CN116004442A - 一种发酵乳杆菌及其在改善高脂血症制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种发酵乳杆菌及其在改善高脂血症制剂中的应用。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25738。该菌株的胆固醇脱除率高达55.2％，并且可以显著降低机体血清中甘油三酯、胆固醇以及低密度脂蛋白水平，以及促进肠道中短链脂肪酸分泌，明显改善小鼠肝脏病理学状况，从而有效改善高血脂症；而且无副作用、安全性高。

Description

一种发酵乳杆菌及其在改善高脂血症制剂中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种发酵乳杆菌及其在改善高脂血症制剂中的应用。

背景技术

高脂血症是一种由于机体脂质代谢紊乱造成的疾病，这种紊乱包括血清中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)异常升高和高密度脂蛋白(HDL-C)异常降低等，如果不及时加以控制和治疗则会引发更严重的疾病。目前我国成人血脂异常患病率为18.6％，估计全国血脂异常现患人数1.6亿。不同类型的血脂异常患病率分别为高胆固醇血症占2.9％，高甘油三酯血症占11.9％以及低高密度脂蛋白血症占7.4％，另有3.9％的人血胆固醇边缘升高。近年来高脂血症的发病率逐年增高，患病人群也越来越年轻化。

目前，可以通过饮食治疗等生活方式进行改善；若改善后，血脂仍异常者，则应根据冠心病及与冠心病等同危险的疾病和危险因素的有无及多少适当加用一些降脂药物。但是，现目前市场上的很多可以降低血脂的药物会带来严重的副反应，即使是在健康人身上，这些药物也常常会引起腹痛、过敏反应、情绪失衡、头发脱落、视力改变、头痛、喉痛和肌肉退化。

有研究发现，经常饮用酸奶的人体内血脂水平普遍较低，且相关性分析显示饮用酸奶和血脂水平低之间具有相关性，从而揭示了益生菌有降低机体血脂水平的可能性；此外，益生菌的代谢产物，短链脂肪酸，同样被报道对血脂具有调节作用；并且摄入益生菌通常不伴有副作用，对机体有较高的安全保障。

因此，挖掘一种可以改善高脂血症的益生菌具备重大意义。

发明内容

针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，其可以显著降低血清中甘油三酯、胆固醇以及低密度脂蛋白水平，并且可以显著促进肠道中短链脂肪酸分泌，明显改善小鼠肝脏病理学状况，从而有效改善高血脂症。

为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供一种发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25738。

本发明另一方面还提供一种组合物，其包括以下物质中的一种或多种组合：(a)上述发酵乳杆菌；(b)上述发酵乳杆菌的裂解物；(c)上述发酵乳杆菌的培养物；(d)上述发酵乳杆菌的发酵液。

本发明再一方面提供一种制剂，其包括上述的发酵乳杆菌或上述组合物，以及载体，其中，载体为可药用载体或可食用载体。

本发明再一方面提供一种上述的发酵乳杆菌或上述组合物在制备改善高脂血症制剂中的应用。

本发明中的发酵乳杆菌保藏信息如下：保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2022年9月16日；保藏编号：CGMCC No.25738；分类命名：发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。

本发明有益效果包括：本发明提供的发酵乳杆菌的胆固醇脱除率高达55.2％，并且可以显著降低机体血清中甘油三酯、胆固醇以及低密度脂蛋白水平，以及促进肠道中短链脂肪酸分泌，明显改善小鼠肝脏病理学状况，从而有效改善高血脂症；而且无副作用、安全性高。

