KR101057504B1 - 바실러스 속 미생물을 함유하는 쌀겨발효용 조성물 - Google Patents

바실러스 속 미생물을 함유하는 쌀겨발효용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 쌀겨를 이용한 찜질, 온욕 등에 사용되는 쌀겨 발효용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 쌀겨에서 분리된 Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주와 쌀겨를 함유하는 쌀겨 발효용 조성물 및 상기 균주와 톱밥, 쑥, 허브, 녹차 및 버섯으로 구성된 군에서 선택되는 재료 및 쌀겨를 함유하는 쌀겨 발효용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 쌀겨 발효용 조성물은 입욕제, 온욕 찜질제, 화장료 등으로 사용 시 쌀겨의 발효열, 미생물의 생산 산물 등에 의하여 노폐물 제거, 미백, 피로회복, 혈액순환 및 진정 효과 등으로 미용분야에서 기술적 이용이 가능하다.

Description

바실러스 속 미생물을 함유하는 쌀겨발효용 조성물 {Composition for Fermentating Rice-Bran Containing Bacillus sp.}
본 발명은 쌀겨를 이용한 찜질, 온욕 등에 사용되는 쌀겨 발효용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 쌀겨에서 분리된 Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주와 쌀겨를 함유하는 쌀겨 발효용 조성물 및 상기 균주와 톱밥, 쑥, 허브, 녹차 및 버섯으로 구성된 군에서 선택되는 재료 및 쌀겨를 함유하는 쌀겨 발효용 조성물에 관한 것이다.
웰빙(well-being)의 사전적 의미는 육체와 정신의 조화를 통해 행복하고 안락한 삶을 지향하는 삶의 유형 또는 문화현상으로,"복지, 안녕, 행복"을 뜻하고 우리말로는 "참살이"라고 번역되어 사용되기도 한다. 육체와 정신의 건강하고 조화로운 결합을 추구하는 새로운 삶의 방식으로 하나의 문화 현상으로 나타난다. 주로 환경 친화적이고 생태학적인 것을 취하는 경향이 있다. 최근 웰빙 열풍은 건강에 대한 관심을 많이 불러들이게 되었고, 이는 산업 전반에 걸쳐 붐(boom)을 일으키고 있다.
건강과 피부 미용 등에 대한 관심으로, 자연재료를 이용한 찜질이나 팩 등이 관심을 끌고 있으며, 피부미용이나, 다이어트 아토피 등에 효과가 좋은 효소온욕이 각광을 받고 있다.
효소온욕은 쌀겨 또는 톱밥에 수분을 자연 발효시킬 때 발생하는 열을 이용한 온욕으로, 자연발효열이 65℃ 이상 올라가면서, 원적외선도 방사하게 되며, 이들 발효열과 원적외선이 결합하여 몸 속 깊숙이 있는 세포를 자극하여 몸 안의 독소 및 발암물질, 중금속, 체지방 등 불순물을 땀으로 배출하는 효과가 있다고 알려져 있다.
쌀겨 온욕에 사용되는 쌀겨는 다른 말로, 미강(米糠)이 라고도 하며, 현미(玄米)를 도정(搗精)하여 정백미(精白米)를 만들 때 생기는 과피(果皮)·종피(種皮)·호분층(糊粉層) 등의 분쇄혼합물로, 현미에서 6∼8%의 쌀겨가 생기는데 현미의 도정도(搗精度)를 높이면 그 양이 증가하고, 또 도정도에 따라서 그 성분도 달라진다. 쌀겨에는 쌀눈과 비타민 A를 비롯한 비타민 B1, B6, 철분, 인, 미네랄 등 다양한 영양소들이 함유되어 있고, 쌀겨의 표준적인 화학조성을 보면 수분 13.5%, 단백질 13.2%, 지방 18.3%, 당질 38.3%, 섬유 7.8%, 회분(灰分) 8.9%이다. 비타민 B1은 100g 중 2.5mg 이나 들어 있으며, 비타민 E도 다량 함유되어 있기 때문에 미용 분야에서의 활용도가 높다.
종래에는 정미소에서 폐기되거나 벼를 도정한 후에 부산물로써 얻어지는 쌀겨를 활용하고 가공하여 쌀겨에 열처리와 분말화가 가능하도록 첨가소재를 혼합하고 분쇄가공을 통해 미세하고 분말화하여, 쌀겨가 가진 좋은 특성을 그대로 살려 식용, 세정, 미용 등의 목적으로 사용해 왔다(대한민국 공개특허 제10-2006-0040326호).
