KR101066429B1 - 항산화 활성과 면역활성 및 항암효과가 향상된 노루궁뎅이버섯 균사체 및 자실체 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노루궁뎅이 버섯의 항상화 활성이 향상되도록 하는 항산화 활성이 향상된 노루궁뎅이버섯용 고체배지와 그 제조방법 및 이를 이용한 노루궁뎅이버섯 균사체 및 자실체 제조 방법에 관한 것으로, 참나무톱밥 : 가시오가피톱밥 : 미강의 비를 중량비율로 50~70:10~30:10~30으로 혼합한 후, 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강 혼합물 100g에 대하여 법제유황분말을 50~100 mg의 비로 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-유황 혼합물 100 g에 대하여 탄산칼슘으로 pH를 5~6으로 조절한 물을 50~80 g비로 가하여 골고루 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-유황- pH5.5로 조절된 물의 혼합물을 밀봉하여 4℃의 저온실에서 12-48시간 경과시키는 항산화 활성이 향상된 노루궁뎅이버섯용 고체배지 및 그 제조방법과 이를 이용하여 균사체 및 자실체를 제조하는 방법을 제공하여, 균사체와 자실체의 폐기율이 낮아져 결과적으로 수확량을 높일 수 있으며 현저하게 높은 항산화활성을 나타내어 기능성 식품, 신약, 화장품 및 기능성 동물 사료 등에 다용도로 활용이 가능하도록 한 것이다.

Description

항산화 활성과 면역활성 및 항암효과가 향상된 노루궁뎅이버섯 균사체 및 자실체 제조 방법{Cultivation Method and Compositions of Solid Medium for Production of Hericium erinaceum Mycelial and Its Fruits Body Enhanced Antioxidative Activities}

본 발명은 노루궁뎅이 버섯과 그 균사체의 항산화 활성과 면역활성 및 항암효과가 향상되도록 하는 노루궁뎅이버섯 균사체 및 자실체 제조 방법에 관한 것이다.

버섯을 배양하기 위한 방법은 크게 고체배지를 이용한 것과 액체 배지를 이용한 것으로 나누어지며, 이 중 고체배지를 이용한 배양은 식품폐소재 등을 활용할 수 있어 가격이 저렴하고 천연소재를 가공공정 없이 사용할 수 있는 장점이 있으나 배양기간(40-50일정도)이 다소 긴 단점이 있고, 액체배양은 가격이 높은 인공적인 화학물질을 많이 사용하고 고가의 장비가 필요한 단점이 있으나 배양기간이 비교적 짧은 장점이 있다.

따라서, 많은 연구자들은 균사체 생산을 위해서는 액체배양을, 자실체 생산을 위해서는 고체배양을 주로 행하고 있다(박창규 등 (2010) 수삼추출물을 이용한 노루궁뎅이버섯 균사체의 jar fermenter에서의 발효조건 최적화. 한국식품과학회지 42: 82-89).

이러한 자실체 생산에 주로 이용되는 고체배지로는 참나무와 같은 활엽수 톱밥에 미강을 20%수준으로 혼합한 배지를 많이 사용하고 있으며(김성필, 최용희, 강미영, 남석현 (2005) 노루궁뎅이버섯 추출공정별 추출물의 대식세포 활성화에 대한 효과. J Korean Soc Appl Biol Chem 48: 285-291), 기타 배지로 원목, 폐면, 면화 등과 같은 재료를 사용하고 있다(김영호 (2005) 노루궁뎅이버섯균의 특성 및 인공재배에 관한 연구. 한경대학교 산업대학원, 농학석사학위논문).

상기에서 고체배지로 주로 이용되는 재료인 참나무는 예로부터 산양 등 산동물의 사료로 이용되었고(이인덕, 이중해, 이형석 (1993) 참나무수엽의 사료가치 비교연구. 한초지 13: 221-227), 축산시험장(1988, 한국표준사료성분표. 농촌진흥청 축산시험장, 수원 p142-152)에서도 갈참나무, 상수리나무, 떡갈나무에 대한 사료성분이 제시되어 있다. 또, 참나무 성분 중에는 항균 및 항산화성분이 풍부하게 함유되어 있다(정일선, 김유정, 갈상완, 최영주 (2007) 참나무목초액의 항균 및 항산화 활성과 일산화질소 합성저해 연구).

이러한 참나무의 효과는 이를 배지로 이용한 버섯에서 확인할 수 있는데, 이는 버섯 종이 배지 조성에 따라 생성하는 유효성분의 함량이 달라지기 때문이다.(박창규 도기, 조주현, 유광원, 정헌상, 이현용, 정재현 (2010) 수삼추출물을 이용한 노루궁뎅이버섯 균사체의 자퍼멘터(jar fermenter)에서의 발효조건 최적화. 한국식품과학회지 42: 82-89).

또한 인공배지에서 재배한 버섯에 비하여 원목 등 천연 배지에서 자란 자연산 버섯의 가격이 현저하게 높은 이유는 기능성 성분의 함량이 높기 때문이다.

그러므로 천연의 소재들을 이용하여 기능성이 높은 균사체와 자실체를 얻을 수 있을 것으로 여겨지나 기능성 균사체를 고체배양법으로 얻고자한 연구와 또 이러한 균사체를 이용하여 자실체를 얻고자한 연구는 찾아보기 어렵다.

한편, 최근 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceus)의 항암작용, 면역기능 증강, 항만성위염 작용, 신체허약체질에 효능(Ahn DK (1992) Medical fungi in Korea. Korean J Mycol 20: 154-166)이 알려지면서 우리나라에서도 재배농가가 늘고 있으며 자실체뿐만 아니라 균사체에서 다양한 생리적 활성이 보고되고 있다. 즉, 노루궁뎅이버섯 열수 추출물이 Sarcoma 180 세포에 대한 항종양효과가 보고되었고(Mizuno T (1995) Yamabushidatake, Hericium erinaceum, bioactive substances and medicinal utilization. Food Rev Int 11:173-178), 치매에 효과가 있는 물질이 분리되어 그 구조가 밝혀졌다(Kawagishi H, Shimada A, Hosokawa S, Mori H, Sakamot H, Ishiguro Y, Sakemi S, Bordner J, Kojima N, Furukawa S (1996) Erinacines EF and G stimulators of nerver growth factor(NGF)-synthesis from the mycelia of Hericium erinaceum. Tetrahedron Letters 37: 7399-7402).