附图说明

图1为发酵乳杆菌TY-S11的菌落形态图；

图2为发酵乳杆菌TY-S11的革兰氏染结果图；

图3为胆固醇-OD_550nm值标准曲线；

图4为74株菌体外胆固醇脱除率；

图5为各组小鼠摄食量曲线图；

图6为各组小鼠饮水量曲线图；

图7为各组小鼠体重曲线图；

图8为各组小鼠血清中甘油三酯水平；

图9为各组小鼠血清中总胆固醇水平；

图10为各组小鼠血清中低密度脂蛋白水平；

图11为各组小鼠肝脏中甘油三酯水平；

图12为各组小鼠肝脏中胆固醇水平；

图13为各组小鼠肝脏油红染色图(200×)；

图14为各组小鼠粪便中丙酸水平；

图15为各组小鼠粪便中乙酸水平；

图16为各组小鼠粪便中丁酸水平；

上述图中，实验数据以平均值±标准误(mean±SEM)表示。标有“*”、“**”、“***”、“****”均代表两组之间存在统计学差异，分别表示p<0.05、p<0.01、p<0.001、p<0.0001。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

本发明实施例提供一种发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)(以下也称发酵乳杆菌TY-S11)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25738。

需要说明的是，本发明中发酵乳杆菌来源于重庆江津长寿老人粪便中，经革兰氏染色结果检测，其形状呈杆状，判定为革兰氏阳性菌(G⁺)；并且通过PCR扩增16S rDNA序列，测得其16SrDNA序列包含如SEQ ID NO.1所示序列。

本发明另一实施例还提供一种组合物，其包括以下物质中的一种或多种组合：(a)上述发酵乳杆菌；(b)上述发酵乳杆菌的裂解物；(c)上述发酵乳杆菌的培养物；(d)上述发酵乳杆菌的发酵液。

需要说明的是，上述组合物中，可以将发酵乳杆菌TY-S11制备成可以用于食用或者药用的组合物。另外，当发酵乳杆菌TY-S11制备成组合物时，可以是将该菌直接以活菌的方式引入到组合物中发挥作用，也可以是通过现有技术手段将该菌灭活后以灭活菌的形态引入到组合物中发挥作用；还可以是将该菌的裂解物引入到组合物中发挥作用；还可以是将该菌培养得到的蛋白质、肽、分泌物或代谢产物等产物引入到组合物中发挥作用；还可以是该菌发酵后的发酵液引入到组合物中发挥作用。在具体使用过程中，可以根据具体需要选择该菌不同的形态制备成组合物发挥作用。

在一些具体实施例中，还包括益生菌、益生元、膳食纤维和中成药中一种或多种组合。

需要说明的是，上述发酵乳杆菌TY-S11及其不同的形态还可以与益生菌、膳食纤维和药学活性化合物中一种或多种组合使用；比如，发酵乳杆菌TY-S11可以与枯草芽孢杆菌、双歧杆菌或乳酸菌等联合使用使得组合物同时具备发酵乳杆菌TY-S11和其他益生菌的功效；再比如，发酵乳杆菌TY-S11可以与益生元联合使用，益生元可以为发酵乳杆菌TY-S11提供能量来源，体高发酵乳杆菌TY-S11的效果；再比如，发酵乳杆菌TY-S11可以与膳食纤维联合使用，膳食纤维可以辅助发酵乳杆菌TY-S11进行定植，从而提高发酵乳杆菌TY-S11的效果；再比如，发酵乳杆菌TY-S11还可以与中成药联合使用形成组合物，同时发挥发酵乳杆菌TY-S11和中成药的作用。

本发明再一实施例提供一种制剂，其包括上述发酵乳杆菌TY-S11或上述组合物，以及载体，其中，载体为可药用载体或可食用载体。

需要说明的是，可以将上述包含发酵乳杆菌TY-S11及其不同形态的组合物添加药用载体或可食用载体制备成药物或可食用的食物或保健品。可药用载体或可食用载体均为本领域所已知的，可以需要根据剂型进行选择，比如制备片剂主要会使用到稀释剂(如淀粉、糊精、蔗糖或甘糖等)、吸收剂(硫酸钙、磷酸氢钙或轻质氧化镁等)、粘合剂(聚维酮、糖浆或羟丙甲纤维素等)、润湿剂(水等)或崩解剂(干淀粉、羟甲基淀粉钠或交联聚维酮等)等；比如制备液体剂主要会使用到增容剂、助悬剂、乳化剂或着色剂等。