또한, 쌀겨로부터 추출한 광합성 세균, 유산균, 방선균, 사상균, 효모균 등의 미생물을 복합해 배양한 미생물제제를 활용하여 축산환경개선, 농 어업의 생산성 향상에 사용한 보고가 있으며(대한민국 등록특허 제10-0656980호), 피부미용 등에 이용되고 있는 쌀겨(rice flour/bran) 효소제는 미생물의 종류, 성질 및 상태에 따라 그 효과의 차이가 나는 것으로 판단되고 있다.
종래에는 쌀겨 본래에 존재하는 토착균에 의하여 발효가 일어나 그 열로 찜질을 하는 방법이 사용돼 왔으나, 존재하는 세균의 종류에 따라 발효 효율에 차이가 있고, 잡균의 오염에 의하여 부패가 일어나는 등 쌀겨를 제품화하는데 어려움이 있었다.
이에, 본 발명자들은 쌀겨발효에 관여하는 우점균을 분리하고, 상기 균주를 첨가하여 매질을 발효시킨 쌀겨온욕시 효소온욕조 내에서 온도가 상승하여, 종래의 쌀겨 온욕보다 뛰어난 온욕 효과를 얻을 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 쌀겨 효소제의 발효 효율을 높이고, 쌀겨 효소제의 품질을 향상시키기 위하여, Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주 및 쌀겨를 함유하는 쌀겨 발효용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 쌀겨온욕용 조성물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 쌀겨온욕용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주 및 쌀겨를 함유하는 쌀겨 발효용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 욕조에 쌀겨, 물 및 배양된 Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주를 넣고, 쌀겨온도를 상승시키는 단계: 및 (b) 상기 온도가 상승된 욕조에 포도당, 건조 효모 및 미가피를 첨가하고, 온도를 60~70℃로 유지시키는 단계를 포함하는 쌀겨온욕용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주, 쌀겨, 물, 포도당, 건조 효모 및 미가피를 함유하는 쌀겨온욕용 조성물을 제공한다.
쌀겨 발효용 조성물은 입욕제, 온욕 찜질제, 화장료 등으로 사용 시 쌀겨의 발효열, 미생물의 생산 산물 등에 의하여 노폐물 제거, 미백, 피로회복, 혈액순환 및 진정 효과 등으로 미용분야에서 효과가 있는 것으로 알려져 있는데, 본 발명은 Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주와 다양한 쌀겨온욕 조성물을 이용한 온욕방법으로 효소온욕조를 균일한 온도를 안정적으로 유지할 수 있는 기술의 구현으로 제품화가 가능하며, 높은 온도 장시간 유지시킬 수 있어 쌀겨온욕 시의 노폐물 제거, 미백, 피로회복, 혈액순환 및 진정 효과를 향상시키는 효과를 기대할 수 있다. 또한 쌀겨에 허브, 버섯 등의 다양한 재료를 첨가함으로써 기존 효소온욕의 효과를 매개로 하여 새로운 시너지효과를 창출할 수도 있다.
도 1은 MRS 배지에서의 미생물 균 성장 패턴 비교를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 광학현미경 상에서 미생물의 형태를 비교한 것이다.
도 3은 본 발명에서 분리된 균주의 분류도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에서 분리된 균주를 이용한 플라스크 배양시의 발효온도변화를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에서 분리된 균주를 이용한 쌀겨 효소온욕방법을 나타낸 사진이다.
본 발명은 일 관점에서, Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주 및 쌀겨를 함유하는 쌀겨 발효용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 쌀겨 온욕시의 욕조 온도는 40~70℃인 것을 특징할 수 있으며, Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주는 1.0 x 106 cells/ml~1.0 x 108 cell/ml 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 균주의 배양기간은 2일에서 2개월이 소요되고 미강인 쌀겨가 미생물의 증식을 위한 영양분으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 쌀겨 발효용 조성물은 톱밥, 쑥, 허브, 녹차 및 버섯으로 구성된 군에서 선택되는 재료를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 톱밥은 발효 조성물의 온도를 높여주는 효과가 있으며, 쑥, 허브, 녹차 및 버섯은 재료들을 훈증 시에 나타나는 특유의 약재학적 효능을 쌀겨온욕 시에도 얻을 수 있는 효과가 있으며, 상기 재료들을 혼합함으로, 발효열이 빨리 올라가 발효 및 배양기간을 단축시키며, 발효기간이 경과하여 추가로 새로운 쌀겨량을 줄여서 공급해도 일정한 온도를 유지할 수 있는 역할을 한다.