이러한 효능을 가진 노루궁뎅이 버섯을 배양함에 있어서 최적의 배지를 얻기 위한 기술로, 박창규 등(2010 수삼추출물을 이용한 노루궁뎅이버섯 균사체의 jar fermenter에서의 발효조건 최적화. 한국식품과학회지 42: 82-89)은 노루궁뎅이버섯 균사체를 배양함에 있어 PD(감자, 포도당)배지외에 보고된 바 있는 10종의 액체배지에 수삼추출물을 첨가하였을 때 균사 및 다당체의 수율과 면역활성에서 상당한 차이를 밝혀내었으며 가장 이상적인 배지를 선별한 바 있다.

또한, 노루궁뎅이 버섯의 기능성을 향상시키고자 한방소재들을 첨가하는 연구들이 이루어지고 있고(발명특허 1005232630000 버섯배양물을 포함하는 배지 및 상기배지를 이용한 버섯배양방법), 액체배지에 미강이나 홍삼 등을 첨가함으로서 기능성 균사체생산이 시도(발명특허 1008264460000 미강 또는 홍삼을 기질로 한 노루궁뎅이버섯의 기능성 균사체 생산방법 및 이를 이용하여 생산된 미강 또는 홍삼 유효성분을 함유하는 노루궁뎅이버섯의 기능성 균사체)되었다.

또 노루궁뎅이 버섯균사체를 고체 배양한 사례로는 인진쑥과 현미에 각각 배양한 노루궁뎅이버섯 균사체 추출액에 다양한 한방소재 추출액을 첨가함으로서 간기능개선과 숙취해소용 차 및 그 제조방법에 관한 특허(발명특허 1007876330000)가 있다.

그러나, 상기한 배지들은 액체배지를 사용하거나 균사체생산에만 인진쑥과 현미를 사용하고 있며, 노루궁뎅이버섯 균사체 및 자실체 모두의 생산을 위한 배지로 참나무를 이용한 고체배지의 사용은 찾아볼 수 없다.

한편, 가시오가피(Acanthopanax senticosus)는 두릅나무과의 식물로 고래로부터 간과 신장질환의 치료에 이용되어온 우리나라의 자원생약이다(Ko SK, Kim JS, Choi YE, Lee SJ, Park KS, Chung SH (2002) Anti-diabetic effects of mixed water extract from Ginseng radix rubra, Acanthopanacis cortex, and Cordy-ceps. Korean J Pharmacogn 33: 337-342). 1969년 Brekhmann에 의해 adaptogen으로서의 효능(Brekhmann II, Dardymov IV (1969) New substances of plant origing which increase nonspecific resistance. Annu Rev Pha -r- macol 9: 419-430)을 지니고 있는 것이 밝혀짐으로서 외부 환경에 대한 적응력을 증가시킬 수 있는 것으로 알려지고 있다(Ha ES, Hwang SH, Shin KS, Yu KW, Lee KH, Choi JS, Park WM, Yoon TJ (2004) Anti-metastatic activity of glycopro-tein fractionated from Acanthopanax senticosus, involve-ment of NK-cell and marcophage activation. Arch Pharm Res 27: 217-224).

또한, 한방에서는 양위, 류머티스 관절염, 요통, 퇴행성 관절증후군, 수종, 각기, 타박상 등의 처방제로 사용되어 왔으며(Yang DS, Cha MH, Kang BJ, Oh SW, Kim YE, Yoon YS (2003) A study on the longitudinal bone growth of growth- stimulating material with Eleutherococcus senticosus. Ko-rean J Food Sci Technol 35: 702-707), 항알러지(Yi JM, Hong SH, Kim JH, Kim HK, Song HJ, Kim HM (2002) Effect of Acanthopanax senticosus stem on mast cell-dependent anaphylaxis. J Ethnopharm 79: 347-352), 항염증(Jung HJ, Park HJ, Kim RG, Shin KM, Ha J, Choi JW, Kim HJ, Lee YS, Lee KT (2003) In vivo anti-inflammatory and antinoceptive effects of liriodendrin isolated from the stem bark of Acanthopanax senticosus. Planta Med 69: 610-616), 항균(Lee S, Shin DS, Oh KB, Shin KH (2003) Antibacterial com-pounds from the leaves of Acanthopanax senticosus. Arch Pharm Res 26: 40-42), 항암(Ha ES, Hwang SH, Shin KS, Yu KW, Lee KH, Choi JS, Park WM, Yoon TJ (2004) Anti-metastatic activity of glycopro-tein fractionated from Acanthopanax senticosus, involve-ment of NK-cell and marcophage activation. Arch Pharm Res 27: 217-224), 항산화(Kim HY, Kim K (2003) Protein glycation inhibitory and antioxidative activities of some plant extracts in vitro . J Agric Food Chem 51: 1586-1591), 항당뇨(Jung HJ, Park HJ, Kim RG, Shin KM, Ha J, Choi JW, Kim HJ, Lee YS, Lee KT (2003) In vivo anti-inflammatory and antinoceptive effects of liriodendrin isolated from the stem bark of Acanthopanax senticosus. Planta Med 69: 610-616), 혈중지질감소(Lee YS, Jung SH, Lim SS, Ji J, Lee SH, Shin KH (2001) Effects of the water extract from the stem bark of Acan - tho - panax senticosus on hyperlipidemia in rats. Korean J Pharmacogn 32: 103-107) 및 항비만(Cha YS, Rhee SJ, Heo YR (2004) Acanthopanax senticosus extract prepared from cultured cells decreases adiposity and obesity indices in C57BL/6J mice fed a high fat diet. J Med Food 7: 422-429)과 더불어 허혈성 질환의 개선효과가 보고되고 있다(Bu Y, Jin ZH, Park SY, Naek S, Rho S, Ha N, Park SK, Kim H, Kim SY (2005) Siberian ginseng reduced infarct volume in transient focal cerebral ischaemia in Sprague-Dawley rats. Phytother Res 19: 167-169).

그리고, 유황은 그 자체로는 독성이 알려져 있어 다양한 방법으로 법제하여 독성을 제거시키며 현재 독성이 없는 법제 식이 유황이 시판되고 있다. 유황은 예로부터 각종 질병의 처방에 사용되었으며 피부질환, 지혈, 신경마비, 냉수족에 사용된다(구정희, 김운애, 류경희, 정형도 (1992) 동양학개론, 여강출판사 p 442-443 ; 박재갑 (1993) 전통약물로부터 신약개발. 항암제 검색방법. 서울대학교 천연물과학연구소. p 174-181). 허준(1994 동의보감. 내경편. 여강출판사)은 고혈압, 중풍, 신경통, 동맥경화, 비만, 결핵, 병후회복, 정력증강, 위장질환, 혈액순환 등에 유황이 효과를 나타낸다고 하였다. 또 김 등(Kim KA, Rho CW, Choi KR, Hwang HJ, Choi HS (2004) Quinone reductase inducer from radish leaf cultivated in the soil containing sulfur. J Korean Soc Food Sci Nutr 33: 946-950)은 열무재배 시 유황을 처리한 결과 열무 내 슬포라판(sulforaphane) 유사체의 함량이 증가한다고 보고하여 무기태 유황이 생물체내에서 유기태로 전환함을 시사하였다.