在一些具体实施例中，上述制剂可以为片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或液体剂。需要说明的是，上述片剂、丸剂、颗粒剂或胶囊剂等固体剂型可以是益生菌片、益生菌糖丸、益生菌粉或益生菌胶囊等产品形式；上述液体剂可以是益生菌饮料等产品形式；上述凝胶剂可以是益生菌果冻、益生菌奶盖或凝固型酸奶等产品形式。

本发明再一实施例提供一种上述的发酵乳杆菌或上述组合物在制备改善高脂血症制剂中的应用。

在一些具体实施例中，应用包括：上述发酵乳杆菌TY-S11或上述组合物在制备降低血清中甘油三酯水平和/或总胆固醇水平和/或低密度脂蛋白水平的制剂中的应用。

需要说明的是，一般高脂血症包括高胆固醇，体内的总胆固醇水平升高，即体内总胆固醇(总胆固醇是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和，人群总胆固醇水平主要取决于遗传因素和生活方式，推荐成人胆固醇值不可过高，理想值为<5.5.17mmol/L)水平大于5.17mmol/L的时候，就属于高脂血症，降低血清中胆固醇水平是治疗高脂血症的有效途径之一。本发明中的发酵乳杆菌TY-S11可以显著降低机体血清中总胆固醇水平，在一些具体实施例中，使用了本发明中的发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的血清总胆固醇水平较没有使用发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的血清总胆固醇水平下降了约39.1％，说明本发明中的发酵乳杆菌TY-S11降胆血清中总固醇效果显著。

还需要说明的是，甘油三酯为心血管疾病的危险因素，血清甘油三酯水平受年龄、性别和饮食的影响，血清甘油三酯增高可见于摄入大量甘油三酯和继发于某些疾病如糖尿病、动脉粥样硬化等。本发明中的发酵乳杆菌TY-S11可以显著降低机体血清中甘油三酯水平，在一些具体实施例中，使用了本发明中的发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的血清甘油三酯水平较没有使用发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的血清甘油三酯水平下降了约19.3％，说明本发明中的发酵乳杆菌TY-S11降血清中甘油三酯效果显著。

还需要说明的是，低密度脂蛋白是一种运载胆固醇进入外周组织细胞的脂蛋白颗粒，可被氧化成氧化低密度脂蛋白；当低密度脂蛋白，尤其是氧化修饰的低密度脂蛋白过量时，其携带的胆固醇便积存在动脉壁上，易引起动脉硬化。本发明中的发酵乳杆菌TY-S11可以显著降低机体血清中低密度脂蛋白水平，在一些具体实施例中，使用了本发明中的发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的低密度脂蛋白水平较没有使用发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的低密度脂蛋白水平下降了约37.9％，说明本发明中的发酵乳杆菌TY-S11降低密度脂蛋白效果显著。

在一些具体实施例中，上述应用包括以下一种或多种组合的应用：(a)上述的发酵乳杆菌TY-S11或上述的组合物在制备降低肝脏中甘油三酯水平和/或胆固醇水平的制剂中的应用；(b)上述的发酵乳杆菌TY-S11或上述的组合物在制备促进肠道中短链脂肪酸分泌的制剂中的应用

需要说明的是，脂类可分为脂肪和类脂两类，脂肪包括甘油三脂，类脂包括胆固醇。甘油三脂易在脂肪堆积，过高甚至有患脂肪肝的风险。肝脏是脂质代谢的中心，人体内70％-80％的胆固醇由肝脏合成，因此检测肝脏中脂质水平有重大意义。本发明中的发酵乳杆菌TY-S11可以显著降低机体肝脏中甘油三酯和胆固醇水平。在一些具体实施例中，使用了本发明中的发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的肝脏中甘油三酯水平较没有使用发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的肝脏中的甘油三酯水平下降了约19.4％，说明本发明中的发酵乳杆菌TY-S11降肝脏中甘油三酯效果显著；另外，使用了本发明中的发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的肝脏中胆固醇水平较没有使用发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的肝脏中的胆固醇水平下降了约52.2％，说明本发明中的发酵乳杆菌TY-S11降肝脏中胆固醇效果显著。