본 발명에서 사용되는 쑥은 일반쑥과 약쑥을 모두 사용할 수 있으며, 쑥은 피로회복, 생리불순, 신경통, 류마티스, 빈혈, 만성간염 위장병 등에 효과가 있으며 성인병 예방에도 좋아 오래전부터 민간에서 널리 이용되어 오고 있으며, 특히 좌훈 등의 방법으로 각종 부인병과 산후하열, 자궁출혈 등의 치료에도 사용되고 있어, 쌀겨 온욕시에 혼합하여 사용할 경우, 쑥이 가지는 약리효과를 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 허브는 고유의 향기를 가지고, 이 향기성분이 약리효과를 나타내는 풀로서, 라벤더, 로즈마리, 유칼립투스, 일랑일랑, 티트리, 페퍼민트 등이 있으며, 허브는 그 종류에 따라, 두통, 스트레스 불안 불면 완화, 면역기능 강화, 항박테리아, 항바이러스 효능, 진총, 소염, 상처치유, 집중력향상, 기억력증진, 모발성장 촉진, 탈모방지, 거담, 혈압조절, 소화촉진, 해열 등의 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 녹차는 녹차잎이나, 녹차잎을 우린 찻물을 모두 사용할 수 있으며, 항산화, 항암, 염증억제, 세균감염억제, 중금속과 니코틴의 해독작용, 피로회복, 숙취제거, 피부미용 등의 효과를 가진 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 버섯은 상황버섯, 차가버섯, 동충하초, 새송이, 영지버섯 등을 사용할 수 있으며, 요통 손발마비, 항종양 및 항바이러스, 저혈압 및 알레르기 반응억제 효과 등을 기대할 수 있다.
본 발명의 쌀겨 발효용 조성물은 조성물 100중량부에 대하여, 쌀겨 20~50중량부, 톱밥 50~80중량부, 쑥 50~80중량부, 허브 50~80중량부, 녹차 40~80중량부, 버섯 40~80중량부로 함유될 수 있다. 이때 쌀겨 발효용 조성물은 반드시 필요하고 나머지 매질은 개별로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 쌀겨 발효용 조성물이 포함된 혼합조성물이 배양되어 사용할 때에는 온도유지와 관리를 위해서 반드시 쌀겨를 미생물 먹이로 공급하여야 한다.
본 발명에서는 쌀겨 효소 제품으로부터 집식배양으로 10 균주의 우점균을 분리하고, 상기 분리된 균주들의 성장 패턴을 비교하고, 현미경 상에서 형태변화를 비교한 결과, 미생물은 간균 형태를 취하며 10 균주의 미생물의 모양은 유사하였다. 상기 균주들을 동정하고자 rRNA시퀀싱을 수행한 결과, 분리된 10개 균주 모두 Bacillus coagulans로 판명되었다.
이들 균주 중 2 균주를 선별하였으며, 상기 선별된 균주를 멸균된 쌀겨에 접종하는 경우, 일반 쌀겨 온욕과 달리 2일째부터 온도가 상승하여 발효 5일째에 51℃를 유지하였다. 한편, 균주를 접종하지 않는 쌀겨의 경우는 온도 상승하는데 걸리는 시간이 열흘 이상으로 오래 걸리며, 최고 상승은 온도 또한 낮았다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 욕조에 쌀겨, 물 및 배양된 Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주를 넣고, 쌀겨온도를 상승시키는 단계: 및 (b) 상기 온도가 상승된 욕조에 포도당, 건조 효모 및 미가피(쌀겨 껍질)를 첨가하고, 온도를 60~70℃로 유지시키는 단계를 포함하는 쌀겨온욕용 조성물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 쌀겨온욕용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 사용되는 쌀겨는 멸균 또는 살균처리된 것임을 특징으로 할 수 있고, 상기 (a) 단계에 톱밥, 쑥, 허브, 녹차 및 버섯으로 구성된 군에서 선택되는 재료를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주는 1.0 x 105 cells/ml~1.0 x 109 cell/ml 농도로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 쌀겨온욕(발효찜질)용 조성물의 온도는 55~65℃ 정도면 상당히 높은 편이다. 그러나 몸을 묻고 찜질할 때 실제 피부에 닿는 체감온도는 40℃ ~ 43℃ 정도이다. 찜질 원재료인 쌀겨에 수분이 약 20-30% 정도 되도록 습도를 조절하여 건식에 가까운 환경을 만들었기 때문이다. 일반적으로 건식 사우나의 실내 온도는 100℃가 넘어도 견딜 수 있지만, 습식 사우나의 경우 70℃ 정도만 되도 견디기 어렵다. 물로 된 탕은 50℃만 넘으면 뜨거워서 사람이 들어가지 못한다. 찜질은 쌀겨 속에 공기층 이 형성되어 실제 인체가 가장 안온하게 느끼는 38~43℃로 찜질할 수 있다. 이 상태에서 개인의 몸 상태에 따라 15-25분 가량 편안하게 찜질하면 된다.