인체는 생명현상의 유지를 위해 산소를 이용하는 호기성 생물로 에너지를 생산하는 과정뿐만 아니라 체내 물질대사 과정에서도 필연적으로 활성산소종이 생성된다.

활성산소종으로 알려져 있는 수퍼옥사이드(super oxide), 하이드로겐 퍼옥사이드(hydrogen peroxide), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical), 싱그렛트 옥시겐(singlet oxygen)은 사립체의 호흡연쇄계(Lie Y, Zhao H, Li H, Kalyanaraman B, Nicolosi AC, Gutterman DD (2003) Mitochondrial sources of H2O2 generation play a key role in flow-mediated dilation in human coronary resistance arteries. Cir Res 93: 573-580), 활면소포체의 약물 대사계(Free an BA (1982) Biology of disease. Free radicals and tissue injury. Lab Invest 47: 412-426), 세포질의 알데히드 옥시다제(aldehyde oxidase)(Kundu TK, Hille R, Velayutham M, Zweier JL (2007) Characterization of superoxide production from aldehyde oxidase. An important source of oxidants in biological tissues. Arch Biochem Biophys 460: 113-121) 잔틴옥시다제(xanthine oxidase)(Waud WR, Rajagopalan KV (1976) Purification and properties of the NAD+-dependent(Type D) and O2-dependent(Type O) form of rat liver xanthine dehydrogenase. Arch Biochem Biophys 172: 354-364) 등을 포함하는 활성산소 생성계에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다.

정상적인 생명활동을 통하여 생성된 활성산소는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 카타라제(catalase), 글루타치온퍼옥시다제(glutathione peroxidase), 글루타치온 에스트란스페라제(glutathione S-transferase) 등과 같은 단백성 항산화제 뿐만 아니라 글루타치온(glutathione), 비타민 C, 비타민 E, 및 코엔자임 큐(coenzyme Q) 등과 같은 비 단백성 항산화제에 의해 제거되는 것으로 알려져 있다(Richard BJ, Bernard BK, Hara PM, Joyce EL, Lawrende SW, Robert LB (1975) The role of superoxide anion generation in phagcytic bactericidal activity. Studies with norman and chronic granulomatous disease leukocyte. J Clin Invest 55 1357-1372).

그러나 생체가 과도한 스트레스를 받거나 과음, 흡연, 피로 또는 각종 질병상태에서는 활성산소 생성계와 제거계 사이의 불균형이 초래되어 과잉의 활성산소 생성으로 조직이 손상되며 이로 인해 노화가 촉진되고 발암, 고혈압, 동맥경화 및 당뇨 등과 같은 각종질환을 유발하는 것으로 보고되고 있어(Danrong Z, Yuquiong C, Dejiang N (2009) Effect of water qulaity on the nutritional components and antioxidant activity of green tea extracts. Food Chem 113: 110-114) 식의약적인 측면에서 활성산소를 감소시킬 수 있는 소재 개발이 관심의 초점이 되고 있다.

이를 위하여 많은 연구자들은 이 같은 각종 활성산소종의 제거 혹은 방어하는 천연물 유래의 소재들을 찾기 위한 수단으로 전자공여능, 환원력, 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase) 유사활성 및 니트리트(nitrite) 소거능 등의 항산화능을 분석하고 있다.

본 발명은 버섯종의 효능과 품질이 인공재배한 것에 비하여 자연에서 채취한 것이 우수하며 가격 면에서도 현저하게 높은 점을 감안하여 노루궁뎅이버섯의 균사체 및 자실체를 생산함에 있어 자연환경에 비교적 가까운 참나무를 이용한 고체상태의 배지를 사용하고 또한 기능성이 높은 소재를 사용함으로서 버섯 균사체 또는 그 자실체의 품질을 향상시키고자 본 발명에 이르게 되었으며, 특히 항산화활성과 면역활성 및 항암활성을 종래에 비하여 더욱 향상시킨 균사체와 자실체를 생산하도록 하는 노루궁뎅이버섯 균사체 및 자실체 제조 방법을 제공하는 데 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은, 참나무톱밥 : 가시오가피톱밥 : 미강의 비를 중량비율로 50~70:10~30:10~30으로 혼합한 후, 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강 혼합물 100g에 대하여 pH를 5~6으로 조절한 물을 50~80 g비로 가하여 골고루 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-유황- pH5.5로 조절된 물의 혼합물을 밀봉하여 4℃의 저온실에서 12-48시간 경과시켜 노루궁뎅이버섯용 고체배지를 제조하거나;

참나무톱밥 : 가시오가피톱밥 : 미강의 비를 중량비율로 50~70:10~30:10~30으로 혼합한 후, 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강 혼합물 100g에 대하여 법제유황분말을 50~100 mg의 비로 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-유황 혼합물 100 g에 대하여 pH를 5~6으로 조절한 물을 50~80 g비로 가하여 골고루 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-유황- pH5.5로 조절된 물의 혼합물을 밀봉하여 4℃의 저온실에서 12-48시간 경과시키는 노루궁뎅이버섯용 고체배지를 제조하여,

상기 복수개의 배지 중 택일한 배지에 노루궁뎅이버섯 종균을 접종한 후 뚜껑을 덮고 20~30℃의 항온실로 옮겨 20~40일간 배양하여 노루궁뎅이버섯 균사체를 배양하고, 상기 배양한 노루궁뎅이버섯 균사체가 배양된 병 배지를 15~18℃, 상대습도 80~100%의 재배실로 옮겨 10~20일간 재배하여 자실체를 수확하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 면역활성 및 항암효과가 향상된 노루궁뎅이버섯 균사체 또는 자실체 제조방법에 있다.

또한, 상기 균사체를 배지를 포함하여 건조한 건조 배지 포함 균사체 또는 균사체를 15일간 재배한 후 건조하여 얻은 자실체에 물 또는 70% 에탄올을 가하여 0.5-5% 되게 조정한 후 30분간 가열 추출하여 얻은 것을 특징으로 하는 노루궁뎅이버섯 추출물에 또 다른 특징이 있다.