还需要说明的是，短链脂肪酸是人体自身无法消化的碳水化合物经肠道细菌发酵后产生的最终代谢产物，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸等，其中90％以上的短链脂肪酸为乙酸、丙酸和丁酸。短链脂肪酸可以影响脂类物质的合成，改善高脂饮食引起的脂类代谢异常，同时还可以增加胆汁酸的排泄，降低血液中的总胆固醇水平。本发明中的发酵乳杆菌TY-S11可以显著促进肠道中短链脂肪酸分泌，提高肠道中短链脂肪酸水平；在一些具体实施例中，使用了本发明中的发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的乙酸、丙酸和丁酸水平较没有使用发酵乳杆菌TY-S11的高脂高胆固醇模型小鼠的肝脏中的乙酸、丙酸和丁酸水平分别下降了约28.5％(乙酸)、约68.2％(丙酸)和约78.2％(丁酸)，说明本发明中的发酵乳杆菌TY-S11促进机体肠道中短链脂肪酸分泌的效果显著。

还需要说明的是，本发明中的发酵乳杆菌TY-S11可以同时降低机体中肝脏甘油三酯和胆固醇水平以及促进肠道中短链脂肪酸的分泌，从而同时降低机体中血清甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白水平，进而协同达到改善高血脂症的目的。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

以下实施例中，MRS液体培养基来自北京陆桥技术股份有限公司提供。

以下实施例中，本发明中使用的发酵乳杆菌，也称TY-S11或发酵乳杆菌TY-S11。

实施例1TY-S11的分离纯化及鉴定

(1)实验材料

采集重庆江津长寿老人粪便样品：收集无尿液污染的粪便，用粪便取样器的勺子采集4-5勺(20克左右)粪便于装有20mL，且含30％甘油的粪便取样器中，拧紧盖子。

(2)TY-S11的分离纯化

吸取1mL样品于9mL无菌生理盐水中获得10^-1稀释液，然后吸取1mL 10^-1的稀释液于9mL灭菌生理盐水中，得到10^-2稀释液，按此操作，依次得到10^-3、10^-4、10^-5和10^-6稀释液。各取200μL不同稀释度样品(10^-3、10^-4、10^-5和10^-6)，分别涂布于MRS固体培养基上，37℃厌氧培养24h后，观察平板上的菌落形态，选取形态各异的单菌落采用平板划线法分离菌株，然后从划线纯化的平板上再挑取一个单菌落继续进行划线纯化，重复此划线操作，直至得到纯化的菌株，通过革兰氏染色进行形态学观察。

菌株菌落形态如图1所示，菌株纯化后在固体培养基中形成单菌落，菌落形态一致，呈半球形，白色半透明，表面光滑湿润，边缘平整。

革兰氏染色结果如图2所示，革兰氏染色后在显微镜下观察到紫色细胞形态(图2做了灰度处理，原图为紫色)，形状呈短杆状，判定为革兰氏阳性菌(G⁺)。

(3)PCR扩增16S rDNA序列

采用25μL反应体系进行PCR扩增：模板1μL、上游引物(SEQ ID NO.2(agagtttgatcctggctcag))(10μM)1μL、下游引物(SEQ ID NO.3(tacgacttaaccccaatcgc))(10μM)1μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，用无菌超纯水补足至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃末端延伸10min。序列扩增后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对检测合格的PCR扩增产物进行测序，测得序列如SEQ ID No.1所示；获得序列后，使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GenBank中进行搜索和相似性比对和同源性分析，16SrDNA同源性分析结果显示TY-S11为发酵乳杆菌。

实施例2TY-S11对胆固醇的降解作用

(1)菌株的培养及处理

取-80℃冻存甘油保藏的菌株，按2％的接种量接种到5mL的MRS液体培养基中，置于37℃厌氧培养24h，菌株活化3代。

(2)试剂的配制

称取胆固醇粉末0.5g用无水乙醇加热溶解并定容到50mL，获得10.0mg/m L的胆固醇溶液；上述溶液用0.45μm微孔滤膜除菌，按1％(v:v)加入到无菌的MRS液体培养基中，获得0.1mg/m L的胆固醇培养基，该培养基现配现用。