본 발명의 쌀겨온욕의 효능으로는 첫째로, 해독(detox)작용이 있으며, 미생물이 발효되면서 만들어지는 발효열과 원적외선에너지 및 효소의 작용으로 체내 독소 및 노폐물을 배출하는 천연의 디톡스 요법이다. 15분간의 효소온욕 입효의 혈류작용에 의한 운동효과는 2시간 이상의 유산소운동을 한 효과를 얻을 수 있다. 모세혈관 및 말단 조직의 독소를 배출하고 깨끗한 자연 상태가 되어 혈액순환을 돕고 조직과 장기는 자기의 기능을 회복하여 대사활동을 원활히 할 수 있으며,
둘째, 원적외선 및 발효열에 의한 신체 온도자극이다. 체내 장부는 각각 기능이 다르고 원하는 온도가 다르다. 예를 들어 가장 낮은 장부는 신장, 방광이고 가장 높은 온도를 요구하는 것이 눈에 보이지 않는 심포, 삼초이다. 이러한 장부의 온도조건이 다르지만 전반적으로 온도가 올라갈 때 생명력이 증가한다. 왜냐하면 심포, 삼초가 생명력을 주관하기 때문이다. 우리의 인체 체온이 36.5℃ 이고 암세포는 온도가 39.5℃ 이상일 때 손상이 가해진다는 설이 있다. 어쨌든 효소온욕은 미생물의 생체에너지 작용으로 인체의 생명온도를 상승시킨다. 맥박수와 땀 배출량을 통해 확인할 수 있다. 발열된 효소가 방출하는 원적외선은 인체에 깊숙이 침투하고 1분에 약 2,000번 세포를 자극하여 에너지를 전달하며, 조직과 효소의 활성을 촉진한다. 특히 발효 쌀겨에 발생한 고온은 인체에서 일반 열기욕에 비해서 높은 체온이 발산하였고, 건강개선에 반응이 높다.
셋째, 체표 장기 반사구 자극효과이다. 옛날 궁중에는 건강하고 아름다운 피부를 위해 쌀뜨물을 이용한다. 효소온욕은 강력한 각질제거 작용과 미백작용을 하며 각종 영양분과 보습성분을 함유하여 매끄럽고 건강한 피부를 가꾸는데 탁월한 효과를 보인다. 손발에는 신체의 오장과 육부에 해당하는 반사구가 있다. 마찬가지로 피부도 우리 몸 모든 부위와 연결되어 상호작용을 하는데 이를 체표장기 반사구라고 한다. 건강이 나쁘면 피부가 거칠고 탁하며, 탄력이 없다는 것을 잘 알고 있다. 반대로 피부가 건강하지 않으면 장기 등 신체의 건강 위협하게 된다. 따라서 피부가 건강하면 우리 몸도 건강하게 된다.
넷째, 대사효소의 활성조건 제고로, 미생물에 의한 매질을 발효시키는 과정에서 매질 내 존재하는 미생물과 효소 그리고 공기 속에 떠다니는 세균과 효소는 대부분 온도가 상승하면서 사멸하고 고온 내열성 미생물만이 존속하여 증식하게 되는데 55℃ 이상의 온도에서는 바실러스 코아굴런스만 남아있고 그 대사물질인 효소만이 존재한다. 이러한 고온 내열성 미생물은 원적외선 에너지의 작용으로 우리 몸의 대사작용을 촉진하는 대사효소의 활성을 증가시켜 상화에 해당하는 생명력을 강화시켜 장부 간의 균형을 통한 생체항상성을 증가시킨다. 즉 대사효소의 활성조건을 맞추어 면역력과 자연치유력을 제고시키는 것이다.
다섯째, 활성세포의 자율반응 회복이다. 우리 몸을 구성하는 세포는 미토콘드리아를 통해 미세전류를 발생시키고 건강한 상태에서는 스스로 자율반응을 하게 된다. 그러나 몸이 차가워지고 굳어져서 막히면 병이 들면 세포의 자율반응이 둔해지고 심지어 통증을 못 느낄 수 있다. 이러한 세포의 자율반응을 회복하기 위해서는 대사효소의 활성을 통해 세포의 자율반응이 회복되면 감각이 살아나고 느끼지 못했던 통증을 느끼게 되고 해독과정에 막혔던 어혈들이 풀려서 피부에 소간증을 발생시키거나 두드러기가 나타나기도 한다. 이러한 현상은 모두 세포의 자율반응이 회복되고 있다는 증거이며 감각이 살아나는 과정으로 이를 명현현상으로 일명하기도 한다
본 발명에서, "우점균" 이란 생물군집에서 그 군집의 성격을 결정하고 군집을 대표하는 환경조건에 잘 적응하고 생산량 및 현존량이 최대인 균을 뜻하며, 본 발명에서는 부패가 진행되지 않고 발효가 잘 이루어진 쌀겨의 우점균을 분리하고, 이를 이용하여, 쌀겨 온욕을 위한 발효용 조성물을 제조하였다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법으로 제조되고, Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주, 쌀겨, 물, 포도당, 건조 효모 및 미가피를 함유하는 쌀겨온욕용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, "집식배양" 이란 특정 미생물 집단을 선택적으로 증식시키는 배양 방법으로 배지 조성과 온도 등의 환경조건을 이용해 원하는 균을 선별적으로 배양하는 것을 뜻한다.
