谢产物用于预防与治疗肌肉与骨骼退化。
本发明的一项涉及菌株Lactobacillus fermentum DR9或其代谢产物用于通过阻碍端粒缩短来减缓衰老迹象，和/或增强能量代谢来抵御衰老。
本发明的一项涉及菌株Lactobacillus fermentum DR9或其代谢产物用于通过阻碍甘油三酯的增加水平，炎症以及脂质积累，来预防与治疗高脂血症与肝脏脂肪积累。
本发明的一项涉及菌株Lactobacillus fermentum DR9或其代谢产物用于预防与治疗心血管疾病与降低胆固醇。
本发明的一项涉及菌株Lactobacillus fermentum DR9或其代谢产物用于作为益生菌来调节肠道抵御肠道菌群与代谢物浓度紊乱失衡。所述肠道代谢产物包括抗坏血酸与5-羟脯氨酸。
本发明的一项涉及菌株Lactobacillus fermentum DR9或其代谢产物用于预防与治疗皮肤退化。
本发明的一项涉及菌株Lactobacillus fermentum DR9或其代谢产物作为益生菌用于预防与治疗焦虑与阿尔茨海默病。
需要注意的是Lactobacillus fermentum DR9拥有以上所述的优势与医疗用途，包括在其它情况下，菌株的使用也需要针对在每一个医学用途之中。
本发明的一项涉及一种组合物，包含菌株Lactobacillus fermentum DR9，其中菌株冻干且组合物中的数量在104-1012cfu/g；以及一种组合物中包含该菌株的代谢产物，其中所述代谢产物包括琥珀酸，苯甲醛与苯甲酸。
Lactobacillus fermentum DR9或其代谢产物的所有上述医疗用途可替代地调配为菌株或其代谢物用于制造食品补充剂、药物、婴儿配方食品，可食用产品或食品，用于治疗和预防上述适应症。此外，也可将其作为用于治疗和预防上述适应症的替代方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本发明菌株或其代谢产物。所述研究对象主要是哺乳动物，尤其是人类。
如本文所用，当提及本文所用菌株时，术语“有效量”是用于组合物中菌株的菌落形成单位(cfu)的量，均在医学评价体系内，其高到足以显著改变病情以积极的方式治疗，同时也低到足以避免严重的副作用(呈合理的有效/风险比值)。
权利要求和本发明的每项中所涉及的术语Lactobacillus fermentum DR9均以其最广泛和共同的定义来理解，并在此文中或简述为“DR9”。
附图简要说明
为了便于理解本发明，在附图中示出了解释说明的特定实施例的，当结合以下描述来考虑时，对本发明、其构造和操作以及其许多优点将容易理解。
图.1A与1B显示对百分比比较解释说明(A)磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)激活，和(B)AMPK抑制剂加入不同乳酸菌(LAB)菌株无细胞上清液中AMPK激活情况。
图.2A与2B显示在细胞系中比较AMPK磷酸化的图示，包括人骨肉瘤(U2OS)、小鼠肌肉(C2C12)、人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)、人卵巢(OVCAR3)、人角质形成细胞(HaCaT)、人前列腺(DU145)和人结直肠(CaCo-2)，用Lactobacillus fermentum DR9的无细胞上清液和未发酵的MRS肉汤培养基(De Man,Rogosa and Sharpe(MRS)broth)处理24小时。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)和化合物C分别作为阳性对照和阴性对照。
图.3A，3B与3C。(A)血液中端粒长度的测量。(B)治疗12周后大鼠血清丙二醛(MDA)浓度。(C)基于坡道表现的衰老诱导的大鼠跑步机消耗实验(距离、时间、速度、功与功率)。(D)p53基因在肌肉(比目鱼肌和腓肠肌)和骨(胫骨)中的表达。用qPCR检测p53基因的表达。青年大鼠：未经治疗的大鼠每天皮下注射0.9％生理盐水(n＝6)；老年大鼠L.fermentumDR9干预(每天皮下注射600mg/kg D-gal，DR9每天干预量为1×1010CFU/天；n＝6)；老年大鼠二甲双胍干预(每日皮下注射D-半乳糖600mg/kg，每日注射二甲双胍300mg/kg；n＝6)或老年-他汀(D-半乳糖致衰老，洛伐他汀2mg/kg/天)。结果用平均值表示；误差线(SEM)；n＝6。统计分析采用独立t检验。
图.4A，4B,4C与4D。(A)12周实验期后大鼠右后腿腓肠肌(左)和胫骨(右)抗氧化基因、超氧化物歧化酶(SOD)mRNA表达水平。腓肠肌(B)AMP活化蛋白激酶(AMPKα2)亚基和(C)肌生成相关基因IGF-1和MyoD的mRNA表达。(D)胫骨破骨细胞生成相关的TNF-α、IL-6和TRAP的mRNA基因表达。(E)12周实验处理后大鼠腓肠肌IL-1β与IFN-γ水平。青年大鼠：未经治疗的大鼠每天皮下注射0.9％生理盐水(n＝6)；大鼠衰老造模通过每天皮下注射600mg/kg的D-半乳糖(n＝6)；老年-DR9：老年大鼠经L.fermentum DR9干预(1×1010CFU/天；n＝6)。老年-二甲双胍：老年大鼠用二甲双胍处理(300mg/kg/天；n＝6)。数据以平均值±S.E.M.表示。采用独立T检验进行统计分析。
图.5A与5B。实验处理12周后大鼠左后腿腓肠肌切片苏木精伊红(HE)染色(倍数，×10)。(a)青年大鼠：未经治疗的大鼠每天皮下注射0.9％生理盐水(n＝6)；(b)大鼠衰老造模通过每天皮下注射600mg/kg的D-半乳糖(n＝6)；(c)老年-DR9：老年大鼠经L.fermentumDR9干预(1×1010CFU/天；n＝6)。(d)老年-二甲双胍：老年大鼠用二甲双胍处理(300mg/kg/天；n＝6)。(e)实验处理12周后大鼠左后腿腓肠肌肌核计数。数据以平均值±S.E.M.表示。采用独立T检验进行统计分析。
图.6。实验处理12周后大鼠左后腿脱钙胫骨近端切片苏木精伊红(HE)染色(倍数，×4)。(a)青年大鼠：未经治疗的大鼠每天皮下注射0.9％生理盐水(n＝6)；(b)大鼠衰老造模通过每天皮下注射600mg/kg的D-半乳糖(n＝6)；(c)老年-DR9：老年大鼠经L.fermentumDR9干预(1×1010CFU/天；n＝6)。(d)老年-二甲双胍：老年大鼠用二甲双胍处理(300mg/kg/天；n＝6)。黑色箭头表示骨骼的物理结构(生长板)。
图.7A，7B与7C。(A)细菌在门水平的分布，(B)厚壁菌门/拟杆菌门相对数量比值与(C)12周衰老诱导后大鼠粪便中布鲁氏菌(Blautia),拟杆菌(Bacteriodetes)与乳酸杆菌(Lactobacillus)菌属的相对丰度。青年大鼠：未经治疗的大鼠每天皮下注射0.9％生理盐水(n＝6)；大鼠衰老造模通过每天皮下注射600mg/kg的D-半乳糖(n＝6)；老年-DR9：老年大鼠经L.fermentum DR9干预(1×1010CFU/天；n＝6)。老年-二甲双胍：老年大鼠用二甲双胍处理(300mg/kg/天；n＝6)。数据以平均值±S.E.M.表示。采用独立T检验进行统计分析。
图.8A与8B。短链脂肪酸的稀疏偏最小二乘判别分析(sPLS-DA)计分图(A)，12周衰老诱导后粪便中水溶性代谢物(B)与(C)5-羟脯氨酸。代谢物检测与分析采用GC-MS。(D)采用多重ELISA法测定大鼠远端结肠中干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的细胞因子水平，Bradford法测定的蛋白质含量并进行标准化。青年大鼠：未经治疗的大鼠每天皮下注射0.9％生理盐水(n＝6)；大鼠衰老造模通过每天皮下注射600mg/kg的D-半乳糖(n＝6)；老年-DR9：老年大鼠经L.fermentum DR9干预(1×1010CFU/天；n＝6)。老年-二甲双胍：老年大鼠用二甲双胍处理(300mg/kg/天；n＝6)。
图.9A与9B。粪便样品中布鲁氏菌(Blautia)相对丰度与(B)12周实验处理期后粪便中厚壁菌门下各菌属分布分析。青年大鼠：未经治疗的大鼠每天皮下注射0.9％生理盐水(n＝6)；大鼠衰老造模通过每天皮下注射600mg/kg的D-半乳糖(n＝6)；老年-DR9：老年大鼠经L.fermentum DR9干预(1×1010CFU/天；n＝6)。老年-他汀：老年大鼠用洛伐他汀处理(2mg/kg/天；n＝6)。
图.10A与10B。12周实验处理后粪便中短链脂肪酸分析。a)热图归一为相对值在2至-2。红色表示高浓度，蓝色表示低浓度。乙酸(b)与丙酸(c)的绝对浓度。青年-ND:正常饮食；青年-HFD:高脂饮食；老年-ND:D-半乳糖诱导衰老正常饮食；老年-HFD：D-半乳糖诱导衰老高脂饮食；老年-HFD-他汀：D-半乳糖诱导衰老高脂饮食，用洛伐他汀处理2mg/kg/天；老年-HFD-DR9：D-半乳糖诱导衰老高脂饮食，经L.fermentum DR9干预(1010CFU/天)。结果用平均值、误差线(SEM)表示，n＝6。统计分析采用独立t检验。