상기한 바와 같은 구성을 갖는 본 발명의 유황 및 가시오가피를 사용한 고체배지를 사용하여 노루궁뎅이 버섯 균사체 및 자실체를 제조하면, 노루궁뎅이 버섯 균사체와 자실체의 폐기율이 낮아져 결과적으로 수확량을 높일 수 있으므로 수익율이 향상되고, 현저하게 높은 항산화활성과 면역증강효과와 함암효과를 나타내어 기능성 식품, 신약, 화장품 및 기능성 동물 사료 등에 다용도로 활용이 가능하게 되는 효과가 있다.

또한, 참나무를 사용하여 버섯 균사체와 자실체를 생산하므로 참나무의 유효성분을 버섯에서 확인할 수 있게된다.

도 1은 노루궁뎅이버섯 균사의 생육도 측정 도면.
도 2는 본 발명의 배지를 사용하여 배양한 균사체가 생육된 병배지 및 병배지를 건조시킨 사진
도 3은 균사체가 배양된 병배지를 상대습도 95%, 온도 18℃에서 10일간 재배하였을 때의 자실체사진 및 동일조건에서 15일 재배하여 수확한 자실체를 건조한 사진.
도 4와 도 5는 각각 본 발명 배지를 포함한 건조 균사체의 1-5% (w/v) 열수추출액 및 1-5%(w/v)의 자실체 열수추출액의 사진.
도 6은 배지별 노루궁뎅이버섯 균사체 열수 추출물의 면역활성 측정 결과 도면
도 7은 배지별 노루궁뎅이버섯 자실체 열수추출물의 면역활성 측정 결과 도면
도 8은 배지별에 따른 노루궁뎅이버섯 균사체 열수추출물의 위암세포 생육저해율 비교 도면
도 9는 배지별에 따른 노루궁뎅이버섯 자실체 열수추출물의 위암세포 생육저해율 비교 도면

이하 본발명의 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.

I. 균사체와 자실체 및 이들의 열수추출물 생산을 위한 재료 및 방법

1. 사용균주

본 발명에 사용된 노루궁뎅이버섯(H. erinaceum KNUF 1007) 균사체는 대구가톨릭대학교에서 분양 받아 PDA(potato dextrose agar) 배지를 넣은 페트리디쉬(petri dish)에 이식하여 25℃의 항온기에서 15일간 배양하여 -20℃에서 보존하면서 사용하였다.

2. 종균의 배양

PDA(potato dextrose agar)배지를 담은 페트리디쉬(petri dish)상에서 배양한 보존 중인 균주를 1cm² 크기로 무균상에서 절취하여 PD(potato dextrose) 액체배지에 이식한 후 23℃의 진탕배양기에서 120 rpm으로 15일간 배양하였다. 다음에 가정용 믹셔를 사용하여 30초간 균질화한 후 종균으로 사용하였다.

3. 혼합 톱밥배지의 제조

1) 톱밥의 제조 및 배지재료의 준비

참나무 톱밥은 경기도 파주시 일원에서 자생하는 5-10년생의 갈참나무(Quercus aliena Blume)를, 가시오가피(Acanthopanax senticosus)는 1-2년생의 나무 가지를 톱밥제조기(S-04, 선일기계)를 채취하여 40 mesh입도로 분쇄한 후 60℃에 하룻밤 동안 건조하였다. 미강은 2010년도에 생산된 일품벼를 수확한 후 9분도미로 정미하는 동안에 발생하는 것을 60 mesh 체로 친 후 60℃에서 하룻밤 동안 건조하였다. 이들 재료는 0.2 mm의 비닐 팩에 3 kg씩 포장한 후 4℃의 저온실에 보관하면서 사용하였다. 유황은 독성을 제거한 법제유황(주식회사 정민)을 구입하여 사용하였다.

2) 혼합 및 반죽

배지용 재료의 혼합은 참나무톱밥 : 가시오가피톱밥 : 미강의 비를 중량비율로 60:20:20으로 혼합한 후 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강 혼합물 100g에 대하여 법제유황분말을 82 mg의 비로 혼합한 후 믹셔기를 사용하여 골고루 혼합하였다.

다음에 참나무톱밥- 가시오가피톱밥 - 미강 -유황 혼합물 100 g에 대하여 탄산칼슘으로 pH를 5.5로 조절한 물을 65 g 비로 가하여 골고루 혼합한 후 비닐 팩으로 밀봉하여 재료에 수분이 골고루 침투되도록 4℃의 저온실에서 하룻밤 방치하였다.

3) 입병과 살균

수분이 조절된 혼합톱밥은 공기필터를 부착한 뚜껑이 달린 1,200 mL 용량의 내열성 플라스틱병에 혼합 톱밥배지 720g씩을 병 입구까지 차도록 눌러 채워 넣는다. 다음에 병 중앙에 직경 12 mm, 길이 15 cm의 나무봉을 사용하여 병 밑 부분까지 구멍을 만든 후 뚜껑을 닫은 상태로 121℃에서 120분간 살균하였다. 살균이 완료되면 무균실로 옮겨 실온이 될 때까지 식혀 균사체 배양용 병배지로 사용하였다.

4. 노루궁뎅이버섯 균사체 배양

식힌 병배지는 뚜껑을 연 다음 종균 45 mL을 취하여 구멍주위와 내벽에 접종한 후 뚜껑을 덮고 25℃의 항온실로 옮겨 30일간 배양하였다. 개발한 배지, 즉 [참나무톱밥:가시오가피톱밥:미강]:물:유황 = [60:20:20]:65: 0.082 중량비와의 비교를 위하여, 참나무톱밥 : 미강 (80:20 중량비), 참나무톱밥: 가시오가피톱밥 : 미강(60:20:20 중량비)을 혼합한 후 수분을 총중량기준 65%되게 가하고 pH를 5.5로 조정한 배지를 제조한 후 상기와 동일한 조건과 방법으로 균사체를 배양하여 비교하였다.

5. 노루궁뎅이버섯 자실체 재배

30일간 배양한 노루궁뎅이버섯 균사체가 배양된 병 배지는 균일한 것만을 골라 15~18℃, 상대습도 95%의 재배실로 옮겨 15일간 재배하여 자실체를 수확하였다.

6. 균사체 및 자실체 열수 추출물의 조제

균사체 추출물의 제조는 상기 노루궁뎅이버섯의 균사체 배양 및 자실체 재배에서 균사체 배양방법에서와 같이 각각의 배지에서 30일간 배지 재료가 포함된 상태의 배양 균사체를 60℃에서 수분함량이 4-5%가 되도록 충분히 건조하였다. 자실체는 각각의 배지를 사용하여 25℃에서 30일 동안 배양한 것을 18℃, 상대습도 95%에서 15일 동안 재배한 것을 60℃에서 수분함량이 4-5%가 되도록 충분히 건조하였다. 다음에 건조균사체와 자실체를 가정용 믹셔를 사용하여 50 mesh 크기로 분쇄한 후 추출용 재료로 사용하였다.