본 발명에서는, 균의 형태를 관찰하기 위해 플레이트에서 가급적 여러 콜로니에 대한 집식배양으로 형태관찰을 수행하였고, 형태의 정밀관찰은 위상차현미경에 의하여 촬영하였다.
본 발명에서는, 분리된 균주의 16S rDNA는 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle sequencing Ready Reaction Kit(Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 시퀀싱하였다. 정제된 혼합물은 automatic DNA sequence (Biosystems, model 310)에 의하여 자동으로 전기영동 하였고, 16S rRNA 유전자 시퀀스는 CLUSTAL W software에 의하여 분석을 하였다. 상기 분석결과는 근린결합법으로 분류도를 만들었다.
본 발명의 쌀겨 발효용 혼합물은 균체와 쌀겨를 함유하고, 발효가 진행되지 않는 조성물과 초기 발효에서 발효가 정지된 조성물을 포함한다.
본 발명에 따른 쌀겨 온욕용 조성물은 마우스를 이용한 동물실험 결과, 독성을 나타내지 않아, 인체에 사용하는데 안정성을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 원적외선 방사율을 한국건설생활환경 시험연구원에 의뢰하여 수행한 실험(KICM-FIR-1005:2006))에서, 발효되지 않은 쌀겨와 발효가 진행된 쌀겨의 원적외선 방사율을 비교한 결과, 동일한 온도일 경우 발효가 진행된 쌀겨에서 더 높은 원적외선을 방사하는 것을 확인하였다.
또한, 발효되지 않은 쌀겨와 발효된 쌀겨(사람이 찜질에 사용한)에서의 중금속 함량을 측정한 결과, 수은, 카드뮴, 알루미늄 등은 두 종류 쌀겨에서 모두 검출되지 않았으며, 비소(발효안된 쌀겨:0.35mg/L, 발효된 쌀겨: 0.6mg/L)와 납(발효안된 쌀겨:0.05mg/L, 발효된 쌀겨: 0.10mg/L)의 경우는 소량이 검출되었으나, 허용가능범위 내이었으며, 사용에 따른 증가폭도 크지 않아, 중금속에 대하여도 안정한 것으로 확인되었다.
실시예
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 미생물 분리 및 균 배양
쌀겨로부터 우점균을 분리하기 위하여, 쌀겨 효소제품(B&F Enzyme House, 한국)과 일본 쌀겨 효소제품(재래방식으로 유지 관리되는 제품, 일본)을 이용한 한계희석법에 의해 콜로니를 분리하였다. MRS(Man, Rogosa and Sharpe)배지, PDA(Potato Dextrose Agar) 배지, PCA(Plate Count Agar) 배지를 사용하여 균의 분리를 수행 후 균의 성장 패턴을 살펴보았다. 균은 50℃-60℃의 배지에서 호기적으로 배양하였고, DNA 추출을 위한 균체는 액체 배지를 이용하여 50℃의 진탕기에서 150rpm의 속도로 진탕 시켜 배양하였다. 샘플은 희석의 배수를 10-1 ~10-10으로 설정하여 순차적으로 희석한 후 50℃에서 24 시간 배양하였고, 배양된 배지에서 생성된 콜로니의 수를 카운팅하여, 희석 배율에 따라 콜로니 수를 보정해 실제 어느 정도 수의 미생물이 있는지를 알아보았다.
각각의 MRS 배지, PDA 배지 및 PCA 배지에서 배양된 콜로니 수를 카운팅한 결과, 특히 MRS 배지에서 다수의 미생물이 분리하였다. B&F Enzyme House 제품의 균수는 약 4.0 x 106 cells/ml 인 반면 일본의 재래식 쌀겨제품의 균수는 5.0 X 105 cell/ml로, B&F Enzyme House의 쌀겨제품이 포함된 균수가 많다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2 : 분리 균의 형태 관찰
균의 형태를 관찰하기 위해 플레이트에서 가급적 여러 콜로니에 대한 집식배양으로 형태를 관찰하여, 유사한 형태를 보이는 우점종 10균주를 선택하였다. 균주형태의 정밀관찰을 전자현미경을 이용하여 촬영하고자 하였으나 형태적인 차이점이 발견되지 않아, 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 쌀겨 효소에서 분리된 우점균의 콜로니 형태는 둥근 모양이고 연쇄적으로 연결되어 있는 고초균과 형태학적으로 유사하게 관찰되었다. (도 2)
실시예 3 : DNA 분리 및 16S rRNA 시퀀싱
실시예 2에서 선택된 균주는 Tanaka 등(Tanaka, T. et al., FEMS Microbiol. Lett.,25: 125,1984)의 방법에 의해 염색체 DNA를 추출하였고, 16S rRNA는 2개의 일반 프라이머에 의하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여, 그의 중합효소 연쇄반응 생산물을 QIAquick PCR purification kit(Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 정제하였다.