图.11A与11B。12周D-半乳糖(600mg/kg/天)诱导衰老大鼠肝脏中(A)SCD1，(B)IL-6,与(C)ABCG5的mRNA表达。(D)血清生化参数。ND(正常饮食),HFD(高脂饮食),HFD-他汀(高脂饮食,洛伐他汀2mg/kg/天),HFD-DR9(高脂饮食,L.fermentum DR9干预(1×1010CFU/天),老年二甲双胍(300mg/kg/天)；n＝6。结果用平均值；误差线(SEM)表示；n＝6。统计分析采用独立t检验。
图.12A与12B。12周D-半乳糖(600mg/kg/天)诱导衰老大鼠肝脏AMPKα1(A)基因相对表达量与细胞因子(IL-4与IL-10)水平(B)，(C)肝脏苏木精伊红(HE)染色切片。ND(正常饮食),HFD(高脂饮食),HFD-他汀(高脂饮食,洛伐他汀2mg/kg/天),HFD-DR9(高脂饮食,L.fermentum DR9干预(1×1010CFU/天))。图.12C，(a)ND，(b)HFD，(c)HFD-他汀，(d)HFD-DR9。结果用平均值；误差线(SEM)表示；n＝6。统计分析采用独立t检验。
图.13A与13B。皮肤弹性(A)，12周实验处理后皮肤中细胞周期蛋白-D1(B),FAS(C),GPX与SOD(D)mRNA基因表达。青年大鼠：未经治疗的大鼠每天皮下注射0.9％生理盐水(n＝6)；大鼠衰老造模通过每天皮下注射600mg/kg的D-半乳糖(n＝6)；老年-DR9：老年大鼠经L.fermentum DR9干预(1×1010CFU/天；n＝6)。老年-二甲双胍：老年大鼠用二甲双胍处理(300mg/kg/天；n＝6)。结果用平均值；误差线(SEM)表示；n＝6。统计分析采用独立t检验。
图.14A与14B(A)旷场实验焦虑评价。青年(对照)，老年(D-半乳糖诱导衰老)，老年-他汀(D-半乳糖诱导衰老，洛伐他汀2mg/kg/天)与老年-DR9(D-半乳糖诱导衰老，L.fermentum DR9干预10log CFU/天))。结果用平均值；误差线(SEM)表示；n＝6。统计分析采用独立t检验。Drosophila Melanogaster(黑腹果蝇)GMR-OreR型在放大倍数250γ眼观察到良好的六边形小眼与直立鬃毛(B)，放大倍数350Υ(C)，在放大倍数250γ下观察出现孔洞的粗糙眼型的转基因Drosophila Melanogaster Aβ42(GMR-Aβ42)(D)与350×(E)。观察GMR-Aβ42眼成型良好具有完整的六边形结构及较少的鬃毛损伤。DR9组饲喂Lactobacillus fermentum DR9菌株，剂量为100μL 1x1011CFU/mL，放大倍数250γ(F)与350×(G)。
图.15A与15B.Lactobacillus fermentumDR9的无细胞上清(CFS)，胞内提取物(IE)与细胞壁残片对AMP激酶活化作用，由ADP-GLO激酶测定。数值以AMPK活性与ATP-ADP转化的百分比表示。n＝6。(B)L.fermentumDR9的CFS脂质组分对U2OS细胞早衰的激活作用。AICAR(2mM)为阳性对照，Dorsomorphin C(20μM)为阴性对照。误差线代表平均值的标准误差。n＝3。a-d表示显著差异(p<0.05)。采用单因素方差分析进行统计分析。(C)Lactobacillus fermentumDR9(上)和未发酵MRS培养基(下)的CFS馏分的GC-MS色谱图。峰1：丁二酸(琥珀酸)；峰2：苯甲醛；峰3：未知；峰4：苯甲酸。
图.16。经12周实验处理大鼠粪便中肠道菌群代谢物5-羟脯氨酸与抗坏血酸浓度。青年大鼠：未经治疗的大鼠每天皮下注射0.9％生理盐水(n＝6)；大鼠衰老造模通过每天皮下注射600mg/kg的D-半乳糖(n＝6)；老年-DR9：老年大鼠经L.fermentum DR9干预(1×1010CFU/天；n＝6)。老年-二甲双胍：老年大鼠用二甲双胍处理(300mg/kg/天；n＝6)。数据以平均值±S.E.M.表示。采用独立T检验进行统计分析。
本发明实施的最佳方式
Lactobacillus fermentum DR9分离自槟城新鲜牛乳中，由马来西亚临床营养国际(马来西亚)私人有限公司提供。菌株鉴定为Lactobacillus fermentum(发酵乳杆菌)并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号。保藏号为CGMCC15536，保藏时间2018年4月2日(02.04.2018)。由相同的申请人临床营养国际(马来西亚)私人有限公司(ClinicalNutrition Intl(M)Sdn.Bhd.)与李润私人有限公司(Lii Run Sdn.Bhd.)共同提交保藏。所保藏菌株具有活性且具有其保藏所需的所有条件。
种属鉴定基于16S rRNA基因测序。16S rRNA基因信息如下，序列为SEQ ID NO:1:
重叠群26(1,1491)
重叠群长度:1491碱基
平均长度/序列:942碱基
总序列长度:1884碱基
总链(Total Strand):1序列
底链(Bottom Strand):1序列
总:2序列
全基因组序列上传于GenBank登录号为CP033371(2018年11月4日)(修订历史记录：CP033371.1 2018.11.4)。
在此声明，利用所保藏的菌株作为起始材料进行试验，技术人员可按照通用操作，包括常规的基因诱变以及再分离技术，获得该菌株的变异型或突变体，同时保有此专利中所描述的原菌株的特性或增强特性。因此，本专利同时将一些可能的突变型在此公开。本文中，针对此菌株的术语“变体”或“突变体”是指由所保藏的菌株经一些自然发生的，或专性进化菌株所获得的菌株，主要指突变，仍旧保持有原菌株的功能。对功能的评价技术方法已经在“实施例”章节进行阐述。
例如，菌株的“变体”16S rRNA基因或是全基因组序列预计与在此公开的原菌株的16SrRNA基因SEQ ID NO:1或CP033371基因组序列比对，具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％比例的基因相同性。
在一个特定实施例中，突变株可以通过DNA重组技术获得。另一个特别的实施例中，突变体可由随机基因重组获得。因此，本专利的另一方面涉及获得DR9突变株的方法，在那里将详细阐述以所保藏的原菌株为原材料，进行基因突变，并获得变体或突变株进一步保留或增强所保藏的原菌株的生物功能。
在一个详细的实施例中，本菌株在人造培养基中发酵，并在发酵后经后处理，获得大量细菌细胞，结果使得这些细菌细胞是处于液体培养基中或固体状态。特别地，后处理可由以下几个方式中进行选择：干燥，冷冻，冷冻干燥，流体层干燥，喷雾干燥与液态培养基冷冻，更特别地，为冷冻干燥。
菌株由适合的人造培养基，在适合的条件下经培养(或发酵)得来。对于“人造培养基”的解读为，是微生物的培养基，含有天然基质，可选地添加化学合成物，例如可使血清功能再生的聚乙烯醇。常规适配的培养基是营养肉汤培养基，包含微生物生长所需的基础碳源(例如葡萄糖)，氮源(氨基酸与蛋白质)，水与盐。生长培养基一般以液体的形式，或添加琼脂及凝胶组分制备的固体培养基。菌株可单独培养制备纯培养物，或跟其它微生物混合培养，亦可分开培养后再以设定比例进行混合。培养后，根据最终的目的，菌株可以作为纯菌使用，或细菌培养物或细胞悬液，经合适的后处理后再进行使用。本文中，术语“生物量”解读为微生物经培养后(或发酵作为培养的同义方式)所获得的细菌菌体。
“后处理”已经在本发明中进行了阐述，其中所涉及的流程均以获得目标生物量即可储藏的细菌体为目标。后处理的目的包括降低菌体细胞的代谢活力，延迟细胞凋亡的比例。所以经后处理之后，细菌细胞可以是固态也可是液态形式。固态形式下，菌体细胞可以以粉状或颗粒状形态储存。在任何情况下，无论哪种形态，固态液态形式下的菌体细胞在自然界不存在，因此不是天然产生的，鉴于均经过人造条件的后处理。后处理的特别之处在于还需要用到一种或多种所谓的后处理试剂。专利中提及的“后处理试剂”指在后处理过程中用到的一系列复合物。该系列复合物包括但不局限于，脱水剂，抑菌剂，防冷冻剂(冷冻保护剂)，惰性填充料(冻干支持剂)，载体材料(核心材料)等，单独使用或是联合使用。
这里有两个基本的方法用以降低菌体细胞的代谢活性，因此也形成两套后处理方式。第一个是抑制化学反应率，通过降低温度如冷藏冷冻，机械冷冻，液氮冷冻。另外，也可通过抑制菌体生长的基质，如抑菌剂等对菌体细胞的生化反应进行抑制。
第二种后处理方法是去除生物量中的水分，利用冷冻干燥法升华水分。去除生物量水分的匹配方式是干燥，冷冻干燥，喷雾干燥，流化床干燥。后处理经干燥，冷冻干燥，喷雾干燥，流化床干燥工艺后，最终将样品处理为固体形态。
后处理尤其是冷冻干燥，降低压力使冷冻菌体细胞悬浮液中的水分升华。此加工包括三个过程：预冷冻形成冷冻结构，先除去大部分水分，第二步干燥再除去结合水。由于工业化培养与菌体收集中，目的及预期具有可变性，因此需添加惰性填充材料，即冻干保护剂。作用是保证产品中活性益生菌的标准量。以下列举了可用的商业化冻干保护剂材料：白砂糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，葡萄糖，麦芽糖，麦芽糊精，玉米淀粉，菊粉，等可用的非吸潮组分。此外，例如抗坏血酸，也经常用作冻干保护剂。无论用何种材料，需要最终能够磨成所要的粒径大小，包括制成粉剂。
Lactobacillus fermentum DR9的医疗应用