추출은 열수추출로 건조시료 5 g씩에 물을 가하여 100 mL로 채워 5%(w/v)가 되게 한 후 냉각관을 부착한 추출조에 넣어 30분간씩 추출하였다. 다음에 Whatman No 2 여과지를 사용하여 여과하여 5%의 추출액을 조제하였다

II . 측정방법

1. 균사체의 생육도 측정

개발된 혼합톱밥배지에서의 균사체 생육도를 비교하기 위하여 40일간 배양한 균사체가 배양된 배지를 스파툴라로 꺼내어 가정용 믹셔로 완전히 파쇄, 혼합하고 1 g을 취하여 증류수 100 mL로 희석한 후 희석액 100 μL씩을 취하여 PDA 배지를 부은 페트리디쉬(petri dish)에 4점씩 접종하여 25℃의 항온기에서 72시간 배양한 후 생장한 직경(cm)을 측정(도 1) 하여 균사체의 생육도로 나타내었다.

2. 자실체의 수확량 측정

개발 톱밥배지에 30일간 균사체를 배양한 병의 필터를 제거시킨 후 18℃, 상대습도 95%의 재배실로 옮겨 15일간 재배하였으며 이때 얻어진 병당 노루궁뎅이버섯을 수확하여 생체 중량을 측정하였다.

3. 폐기율의 측정

균사체 폐기율은 균사체를 30일간 배양한 후 뚜껑을 개열하였을 때 곰팡이가 오염된 것 및 번식이 균일하지 못한 것, 번식이 안된 것 등을 모두 폐기하였으며 폐기 %로 나타내었다. 자실체의 폐기율은 균사체 성장이 균일하게 된 것 중에서 자실체 생성이 이루어지지 않거나 도중에 변색 또는 오염된 것을 율(%)로 나타내었다.

4. 항산화능 분석

항산화능을 분석하기 위한 시료는 균사체의 경우는 각각의 배지에서 30일간 배양한 균사체가 함유된 건조배지 5 g에 증류수 100 mL을 가하여 총부피를 100 mL로 채운 5%(w/v) 용액을 냉각관을 부착한 추출장치에 넣어 30분간 가열추출한 후 Whatman No 2 여과지를 이용하여 여과한 여액을 분석용 시료로 사용하였으며 자실체는 배양된 균사체를 재배실로 옮겨 15일간 재배하여 수확한 노루궁뎅이버섯을 60℃에서 건조한 후 분쇄한 분말 1 g을 취하여 증류수를 가하여 100 mL로 채워 중량비가 5%(w/v)가 되게 한 후 균사체 추출과 동일하게 30분간 가열 추출한 여과액을 사용하였다.

전자공여활성(electron donating ability)은 Blois(Blios MS (1958) Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 26: 1199-1200)의 방법에 따라 시액 0.2 mL에 0.4 mM DPPH(1,1diphenyl-2-picryl-hydrazyl)용액 0.8 mL를 가하여 vortex상에서 가하고 10분간 방치 한 다음 525 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식은 전자공여능(%) = 100 - [(시료의 흡광도/대조구의 흡광도) x 100]에 의하여 활성도를 산출하였다.

환원력(reducing power)은 Saeedeh & Asna (Saeedeh AD, Asna U (2007) Antioxidant properties of various solvent extracts of mulberry (Morus indica L.) leaves. Food Chem 102: 1233-1240)의 방법에 따라 시액 1 mL에 0.2 M 포스페이트 완충용액(phosphate buffer, pH 6.6) 2.5 mL와 1% 포타시움 페리시아나이드(potassium ferricyanide 용액 2.5 mL를 가한 후 50℃에서 30분간 반응시켰다. 다음에 10% 트리클로르아세트산 (trichloroacetic acid, TCA) 용액 2.5 mL를 가한 후 1,650 x g에서 10분간 원심분리 하였으며, 상징액 2.5 mL에 증류수 2.5 mL와 0.1% FeCl₃ 용액 0.5 mL를 가한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

수퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase: SOD) 유사활성은 Marklund와 Marklund (Marklund, S. and Marklund, G (1974) Involvement of superoxide anion radical in the oxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur. J. Biol. Chem. 47: 468-474)의 방법에 따라 시액 200 μL에 pH 8.5로 조정한 tris-HCl buffer 용액 3 mL와 7.2 mM pyrogallol 200 μL을 가하고 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, SOD-유사활성(%) = 100 - [(시료의 흡광도/대조구의 흡광도) x 100]에 의하여 활성을 산출하였다.

아질산염 소거능(nitrite scavenging activity)은 Kato 등(Kato H, Lee IE, Chuyen NV, Kim SB, Hayase F (1987) Inhibition of nitrosamine formation by nondialyzable melanoidins. Agri. Bio. Chem. 51: 1333-1338)의 방법에 따라 1 mM NaNO 용액 1 mL에 시액 1 mL를 가하고 0.1 N HCl과 0.2 M citrate buffer(pH 2.5)를 가하여 총 부피를 10 mL로 조정하였다. 다음에 37℃에서 1시간 반응시킨 후 1 mL를 취하여 2% 초산용액 3 mL와 30% 초산용액으로 용해한 Griess reagent(1% sulfanilic acid : 1% naphthylamine = 1 : 1) 0.4 mL을 순차적으로 가한 후 실온에서 15분간 방치, 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 Griess reagent 대신 증류수를 사용하였으며 계산식, 아질산염소거능(%) = 100 - [(시료의 흡광도/대조구의 흡광도) x 100]에 의하여 산출하였다.

5. 면역활성의 측정

면역활성은 MTT 분석법(Sugawara I Kimoto M, Fujimot M, Ishizaka S, Tsuji T, Nishiyama T (1984) MTT assay, rapid colorimetric assay applicable to cellular proliferation and cytotoxicity. Igakuno Ayuni 123: 733-735)에 따라 마이토겐(mitogen)활성 을 측정하였다. 즉, 6주령의 마우스(BALB/c)로부터 무균적으로 비장을 적출하고 그 세포를 회수하여 2 x 10⁵ / mL로 조정하였다. 다음에 96-웰플레이트(96-well plate)의 각 웰에 100 μL씩 분주하였다. 다음에 농도별 열수추출물 시료를 100 μL씩 첨가하여 72시간동안 배양한 후 상대적 활성을 비교하였다.