称取邻苯二甲醛50mg用无水乙醇定容到50mL，获得1mg/mL的邻苯二甲醛工作液，该工作液4℃冷藏备用。

取冰乙酸与浓硫酸按1:1(v:v)混匀，得混合酸，室温储藏。

(3)标准曲线的绘制

取出5支试管按照1-5编号，按顺序分别加入0、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL和0.5mL的胆固醇培养基，并加冰醋酸将5支试管均补至0.5mL；每支试管分别加入邻苯二甲醛工作液0.2m L，震荡混匀，静置10min后分别加入混合酸4.0mL，混合均匀，在室温静置10min，将反应液置入96孔板中，以胆固醇的浓度为横坐标，OD_550nm值为纵坐标绘制标准曲线，如图3所示。

(4)胆固醇脱除率的测定

将活化好的菌悬液按照3％的接种量(v:v)添加到5mL的胆固醇培养基中；将刚接种菌的培养基在4℃、9000r/min离心10min，取上清液0.5mL，加入邻苯二甲醛工作液0.2mL，充分震荡后静置10min，加入混合酸溶液4.0mL，室温静置10min，将反应液置入96孔板中，测定其OD_550nm的值；另将接种菌、37℃培养24h的胆固醇培养基按以上步骤同样测定OD_550nm的值；根据胆固醇标准曲线的拟合方程确定发酵液中胆固醇含量，根据以下公式进行计算胆固醇脱除率：

其中，A是37℃培养24h后上清液中的胆固醇含量；B是接入菌种前上清液中的胆固醇含量。

按照上述的计算方法计算了74株乳酸菌的胆固醇脱除率，结果如图4所示，其中TY-S11具有最高的胆固醇脱除率(55.2％)，说明其具有高胆固醇降解能力，具备缓解高脂血症的潜力。

实施例3TY-S11对高脂血症的改善作用

(1)菌株的培养及处理

取-80℃冻存甘油保藏的菌株，按2％的接种量接种到5mL的MRS液体培养基中，置于37℃厌氧培养24h，菌株活化3代；活化好的菌液在4℃下，10000r/min，离心10min，弃去上清液，收集菌体；菌体用生理盐水洗涤，再次离心，重复两次，得到菌泥，用30％(m/v)蔗糖溶液重悬菌泥，冻存于80℃待用，用于动物实验灌胃；使用前在4℃下，10000r/min，离心10min，弃去上清液，用生理盐水梯度稀释，并利用倾注法对活菌数进行计数，计算菌落形成单位(CFU)；根据计数结果用生理盐水调整菌液浓度至10⁹CFU/mL，得灌胃用菌悬液。

(2)实验小鼠分组及干预

选取SPF级野生型雄性C57BL/6小鼠10只和SPF级雄性ApoE^-/-小鼠20只，均为8周龄；饲养于室温25±2℃、相对湿度50±5％和12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验；适应期结束后，C57BL/6小鼠为空白组，ApoE^-/-小鼠随机分为模型组和TY-S11组，每组10只。

实验周期为42天，期间空白组小鼠摄入普通饲料，模型组和TY-S11组小鼠摄入高脂高胆固醇饲料，具体配方如表1所示；另每日对所有组别小鼠进行灌胃操作，空白组和模型组小鼠灌胃生理盐水(200μL)，TY-S11组灌胃上述菌悬液(200μL)，每天灌胃时间保持一致。

表1高脂高胆固醇饲料配方表

(3)实验期间小鼠生长性能监测

记录小鼠实验周期42天内，每周记录小鼠的体重，每天记录小鼠的摄食量及饮水量(小鼠的摄食量、饮水量及体重变化能在一定程度上反映其健康状况)。

实验期间小鼠摄食量、饮水量及体重变化统计图具体如图5、图6和图7所示，在整个实验期间，摄食量及饮水量方面，模型组和TY-S11组小鼠与正常组相比无明显降低；体重方面，模型组和TY-GS11组小鼠与正常组相比略有增重，以上结果表明高脂高胆固醇饲料未影响小鼠的正常进食，且副干酪乳杆菌TY-G05无任何毒副作用。