Lactobacillus fermentum DR9具有作为益生菌的优良特性。益生菌需要具备的特性有无毒，活的，可粘附以及对健康有积极作用。每一个菌株都是独特的，即便与其归属于同一菌种的菌株，也无法进行类比。
在本专利实施例部分所述实验中，列举了Lactobacillus fermentum DR9菌株与其它相比所具有的与提升健康相关的优良特性。
1.Lactobacillus fermentum DR9通过激活AMPK，阻止端粒缩短，降低脂质过氧化与增强身体耐受力(详见本文后续的实施例1部分)。共18株乳酸菌(LAB)围绕其腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)活化作用，介导寿命延长的细胞内能量传感器，进行评价。Lactobacillus fermentum DR9(DR9)无细胞上清液(CFS)具有较高的AMPK激活作用，并进行下一步评价。DR9对AMPK的磷酸化作用经多细胞系进行证明，并与Compound-C即AMPK抑制剂进行对比(P<0.05)。使用由D-半乳糖(D-gal)诱导早衰SD大鼠，与D-gal处理大鼠进行DR9(10log CFU/只/天)干预12周阻碍端粒缩短，与未干预组进行对照。与未经治疗的对照组相比，DR9增加了肝脏中AMPKα1的基因表达，表明其具有活化作用。与未经处理的对照组相比，DR9降低了血脂过氧化，降低氧化应激。在跑步机耐力试验中，与未经处理的对照组相比，喂食DR9的大鼠表现出更长的跑步时间、更高的速度、更高的功和功率，显示出更好的身体耐力。与对照组相比，DR9降低了腓肠肌和胫骨中已知衰老生物标志物p53的基因表达。
因此，如前所述，本发明的一个方面涉及Lactobacillus fermentum DR9或其代谢物，其通过激活AMPK、阻止端粒缩短、降低脂质过氧化和增强身体耐力来减缓衰老迹象。衰老迹象包括：能量代谢减少，导致行动不便，血浆氧化，导致免疫系统损伤。
2.Lactobacillus fermentum DR9预防与治疗肌肉及骨骼退化(详见本文后续的实施例2部分)。以D-半乳糖诱导衰老大鼠腓肠肌和胫骨为模型探究DR9抗衰老机制。证实与未干预对照相比，DR9提高了腓肠肌和胫骨中SOD表达，提高了腓肠肌中AMPKα2表达。与老年对照组相比，DR9还增加了IGF-1的mRNA表达，同时降低了MyoD mRNA的表达。与老年大鼠相比，DR9还降低了胫骨中IL-6、TNF-α和TRAP的表达，以及腓肠肌中IL-1β和IFN-γ的表达。DR9大鼠腓肠肌的肌核(肌细胞核)数目较多，肌纤维排列较密集。DR9大鼠胫骨骨小梁排列较整齐，骨小梁正常，骨髓脂肪较少，而未治疗的老年大鼠骨小梁排列稀疏，网状结构较薄。
因此，如前所述，本发明的一个方面涉及Lactobacillus fermentum DR9或其代谢物，其用于通过增强抗氧化和能量代谢来预防和治疗肌肉和骨退化，同时减少萎缩、破骨细胞生成、炎症和肌核的消耗，带来更好的机动性和身体耐力。
3.Lactobacillus fermentum DR9具有调节肠道以抵御菌群结构与代谢物
浓度紊乱的作用(详见本文后续的实施例3部分)。在衰老模型中，厚壁菌门/拟杆菌门比值显著降低，经DR9干预后比值升高。在属水平研究来看，与衰老大鼠相比，DR9干预后提高了Lactobacillus与Blautia丰度，降低了Bacteroides的丰度。粪便中短链脂肪酸(SCFA)与水溶性代谢产物在DR9干预后，其状况与青年大鼠更为相似。通过对水溶性代谢产物分析发现，经D-半乳糖诱导衰老之后，对肠道中氨基酸代谢影响较大，如5-羟脯氨酸水平降低，而经DR9干预后，其水平得到回升。与未经干预的老年大鼠相比，DR9降低降低末端结肠中如干扰素γ(IFN-γ)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。在老年高脂模型组(HFD)，雄性SD大鼠饲喂高脂饮食同时注射D-半乳糖持续12周来诱导衰老。与老年高脂模型组相比，其在DR9干预下，可以增加肠道中Blautia丰度。对粪便中水溶性代谢物分析揭示了与老年高脂模型组相比DR9干预后介导了与氨基酸代谢相关的化合物浓度升高，如色氨酸，亮氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸，缬氨酸和赖氨酸，同时如乙酸与丙酸等短链脂肪酸浓度也升高。
因此，如之前所提到的，作为本发明的一项内容涉及LactobacillusfermentumDR9或其代谢物组分作为益生菌调节肠道以抵御菌群结构与代谢物浓度紊乱的作用；即改善微生态失调。
4.Lactobacillus fermentum DR9增强脂质代谢与缓解NAFLD(详见本文后续的实施例4部分)。在本研究中，评测不同乳酸菌菌株通过激活AMPK来减轻老年大鼠的高脂血症和肝脂肪变性。雄性SD大鼠饲喂高脂饮食同时注射D-半乳糖12周诱导衰老模型。实验处理包括i)正常饮食，ii)HFD，iii)HFD-他汀(洛伐他汀2mg/kg/天)，iv)HFD-Lactobacillusfermentum DR9(10log CFU/天)。与对照组相比，DR9在肝脏基因表达和肝脏组织学方面发挥了积极作用；与HFD老年对照组相比，DR9下调了肝脏脂质合成和β-氧化基因SCD1，上调了肝脏IL-6和ABCG5的甾醇分解代谢基因。与HFD老年对照组相比，摄入DR9可降低12周后的血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平。与HFD老年对照组相比，DR9还上调肝脏能量代谢基因AMPKα1，增加肝脏抗炎细胞因子IL-4和IL-10的浓度，降低肝脏脂肪变性程度。总而言之，这项研究表明，DR9菌株通过激活能量和脂质代谢，改善了脂质分布，这表明它是一种缓解心血管和肝脏疾病的自然干预措施。
因此，如前所述，本发明的一个方面涉及Lactobacillus fermentum DR9或其代谢物组分，其通过降低甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平、抑制炎症和脂质积聚来预防和治疗高脂血症和肝脂积聚。在特定实施例中，本发明菌株用于预防和治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)。
5.Lactobacillus fermentum DR9预防和治疗皮肤退化、衰老和氧化应激(详见本文后续的实施例5部分)。雄性SD大鼠注射D-半乳糖12周诱导衰老模型。实验处理12周后，老年组皮肤弹性低于青年组。与未治疗的老年组相比，给予DR9可防止皮肤弹性的丧失。衰老标志物Cyclin-D1在老年组皮肤中的表达高于青年组。与未治疗的老年组相比，给予DR9的大鼠皮肤cyclin-D1的表达较低。与老年大鼠相比，DR9还上调了皮肤FAS的表达，FAS是一种促进皮肤再生的凋亡生物标志物。老年大鼠表现出较高的GPX(氧化应激的生物标志物)表达和较低的SOD(抗氧化基因)表达，而DR9则分别降低和增加了这种表达。
6.Lactobacillus fermentum DR9预防和治疗焦虑与阿尔茨海默病(详见本文后续的实施例6部分)。焦虑采用旷场实验进行评价。与未经治疗的老年大鼠相比，DR9的干预减少了大鼠向外侧区的移动。阿尔茨海默病是通过转基因果蝇、Drosophila melanogaster和淀粉样β-Aβ42来评估的，通过GMRGal4来评估眼睛畸形的靶向表达。DR9的使用预防了眼球畸形，使小眼形状更整齐，鬃毛损伤更少，说明阿尔茨海默病的严重程度较低。
因此，如前所述，本发明的一个方面涉及Lactobacillus fermentum DR9或其代谢物组分，通过改善皮肤弹性和皮肤细胞再生来预防和治疗皮肤退化，同时减少衰老和氧化应激。
7.Lactobacillus fermentum DR9通过生成琥珀酸、苯甲醛和苯甲酸等代谢产物发挥其健康益处(详见本文后续的实施例7部分)。
琥珀酸具有抗氧化特性，有助于治疗皮肤老化和恢复与细胞衰老和全身老化相关的功能丧失。另一方面，代谢产物中苯甲酸的存在可以减少氯离子和增加骨骼中的镁，然后增加给药后的骨骼重量。此外，使用含有苯甲酸的代谢物也可以增加钙和磷在骨中的滞留，进而减缓骨中的老化迹象。此外，代谢物中的苯甲醛具有抗肿瘤和抗病毒特质，使得该菌株代谢物可选用于治疗肿瘤或癌症。
该代谢物会减缓摄入后受试体骨骼和肌肉的老化迹象。该组合物适用于患有与年龄有关的疾病的受试者，例如肌肉减少症、骨质疏松症和代谢紊乱。粗代谢物可被摄取或进一步加工以与至少一种赋形剂混合以形成保健食品或饮料组合物。加工可以以较温和的方式进行，优选在较低温度和大气压下进行，以保持代谢物的营养价值。
在本发明的另一优选实施例中，摄取代谢物诱导受试者产生抗坏血酸。尤其是在哺乳动物中。抗坏血酸的产生可直接从受试者的胃肠道诱导，或间接从胃肠道内的肠道微生物群诱导。在皮肤水平存在抗坏血酸可去除受试者体内的毒素，并为受试者提供抗氧化、抗炎和光保护特性。特别的是，抗坏血酸提供的抗氧化酶活性与一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)密切相关，其中AMPK的活化与衰老相关代谢通路非常重要，可以延缓骨骼和肌肉中衰老的迹象。
