KR101032249B1

KR101032249B1 - ＤｅｓＡ 피브린을 함유하는 악성종양 억제제

Info

Publication number: KR101032249B1
Application number: KR1020077001621A
Authority: KR
Inventors: 히로부미 센가; 카이시아 리; 용링 완; 리슈이 창
Original assignee: 토비시 파마슈티칼 컴패니 리미티드
Priority date: 2004-06-24
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2011-05-02
Anticipated expiration: 2025-06-24
Also published as: EP1762242A4; CN1972706B; RU2006145902A; JPWO2006001523A1; US8481047B2; US20090018062A1; EP1762242B1; AU2005257508A1; RU2358754C2; EP1762242A1; JP4716994B2; HK1105091A1; HK1100359A1; KR20070026846A; CA2566991A1; US20060088519A1; CN1972706A; WO2006001523A1

Abstract

Des A 피브린을 함유하는 것에 의해, 악성종양세포의 신전 및 유주를 억제하고, 악성종양을 억제할 수 있는 악성종양 억제제를 제공한다.

Description

ＤｅｓＡ 피브린을 함유하는 악성종양 억제제{Malignant Tumor-Inhibiting Preparation Comprising Des A Fibrin}

본 발명은 Des A 피브린(fibrin)을 함유하는 것을 특징으로 하는, 악성종양 억제제에 관한 것이다.

근년, 악성종양(malignant tumor) 치료는, 외과적 수술, 방사선 치료 혹은 화학요법에 의한 원발암(原發癌, primary carcinoma)의 제거의 성공율의 향상에 의해서, 착실하게 진보하고 있다. 그러나, 원발암의 제거가 완전하게 되어도 암의 전이에 의해 사망하는 경우가 적지 않다.

특히, 흑색종(melanoma), 폐암, 간암 및 췌장암 등의 악성도가 높은 악성종양은 조기발견이 어렵고, 악성종양이라고 진단된 시점에서는, 이미 원발암과 전이암이 동시에 존재하여, 수술치료를 받을 수 없는 케이스가 매우 많다. 이러한 악성종양에 대해서, 방사선 치료는 양호한 결과를 나타내지 않는다. 또한, 현재, 임상으로 사용되고 있는 아드리아마이신(adriamycin) 등의 화학요법제는, 그 대부분이 악성종양세포를 직접 공격하여 약효를 발휘하는 것이지만, 동시에 정상세포도 타겟으로 하므로, 부작용이 강하고, 임상상의 문제가 되어 있는 것이 현실이다. 따라서, 최근 수십년간, 획기적인 신약이 개발되지 않는 상황에 있다. 이러한 상 황을 타개하기 위해서, 새로운 타입의 악성종양용 의약품이 요구되고 있다.

이러한 상황하에서, 최근, 수많은 기초연구 및 임상연구에 의해 악성종양과 응고 선용계(blood coagulation and fibrinolysis system)와의 밀접한 관계가 시사되고 있다. 예를 들면, 악성종양환자에서는, 혈장 피브리노겐의 증가, 혈액점도의 증가 및 혈액 유동성(rheology)의 이상 등의 응고선용계의 이상에 의해 미소 순환장해를 일으키는 것이 알려져 있다. 또한, 혈장 피브리노겐의 증가 또는 악성종양세포가 스스로 피브리노겐을 분비하는 것에 의해, 악성종양조직의 세포외 매트릭스에 피브리노겐 또는 피브린의 침착이 발생하여, 이것이 세포외 매트릭스의 일원으로서 악성종양세포의 증식, 침윤 및 전이에 촉진적인 작용을 이루고 있는 것이 보고되어 있다{예를 들면, Cancer Research 60: 2033-2039(2000), Ann N Y Acad Sci 936: 406-425(2001) 및 Blood 96: 3302-3309(2000)를 참조}.

상술의 악성종양과 응고선용계와의 관계에 주목하여, 인비트로(in vitro)에 있어서 악성종양세포를 피브린으로 처리하면, 악성종양세포의 폐장에의 실험적 전이성이 증강되는 것이 확인되고 있다{예를 들면, Clin Exp Metastasis 17: 723-730(1999)을 참조}. 피브린(Des AB 피브린 또는 피브린 Ⅱ라고도 한다)은, 트롬빈이 피브리노겐에 작용하고, 피브리노겐으로부터 피브리노펩티드 A(fibrinopeptide A, 이하 FPA라고 한다) 및 피브리노펩티드 B(fibrinopeptide B,이하 FPB라고 한다)를 유리시켜 얻을 수 있는 물질이다{예를 들면, Nature 275: 501-505(1978) 및 Biochemistry 35: 4417-4426(1996)을 참조}.