정제된 16S rDNA는 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle sequencing Ready Reaction Kit(Biosystems, Foster City, CA)에 의하여 시퀀싱하였다.
정제된 혼합물은 automatic DNA sequence(Biosystems, model 310)에 의하여 자동으로 전기영동 하였고, 16S rRNA 유전자 시퀀스는 CLUSTAL W software에 의하여 분석을 하였다. 상기 10 균주 중 2균주의 rRNA서열은 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타내었으며, 각각 Bacillus sp. EH-1 및 Bacillus sp. EH-2 로 명명하였다.
상기 분석결과는 근린결합법으로 분류도를 만들었으며, 상호안정성은 SEQBOOT, DNADIST, NEIGHBOR 및 CONSENSE of the PHYLIP package 등에 의하여 수행하였다.
그 결과, 상기의 분리된 균주는 Bacillus균주로서, EH-1과 EH-2는 상호 93%의 상동성을 지니고 있으며 이들은 각각 B. coagulans와 100%의 상동성을 가지는 것으로 나타났으며, 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 각각 기탁번호 KCTC 11535BP 및 KCTC 11536BP으로 기탁하였다.
실시예 4 : 분리된 균주를 이용한 플라스크 배양
실시예 1에서 분리한 Bacillus sp. EH-1 균주에 의한 플라스크 내에서의 고체배양에서의 온도 변화를 관찰하였다. 고체배양의 배지로는 1000 ml용 플라스크에 쌀겨 100g을 넣고 이를 121℃에서 20분간 고압멸균하고, 37℃ 항온기에 하룻밤 정치하였다가 클린벤치에서 멸균수 10ml을 스프레이로 살포하고 분리한 Bacillus sp. EH-1 균주를 쌀겨 1g 당 약 1.0 x 106 cells로 접종하고 균주를 접종하지 않은 대조구로 하여 5일간 30℃ 배양기에서 고체발효하면서 온도변화를 관찰하였다.
그 결과, 분리된 균주를 접종한 경우에는 고체발효 2일째부터 온도가 서서히 상승하여 발효 3일째에 온도가 38.3도, 5일째에 51℃를 유지하는 것으로 나타났다. 그 반면, 균주를 접종하지 않은 대조구에서는 발효 3일째에 온도가 30도, 5일째에 30.5도를 유지하였는데, 이는 고온멸균으로 인하여 균주를 접종하지 않은 대조구에서는 미생물이나 기타 타 균주에 의한 생육이 없음을 시사하고 있다. 이에 반하여 분리한 Bacillus sp. EH-1 균주를 접종한 구에서는 미생물 상호의 생육에 의하여 온도가 급격히 상승된 것으로 추정된다. 한편 멸균하지 않은 쌀겨를 플라스크에 넣고 발효를 할 경우,의 온도상승은 최고 42℃ 정도였으며, 이 경우에는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis 등 타 미생물 및 Bacillus가 아닌 여타의 미생물군도 검출되므로 이는 실시예 5에서 응용가능한 미생물군으로는 부적절하다고 판단된다.
실시예 5 : 분리된 균주를 이용한 쌀겨효소온욕
실시예 1에서 분리한 Bacillus sp. EH-1 및 Bacillus sp. EH-2 균주를 이용하고 실시예 4에서 플라스크 고체배양에서의 실험결과를 토대로 실제 효소온욕조 내에서의 온도상승의 최적 조건을 설정하고 이로 인한 효소온욕의 가능 여부를 확인하였다.
(1) 효소온욕조의 가동
효소온욕 실험은 2 m(가로) x 1.5m(세로) x 1 m(높이) 크기의 나무욕조에 쌀겨 400kg 및 물 40 L를 넣고, Bacillus sp. EH-1 및 Bacillus sp. EH-2 균주를 쌀겨 1g 당 약 1.0 x 106 cells 농도로 첨가하고, 3-4일 동안 매일 6-7회 교반하였으며, 온도가 약 48℃ 에 다다랐을 때, 포도당 2.5%, 건조 효모 0.1%, 미가피(쌀겨 껍질) 1.25%를 첨가시켜 다시 매일 6~7회 교반을 실시하여 온도가 60-70℃로 유지되는 것을 확인하였다.