本发明的又一优选实施例，摄取代谢物诱导受试者中5-羟脯氨酸的产生。尤其当对象是哺乳动物时。摄入后可在结肠中诱导5-羟脯氨酸的产生，特别是在形成谷胱甘肽的过程中。谷胱甘肽的形成可维持体内细胞内氧化还原稳态，对抗活性氧。此外，摄取该组合物还诱导一系列酶水解，其导致在下丘脑中产生包含5-羟脯氨酸的促甲状腺素释放激素(TRH)，其可用于治疗脊髓小脑共济失调。除了与TRH一起改善语言记忆功能外，5-羟脯氨酸在代谢过程中对游离氨基酸的细胞内转运也起着重要作用。此外，5-羟脯氨酸可能在生理上诱导AMPK活化，进而改善代谢健康，减缓骨骼和肌肉的衰老迹象。摄入该组合物所诱导产生的5-羟脯氨酸可减缓骨骼和肌肉中的老化迹象。
在本发明的另一优选实施例中，代谢物通过激活AMPK磷酸化，由AMPK通路来调控骨和肌肉中老化迹象的减缓。特别的是，AMPK是一种能量感应网络调节因子，可以转录重组细胞对外源性应激的代谢反应，AMPK是细胞能量稳态的开关。AMPK还可以作为限制热量效应的介质，其作用包括提高胰岛素敏感性、提高代谢率、减缓生物功能的退化和减轻体重。此外，包含L.fermentum DR9的代谢物的组合物可在不需要减少实际热量摄入的情况下，施加模拟热量限制效应，因此允许将该组合物用于与老化因子相关的代谢疾病。
根据本发明的另一优选实施例，代谢物通过防止端粒缩短而减缓骨和肌肉中老化迹象。AMPK磷酸化来激活AMPK通路，阻止端粒缩短。在一个示例性实施方案中，与经二甲双胍治疗的动物模型相比，饮食包含代谢物的衰老动物模型显示出端粒长度的优势，展现出更高的抗老化潜能。此外，受代谢物影响的动物模型显示没有出现服用二甲双胍后包括低血糖和胃不适等副作用。
在本发明的一个优选实施例中，代谢物通过AMPK通路，调节代谢标记物与减缓骨骼和肌肉衰老，特别是对骨强度损失和肌肉质量减少的标记物，因此减缓骨骼和肌肉中老化迹象的。更具体地说，代谢物降低了局部腓肠肌和胫骨中p53基因的表达，其中编码肿瘤抑制蛋白的p53基因是端粒应激诱导衰老的关键标志物，是细胞周期阻滞、DNA修复、凋亡和细胞衰老的调节器。p53基因表达的降低与AMPK磷酸化的促进有关，因此线粒体相关基因可以上调以改善老年人的运动功能。在示例性实施例中，L.fermentum DR9菌株的代谢物的组合物干预下，衰老动物模型在爬坡运动测试中显示出运动性能的改善与提升。
此外，本发明的代谢物通过调节AMPK来保护代谢系统和系统，从而延缓骨骼和肌肉中的衰老迹象。这些代谢物能够通过激活AMPK途径来调节线粒体的动力学，从而恢复代谢功能，克服氧化应激，减少能量消耗，减少资源消耗。此外，这些代谢物可以改善脂质、肝脏和肾脏的状况，这可能降低成年后期心血管疾病、肥胖、糖尿病、慢性肾病和非酒精性脂肪肝的风险。
产品组成
本发明的一个方面涉及包含本发明菌株的组合物，其中所述菌株是冷冻干燥的并且在所述组合物中的量在104和1012cfu/g之间。
另一方面涉及包含所述菌株的代谢物的组合物，其中所述代谢物包含琥珀酸、苯甲醛和苯甲酸。
应用中有效的活菌细胞数量应由专业人员根据使用的途径与目的进行调整与确定，同时要考虑例如治疗者的年龄与生理状态，病症程度，使用时的最终剂型等。当口服途径时，本专利菌株组分建议日服用量为107-1012cfu，且符合目前的法规要求，最佳口服量为109-1011cfu。“菌落形成单位”(“cfu”)定义是在琼脂培养板中所出现的微生物克隆数，用以计算细菌细胞的数量。当使用本专利发明物组分时，菌株在其中所占比例为1:1。
对本专利菌株的应用通常是指使用该菌株的活细胞，即活菌体。此外也可扩展为使用该菌株的灭活菌体或菌体裂解物(由以下方式获得灭活菌或菌体裂解物，如改变pH值，超声处理，辐射，高温高压等)，以及组分包括本专利菌株所产生的有益因子例如组分中的2-羟基异癸酸(2-hydroxyisocapric acid)与3-苯乳酸。
本专利发明物的具体应用于食品补充剂，药剂，婴幼儿配方食品，可食用产品及食品中。
本专利发明物的应用形式可为将组分制备片剂，胶囊，丸剂等用于口服。
本专利发明的组分可制备成任何合适的形态，在不影响其菌体与代谢物的生物活性基础上。因此在针对特定的使用终端来设计制备该发明组分的使用形态时，也许在药剂学、食品技术领域的专业人员进行设计与制备。
本发明物组分也可制备成只包含菌体的单一组分，也可混合另外一种或多种活性成分或药剂辅料，添加剂，食品组分。本专利发明物的具体应用中，可以添加另外一种或多种的活性组分。当另外的添加组分为其它种类的益生菌菌株，
当然对本专利菌株及其代谢物不产生拮抗作用的前提下，使用效果更好。根据以上阐述说明，本专利菌体细胞可以纯菌形态使用，亦可以菌体培养混合形态使用，作为菌体培养的部分组分使用，或菌体培养经后处理再使用，以单一菌株或符合其它菌株一同使用，亦可添加合适的载体与辅料一同使用。其它益生菌也可一同符合使用。
本专利组分可用于药物产品形式使用。此处的“药物产品”定义按其最广泛的描述理解，包括添加了本专利组分中任意活性组分，菌体细胞与相匹配的药剂符合使用。“药物产品”也并非局限于医用药剂。“药物产品”在此喻指混合物，材料，组分等形式，在健全的医疗判断内，对人体等的组织无毒性伤害，无刺激，无过敏反应等其它副作用与并发症。其中每一种载体或辅料等，都必须与终产品中添加的其它复合物相适应。相匹配的载体或辅料等均可在药剂学标准资料中寻找。
药物产品根据各国的不同要求会有多种形态与名称。例如，一个药剂就可以是一个特定的药物产品。医用食品也在本专利所提到的药物产品范围内。“医用食品”与“特医食品”在一些国家中指某些食品可以通过饮食干预对特定疾病有效，弥补日常饮食所欠缺的营养。该定义由一些法案所规定，如美国食品与药品管理局的1988颁布的罕用药行政管理法案修正案，欧洲委员会指令1999/21/EC。医用食品因其所声称的特定保健功能，与其它广义的食物类别有明显的区分。
通常把益生菌组分，例如在本专利中公开的菌株，作为食品补充剂使用。食品补充剂作为膳食补充或营养补充，通常作为一种特殊的药用产品。该品类的制备是作为膳食的补充，能够提供日常饮食中所缺乏的或获取量不足的营养成分。通常，食品补充剂也是一种食品，但有时也将他们划分到药物，天然健康产品或保健品之中。就本专利而言，食品补充剂也包括保健品。食品补充剂常作为“非处方药”在无处方下销售。如果食品补充剂采用丸剂或胶囊的形式，则使用与药物相同的赋形剂。食品补充剂也采用食品的形式，增强了某些营养效用(如婴幼儿配方产品等)。因此对于本专利发明物的具体应用，可作为食品补充剂使用。
本专利组合物可混合合适的可食用液体或固体组分，经冷冻干燥制备片剂，丸剂，胶囊，糖果，颗粒剂，粉剂，悬混剂，散剂，糖浆，并明确其单位剂量。此外，也可按照一定剂量冻干组分提供，另外配备液体组分，在使用前混匀后一并摄入。
本专利组合物可添加于大范围的食品与可食用产品中，例如婴幼儿乳品。“可食用产品”在此为广泛的通指，包括众多产品类型，形态包括以上所述，如可被动物所利用；以及感官气味可被接受的产品。“食品”可理解为可食用的产品，同时可为机体提供营养支持。尤其是目前较为感兴趣的食品是食品补充剂与婴幼儿配方食品。食品中较为适宜的复合物为包含例如燕麦，乳酸发酵食品，抗性淀粉，膳食纤维，碳水，蛋白以及糖基化蛋白。作为食品中的具体应用，菌体可与其它佐料均质，例如谷物与奶粉，构成婴幼儿配方食品。
本专利的其中一项内容涉及到包含冷冻保护剂的固态组合物；本专利菌株的冷冻干燥生物质；以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可从乳液，凝胶，糊剂，颗粒，粉剂，胶体中选择。本专利的其他方面亦可用于提供口腔健康防护产品，药物组合物，可食用产品，膳食补充剂以及美容产品，均可复合本专利中发明物一定的有效剂量进行应用。在特定的实施方式中，口腔护理产品为口香糖，牙膏，口腔喷雾，止咳糖，口腔分散片等。
在特定的实施方式中，药物组合物，可食用产品或是膳食补充剂均可以止咳糖或口腔分散片的产品形式应用。
本专利发明的组合物具体实施例在下文实施例8中。
贯穿本专利申请书中描述以及声称的“包含”，其变体并不包括其它技术指标，添加剂，成分，操作或步骤。其他对象，本专利的优点与特点对于有技术背景的人员在相关说明书阅读基础上是显而易见的，当然也可通过实践本专利的描述进行掌握。此外，目前的发明包含了所有本文中所描述的特定的与优先的多种体现的组合方式。以下的例子与图示均用来作为目标用途的实施例说明，但本专利并不局限与此。
发明方式
实施例
材料与方法
细菌菌株与培养
Lactobacillus fermentum DR9分离自马来西亚槟城的新鲜牛乳中，以友好的方式从Clinical nutrition Sdn.Bhd.(马来西亚吉隆坡)公司获得。贮藏的菌体培养物在20％甘油下封存(-20℃)，活化时使用无菌MRS液体培养基(Hi-Media，孟买，印度)经三轮传代，每代活化条件为，按照10％(v/v)接种量，在37℃下培养24h。培养物4℃下12000×g离心5min，沉淀物在PBS(pH 7.5)下重悬，形成最终浓度为1×1011CFU/mL。
体外实验
细胞培养与AMPK活性