또한, 혈중 피브리노겐 농도와 악성종양의 증식 및 전이와의 관계에 주목하 여, 탈피브리노겐 작용을 갖는 트롬빈유사(thrombin-like) 효소인 바트록소빈(Batroxobin)이나 앤크로드(Ancrod)를 투여하여 피브리노겐을 감소시켜, 악성종양의 증식 및 전이를 억제하는 것이 보고되어 있다{예를 들면, Eur J Cancer 16: 919-923(1980) 및 일본 혈액학회잡지 44: 739-743(1981)을 참조}. 바트록소빈은, Bothrops atrox moojeni의 독액에 유래하는 트롬빈유사 세린 프로테아제(serine protease)이며, 피브리노겐으로부터 FPA만을 유리하여, Des A 피브린(피브린 Ⅰ라고도 한다)을 생산하는 당단백효소이다{예를 들면, Thromb Haemost 36: 9-13(1976) 및 Thromb Diath Haemorrh 45(Suppl.): 63-68(1971)을 참조}.

이러한 문헌에 개시된 기술은, 악성종양세포를 공격하는 면역계로부터 해당 세포를 보호하는 배리어로서 피브리노겐이 기능하고 있다는 추정에 기초하여, 트롬빈유사 효소에 의해 피브리노겐을 감소시키고, 면역계에 의한 악성종양세포에 대한 공격을 용이하게 하여, 결과적으로 악성종양의 증식 및 전이를 억제하려고 하는 것이다.

한편, 악성종양세포는 신전 및 유주하는 것이 알려져 있다. 여기서, 악성종양세포의 신전(伸展, spreading)이란, 종양세포가 어떠한 신호를 받아, 원형의 종양세포가 위족을 형성하는 것으로, 이것은 종양의 증식, 침윤 및 전이의 기초가 되는 종양세포의 생물학적 행위이다.

또한, 악성종양세포의 유주(遊走, migration)란, 종양세포가 어떠한 신호를 받아, 세포막에 있는 세포접착분자와 리간드의 사이에서 결합 및 해리를 반복하는 것에 의해, 종양세포가 원래의 장소로부터 이동하는 것이고, 이것은 종양의 침윤과 전이의 기초가 되는 생물학적 행위이다.

따라서, 악성종양세포의 신전 및 유주를 억제하는 것에 의해, 종양의 침윤 및 전이를 억제하고, 나아가서는 악성종양을 억제할 수 있다.

그러나, 이러한 기서에 의해 악성종양을 효과적으로 억제할 수 있는 약제는 보고되어 있지 않다.

또한, 피브리노겐의 분해산물인 Des A 피브린과 악성종양 세포의 신전 및 유주와의 관련성에 대한 보고예도 존재하고 있지 않다.

발명의 개시

따라서, 본 발명은, 악성종양 억제제로서 새로운 유효성분을 함유하는, 악성종양 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은, Des A 피브린이 악성종양세포에 대해서 피브린과는 다른 작용을 주는 것은 아닌가하고 생각하여, 악성종양세포의 신전 및 유주에 미치는 Des A 피브린의 영향에 대해 예의 연구를 실시한바, Des A 피브린이 악성종양세포의 신전 및 유주를 억제하는 작용을 갖는 것을 발견하였다. 본 발명은, 이 지견에 기초하여 이루어진 것이다.

즉, 본 발명은, Des A 피브린을 함유하는 것을 특징으로 하는 악성종양 억제제에 관한 것이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.

본 발명의 악성종양 억제제는, Des A 피브린을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.

Des A 피브린은, 피브리노겐으로부터 FPA를 유리시켜 얻을 수 있는 물질이다.

피브리노겐은, 3종의 Aα사슬, B β사슬 및 γ사슬이 S-S결합으로 결합하여 이루어지는 서브유닛(AαBβγ) 2개가, S-S결합에 의해 더욱 결합하여 이루어지는 2량체 당단백(AαBβγ)₂이다. Aα사슬은 610개의 아미노산(68kDa), Bβ사슬은 461개의 아미노산(54kDa), γ사슬은 411개의 아미노산(48kDa)으로 이루어지기 때문에, 피브리노겐의 분자량은 340kDa이다(Thromb Res 83:1-75(1996) 및 Blood Coagulation, Fibrinolysis and Kinin, Aoki A and Iwanaga S(Eds) Chugai Igaku Co., Tokyo, 1979, p59-71을 참조). 또한, Bβ사슬과 γ사슬에는 당이 결합하고 있지만, Aα사슬에는 없는 것으로 알려져 있다(Int J Biochem & Cell Biol 31:741-746(1999)을 참조).

FPA는, 피브리노겐의 Aα사슬의 NH₂말단으로부터 16개의 아미노산(NH₂-Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg)(서열번호 1)에 해당하는 펩티드이다.

따라서, Des A 피브린은, 피브리노겐으로부터 FPA를 유리하여 얻을 수 있는 잔부[(αBβγ)₂]이다(Thromb Haemost 36:9-13(1976) 및 Thromb Diath Haemorrh 45(Suppl.): 63-68(1971)을 참조). FPA의 분자량은 1,536Da이므로, Des A 피브린의 분자량은 약 337kDa으로 계산할 수 있다.