(2) 효소온욕조의 온도변화
상기와 같은 조건의 효소온욕 욕조 5개를 가동하여, 효소온욕조의 평균 온도를 측정한 결과, 오전 9시에 측정한 각 욕조의 최저온도는 64℃, 최고온도는 68℃ 이었다. 각 욕조에는 효소온욕을 적게는 0회, 많게는 5회를 실시할 경우, 오후 6시경의 욕조의 온도는 최저 55℃, 최고 64℃이었다. 온욕 중 온도가 60℃ 이하로 강하 시 당분이나 물을 1/10 수준으로 투입하고 교반을 하여 정치 시 온도가 다시 60-70℃ 사이로 회복됨을 확인할 수 있었다.
(3) 효소온욕실의 실내와 효소온욕 욕조의 온도 및 습도변화
효소온욕실의 실내의 온도와 습도는 효소욕조 내의 온도 유지를 위하여 매우 중요한 요인이다. 30일간 각 온욕실의 실내온도와 습도를 측정한 결과는 다음과 같다. 각 5개의 온욕실의 실내 온도는 1번에서 5번까지 각각 31.21±1.322℃, 25.08±0.095℃, 30.10±1.665℃, 25.09±0.096℃ 및 25.02±0.068℃이었다. 또한 습도는 각각 43.29±8.485%, 42.58±4.822%, 48.70±4.858%, 48.83±4.949% 및 38.70±4.481%이었다.
이상의 결과로부터 효소온욕실의 실내 온도는 약 25-31도 정도이며, 습도는 약 38-48% 전후가 적당함을 알 수 있었다.
이러한 효소온욕실의 실내온도를 유지시킴으로서 욕조내의 온도는 항상 60-70℃를 유지하는데 많은 기여를 할 수 있는데, 효소온욕실의 실내와 동일하게 온도와 습도를 확인하여 본 결과는 다음과 같다. 먼저 전일 20시에 교반한 효소온욕실의 욕조내부의 온도는 익일 오전 9시에 온도를 측정한 결과는 다음과 같다. 오전 9시에 온도는 각각 65.86±1.268℃, 66.83±0.848℃, 66.45±0.632℃, 67.04±0.576℃, 66.70±0.702℃이었고, 오후 8시(20시)에 온도는 각각 59.31±2.989℃, 60.64±3.176℃, 59.93±1.804℃, 60.54±2.728℃, 60.54±1.732℃이었으므로 약 6-7도가 상승하는 것을 알 수 있었다. 이상의 효소온욕의 욕조는 경우에 따라서는 매일 쌀겨의 1/10 정도를 새로운 쌀겨로 교체가 가능하며, 1개월이 경과시 전량 새로운 쌀겨로 교체하여 청결하게 유지하며, 당분과 물을 공급해 주는 과정을 반복하여 욕조의 온도를 60~70℃로 유지시킬 수 있었으며 이 과정 중에 다른 여타의 미생물은 검출되지 않았다 (도 5).
실시예 6: 약리물질을 첨가한 쌀겨온욕조성물을 이용한 온욕
실시예 5와 동일한 조건에서 쌀겨에 톱밥과 쑥, 허브, 녹차 및 버섯을 첨가하여 효소온욕의 가능 여부를 확인하였다.
(1) 효소온욕조의 가동
효소온욕 실험은 2 m(가로) x 1.5m(세로) x 1 m(높이) 크기의 나무욕조에 쌀겨 200kg, 톱밥 100kg, 쑥 50g, 허브(로즈마리) 20g, 녹차 20g, 상황버섯 10g에 물 40 L를 넣고, Bacillus sp. EH-1 및 Bacillus sp. EH-2 균주를 쌀겨 1g 당 약 1.0 x 106 cells 농도로 첨가하고, 3-4일 동안 매일 6-7회 교반하였으며, 온도가 약 48℃ 에 다다랐을 때, 포도당 2.5%, 건조 효모 0.1%, 미가피(쌀겨 껍질) 1.25%를 첨가시켜 다시 매일 6~7회 교반을 실시하여 온도가 60-70℃로 유지되는 것을 확인하였다.
(2) 효소온욕조의 온도변화
상기와 같은 조건의 효소온욕 욕조 5개를 가동하여, 효소온욕조의 평균 온도를 측정한 결과, 발효 시작 후 2일 만에 65℃로 증가하였으며, 쌀겨를 단독으로 사용하였을 때 50일만에 65℃의 온도를 나타내는 것보다, 빠른 시간에 높은 온도에 도달하였으며, 온도가 지속되는 확인할 수 있었다.
실시예 7: 동물실험을 통한 안정성 평가
본 발명의 쌀겨온욕용 조성물의 안정성을 확인하기 위하여, 마우스를 사용하여, 투여에 따른 체중변화, 사료섭취량 변화 및 GOT, GPT를 확인하였다.