6. 항암효과 측정

항암효과를 조사하기 위한 세포주는 위암 세포주 AGS(KCLB 21739)로 한국세포주은행에서 분양 받았다. 배양은 10% FBS와 페니실린 100 유니트/mL, 스트렙토마이신 10 μg/mL을 함유하는 RPMI 1640 배지를 사용하였으며 T-75 cm² 플라스크에 이식한 후 5% CO₂, 37℃의 인큐베이타(Vision CO₂ Incubator, Bionex, Korea)에서 배양하였다. 암세포 가 4 x 10⁵/mL로 증식되었을 때 PBS로 세척하고 트립신(trypsin)-EDTA로 분리시켜 배양플레이트(NUNC, 35 mm)에 1 x 10⁶ cells씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이타(Vision CO₂ Incubator, Bionex, Korea)에서 24시간동안 배양한 후 시료 열수추출액이 함유된 새로운 배지로 옮겨 다시 24시간 배양하였다. 암세포 증식 억제율은 0.4% Trypan blue assay법으로 상대적인 억제율을 측정하였다.

7. 통계분석

분석은 3회 반복으로 측정하여 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 균사체 배양 및 자실체 재배는 10회 반복하여 얻어진 데이터를 Statistical Analysis System Software Package Program으로 평균값과 표준편차로 나타내었다. 유의성 검증은 던컨의 다중검증법에 의하였다.

III . 결과

1. 노루궁뎅이버섯 균사체의 생육도

개발된 노루궁뎅이버섯 균사체 배양을 위한 고체배지로 참나무톱밥에 가시오가피톱밥과 미강 및 법제유황을 처리한 병배지에 종균을 접종하여 25℃에서 30일간 배양한 후 실험방법에서 제시한 바와 같이 일정량을 PDA 배지에 이식하여 배양하였을 때의 균사체 생육도를 비교한 결과는 표 1과 같다.

생육도의 효율적인 비교를 위하여 본 발명 배지에서 유황을 제거시킨 배지 및 유황과 가시오가피를 제거시킨 배지에서 동일조건으로 배양하였을 때 균사체의 생육도는 참나무-가시오가피-미강-유황 배지에서 5.94 cm로 유황만을 제거시킨 참나무-가시오가피-미강 배지의 생육도 6.37cm와는 p<0.05 수준에서 유의적인 차이를 보이지 않았으나 가시오가피와 유황을 함께 제거시킨 참나무-미강 배지의 생육도 5.56 cm 보다는 유의적으로 높은 값을 나타내었다. 이러한 현상은 가시오가피에 함유된 다양한 성분에 기인된 현상이라 생각된다. 평균값으로는 유황을 첨가한 경우가 유황을 제거시킨 참나무-가시오가피-미강 배지에 비하여 다소 낮은 생육도를 보였는데 이는 유황의 항균성에 기인한 현상으로 생각된다. 따라서 종합적으로 볼 때 가시오가피와 유황의 첨가는 기존에 잘 알려져 있는 톱밥과 미강 혼합배지에 비하여 균사의 생육도가 촉진됨을 확인할 수 있었다.

2. 노루궁뎅이버섯 자실체의 수확량

노루궁뎅이버섯 균사체가 균일하게 퍼진 병배지를 골라서 상대습도 95%로 조정된 18℃의 재배실에서 15일간 재배하여 수확한 버섯의 수확량을 비교한 결과는 표 2와 같다.

가시오가피톱밥과 유황 및 미강을 혼합한 참나무 톱밥을 배지로 사용하였을 때의 병당 생버섯의 수확량은 712.52 g으로 참나무-가시오가피-미강 배지 경우의 741.61 g과 통계적으로 유의성이 없으나 참나무-미강 배지 경우의 627.50 g과는 유의적으로 높은 값을 나타내었다. 따라서 일반적으로 사용하고 있는 참나무 등 활엽수 톱밥에 미강을 혼합하여 재배하는 일반적인 배지에 비하여 가시오가피 또는 가시오가피와 유황을 혼합하였을 때 높은 수확량을 얻을 수 있는 것으로 사료된다.

3. 노루궁뎅이버섯 균사체 및 자실체의 폐기율

개발된 배지에서의 균사체 배양과 자실체 재배 중 폐기되는 율을 조사한 결과는 표 3과 같다.

참나무-가시오가피-미강-유황 배지를 사용할 경우 균사체의 폐기율은 1.62%, 자실체의 폐기율은 0.82%로 낮았으며, 참나무-가시오가피-미강 배지에서도 균사체 및 자실체의 폐기율이 각각 3.45% 및 1.65%로 낮은 수치를 나타낸 반면 참나무-미강 배지에서는 각각 5.12% 및 4.57%로 높았다. 이러한 현상은 앞에서도 언급한 바와 같이 가시오가피와 유황의 항균성이 기인한 결과로 보인다. 따라서 일반톱밥배지에 가시오가피 또는 가시오가피 및 법제유황을 첨가함으로서 균사체와 자실체의 성장촉진은 물론 수확량을 높힘으로서 산업적 활용성이 높은 것으로 판단된다.

4. 노루궁뎅이버섯 균사체 및 자실체 열수추출물의 항산화능

개발된 배지에서 배양한 노루궁뎅이버섯 균사체와 자실체 건조물을 열수추출한 후 중량비로 5%(w/v)되게 하여 여과한 용액의 항산화능을 조사한 결과는 표 5와 같다.

5% 건조균사체 열수출액과 5% 건조 자실체 열수추출액의 전자공여능은 본 발명 배지이 경우 각각 74.52% 및 86.59%이었으며 참나무-가시오가피-미강 배지의 경우는 67.36% 및 72.44%로 참나무-미강배지의 45.48% 및 57.50%보다 현저하게 높았다.

환원력에서도 참나무-가시오가피-미강-유황 배지의 경우는 5% 균사체열수 추출액은 0.47, 5% 자실체 열수추출액은 0.65로 참나무-가시오가피-미강 배지의 0.36 및 0.50와 참나무-미강배지의 0.21 및 0.35보다 높은 활성을 나타내었다.

SOD 유사활성은 참나무-미강 배지에서는 8.75% 및 17.53%로 나타났으나 참나무-가시오가피-미강-유황 배지의 경우는 27.55% 및 32.47%, 참나무-미강배지에서는 8.75 및 17.53%를 나타내어 개발배지가 기존의 참나무-미강 배지에 비하여 높은 활성을 나타내었다.