피브리노겐으로부터의 FPA의 유리는, 트롬빈유사 효소를 이용하여 실시할 수 있다. 트롬빈유사 효소는, 세린 프로티아제의 일종이다. 일반적으로는, 뱀독의 유래의 것이 많다. 구체적인 예로서는, Bothrops atrox moojeni의 독액으로부터 추출·정제한 바트록소빈(도비시약품공업주식회사 및 그 자회사인 Beijing Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd., Beijing, China제), 앤크라드 및 그 외의 뱀독의 유래의 트롬빈유사 효소(예를 들면 Crotalase) 등을 들 수 있다. 이러한 트롬빈유사 효소는, 천연물이라도 좋고, 유전자 재조합 제품이라도 좋다.

피브리노겐 및 트롬빈유사 효소를 이용한 Des A 피브린의 제조는, 예를 들면 하기 (1)∼(6) 방법에 의해 실시할 수 있다.

(1) 플라스틱 배양기구, 유리 배양기구, 슬라이드 글라스, 스테인레스 또는 합성고형물질인 EPTFE 인공혈관 등의 표면에 피브리노겐을 부착시키고, 여기에 트롬빈유사 효소를 첨가하여 Des A 피브린을 제조하는 방법;

(2) 상기의 고형물질에 피브리노겐 및 트롬빈유사 효소를 동시에 첨가하여 Des A 피브린을 제조하는 방법;

(3) 액체 반응계에서 0.1∼15N의 요소 및/또는 항응집 펩티드{Gly-Pro-Arg-Pro-amide, GPRP-NH₂(서열번호 2)}의 존재하에서, 피브리노겐과 트롬빈유사 효소를 반응시켜, Des A 피브린끼리의 응집을 방지하면서 작성하는 방법{Clin Exp Metastasis 17:723-730(1999)을 참조};

(4) 칼럼에 피브리노겐을 결합하고, 트롬빈유사 효소를 포함하는 용액을 흘려 Des A 피브린을 제조하는 방법;

(5) 트롬빈유사 효소를 컬럼에 결합하고, 피브리노겐을 포함한 용액을 흘려 Des A 피브린을 제조하는 방법;

(6) 트롬빈유사 효소를 정맥, 복강내, 피하 및 근육주사 등에 의해 투여하고, 체내의 피브리노겐에 작용시켜 인비보(in vivo)로 Des A 피브린을 제조하는 방법{Acta Haematol Jpn 44: 706-711(1981)을 참조}.

본 발명의 Des A 피브린의 제조에 이용하는 피브리노겐 및 트롬빈유사 효소는 그 자체 공지물질이며, 시장에서 용이하게 입수 가능하거나, 또는 조제 가능하다. Des A 피브린도 그 자체 공지물질이며, 상기의 방법에 의해 조제 가능하다.

본 발명의 악성종양 억제제의 대상이 되는 것은 악성종양이다. 악성종양은 발생모(母)조직에 의해 상피성의 악성종양과 비상피성의 악성종양으로 크게 나눌 수 있다. 상피성의 종양은 종양전체의 약 90%를 차지하고 있다고 알려져 있다. 비상피성의 악성종양은 또한, 간엽계 조직(mesenchymal tissue) 유래의 악성종양, 신경조직 유래의 악성종양 및 미분화 세포의 악성종양으로 분류할 수 있다. 이하에, 각 악성종양의 구체적인 예를 예시한다.

상피성의 악성종양

선암(Adenocarcinoma)(선상피 유래의 암종이며, 위, 장, 췌장, 기관, 폐, 유선, 난소, 자궁, 전립선 등, 몸의 각 곳에 발생하는 것으로, 사람의 암의 70∼80%를 차지한다고 추측된다), 편평상피암(squamous cell carcinoma)(중층편평상피 유래, 예를 들면 표피, 입술, 혀, 인두, 식도, 항문, 외음, 자궁경부 등의 상피조직에 발생하는 암, 비소세포폐암으로 분류되는 폐편평상피암), 기저세포암(basal cell carcinoma)(피부 및 부속기의 기저세포 유래), 이행상피암(transitional cell carcinoma)(이행상피 유래, 예를 들면 방광암), 간세포암(간실질세포 유래), 신세포암(renal cell carcinoma)(신상피유래), 담관암(cholangiocarcinoma)(담관 유래), 융모암(choriocarcinoma)(태반상피 유래)

비상피성의 악성종양

간엽계 조직유래의 악성종양

섬유육종(결합조직 및 섬유조직 유래), 지방육종(결합조직 및 지방조직 유래), 연골육종(결합조직 및 연골조직 유래), 골육종(결합조직 및 골조직 유래), 혈관육종(혈관 유래), 림프관 육종(림프관 유래), 골수성 백혈병(조혈세포 유래), 단구성 백혈병(조혈세포 유래), 악성 림프종(림프조직 유래), 림프성 백혈병(림프조직 유래), 형질세포종(다발성 골수종)(림프조직 유래), 호지킨세포(Hodgkin's cell)(림프조직 유래), 평활근 육종(평활근 유래), 횡문근 육종(횡문근 유래)