人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y(ATCC)、人结直肠细胞系Caco-2(ATCC)、人角质形成细胞系HaCaT、人前列腺细胞系DU145(ATCC)、人骨肉瘤细胞系U2OS(ATCC)和小鼠肌肉细胞系C2C12(ATCC)在Dulbecco改良的基本培养基(DMEM)中培养，人卵巢细胞系OVCAR3(ATCC)培养在Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中加入10μg/mL胰岛素进行培养。所有细胞补充10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、50μg/mL链霉素(37℃)和5％CO2。在用25％体积的无细胞上清液处理细胞24小时之前，将所有细胞系接种到96孔板上，最终浓度为5×104cells/mL/孔。根据说明书操作步骤，使用细胞内酶联免疫吸附试验(ELISA)比色检测试剂盒测量5'腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化。
代谢物的鉴定
用于AMPK分析的培养物分离
活化DR9的过夜培养(18小时)标准化为1.000±0.05的光密度(600nm)，然后在1100хg下离心15min。收集上清液并过滤灭菌(孔径0.22μm)。
这个部分被称为无细胞上清液(CFS)。收集标准化培养物中剩余的细胞颗粒，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，10mM，pH 7.4)洗涤三次，重新悬浮在PBS中，在冰浴中超声处理30min，然后在4℃下以3500×g离心15min。收集上清液并过滤灭菌(孔径0.22μm)。这部分为细胞内提取物(IE)。收集洗涤后的细胞颗粒，此为细胞壁(CW)。使用AMPK(A1/B1/G1)激酶酶系统结合ADP-GLO分析试剂盒，按照说明说操作(美国Promega)通过CFS、IE和CW激活AMPK。
利用人骨骨肉瘤细胞系(U2OS)激活AMPK
从废肉汤中分离细胞颗粒，收集DR9的CFS。用人骨肉瘤细胞系U2OS(ATCC)将废肉汤分离成脂质组分并评价AMPK的活化。U2OS在添加10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、50μg/ml链霉素的Dulbecco改良基本培养基(DMEM)(Gibco，美国)中于37℃和5％CO2下培养。用H2O2诱导细胞衰老。细胞系连续传代至80％融合，然后使用胰蛋白酶EDTA溶液(0.02％乙二胺四乙酸中的0.1％胰蛋白酶)分离细胞系，并在200×g下离心5min。然后将细胞重新悬浮于无血清DMEM中，最终浓度为5×105cells/ml。将100μl细胞等分接种于96孔板上，并在37℃和5％CO2下培养24小时。在细胞附着后，丢弃培养基并用100μl处理培养基替换以诱导早衰。用含100μM H2O2的无血清DMEM制备处理培养基96h。将脂质部分与U2OS细胞一起培养，同时将其暴露于100μM H2O2 96h。终止处理后，用MTT法分析细胞的活力。根据说明书，使用细胞内ELISA比色检测试剂盒(Thermo Scientific，美国)通过基于细胞的ELISA方法对细胞的AMPK磷酸化进行定量。
GC-MS鉴定脂质组分
将脂质部分浓缩、水解和甲基酯化，使用气相色谱-质谱(GC-MS)进行脂肪酸甲酯(FAME)分析。将约100μL样品提取物与500μL溶剂混合物(包含2％H 2SO 4和甲醇)在2mlEppendorf管中混合，然后在80℃温度下搅拌2小时。然后，将500μL 0.9％重量/体积氯化钠(NaCl)和500μL己烷添加到包含样品提取物的管中，并在16000×g下离心3min。用移液管将己烷层移入自动进样瓶中进行定量。将约1μl己烷层注入配备5977MSD质谱仪(AgilentTechnologies Australia Pty Ltd；GC/MS)的Agilent 5977A气相色谱仪系统中，以鉴定FAME。采用BPX-70柱进行分离。
动物实验
实验组
所有动物实验均获得USM动物护理和使用委员会的批准(USM/animal EthicsApproval/2016/(724))。8周龄雄性SD大鼠分为两组：1)二甲双胍干预的阳性对照衰老模型，2)老年高脂饮食(HFD)加他汀为阳性对照的模型。
在模型(1)，大鼠分配到以下几个处理组(N＝6)实验期12周：(1)青年(对照)，(2)老年(D-半乳糖诱导衰老)，(3)老年-二甲双胍(D-半乳糖诱导衰老，二甲双胍300mg/kg/天)，(4)老年-DR9(D-半乳糖诱导衰老，L.fermentum DR9(10log CFU/天，菌体冻干粉加20％(v/v)蔗糖冷冻保护剂))。
在模型(2)，大鼠分配到以下几个处理组(N＝6)实验期12周：(1)青年(正常饮食)，青年HFD(青年大鼠高脂饮食)，老年(D-半乳糖诱导衰老，600mg/kg/天)，老年HFD(D-半乳糖诱导衰老加高脂饮食)，老年HFD DR9(D-半乳糖诱导衰老加高脂饮食，L.fermentum DR9log 10CFU/天)，老年HFD他汀(D-半乳糖诱导衰老加高脂饮食，洛伐他汀2mg/kg/天)。标准饲粮(Altromin，德国)用作ND，添加25％(w/w)动物脂肪(酥油，99％脂肪含量)的标准饲粮用作HFD。将处理物混合到1g食物颗粒中并每天喂食。在喂食治疗期间，将大鼠放置在单独的笼子中，以确保完全摄入。在12周治疗期结束时，大鼠禁食12小时，然后吸入二氧化碳处死。立即切除所有组织并用生理盐水冲洗。组织经实时荧光定量PCR进行基因定量。
端粒长度测量
使用最终DNA浓度范围为0.073ng/μL至17.65ng/μL的DNA参照样本(“标准DNA”)生成两条标准曲线(端粒和白蛋白)。实验DNA样本的T/S比率为T(与端粒模板拷贝数实验样本相匹配的标准DNA纳克数)除以S(与白蛋白拷贝数实验样本相匹配的标准DNA纳克数)。平均T/S预期与每个细胞的平均端粒长度成正比。
跑步机疲劳测试
跑步机疲劳测试参照Castro和Kuang(2017)。大鼠先置于无运动室5min适应环境，0°斜坡，接着进行5min速度10m/min 0°斜坡跑步运动。2-3天的适应期，让大鼠在10°斜坡跑步10min。一个带有瞬间的微电流刺激(0.4mA)网格置于大鼠身后，刺激大鼠向前跑。在第4天(测试日)，皮带转速设定为10m/min，5min，以2m/min的速度增至46m/min。大鼠持续跑步直至精疲力竭(能够静止抵抗5s的电刺激)或直至到达最高时速。时间，速度与距离在大鼠精疲力竭时显示并记录。功与功率计算基于以下方程式：功(J)＝身体指数(kg)×重力(9.81m/s2)×垂直速度(m/s×角度)×时间(s)。功率(W)＝功(J)/时间(s)。
实时定量PCR
大鼠的样本在-80℃下储存在RNATlater(Ambion，Austin，TX，美国)中。使用
Figure BDA0003027371220000181
(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，美国)从均质样本中提取总RNA，并使用ReverTra
Figure BDA0003027371220000182
试剂盒(Toyobo，Kita ku，大阪，日本)合成第一链cDNA。用安捷伦AriaMx实时PCR系统(安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉)测定mRNA表达水平。PCR反应包括SensiFAST
Figure BDA0003027371220000183
(Bioline，Cricklewood，伦敦，英国)、20ng cDNA和10μM引物。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)作为内源对照。
血清丙二醛含量测定
全血离心(20min，3500g)分离血清和红细胞颗粒。根据Chakraborty和Bhattacharyya(2001)，通过测量丙二醛(MDA)的形成来测定脂质过氧化。简要说明，样品加入三氯乙酸(Sigma-Aldrich)和2-硫代巴比妥酸(Sigma-Aldrich)，在95℃加热30min，然后冷却(30℃)并离心(12000g，2min)。然后上清液在534nm处读数，并使用1.563x105/(mol/L).cm的消光系数计算丙二醛的浓度。
多重酶联免疫吸附试验(ELISA)
冷冻组织样品在液氮下用冷不锈钢研钵和研杵破碎或粉碎。将粉末样品悬浮在有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Promega，美国)的RIPA裂解缓冲液(Merck,美国)中，并使用超声波均质机(Labsonic，Sartorius，德国)在冰上进一步均质。将样品在4℃下以10000хg离心10min，并收集上清液作为蛋白质裂解物，分离成小份并在-80℃下储存直到随后的分析。根据说明书，使用
Figure BDA0003027371220000191
大鼠细胞因子/趋化因子磁珠面板试剂盒(Merck,美国)检测炎性细胞因子在4℃(18小时)条件下，在持续摇动下过夜培养。用一个手持式磁块辅助清洗盘子。TNF-α、IFN-γ和IL-1β的标准品由公司提供，每种标准品一式两份。使用校准的