실시예 5의 방법으로 발표된 쌀겨에 증류수 10배를 가하여 환류냉각기가 장착된 수욕상에서 80℃로 1시간 30분간 추출한 것을 2회 반복하고 여과하여 80℃에서 농축 후 동결?건조한 분말을 시료로 사용하여 일정 농도로 다시 재용해시켜 동물실험에 사용하였다.
체중 80∼90 g인 SD계 흰쥐를 70마리 구입하여 7일간 적응시킨 후 육안적으로 일반증상을 관찰하여 건강한 동물 암?수 각 30마리를 실험에 사용하였으며, 사육조건은 온도 22±2℃, 상대습도 55±5%, 명암시간 12시간 주기로 하고, 사료는 실험동물용 고형사료를 제한 없이 공급하였다. 실험물질에 대한 예비실험결과 20,000mg/kg 용량에서도 독성이 아주 미약한 것으로 나타나 본 실험에 있어서 50,000mg/kg을 최고 용량으로 하고 실험의 투여량을 10,000mg/kg과 30,000mg/kg으로 설정하였다.시료의 투여는 하룻밤 절식시킨 흰쥐에게 경구투여용 바늘을 이용하여 1회 강제 경구투여 시켰다. 투여 용량은 투여 당일 측정된 체중을 기준으로 산출하였다.
투여당일은 투여 후 1시간에서 12시간 까지는 매시간 관찰하였고, 투여 다음날부터 14일 까지는 매일 1회 이상씩 일반증상의 변화와 중독증상 및 사망동물의 유무를 관찰하였다.
투여개시전과 투여 후 매일 체중을 측정하였으며, 최종 체중은 실험 개시전의 체중을 감하여 실험기간 중의 체중 증가량으로 나타내었다.사료 섭취량은 매일 일정한 시각에 측정한 후 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다.
GOT(glutamic oxalacetic transaminase) 및 GPT(glutamic pyruvic transaminase)의 활성도 측정은 Reitman-Frankel법에 의한 assay kit(아산제약, 한국)를 이용하여 측정하였고, 활성도 단위는 IU/L serum로 표시하였다
시료를 물에 희석하여 SD계 흰쥐에게 0%, 1%, 3%, 5%의 용량으로 14일간 독성실험을 한 결과, 실험에 이용된 암?수컷 모두 실험기간을 통하여 사망하지 않았고 최고 투여 용량인 5%에서도 사망예가 관찰되지 않아 LD50 값의 산정은 불가능하였으며, LD50 값은 암?수컷 모두 5% 이상인 것으로 생각된다. 실험에 이용된 SD계 흰쥐에게 시료를 농도별로 각각 0, 1, 3, 5% 투여한 후, 14일간 임상 증상 관찰한 결과, 모두 운동 상태와 외관변화 및 그 외의 외부적으로 천연 한방소재 복합물에 의한 것으로 여겨지는 어떤 것도 특별한 소견이 관찰되지 않았다. 암?수컷 모두 큰 변화없이 잘 성장했으며, 5% 투여군에서 가장 낮은 체중변화를 나타내었고, 암?수컷 모두 1% 투여군에서 낮은 체중증가율을 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따른 쌀겨 발효용 조성물은 동물실험에서 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11585BP 20090724 한국생명공학연구원 KCTC11586BP 20090724
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Claims (8)

  1. Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주 1.0 x 105 cells/ml~1.0 x 109 cell/ml 및 쌀겨를 함유하는 쌀겨 발효용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 톱밥, 쑥, 허브, 녹차 및 버섯으로 구성된 군에서 선택되는 재료를 추가로 함유하는 쌀겨 발효용 조성물.
  4. 다음 단계를 포함하는 쌀겨온욕용 조성물의 제조방법:
    (a) 욕조에 쌀겨, 물 및 배양된 Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주를 넣고, 발효시켜 쌀겨온도를 상승시키는 단계: 및 (b) 상기 온도가 상승된 욕조에 포도당, 건조 효모 및 미가피를 첨가하고, 온도를 40~70℃로 유지시키는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 사용되는 쌀겨는 멸균 또는 살균처리된 것임을 특징으로 하는 쌀겨온욕용 조성물의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, (a) 단계에 톱밥, 쑥, 허브, 녹차 및 버섯으로 구성된 군에서 선택되는 재료를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 쌀겨온욕용 조성물의 제조방법.
  7. 제4항에 있어서, Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주는 쌀겨 1g당 1.0 x 105 cells ~ 1.0 x 109 cells 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 쌀겨온욕용 조성물의 제조방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고, Bacillus sp. EH-1 (기탁번호 KCTC 11535BP) 균주 또는 Bacillus sp. EH-2 (기탁번호 KCTC 11536BP) 균주, 쌀겨, 물, 포도당, 건조 효모 및 미가피를 함유하는 쌀겨온욕용 조성물.
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