신경조직 유래의 악성종양

신경아종(Neuroblastoma)(신경아 유래), 수아세포종(medulloblastoma)(수아세포 유래), 악성성상교세포종(malignant astrocytoma)(성상교세포 유래), 망막아종(retinoblastoma)(망막아세포 유래), 교아세포종(glioblastoma)(교아세포 유래), 악성신경초종(malignant neurilenoma)(슈완세포(Schwann cells) 유래), 흑색종 (melanoma)(신경외배엽 유래)

미분화 세포의 악성종양

악성기형종(malignant teratoma)(전능세포 유래), 신아종(nephroblastoma) (신아세포 유래), 간아종(hepatoblastoma)(간아세포 유래), 혼합종양(복수종류의 세포유래)

본 발명의 악성종양 억제제는, 이러한 악성종양중에서, 상피성의 악성종양, 및, 비상피성의 악성종양인 신경조직 유래의 악성종양 및 간엽계 조직 유래의 악성종양, 특히 흑색종, 유방암 또는 섬유육종에 대해서 뛰어난 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 악성종양 억제제는, 악성종양세포의 신전 및 유주를 억제하는 것에 의해, 종양의 침윤 및 전이를 억제하고, 나아가서는 악성종양을 억제할 수 있다.

여기서, 악성종양세포의 신전(spreading)이란, 종양세포가 어떠한 신호를 받아, 원형의 종양세포가 위족을 형성하는 것으로, 이것은 종양세포의 증식, 침윤 및 전이의 기초가 되는 종양세포의 생물학적 행위이다.

또한, 악성종양세포의 유주(migration)란, 종양세포가 어떠한 신호를 받아, 세포막에 있는 세포 접착분자와 리간드의 사이에서 결합 및 해리를 반복하는 것에 의해, 종양세포가 원래의 장소로부터 이동하는 것으로, 이것은 종양의 침윤과 전이의 기초가 되는 생물학적 행위이다.

본 발명의 악성종양 억제제는, Des A 피브린 단일체로 이루어지는 것이라도 좋고, 그 외의 활성물질과 조합한 것이라도 좋다.

그 외의 활성물질로서는, 플루오로우라실(fluorouracil)과 같은 대사길항제, 아드리아마이신과 같은 항종양 항생물질제제, 다카르바진(dacarbazine)과 같은 알킬화제, 파크리탁셀(paclitaxel)과 같은 식물 유래의 제암제 등을 들 수 있다.

본 발명의 악성종양 억제제의 제형으로서는, 일국제제(Japanese Pharmacopoeia) 총칙에 있는 제형을 적용할 수 있고, 예를 들면 직접 체내에 적용하는 주사제(현탁제, 유제를 포함한다); 연고제{유지성 연고, 유제성 연고(크림), 수용성 연고 등을 포함한다}, 흡입제, 액제(점안제, 점비제 등을 포함한다), 좌제 (suppository), 첩부제(patch), 파프제(poultice), 로션제 등의 외용제; 또는, 정제(당코팅, 필름코팅, 젤라틴코팅을 포함한다), 액제, 캅셀제, 과립제, 산제 (powder)(세립을 포함한다), 환제(pill), 시럽제, 트로치제(troche) 등의 내용제 등을 들 수 있다. 이러한 제제는, 일국제제 총칙 등에 기재된 방법으로 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 악성종양 억제제는, 제형에 따라 의약적으로 허용가능한 고체형상 혹은 액체형상의 담체 또는 개입 치료기재를 포함하고 있어도 좋다. 의약적으로 허용가능한 고체형상 혹은 액체형상의 담체로서는, 용제, 안정화제, 보존제, 용해보조제, 유화제, 현탁화제, 완충제, 등장화제, 착색제, 기제, 증점제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 코팅제, 교미제(corrigent) 등을 들 수 있다.