Figure BDA0003027371220000192
平台(Luminex，美国)测量信号，使用Bradford方法标准化样品蛋白质浓度，依据说明书操作(Sigma-Aldrich，美国)。
组织病理
标本切取后固定于中性福尔马林缓冲液中。胫骨样品在5％甲酸中在恒定搅拌下脱钙72小时，每24小时更换一次新鲜脱钙溶液。此后，使用自动组织处理器(ThermoScientificTM Shandon Excelsior,美国)修剪、脱水并用石蜡渗透组织。随后将样品包埋在石蜡中，并用切片机切片。切片(5μm厚)苏木精染色15min，伊红染色5min，光镜下观察。对于腓肠肌，在10倍放大率下捕获图像，并使用ImageJ细胞计数软件对腓肠肌上的细胞核数量进行量化。对于骨骼样本，图像在4倍下拍摄。
皮肤弹性
用拉伸强度试验机(Shimadzu，Japan)测定皮肤弹性。使用0.025探针按压皮肤样本直至其破裂。生成图形，并根据图形面积计算弹性强度。
生化分析
分析全血血脂(总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL))、肝功能(总蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白比值(AG比值)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)，碱性磷酸酶(ALP)和总胆红素)和肾功能(钠、尿素、氯化物、钾、肌酐、尿酸、钙和磷酸盐)情况。
粪便样本中代谢物分析
水溶性代谢物的检测根据Tsugawa等.2011，对样品进行衍生后进行气相色谱-质谱(GCMS)分析。依据Nakajima等.2017.所述方法，提取粪便样本中短链脂肪酸(SCFA)。使用GCMS-TQ8030三重四极质谱仪(Shimadzu，京都，日本)进行气相色谱-串联质谱平台分析。
粪便菌群测序分析
对提取的细菌DNA中16S rRNA基因的V1-V2区扩增。PCR产物按照先前的研究中准备(Kato T等.2014)。16S rRNA基因测序采用454GS Junior平台，根据其操作手册。测序结果用QIIME pipeline进行分析。
旷场试验(OFT)
OFT在先前研究方法上进行修饰，采用长方形暗盒(32cm H×38cm W×52cm L)有标记的的网格(Sprott和Eleftheriou,1974)。每只动物轻柔由笼舍转移至盒中，让其自由探索5min，连续3天。记录大鼠进入中央与外部区域的次数。每只大鼠的表现与轨迹均由相机记录(GoPro，加利福利亚，美国)。
果蝇Drosophila melanogaster用于阿尔茨海默病研究
实验准备
本实验中所用到的果蝇均列在果蝇数据库(http：//fybase.bio.indiana.edu)由Bloomington Drosophila保藏中心提供(Bloomington，美国)：Oregon-R野生型(#5)，GlassMultiple Reporter-GAL4(#1104)(Moses和Rubin，1991)与UAS-Aβ42(#33769)(Sign和Mahoney，2011)。所有定向表达实验均使用GMR-GAL4。对于野生型对照，Oregon-R与GMR-GAL4杂交产生GMR-OreR，UAS-Aβ42与GMR-GAL4杂交产生转基因Drosophila系GMR-Aβ42，表达Aβ42。储藏保持在25℃，杂交温度保持在29℃。正常饮食准备，煮沸4％(w/v)玉米淀粉，5％(w/v)玉米粥，10％(w/v)红糖，0.7％(w/v)琼脂，5％(w/v)加热灭活酵母，3％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯与0.7％(v/v)丙酸混合，在用无菌塑料瓶传递之前冷却并凝固。所有进食都不含对羟基苯甲酸甲酯与丙酸。Lactobacillus plantarum DR7(100μL)以浓度为1×1011CFU/mL的添加量加入冷却凝固的饲料中，使其在表明凝固。新鲜的DR7饲料饲喂Drosophila在其凝固的2h内。杂交前准备工作，5-10只Drosophila雌虫(GAL4或UAS系)与3-5只Drosophila雄虫置于塑料瓶中交配，提供食物。野生型对照杂交由雌性Oregon-R系与UAS-Aβ42雄虫交配，所有GMR-Aβ42杂交都来源自UAS-Aβ42雌虫与GMR-GAL4雄虫杂交所得。对照与转基因GMR-Aβ42.nf Drosophila系正常饮食饲喂，不含DR7(表2)。DR7组采用转基因GMR-Aβ42Drosophila。亲本Drosophila在交配期4-5天后分开。F1代在10天交配期后获得，并进行下一步的分析实验使用。
扫描电子显微照片
每组选取10个子代放置于McDowell-Trump固定剂(Sigma-Aldrich)中4℃过夜固定，其中包含4％甲醛1％戊二醛0.1M磷酸缓冲液(Sigma)(pH 7.2)。标本用磷酸缓冲液冲洗三次，继而使用1％(w/v)四氧化锇(Sigma-Aldrich)25℃固定1小时。标本蒸馏水冲洗，在联系梯度乙醇脱水处理；50％，75％，95％与100％乙醇各15min处理。脱水后的标本浸入六甲基二硅氮烷(HMDS)(Sigma)10min。标本在干燥器中过夜自然风干。风干后的标本装裱，喷金处理进而用扫描电镜(SEM)(SU8010；Hitachi Ltd.,东京,日本)观察。
结果与结论
实施例1：Lactobacillus fermentum DR9通过激活AMPK、防止端粒缩短、降低脂质过氧化和增强身体耐力来减缓衰老迹象。
体外细胞培养研究结果
与阳性对照组相比，DR9表现出更高的AMPK激活能力，结果如图1A所示。DR9在存在AMPK抑制剂Dorsormophin的情况下表现出较高的AMPK激活力，结果如图1B所示。进一步对DR9的无细胞上清液对7种不同细胞系的AMPK磷酸化进行了测试，如图2A和2B所示。DR9的无细胞上清液有效促进了U2OS细胞的AMPK磷酸化，AMPK活性分别高于未处理组和阳性对照组。在SH-SY5Y、OVCAR3和DU145细胞上检测时，DR9无细胞上清液具有显著的AMPK磷酸化作用。
动物实验研究结果
D-半乳糖诱导衰老后，老年大鼠的端粒长度比年轻大鼠显著缩短，结果如图3A(A)所示。乳酸菌处理衰老诱导的大鼠后显示端粒长度缩短得到改善，与老年大鼠相比，DR9组的端粒长度最高。与老年大鼠相比，二甲双胍能显著阻碍端粒长度缩短。
脂质易被氧化，脂质过氧化产物经常被报道为氧化应激的潜在生物标志物。通过测定丙二醛(MDA)浓度测定血清脂质过氧化程度。老年组血清MDA水平显著高于青年组(P<0.05)。与老年组相比，老年-DR9组血清中MDA浓度显著降低(P<0.05)，如图3A(B)所示。
跑步机疲劳测试的结果如图3B(C)所示。衰老诱导后，各处理的跑距均不受影响，但时间、速度、功、功率等受影响较大。老年大鼠的跑步时间、速度、功和功率均显著低于青年大鼠。DR9能改善衰老对运动能力的不利影响，在跑步时间、速度、功、力等方面均优于衰老大鼠。
如图3C(D)所示，随着年龄的增长，p53基因的表达增加，而DR9降低了肌肉(腓肠肌)和骨骼(胫骨)中p53基因的表达，这与老年大鼠运动功能的改善有关，如图3B(C)所示，说明了对骨骼和肌肉衰老的潜在保护作用。
结论：
对18株乳酸菌(LAB)进行了单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)的活性测定，AMPK是一种介导寿命延长的细胞内能量传感器。Lactobacillus fermentum DR9(DR9)的无细胞上清液(CFS)显示了较高的AMPK活性，并进行进一步评价。与已知的AMPK抑制剂Compound-C相比，在大多数细胞系中DR9具有显著的AMPK磷酸化作用(P<0.05)。使用D-半乳糖(D-gal)诱导的早衰SD大鼠，与未处理对照组相比，给予DR9(10log CFU/只/天)12周可防止D-半乳糖处理组大鼠端粒长度缩短。与未经处理的对照组相比，DR9增加了肝脏中AMPKα1的基因表达。与未经处理的对照组相比，DR9降低了血脂过氧化，表明机体氧化应激降低。在跑步机耐力测试试验中，与未经DR9干预的对照组相比，DR9干预的大鼠表现出更长的跑步时间、更高的速度、更高的功和功率，显示出更好的身体耐力。与对照组相比DR9降低p53基因表达，p53是一种已知的衰老生物标志物。利用体外细胞培养和衰老大鼠体内实验模型，本研究阐明了DR9菌株具有在减轻衰老相关损伤方面的潜力。
实施例2：Lactobacillus fermentum DR9预防与治疗肌肉与骨骼退化。
动物实验研究结果
抗氧化基因，超氧化物歧化酶(SOD)参与抗氧化剂是应对氧化应激的第一道防线。与青年大鼠相比，老年大鼠的SOD表达显著降低。用L.fermentum DR9处理的老年大鼠与老年大鼠相比，腓肠肌(P＝0.028)和胫骨(P＝0.018)的SOD水平增加，如图4A(A)所示。
AMPKα2在运动能力的调节中起关键作用。D-半乳糖处理12周后，老年大鼠腓肠肌AMPKα2表达较青年大鼠降低72％(P＝0.012)。然而，用L.fermentum DR9处理使AMPKα2的表达增加了2.7倍(P＝0.029)，较老年大鼠的表达增高，如图4A(B)所示。