(4)小鼠样本收集及处理

实验周期持续42天，之后牺牲小鼠；牺牲小鼠前一天小鼠禁食不禁水16h，并收集小鼠粪便于离心管，立即液氮冷冻后-80℃冰箱保存；摘眼球取血，血液于4℃静置1h，3000r/min离心15min，小心收集上层血清；解剖小鼠分离肝组织，立即液氮冷冻后-80℃冰箱保存。

(5)小鼠血清脂质水平测定

取出上述(4)中冷藏的血清，用全自动生化仪检测血液脂质(血液脂质主要包括总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇，是衡量高脂血症严重程度的核心指标之一)。

血清甘油三酯水平的检测结果如图8所示，空白组小鼠血清甘油三酯水平为0.71mmol/L，模型组为1.19mmol/L，模型组较之空白组血清甘油三酯水平显著升高(p＜0.0001)，而TY-S11组小鼠血清甘油三脂水平为0.96mmol/L，较之模型组显著降低(降低约19.3％)(p＜0.01)。

血清总胆固醇水平的检测结果如图9所示，空白组小鼠血清总胆固醇水平为2.55mmol/L，模型组为27.76mmol/L，模型组较之空白组血清总胆固醇水平显著升高(p＜0.0001)，而TY-S11组小鼠血清总胆固醇水平为16.91mmol/L，较之模型组显著降低(降低约39.1％)(p＜0.05)。

血清低密度脂蛋白水平的检测结果如图10所示，空白组小鼠血清低密度脂蛋白水平为0.24mmol/L，模型组为15.45mmol/L，模型组较之空白组血清低密度脂蛋白水平显著升高(p＜0.0001)，而TY-S11组小鼠血清低密度脂蛋白水平为9.59mmol/L，较之模型组显著降低(降低约37.9％)(p＜0.0001)。

以上结果说明，发酵乳杆菌TY-S11具有调控血液脂质的功效。

(6)小鼠肝脏脂质水平测定

取出上述(4)中冷藏的肝脏，切取并准确称量0.5g，加入5mL甲醇与氯仿混合液(体积比2:1)，用组织匀浆机(60HZ，匀浆时间10s/次，间隙30s，连续5次，在4℃下进行)充分研磨，使肝脏组织匀浆化；完全磨碎后将研磨混合液转至刻度试管内，并用4.5mL甲醇与氯仿混合液(体积比2:1)冲洗研磨器，洗涤液一并转至刻度试管，将前后两次收集的匀浆混合液定容至10mL，置于水浴锅45℃温浴1小时，然后8000g，10min，4℃离心收集上清液，用全自动生化仪检测肝脏胆固醇水平和肝脏甘油三酯水平。

肝脏胆固醇水平的检测结果如图11所示，空白组小鼠肝脏甘油三酯水平为5.22μmol/g，模型组为7.10μmol/g，模型组较之空白组肝脏甘油三酯水平显著升高(p＜0.01)，而TY-S11组小鼠肝脏甘油三脂水平为5.72μmol/g，较之模型组显著降低(降低约19.4％)(p＜0.05)。

肝脏甘油三酯水平的检测结果如图12所示，空白组小鼠肝脏胆固醇水平为2.40μmol/g，模型组为7.70μmol/g，模型组较之空白组肝脏胆固醇水平显著升高(p＜0.0001)，而TY-S11组小鼠肝脏胆固醇水平为3.68μmol/g，较之模型组显著降低(降低约52.2％)(p＜0.01)。

以上结果说明，发酵乳杆菌TY-S11具有调控肝脏脂质水平的功效。

(7)小鼠肝脏油红O脂肪染色

从-80℃冰箱取出肝脏冰冻切片，于室温下干燥10min；室温下油红O工作液对切片进行染色45min；60％异丙醇清洗5遍后ddH2O清洗3遍，苏木精染色1min；自来水缓慢冲洗3min至流水无色；切片风干后封片；显微镜下观察小鼠肝脏病理学变化。需要说明的是，油红O脂肪染色是为了显示组织内的脂肪常采用的方法，油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性地使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。