구체적인 예로서는, 물 및 유당, 백당, 과당, 포도당, 만니톨, 소르비톨 등의 당·당 알코올류, 결정 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시 프로필셀룰로오스, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트, 카멜로스, 카멜로스칼슘, 카멜로스나트륨, 크로스카멜로스나트륨, 카르복시메틸에틸셀룰로오스, 초산 프탈산 셀룰로오스 등의 셀룰로오스 및 그 관련 유도체, 옥수수 전분, 소맥전분, 쌀전분, 감자전분, 덱스트린, 알파화 전분, 부분 알파화 전분, 히드록시프로필 전분, 카르복시메틸 전분나트륨, 시클로덱스트린, 풀루란 등의 전분 및 그 관련 유도체, 한천, 알긴산나트륨, 아라비아고무, 젤라틴, 콜라겐, 쉘락, 트라가칸트, 잔탄검 등의 천연고분자(해초류, 식물점질물, 단백질 등), 폴리비닐피롤리돈, 아미노알킬메타크릴레이트 코폴리머, 메타크릴산 코폴리머, 카르복시비닐 폴리머, 폴리비닐알코올, 디메틸폴리실록산 등의 합성 고분자, 올리브유, 카카오지, 카나우바 왁스, 우지(beef tallow), 경화유, 대두유, 참기름, 동백유, 파라핀, 유동파라핀, 황밀납, 백색 바셀린, 야자유, 마이크로크리스탈린왁스 등의 유지류, 스테아린산, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 구연산트리에틸, 트리아세틴, 중쇄지방산 트리글리세라이드, 하드패트(hard fat), 미리스틴산이소프로필 등의 지방산 및 그 유도체, 글리세린, 스테아릴알코올, 세탄올, 프로필렌글리콜, 마크로골(macrogol) 등의 알코올 및 다가 알코올, 산화아연, 인산수소칼슘, 침강 탄산칼슘, 합성 규산알루미늄, 무수규산, 카올린, 건조 수산화알루미늄 겔, 합성 히드로탈사이트, 산화티탄, 탈크, 벤토나이트, 메타규산알루민산마그네슘, 황산알루미늄칼륨, 차몰식자산 비스무스(bismuth subgallate), 차살리실산 비스무스, 유산칼슘, 중탄산나트륨 등의 무기성 물질 및 금속염 화합물, 자당지방산 에스테르, 스테아린산 폴리옥실, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 세스퀴올레인산 소르비탄, 트리올레인산 소르비탄, 모노스테아린산 소르비탄, 모노팔미틴산 소르비탄, 모노라우린산 소르비탄, 폴리솔베이트, 모노스테아린산 글리세린, 라우릴황산나트륨, 라우로마크로골 등의 계면활성 물질, 색소, 향료 등을 들 수 있다.

개입 치료기재로서는 스텐트(stent), 인공혈관 등을 들 수 있다.

본 발명의 악성종양 억제제중의 Des A 피브린의 함유량은, 채용하는 제형에 의존하여 변화하지만, 예를 들면, 내용제의 경우는 1g당 0.01∼900mg이고, 주사제의 경우는 1㎖당 0.01∼500mg이고, 외용제의 경우는 1g당 0.01∼500mg이다.

본 발명의 악성종양 억제제의 투여량은, 통상, 환자의 체중, 질환의 성질 및 상태에 의존하여 변화하지만, 성인에게 사용하는 경우, 1일당의 Des A 피브린량으로 0.1∼5000mg, 보다 바람직하게는 100∼2500mg이다.

도 1은, 피브리노겐, Des A 피브린 및 피브린의 전기영동상을 나타내는 사진이다.

도 2는, 도 1의 전기영동상을, 화상분석 시스템을 이용하여 정량화하여 도시한 그래프이다.

도 3은, PBS(A), 피브리노겐(B), 바트록소빈(C), 트롬빈(D), Des A 피브린 (E) 및 피브린(F)으로 처리한 웰(well)중에서 배양한 흑색종세포의 현미경 사진이다.

도 4는, PBS(A), 피브리노겐(B), 바트록소빈(C), 트롬빈(D), Des A 피브린 (E) 및 피브린(F)으로 처리한 웰중에서 배양한 흑색종세포의 신전률의 그래프이다.

도 5는, PBS(A), 피브리노겐(B), 바트록소빈(C), 트롬빈(D), Des A 피브린 (E) 및 피브린(F)으로 처리한 웰중에서 배양한 유방암세포의 현미경사진이다.

도 6은, PBS(A), 피브리노겐(B), 바트록소빈(C), 트롬빈(D), Des A 피브린 (E) 및 피브린(F)으로 처리한 웰중에서 배양한 유방암세포의 신전률의 그래프이다.

도 7은, PBS(A), 피브리노겐(B), 바트록소빈(C), 트롬빈(D), Des A 피브린(E) 및 피브린(F)으로 처리한 웰중에서 배양한 섬유육종세포(fibrosarcoma cells)의 현미경사진이다.

도 8은, PBS(A), 피브리노겐(B), 바트록소빈(C), 트롬빈(D), Des A 피브린 (E) 및 피브린(F)으로 처리한 웰중에서 배양한 섬유육종세포의 신전률의 그래프이다.

도 9는, 흑색종세포의 신전에 대한 Des A 피브린양의 영향을 나타내는 그래프이다.

이하에 실시예를 나타내어 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] Des A 피브린의 조제 및 확인

트롬빈유사 효소를 이용하여 피브리노겐으로부터 FPA를 유리하여 Des A 피브린을 조제하였다. 또한, Des A 피브린의 생성을 확인하기 위해서 피브리노겐 및 피브린과의 대비를 실시하였다.