低IGF-1影响骨骼肌肌管的分化，导致肌肉的大小和功能受损。与青年对照组相比，老年大鼠的IGF-1表达降低(P＝0.015)，而与老年大鼠相比，L.fermentum DR9显著提高IGF-1水平(P＝0.042)。MyoD在老年大鼠肌肉中的高表达是由于细胞试图激活代偿性肌生成以克服衰老导致的MyoD在老年大鼠中的高表达(P＝0.036)。与老年大鼠相比，L.fermentum DR9显著降低了MyoD水平(P<0.05)，如图4B(C)所示。
在衰老过程中，由于骨吸收(破骨细胞生成)超过骨形成(成骨细胞生成)而导致骨量和密度的损失。TNF-α和IL-1β是破骨细胞分化的信号分子，TRAP是破骨细胞的标志物。结果表明，老年大鼠TNF-α表达明显升高，是青年大鼠的4.4倍(P<0.001)。与老年大鼠相比，L.fermentum DR9改善了细胞因子的表达(P＝0.005)。如图4C(D)所示，与老年大鼠相比，L.fermentum DR9致使IL-6(P＝0.022)和TRAP(P＝0.013)的表达显著降低。
对与免疫应答相关的蛋白表达、白细胞介素1β(IL-1β)和干扰素γ(IFNγ)进行分析。老年大鼠胫骨中IL-1β含量明显升高，比青年大鼠高90％(P<0.001)。与老年对照组相比，L.fermentum DR9处理降低了IL-1β水平(P<0.05)。L.fermentum DR9干预后显示老年大鼠腓肠肌中IFN-γ水平降低，如图4D(E)所示。
观察到老年大鼠腓肠肌中肌核(肌细胞核)的数量减少，肌核的排列彼此相距甚远，如图5A b所示。L.fermentum DR9干预衰老大鼠后显示肌核增多，肌纤维排列非常紧密，如图5A c所示。用L.fermentum DR9干预后，衰老大鼠的肌细胞核(肌细胞的细胞核)显著增加，肌纤维排列非常紧密，与老年大鼠相比，肌细胞核的数量增加了三倍(P<0.001)，如图5Be所示。在胫骨近端，青年大鼠的骨小梁排列整齐，如图6a所示，而老年大鼠的骨小梁排列稀疏，网状结构较薄，如图6b所示。用L.fermentum DR9干预的老年大鼠的骨小梁排列整齐，如图6c所示，与老年大鼠相比，干预后大鼠的骨骼更丰满，骨髓脂肪较少。与图6b所示的老年对照组相比，图6a所示的青年大鼠的物理(生长板)密度也更高。图6c所示的L.fermentumDR9干预大鼠的生长板生理情况有显著改善。
结论：
对D-半乳糖致衰老大鼠腓肠肌和胫骨进行了抗衰老机制的研究。DR9组大鼠腓肠肌、胫骨SOD表达及腓肠肌AMPKα2表达较未治疗组明显改善。与老年对照组相比，DR9还增加了IGF-1的mRNA表达，同时降低了MyoD mRNA的表达。与老年大鼠相比，DR9还降低了胫骨中IL-6、TNF-α和TRAP的表达，以及腓肠肌中IL-1β和IFN-γ的表达。DR9大鼠腓肠肌肌的肌核(肌细胞核)数目较多，肌纤维排列较密集。DR9大鼠胫骨骨小梁排列较整齐，骨小梁正常，骨髓脂肪较少，而未治疗的老年大鼠骨小梁排列稀疏，网状结构较薄。本研究利用衰老大鼠模型，阐明了DR9菌株在缓解肌肉和骨损伤方面的作用。
实施例3.Lactobacillus fermentum DR9调节肠道抵御肠道菌群与代谢物浓度紊乱。
衰老动物模型实验研究结果
在菌门的水平上，共检测到12个菌门，未归类序列被标记为“未分类”。主要菌门为厚壁菌门、拟杆菌门和放线杆菌门如图7A所示，占93％以上。Lactobacillus fermentumDR9能够恢复大鼠因衰老而导致菌门水平上的变化，使之与青年大鼠更为相似。厚壁菌门和拟杆菌门占肠道微生物群的近90％。在人与动物的自然衰老过程中，F/B比值显著降低。而Lactobacillus fermentum DR9能够恢复衰老大鼠的厚壁菌/拟杆菌比率，使之更相似于幼鼠如图7B所示。
拟杆菌属被归为条件致病菌，菌属中常见的B.fragilis就会引起脓疮的形成。L.fermentum DR9组中菌属中Blautia与Lactobacillus丰度较高，如图7C所示。众所周知，Blautia可降解结肠中的复杂多糖，因此在营养吸收中起主要作用，而Lactobacillus等益生菌被充分证明可促进肠道中Blautia群落的富集。
短链脂肪酸作为宿主的能量来源可调节健康，调节代谢综合征，特别是在肥胖和免疫方面。L.fermentum DR9能够恢复老年大鼠的肠道SCFA代谢水平，与图8A(A)所示的青年大鼠更为一致。青年大鼠和接受二甲双胍治疗的老年大鼠被紧因不同的菌群结构而呈现两个集群；接受L.fermentum DR9干预的老年大鼠单独为一个集群，如图8A(B)所示。用L.fermentum DR9干预的老年大鼠与青年大鼠的肠道水溶性代谢物较类似。
与老年对照组相比，接受L.fermentum DR9干预的老年大鼠的粪便5-氧代脯氨酸含量显著提高(P<0.05)，如图8B(C)所示。5-氧代脯氨酸参与谷胱甘肽代谢，其中谷胱甘肽是一种抗氧化剂，可清除氧化应激引起的活性氧。L.fermentum DR9干预的大鼠的厚壁菌门发生了正变化，而厚壁菌门水平较低的老年大鼠的5-氧代脯氨酸含量减少，这表示该菌门与肠道代谢物变化的相关性。
慢性炎症是衰老过程中常见的现象，但D-半乳糖诱导衰老大鼠结肠未见慢性炎症。然而，L.fermentum DR9干预降低了肠道中的促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ，如图8B(D)所示。益生菌在体内和体外实验中都表现出良好的免疫调节特性。
老年-HFD动物模型实验研究结果
如图9A所示，与老年-HFD组相比，老年-HFD-DR9组的有益微生物布鲁氏菌(Blautia)丰度显著增高(P<0.05)。老年-HFD组的Blautia属相对量为16％，经L.fermentumDR9处理后，Blautia属相对量提高至30％，如图9B所示。
Blautia可产丁酸，据报道，Blautia和粪便中丁酸浓度存在正相关关系，如图10A所示。高脂肪饮食降低了粪便中乙酸和丙酸的浓度，如图10B所示。但是，与老年-HFD组相比，老年-HFD DR9组的粪便乙酸和丙酸浓度显著升高(P<0.05)。丙酸和乙酸能够通过降低血浆和肝脏脂肪酸含量，降低胆固醇，并可能改善胰岛素敏感性，从而缓解肠道疾病。
结论：
在衰老模型中，厚壁菌/拟杆菌的比率显著降低，而DR9干预则在菌门水平上增加了其比率。在菌属水平上的研究表明，与老年大鼠相比，DR9干预的大鼠促进了Lactobacillus与Blautia的增殖，同时减少了拟杆菌(Bacteriodetes)的数量。DR9大鼠的粪便中短链脂肪酸(SCFA)和水溶性代谢物与未经治疗的老年大鼠相比，其图谱更类似于青年大鼠。对粪便中水溶性代谢产物的分析表明，D-半乳糖诱导的衰老其氨基酸代谢发生很大变化，如5-羟脯氨酸水平降低，但DR9干预后抑制其降低。与未DR9干预的老年大鼠相比，DR9还降低了大鼠远端结肠中干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。在衰老和高脂饮食(HFD)模型中，雄性SD大鼠饲喂HFD并注射D-半乳糖12周以诱导衰老。与老年-HFD对照组相比，DR9干预增加了肠道中Blautia的丰度。对粪便中水溶性代谢物的分析显示，与老年-HFD对照组相比，DR9干预促进与氨基酸代谢相关的化合物(如色氨酸、亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、缬氨酸和赖氨酸)含量增高，粪便中SCFA(如乙酸和丙酸)也升高。利用体内动物模型，本研究阐明了DR9菌株具有调节肠道微生态与健康的能力。
实施例4.Lactobacillus fermentum DR9增强脂质代谢与缓解NAFLD。
动物实验研究结果
硬脂酰辅酶A脱氢酶1(SCD1)是调节肝脏脂质合成和β-氧化的关键。与HFD组相比，HFD-DR9组肝脏中SCD1的mRNA表达水平显著下调(P<0.05)，如图11A(A)所示。HFD组IL-6基因表达明显低于ND组(P<0.05)。还观察到在HFD大鼠中L.fermentum干预后显著上调IL-6的表达(P<0.05)，于正常饮食大鼠相似，如图11A(B)所示。ABCG5是ABC转运蛋白的一部分，作为异二聚体(ABCG5/G8)发挥作用，增加肝脏甾醇的排泄。高脂饮食显著降低了ABCG5的mRNA表达(P<0.05)，而在HFD-DR9中，ABCG5的mRNA表达显著上调(P<0.05)，如图11A(C)所示。与正常老年大鼠相比，饲喂DR9的老年大鼠血清甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平降低，如图11B(D)所示。DR9对所研究的其他血清生化参数没有任何消极影响。
AMPK是一种能量传感器，在维持细胞能量水平方面起着重要作用。HFD组AMPKα1mRNA表达明显低于ND组。与HFD组相比，HFD-DR9组AMPKα1的表达显著增高，如图12A(A)所示。
肝细胞损伤，肝脏出现炎症，导致对抗炎细胞因子需求增加。IL-4和IL-10是抗炎细胞因子。结果表明，HFD组IL-4、IL-10较ND组明显升高。如图12A(B)所示，HFD-DR9组IL-4和IL-10水平降低(P<0.05)。这表明DR9可以预防肝细胞损伤和炎症，降低对IL-4和IL-10的需求。