아질산염 소거능에서도 참나무-가시오가피-미강-유황 배지에서는 5% 균사체 열수추출액 및 5% 자실체 열수추출액에서 각각 30.72% 및 39.70%로 나타났으며 참나무-가시오가피-미강 배지에서는 18.63% 및 23.56%로 참나무-미강배지의 9.45% 및 12.81% 보다 높은 활성을 나타내었다.

전자공여능은 생체내 활성산소라디칼에의 산화를 방어하는 지표(Aoshima H, Tsunoue H, Koda H, Kiso Y (2004) Aging of whiskey increases 1,1- diphenyl-2- picrylhydrazl radical scavenging activity. J. Agric. Food Chem. 52: 5240-5244)로 수치가 높을수록 높은 항산화활성을 나타내며, 환원력은 체내의 산화반응을 억제함으로서 생체를 방어하는 능력에 대한 지표로 알려져 있다(Zhu QY, Hackman RM, Ensunsa JL, Holt RR, Keen CL (2002) Antiocidant activities of oolong tea. J. Agric. Food Chem. 50: 6929-6934). SOD유사활성도 체내에서 수퍼옥사이드(superoxide)를 제거함으로써 노화억제와 함께 산화적 장애를 방어하는 지표로 알려져 있다(Shin SR, Hong JY, Nam HS, Yoon KY, Kim KS (2006) Antioxidative effects of extracts of Korean herbal materials. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 35: 187-191). 니트리트(nitrite)는 아민(amine)류와 반응하여 발암물질인 N-니트로사민(N-nitrosamine)을 생성하므로 아질산염 소거능은 항암작용을 간접적으로 알 수 있는 하나의 지표로 활용되고 있다(Na GM, Han HS, Ye SH, Kim HK. 2004. Physiological activity of medicinal plant extracts. Kor. J. Food Preserv. 11: 388-393).

5. 고체배지에서 배양한 노루궁뎅이버섯 균사체 배양물 및 자실체 추출액 및 추출수율

“참나무-가시오가피-미강-유황 배지” 배지, “참나무-가시오가피-미강 배지” 배지 및 “참나무-미강 배지”를 넣은 병배지를 사용하여 25℃에서 30일간 배양한 후 얻은 균사체 및 그 배지와, 상기 균사체를 18℃, 상대습도 95%의 재배실에서 10-15일간 재배하여 얻은 자실체를, 각각 60℃에서 수분함량이 4-5%가 되게 건조시킨 후 파쇄기를 사용하여 100 mesh 입도로 분쇄하여 최종적으로 배지를 포함한 노루궁뎅이버섯 균사체 분말을 얻고 여기에 중량비로 5%가 되게 물을 가하여 가압 솥에 넣어 121℃에서 30분간 가열 추출하였을 때 추출되는 가용성 고형물의 함량은 나타낸 결과는 표 5와 같다.

열수에 의한 추출수율은 배지를 함유하는 균사체와 자실체 모두 “참나무-가시오가피-미강-유황 배지”와 “참나무-가시오가피-미강 배지” 상호간에는 유의적인 차이를 보이지 않았으나 “참나무-미강 배지”에 비하여는 유의적으로 높은 함량을 나타내었다. 이러한 결과는 가시오가피 또는 유황의 첨가가 균사체 및 자실체의 생육을 촉진한 결과 가용성 고형물의 함량이 높아진 것이라 사료된다.

“참나무-가시오가피-미강-유황 배지” 또는 “참나무-가시오가피-미강 배지”에서 생육한 배지를 포함한 균사체는 육안적으로 보아서는 뚜렷한 차이를 발견할 수 없었다. 도 2의 (a)는 “참나무-가시오가피-미강-유황 배지” 배지를 사용하여 배양한 균사체가 생육된 병배지를 나타낸 것이며, 도 2의 (b)는 균사체가 배양된 “참나무-가시오가피-미강-유황 배지” 병배지를 건조시킨 사진이다.

그리고 도 3의 (a)는 균사체가 배양된 “참나무-가시오가피-미강-유황 배지” 병배지를 상대습도 95%, 온도 18℃에서 10일간 재배하였을 때의 자실체 사진이며, 도 3의 (b)는 동일조건에서 15일 재배하여 수확한 자실체를 건조한 사진이다.

도 4와 도 5는 각각 “참나무-가시오가피-미강-유황 배지”에서 배양한 배지를 포함한 건조 균사체의 1-5% (w/v) 열수추출액 및 1-5%(w/v)의 자실체 열수추출액의 사진이다. 이 사진에서 보는 바와 같이 균사체 및 자실체의 농도가 높아질수록 색상이 진해졌으며 면역활성 및 항암효과 검증을 위한 시료는 5%(w/v) 열수 추출액을 사용하였다.

6. 가시오가피와 미강 및 유황을 함유하는 참나무톱밥배지에서 배양한 배지함유 노루궁뎅이 균사체 열수 및 에탄올 추출물의 면역활성 효과

가시오가피와 미강 및 유황을 함유하는 참나무톱밥배지에서 배양한 노루궁뎅이버섯 균사체 열수 추출물의 면역활성을 관찰한 성적이 도 6이다. 모든 균사체 열수추출물을 첨가하였을 때, 시료를 첨가하지 않은 대조구에 비하여 첨가농도에 비례하여 면역활성이 증가하였다. 그러나 면역활성 증가의 정도는 가시오가피-참나무-미강-유황(“가참미유”) 및 가시오가피-참나무-미강(“가참미”) 배지에서 배양한 균사체의 추출물이 참나무-미강(“참미”) 배지에서 배양한 균사체 추출물 보다는 모든 첨가 농도에서 유의하게 높은 것으로 나타났다. 또한 “참나무-가시오가피-미강 배지” 배지에서 배양한 균사체의 추출물에 비해 “참나무-가시오가피-미강-유황 배지” 배지에서 배양한 균사체의 추출물에서 면역활성이 유의성은 없으나 약간 높게 나타나는 경향을 보였다.

한편, 모든 자실체 추출물을 첨가한 경우 도 7에도 면역활성에 있어서 정도의 차이는 있으나 균사체 추출물의 경우와 유사한 결과를 관찰할 수 있었다.

7. 가시오가피와 미강 및 유황을 함유하는 참나무톱밥배지에서 배양한 배지함유 노루궁뎅이 균사체 열수 및 에탄올 추출물의 위암세포 생육 억제 효과

가시오가피와 미강 및 유황을 함유하는 참나무톱밥배지에서 배양한 노루궁뎅이 균사체 열수 추출물의 위암세포 생육억제 활성을 관찰한 성적이 도 8이다. 모든 균사체 열수추출물을 첨가하였을 때, 시료를 첨가하지 않은 대조구에 비하여 첨가농도에 비례하여 위암세포 생육억제 활성이 증가하였다.