(1) Des A 피브린의 조제

피브리노겐의 최종농도가 3.0mg/㎖, 바트록소빈의 최종농도가 0.5BU/㎖가 되도록, 사람 피브리노겐(F-4883, Sigma, MO, USA)의 인산 완충액(PBS) 용액에 트롬빈유사 효소인 바트록소빈{Tobarpin(등록상표), Beijing Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd., Beijing, China제}를 가한 후, 37℃에서 1시간 인큐베이트하여, Des A 피브린을 조제하였다.

(2) 피브린의 조제

피브리노겐의 최종농도가 3.0mg/㎖, 트롬빈의 최종농도가 0.5U/㎖가 되도록, 사람 피브리노겐(F-4883, Sigma, MO, USA)의 PBS용액에 트롬빈(Sigma, MO, USA)의 PBS 용액을 가한 후, 37℃에서 1시간 인큐베이트하여, 피브린을 제작하였다.

(3) 피브리노겐의 조제

무처리 대조로서, 사람 피브리노겐(F-4883, Sigma, MO, USA)을 이용하여 최종농도가 3.0mg/㎖의 피브리노겐의 PBS용액을 조제하였다.

(4) Des A 피브린 생성의 확인

상기 (1)의 공정에 의해 Des A 피브린이 생성한 것을 전기영동에 의해 확인하였다. 구체적으로는, 하기의 처리에 의해 피브리노겐이 3종의 Aα사슬, Bβ사슬 및 γ사슬로 환원되는 것을 기준으로 하여, Des A 피브린을 3종의 α사슬, Bβ사슬 및 γ사슬로, 피브린을 3종의 α사슬, β사슬 및 γ사슬로 환원한 후에 전기영동에 의하여 평가하였다.

공정 (1)에서 얻어진 Des A 피브린 및 공정 (2)에서 얻어진 피브린을 무균 생리식염수로 3회 세정한 후, 2% SDS-2% β메르캅토에탄올-5M 요소액 0.5㎖에서, 5∼6분 끓여, S-S결합을 해제하여, 용해하였다.

공정 (3)에서 얻어진 피브리노겐에서는, 상기의 세정공정을 생략하고, 그 후는 상기와 같은 조작으로 S-S결합을 해제하고, 가열용해하였다.

얻어진 샘플의 각 용액 150㎕에, 50㎕의 전기영동 완충액(4× 2% SDS-0.1% 브롬크레졸블루)을 가하여, 7.5% SDS-PAGE{PAGEL(등록상표), Atto Corp., Tokyo, Japan} 전기영동을 실시하였다.

결과를 전기영동도로서 도 1에 나타낸다. 도 1에 있어서, 레인 1 및 4는 피브리노겐, 레인 2는 Des A 피브린, 레인 3은 피브린을 나타낸다.

각 레인에 있어서, 가장 아래의 밴드는 γ사슬, 아래로부터 2번째의 밴드는 Bβ사슬, 아래로부터 3번째의 밴드는 Aα사슬을 나타낸다.

여기서, 레인 1 및 레인 4(피브리노겐)를 기준으로 하여, 레인 2(Des A 피브린)를 평가하면, 레인 2의 아래로부터 3번째의 밴드(Aα사슬)의 위치가 아래쪽(저분자량측)으로 시프트하였다. 이것은, 트롬빈유사 효소인 바트록소빈의 작용에 의해 피브리노겐의 Aα사슬로부터 FPA가 유리한 것을 나타내고 있다. 한편, 그 외의 밴드의 위치는 피브리노겐과 일치하고 있었다. 이상으로부터, 공정(1)에 의해 피브리노겐으로부터 FPA가 유리하여 Des A 피브린이 생성된 것이 이해된다.

또한, 레인 1 및 레인 4(피브리노겐)를 기준으로 하여, 레인 3(피브린)을 평가하면, 레인 3의 아래로부터 2번째의 밴드(Bβ사슬) 및 3번째의 밴드(Aα사슬)의 위치가 모두 아래쪽(저분자량측)으로 시프트하였다. 이것은, 트롬빈의 작용에 의해 피브리노겐의 Aα사슬 및 Bβ사슬로부터 각각 FPA 및 FPB가 유리한 것을 나타내고 있다. 이상으로부터, 공정(2)에서는, 피브린이 생성된 것이 이해된다.

한편, 이러한 결과는, 공지의 데이터와 일치하고 있었다{Acta Haematol Jpn 44: 706-711(1981)을 참조}.

또한, 상기의 전기영동상을, 화상분석 시스템(Furi Science & Technology Co., Ltd., Shanghai, China)을 이용하여 정량화하여, 그래프로서 나타내었다(도 2).

도 2중의 3개의 피크에 있어서, 좌측의 피크는 Aα사슬의 밴드밀도를, 중앙의 피크는 Bβ사슬의 밴드밀도를, 우측의 피크는 γ사슬의 밴드밀도를 나타낸다.

좌측의 피크(Aα사슬)를 평가하면, Des A 피브린과 피브린의 피크는 일치하고, 또한, 피브리노겐의 피크보다 저분자량측으로 시프트하였다. 이것은, Des A 피브린 및 피브린에서는, 피브리노겐의 Aα사슬로부터 FPA가 유리하고 있는 것을 나타내고 있다.