检测结果如图13所示，空白组小鼠肝细胞排列正常，未见明显异常；模型组小鼠肝细胞肿胀且脂质沉积，而TY-G05组小鼠肝细胞肿胀和脂质沉积现象均有所改善。

以上结果说明，发酵乳杆菌TY-S11具有改善肝脏病理学状况的功效。

(8)气相色谱法检测小鼠粪便中的短链脂肪酸含量

取上述(4)中50mg小鼠粪便样品加入500μL饱和NaCl溶液，振荡至无明显块状物(组织破碎仪，60HZ，匀浆时间10s/次，间隙30s，连续5次，在4℃下进行)，加入40μL 10％硫酸酸化，振荡混匀，随后加入1000μL的乙醚萃取，振荡混匀，12000rpm、15min、4℃条件下离心，取上清加入到装有0.25g的无水硫酸钠的EP管中，静置15min，同样条件离心，取上清加入气相小瓶，上机分析，气相色谱检测条件如下表2所示。

表2气相色谱检测条件表

利用气相色谱法检测小鼠粪便中短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的含量，浓度通过外标法计算。

乙酸水平的计算结果如图14所示，空白组小鼠粪便乙酸水平为385.86μg/g，模型组为129.32μg/g，模型组较之空白组显著降低(p＜0.0001)，而TY-S11组小鼠粪便乙酸水平为166.14μg/g，较之模型组有所升高(升高约28.5％)。

丙酸水平的计算结果如图15所示，空白组小鼠粪便丙酸水平为157.07μg/g，模型组为58.48μg/g，模型组较之空白组显著降低(p＜0.0001)，而TY-S11组小鼠粪便丙酸水平为98.38μg/g，较之模型组显著升高(升高约68.2％)(p＜0.001)。

丁酸水平的计算结果如图16所示，空白组小鼠粪便丁酸水平为140.70μg/g，模型组为55.08μg/g，模型组较之空白组显著降低(p＜0.0001)，而TY-S11组小鼠粪便丁酸水平为98.16μg/g，较之模型组显著升高(升高约78.2％)(p＜0.01)。

以上结果说明，发酵乳杆菌TY-S11具有促进肠道短链脂肪酸分泌的功效。

综上所述，本发明中的发酵乳杆菌TY-S11可以同时降低机体中肝脏甘油三酯和胆固醇水平以及促进肠道中短链脂肪酸的分泌，从而同时降低机体中血清甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白水平，进而协同达到改善高血脂症的目的。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims (10)

1.一种发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25738。

2.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于，其16SrDNA序列包含如SEQ ID NO.1所示序列。

3.组合物，其特征在于，包括以下物质中的一种或多种组合：(a)权利要求1或2所述的发酵乳杆菌；(b)权利要求1或2所述的发酵乳杆菌的裂解物；(c)权利要求1或2所述的发酵乳杆菌的培养物；(d)权利要求1或2所述的发酵乳杆菌的发酵液。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，还包括益生菌、益生元、膳食纤维和中成药中一种或多种组合。

5.制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的发酵乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物，以及载体；其中，载体为可药用载体或可食用载体。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或液体剂。

7.权利要求1或2所述的发酵乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物在制备改善高脂血症制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用包括：权利要求1或2所述的发酵乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物在制备降低血清中甘油三酯水平和/或总胆固醇水平和/或低密度脂蛋白水平的制剂中的应用。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，应用以下一种或多种组合的应用：(a)权利要求1或2所述的发酵乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物在制备降低肝脏中甘油三酯水平和/或胆固醇水平的制剂中的应用；(b)权利要求1或2所述的发酵乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物在制备促进肠道中短链脂肪酸分泌的制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，应用(c)中，短链脂肪酸为乙酸、丙酸或丁酸中的一种或多种。

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