그러나 위암세포 생육억제 활성 증가의 정도는 가시오가피-참나무-미강-유황(“가참미유”) 및 가시오가피-참나무-미강(“가참미”) 배지에서 배양한 균사체의 추출물이 참나무-미강(“참미”) 배지에서 배양한 균사체 추출물보다는 모든 첨가 농도에서 유의하게 높았다.

또한 “참나무-가시오가피-미강 배지” 배지에서 배양한 균사체의 추출물에 비해 “참나무-가시오가피-미강-유황 배지” 배지에서 배양한 균사체의 추출물에서 위암세포 생육억제 활성이 유의성은 없으나 약간 높게 나타나는 경향을 보였다. 한편, 모든 자실체 추출물을 첨가한 경우 도 9에 나타내는 바와 같이 위암세포 생육억제 활성에 있어서 정도의 차이는 있으나 균사체 추출물의 경우와 유사한 결과를 관찰할 수 있었다.

상기한 본 발명에 의한 배지를 사용하여 배양한 균사체는 일반 톱밥배지(활엽수 톱밥에 미강을 혼합한 배지)에 비하여 증식도가 높고 그 자실체는 수확량이 높으며 폐기율을 감소시킬 수 있다.

아울러, 본 발명의 배지에 배양한 균사체와 균사체를 포함하는 배지 추출물, 그리고 자실체는 일반 톱밥배지(활엽수 톱밥에 미강을 혼합한 배지)에 비하여 전자공여능, 환원력, SOD(수퍼옥사이드 디스뮤타제) 유사활성 및 아질산염 소거능이 더욱 향상된다.

또한, “참나무-가시오가피-미강-유황 배지”와 “참나무-가시오가피-미강 배지” 배지를 사용하여 배양한 배지를 포함한 균사체 열수추출물은 0.5-4 mg/mL의 농도범위 내에서 “참나무-미강 배지”배지에서 얻은 균사체 및 자실체에 비하여 유의적으로 높은 면역증강효과와 함암효과를 나타내었다.

Claims (6)

1. 참나무톱밥 : 가시오가피톱밥 : 미강의 비를 중량비율로 50~70:10~30:10~30으로 혼합한 후, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강 혼합물 100 g에 대하여 pH를 5~6으로 조절한 물을 50~80 g 가하여 골고루 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-pH5.5로 조절된 물의 혼합물을 밀봉하여 4℃의 저온실에서 12-48시간 경과시켜 노루궁뎅이버섯용 고체배지를 제조하고,
   상기 노루궁뎅이버섯용 고체배지에 노루궁뎅이버섯 종균을 접종한 후 뚜껑을 덮고 20~30℃의 항온실로 옮겨 20~40일간 배양하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 면역활성 및 항암효과가 향상된 노루궁뎅이버섯 균사체 제조방법.
2. 참나무톱밥 : 가시오가피톱밥 : 미강의 비를 중량비율로 50~70:10~30:10~30으로 혼합한 후, 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강 혼합물 100g에 대하여 법제유황분말을 50~100 mg 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-유황 혼합물 100 g에 대하여 탄산칼슘으로 pH를 5~6으로 조절한 물을 50~80 g 가하여 골고루 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-유황- pH5~6으로 조절된 물의 혼합물을 밀봉하여 4℃의 저온실에서 12-48시간 경과시킨 후 입병하고 살균하여 균사체 배양용 배지를 제조하고,
   상기 노루궁뎅이버섯용 고체배지에 노루궁뎅이버섯 종균을 접종한 후 뚜껑을 덮고 20~30℃의 항온실로 옮겨 20~40일간 배양하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 면역활성 및 항암효과가 향상된 노루궁뎅이버섯 균사체 제조방법.
3. 참나무톱밥 : 가시오가피톱밥 : 미강의 비를 중량비율로 50~70:10~30:10~30으로 혼합한 후, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강 혼합물 100 g에 대하여 pH를 5~6으로 조절한 물을 50~80 g 가하여 골고루 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-pH5~6으로 조절된 물의 혼합물을 밀봉하여 4℃의 저온실에서 12-48시간 경과시켜 노루궁뎅이버섯용 고체배지를 제조하고,
   상기 배지에 노루궁뎅이버섯 종균을 접종한 후 뚜껑을 덮고 20~30℃의 항온실로 옮겨 20~40일간 배양하여 노루궁뎅이버섯 균사체를 배양하고,
   상기 배양한 노루궁뎅이버섯 균사체가 배양된 병 배지를 15~18℃, 상대습도 80~100%의 재배실로 옮겨 10~20일간 재배하여 자실체를 수확하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 면역활성 및 항암효과가 향상된 노루궁뎅이버섯 자실체 제조방법.
4. 참나무톱밥 : 가시오가피톱밥 : 미강의 비를 중량비율로 50~70:10~30:10~30으로 혼합한 후, 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강 혼합물 100g에 대하여 법제유황분말을 50~100 mg 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-유황 혼합물 100 g에 대하여 탄산칼슘으로 pH를 5~6으로 조절한 물을 50~80 g 가하여 골고루 혼합하고, 상기 참나무톱밥-가시오가피톱밥-미강-유황- pH5~6으로 조절된 물의 혼합물을 밀봉하여 4℃의 저온실에서 12-48시간 경과시킨 후 입병하고 살균하여 균사체 배양용 배지를 제조하고,
   상기 배지에 노루궁뎅이버섯 종균을 접종한 후 뚜껑을 덮고 20~30℃의 항온실로 옮겨 20~40일간 배양하여 노루궁뎅이버섯 균사체를 배양하고,
   상기 배양한 노루궁뎅이버섯 균사체가 배양된 병 배지를 15~18℃, 상대습도 80~100%의 재배실로 옮겨 10~20일간 재배하여 자실체를 수확하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 면역활성 및 항암효과가 향상된 노루궁뎅이버섯 자실체 제조방법.
5. 청구항 1 또는 2의 방법으로 제조된 균사체를 배지를 포함하여 건조한 건조 배지 포함 균사체 0.5-5g에 물 또는 70% 에탄올 100 mL를 가한 후 30분간 가열 추출하여 얻은 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 면역활성 및 항암효과가 향상된 노루 궁뎅이 버섯 추출물.
6. 청구항 3 또는 4의 방법으로 제조한 후 건조하여 얻은 자실체 0.5-5g에 물 또는 70% 에탄올 100 mL를 가한 후 30분간 가열 추출하여 얻은 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 면역활성 및 항암효과가 향상된 노루 궁뎅이 버섯 추출물.
   

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