중간의 피크(Bβ사슬)를 평가하면, 피브리노겐과 Des A 피브린의 피크는 일치하고 있지만, 피브린의 피크만이 저분자량측으로 시프트하였다. 이것은, 피브린에 있어서만 피브리노겐의 Bβ사슬로부터 FPB가 유리한 것을 나타내고 있다.

이상으로부터, 바트록소빈이 피브리노겐{(AαBβγ)₂}에 작용하여 생성한 물질은, Des A 피브린{(αBβγ)₂}이고, 트롬빈이 피브리노겐에 작용하여 생성한 물질 은 피브린{(αβγ)₂}인 것이 확인되었다.

[실시예 2] Des A 피브린의 악성종양세포의 신전에 대한 영향

마트리겔{Matrigel(등록상표), BD Biosciences, NJ, USA)를 이용하여 의사(擬似)적인 체내의 세포외 매트릭스 환경을 제작하고, 이러한 환경하에서의 악성종양세포의 신전에 대한 Des A 피브린의 영향을, 3종류의 악성종양(흑색종, 유방암 및 섬유육종) 세포를 이용하여 평가하였다.

(1) 사용한 악성종양세포

흑색종세포로서의 B16-BL6 마우스 악성 흑색종세포(Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, China)는, 10% 우태아 혈청(FBS, HyClone, Utah, USA)을 함유하는 RPMI-1640 배지(Gibco, MD, USA) 중에서 계대배양하여, 본 실험에 제공하였다.

유방암세포로서의 MMT060562 마우스 유방암세포(ATCC, VA, USA)는, 10% FBS 및 1% 비필수 아미노산 용액(Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco, MD, USA)을 함유하는 MEM 배지(Gibco, MD, USA) 중에서 계대배양하여, 본 실험에 제공하였다.

섬유육종세포로서의 HT-1080 사람 섬유육종세포(Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, China)는, 10% FBS를 함유하는 MEM 배지(Gibco, MD, USA) 중에서 계대 배양하여, 본 실험에 제공하였다.

(2) 세포 신전의 측정법

8-웰 슬라이드·챔버(Nunc, IL, USA)의 각 웰에 0.25㎖의 마트리겔 {Matrigel(등록상표) 7.5㎍/㎖, BD Biosciences, NJ, USA}을 첨가하고, 실온하에서 1시간 인큐베이트하여 마트리겔을 슬라이드에 코팅하였다. 이어서, 마트리겔을 코팅한 웰에 아래와 같은 A∼F의 용액(각 0.25㎖)을 첨가하여 처리를 실시하였다.

A : 인산 완충액(PBS)의 첨가(용매대조)

B : 피브리노겐(3mg/㎖)의 첨가

C : 바트록소빈(0.5BU/㎖)의 첨가

D : 트롬빈(0.5U/㎖)의 첨가

E : Des A 피브린(3mg/㎖ 피브리노겐 및 0.5BU/㎖ 바트록소빈)의 첨가

F : 피브린(3mg/㎖ 피브리노겐 및 0.5U/㎖ 트롬빈)의 첨가

이상의 처리에 이용한 용매는 모두 PBS이었다.

{여기서, BU(바트록소빈 단위)란, 바트록소빈의 효소 활성량을 나타내는 단위를 의미하고, 37℃에서, 표준 사람 구연산 첨가 혈장 0.3㎖에, 바트록소빈용액 0.1㎖를 가할 때, 19.0 ±0.2초에 응고하는 활성량을 2BU로 하는 것이다.}

A∼D의 처리에서는, 나타낸 각 성분을 나타낸 최종농도로 웰에 첨가하고, 실온하에서 1시간 인큐베이트하여, 그 후 액체를 버리고, PBS로 세정하였다.

E∼F의 처리에서는, 나타낸 각 성분을 나타낸 최종농도로 웰에 첨가하고, 60초간 반응시켜, 생성물(처리 E : Des A 피브린, 처리 F : 피브린)의 응고가 일어나기 전에 액체를 버렸다. 그 후, 실온하에서 1시간 인큐베이트하고, PBS로 세정하였다. E의 처리에서는 바트록소빈을 피브리노겐에 작용시키는 것에 의해 Des A 피 브린이 생성하고, F의 처리에서는 트롬빈을 피브리노겐에 작용시키는 것에 의해 피브린이 생성되었다.

각 처리 웰에, 무혈청 RPMI-1640 배지중에 현탁한 5600개의 B16-BL6 흑색종세포를 뿌리고, 슬라이드·챔버를 CO₂ 인큐베이터속에서 2시간 배양하였다. 그 후, 처리제의 웰에 부착한 약 150개의 세포에 대해서, 신전세포(위족(pseudopodia)을 내밀고 있는 세포) 수를 위상차 현미경을 이용하여 계수하여, 그 신전 세포수의 비율을 아래와 같은 계산식에 따라 신전률로서 산출하였다.