与ND组相比，HFD组脂肪堆积程度高，组织结构稀疏。与HFD组相比，HFD-DR9组的脂质积聚较少。图12B所示，与其他实验处理组相比，HFD-DR9的组织结构更为有序。
结论：
与对照组相比，DR9在肝脏基因表达和肝脏组织学方面发挥了积极作用；与老年-HFD对照组相比，DR9下调了肝脏脂质合成和β-氧化基因SCD1，上调了肝脏IL-6和ABCG5的甾醇排泄基因。与老年-HFD对照组相比，DR9摄入12周后血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平降低。与老年-HFD对照组相比，DR9还上调肝脏能量代谢基因AMPKα1，增加肝脏抗炎细胞因子IL-4和IL-10的浓度，使肝脏脂肪变性程度降低。总而言之，这项研究表明，DR9菌株通过激活能量和脂质代谢，改善了脂质分布，表明它是一种自然干预措施，可缓解心血管和肝脏疾病，如NAFLD。
实施例5.Lactobacillus fermentum DR9预防与治疗皮肤的退化，衰老及氧化应激。
动物实验研究结果
老化过程导致皮肤失去弹性。实验处理12周后，老年组皮肤弹性低于青年组。但与未治疗的老年组相比，给予LF-DR9的老年组大鼠皮肤弹性显著升高，如图13A(A)所示。
细胞衰老是生理衰老的一个基本过程。Cyclin-D1是衰老的生物标志物之一。实验处理12周后，老年组cyclind1基因相对表达明显高于青年组。与未干预的老年组相比，给予LF-DR9的老年组大鼠的cyclin-D1表达显著降低，如图13A(B)所示。
细胞凋亡是去除炎症细胞和肉芽组织，促进再生周期中新皮肤细胞发育所必需的。皮肤老化是由于皮肤细胞再生能力下降。与老年大鼠皮肤相比，DR9上调年轻大鼠皮肤中凋亡生物标志物FAS的表达。12周后老年组FAS相对基因表达明显低于青年组，提示皮肤再生能力下降。观察到，与未治疗的老年组相比，给予LF-DR9的老年组大鼠具有显著更高的FAS表达，如图13B(C)所示。
抗氧化基因，超氧化物歧化酶(SOD)作为抗氧化剂是抵御氧化应激的第一道防线，GPX是氧化应激的生物标志物。老年大鼠GPX表达显著高于青年大鼠。如图13B(D)所示，与未治疗的老年组相比，用L.fermentum干预的老年大鼠具有显著较低的GPX水平。与青年大鼠相比，老年大鼠表达SOD较低。如图13B(D)所示，与未经处理的老年组相比，经L.fermentum干预的老年大鼠的SOD水平显著增高，表明降低了氧化应激。
结论：
雄性SD大鼠12周实验期每日注射D-半乳糖致衰老。实验处理12周后，老年组皮肤弹性低于青年组。与未干预的老年组相比，给予DR9可阻碍皮肤弹性丧失。衰老标志物Cyclin-D1在老年组皮肤中的表达高于青年组。与未治疗的老年组相比，给予DR9大鼠皮肤cyclin-D1的表达较低。与老年大鼠相比，DR9还上调了皮肤FAS的表达，FAS是一种促进皮肤再生的凋亡生物标志物。老年大鼠表现出较高的GPX(氧化应激的生物标志物)表达和较低的SOD(抗氧化基因)表达，而DR9则分别降低GPX和增加SOD表达。基于动物模型的体内实验，本研究阐明了DR9菌株具有抑制皮肤退化的同时阻碍衰老和氧化应激的能力。
实施例6.Lactobacillus fermentum DR9预防与治疗焦虑与阿尔茨海默病(AD)。
动物实验研究结果
旷场实验评测是评估啮齿动物焦虑的有效方法。动物焦虑表现为，与停留在旷场中心相比，更愿意处于旷场的外角区域。如图14A(A)所示，与未经治疗的老年对照组相比，DR9干预后减少了进入外层区域大鼠的数量(P<0.05)。
果蝇实验结果
果蝇，Drosophila melanogaster(黑腹果蝇)，其眼睛由形状良好的六角形小眼和竖直鬃毛(毛发状结构)组成，如图14A(B)、(C)所示。然而，Drosophila melanogaster的阿尔茨海默病突变体呈现出粗糙的眼型，小眼畸形，存在孔洞与丧失六角形特征，鬃毛断裂，如图14B(D)、(E)所示。如图14B(F)，(G)所示，DR9的干预可防止此类畸形形变，如小眼形状整齐和鬃毛较少损伤，表明其阿尔茨海默病的严重性较低。
结论：
衰老的雄性SD大鼠焦虑水平较高，饲喂DR9后焦虑水平降低。通过对
AD模型Drosophila melanogaster的饲养，也证实了DR9菌株对逆转AD的作用。通过Drosophila melanogaster AD模型可以看出，DR9能够防止AD Drosophila粗糙眼表型的出现。
实施例7：Lactobacillus fermentum DR9通过产生代谢物琥珀酸、苯甲醛和苯甲酸来发挥其健康作用。
体外实验研究结果
将DR9的无细胞上清分为细胞内提取物(IE)和细胞壁碎片(CW)。在所研究组分中，CFS组分比IE和CW组分激活AMPK能力更强，如图15A(A)所示。因此，CFS组分随后用于进一步分析。用U2OS细胞培养法测定CFS脂质组分的AMPK激活能力。脂质组分激活U2OS细胞中的AMPK，其方式与已知的AMPK激活剂AICAR相似，对AMPK的激活力与AMPK抑制剂DorsomorphinC进行对照，如图15A(B)所示。因此，随后对脂质部分进行鉴定。
通过比较图15B(C)所示的DR9脂质部分和空白的未发酵MRS培养基脂质部分之间的GC-MS色谱图，有四个峰的浓度增加，即丁二酸(琥珀酸；峰1)、苯甲醛(峰2)、未知(峰3)和苯甲酸(峰4)。这表明DR9产生了这些代谢物并释放到培养基中。琥珀酸具有抗氧化特性，有助于治疗皮肤老化和显著恢复由细胞衰老和全身老化导致功能丧失状况。另一方面，据文献报道，苯甲酸能减少氯化物和增加骨骼中的镁，增加骨骼重量，增加骨骼中的钙和磷滞留。此外，据文献报道，苯甲醛对宿主来说还具有抗肿瘤和抗病毒的特性。
动物实验研究结果
给予DR9摄入12周后，由GC-MS鉴定的两种粪便代谢物在大鼠粪便样品中显著增加，即5-羟脯氨酸和抗坏血酸，如图16所示。这些代谢物在DR9的作用下在宿主肠道产生。在代谢过程中，5-羟脯氨酸在游离氨基酸的细胞内转运中起着重要作用，在II型糖尿病患者的血液中发现5-羟脯氨酸含量降低。在II型糖尿病的动物和人类中AMPK失调，AMPK的激活可以改善机体代谢健康，激活AMPK已经用于治疗II型糖尿病。该实验结果表明DR9提高了肠道中5-羟脯氨酸的产生，从而在生理上诱导AMPK活化。抗坏血酸是公认的抗氧化剂。AMPK是参与抗氧化酶活性的上游蛋白之一。例如，在脑海马神经元中，AMPK通过抑制炎症和诱导Nrf2抗氧化途径来保护细胞。这表明DR9增强了肠道中抗坏血酸的生成，通过激活AMPK诱导抗氧化作用。
结论：
综上所述，本研究表明Lactobacillus fermentum DR9通过其代谢物即琥珀酸、苯甲醛和苯甲酸来发挥其健康功效。此外，DR9和/或其代谢物诱导肠道产生5-羟脯氨酸和抗坏血酸。本研究利用体外和体内动物模型，阐明了DR9菌株及其代谢产物在预防和治疗衰老引起的骨、肌肉和代谢衰退以及增强AMPK活化方面的能力。
实施例8：Lactobacillus fermentum DR9组合物成分
表1
Figure BDA0003027371220000281
注：通过引用将描述本节中使用的材料和方法的上述论文的内容全部并入本文。
序列表自由文本
序列表
Lactobacillus fermentum DR9的16S rRNA
AACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGGAAGTCGAACAAGAG

Claims (13)

1.一株Lactobacillus fermentum(发酵乳杆菌)或其代谢产物，其中菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏号为CGMCC15536，全基因组序列上传于GenBank登录号为CP033371，代谢组分包括琥珀酸、苯甲醛和苯甲酸。
2.根据权利要求1中的菌株或其代谢产物，用于减缓衰老迹象。
3.根据权利要求1中的菌株或其代谢产物，用于预防与治疗肌肉与骨骼退化。
4.根据权利要求1中的菌株或其代谢产物，作为益生菌用于调节肠道抵御肠道菌群与代谢物浓度失衡。
5.根据权利要求4中的代谢产物，包括抗坏血酸与5-羟脯氨酸。
6.根据权利要求1中的菌株或其代谢产物，用于预防与治疗高脂血症，肝脏脂肪累积，脂质代谢与脂质疾病。
7.根据权利要求6中的菌株或其代谢产物，用于预防与治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
8.根据权利要求1中的菌株或其代谢产物，用于预防与治疗皮肤退化。
9.根据权利要求1中的菌株或其代谢产物，用于预防与治疗焦虑与阿尔茨海默病。
10.一种包含权利要求1中菌株的组合物，其中的菌株经冷冻干燥且组合物中的量在104与1012cfu/g之间。
11.一种包含权利要求1中菌株代谢物的组合物，其中代谢物包括琥珀酸、苯甲醛和苯甲酸。
12.根据权利要求10-11中所述的任一组合物，其形式选自下组：食品补充剂、药物、婴幼儿配方食品、可食用产品和食物产品。
13.根据权利要求12中的组合物，其形式选自片剂、胶囊或丸剂。
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