신전률(%) = (신전세포수/부착세포수) × 100

같은 순서를, 무혈청 RPMI-1640 배지중에 현탁한 5600개의 B16-BL6 흑색종세포 대신, 무혈청 MEM+1% 비필수 아미노산 용액 배지중에 현탁한 5600개의 MMT 060562 유방암세포, 또는, 무혈청 MEM 배지중에 현탁한 5600개의 HT-1080 섬유육종세포에 대해서 실시하였다.

(3) 흑색종세포의 신전 억제

도 3에, 각 처리 웰중에서 2시간 배양한 흑색종세포의 현미경 사진(×45배)을 나타낸다. 도 4에, 각 처리 웰중에서 배양한 흑색종세포의 신전률의 그래프를 나타낸다.

PBS(A), 피브리노겐(B), 바트록소빈(C), 트롬빈(D) 및 피브린(F)의 존재하에서는, 흑색종세포의 대부분이 위족을 내밀어서 신전하여(도 3), 모두 신전률이 80%를 넘었다(도 4).

한편, Des A 피브린(E)의 존재하에서는, 흑색종세포는 그 대부분이 둥근 상태로, 위족을 내밀어도 짧고(도 3), 신전률은 12.53±6.69%이었다(도 4).

따라서, Des A 피브린은, 다른 성분과 비교하여, 마트리겔 존재하의 흑색종세포의 신전을 의미있게 억제한 것이 인정되었다(도 4, P<0.01).

이상으로부터, Des A 피브린이, 흑색종세포의 신전을 효과적으로 억제하는 것이 이해된다.

(4) 유방암세포의 신전 억제

도 5에, 각 처리 웰중에서 2시간 배양한 유방암세포의 현미경사진(×45배)을 나타낸다. 도 6에, 각 처리 웰중에서 배양한 유방암세포의 신전률의 그래프를 나타낸다.

PBS(A), 피브리노겐(B), 바트록소빈(C), 트롬빈 (D) 및 피브린(F)의 존재하에서는, 유방암세포의 대부분이 위족을 내밀어서 신전하고(도 5), 모두 신전률이 60%를 넘었다(도 6).

한편, Des A 피브린(E)의 존재하에서는, 유방암세포는 그 대부분이 둥근 상태로, 위족을 내밀어도 짧고(도 5), 신전률은 8.87±3.06%이었다(도 6).

따라서, Des A 피브린은, 다른 성분과 비교하여, 마트리겔 존재하의 유방암세포의 신전을 의미있게 억제한 것이 인정되었다(도 6, P<0.01).

이상으로부터, Des A 피브린이, 유방암세포의 신전을 효과적으로 억제하는 것이 이해된다.

(5) 섬유육종세포의 신전 억제

도 7에, 각 처리 웰중에서 2시간 배양한 섬유육종세포의 현미경 사진(×45 배)을 나타낸다. 도 8에, 각 처리 웰중에서 배양한 섬유육종세포의 신전률의 그래프를 나타낸다.

PBS(A), 피브리노겐(B), 바트록소빈(C), 트롬빈 (D) 및 피브린(F)의 존재하에서는, 섬유육종세포의 대부분이 위족을 내밀어서 신전하고(도 7), 모두 신전률이 70%를 넘었다(도 8).

한편, Des A 피브린(E)의 존재하에서는, 섬유육종세포는 그 대부분이 둥근 상태로, 위족을 내밀어도 짧고(도 7), 신전률은 34.19±6.55%이었다(도 8).

따라서, Des A 피브린은, 다른 성분과 비교하여, 마트리겔 존재하의 섬유육종세포의 신전을 의미있게 억제한 것이 인정되었다(도 7, P<0.01).

이상으로부터, Des A 피브린이, 섬유육종세포의 신전을 효과적으로 억제하는 것이 이해된다.

[실시예 3] 악성종양세포의 신전에 대한 Des A 피브린양의 영향

바트록소빈을 피브리노겐에 작용시켜 얻어지는 Des A 피브린의 생성량은, 피브리노겐량의 증가 및 피브리노겐과 바트록소빈의 반응시간의 연장에 따라 증가한다고 생각할 수 있다. 따라서, 동일 농도의 바트록소빈(0.5BU/㎖)과 다른 농도의 피브리노겐(0.1mg/㎖, 0.5mg/㎖, 1mg/㎖, 2mg/㎖, 3mg/㎖, 6mg/㎖, 9mg/㎖, 12mg/㎖ 및 15mg/㎖)을, 각각 30초간, 60초간 및 90초간 반응시켜 여러 가지 양의 Des A 피브린을 조제하여, 이들의 악성종양세포의 신전에 대한 영향을 평가하였다. 실험방법은, 사용한 피브리노겐의 양 및 반응시간을 제외하고, 실시예 2의 (2) 세포 신 전의 측정법의 E처리와 같았다. 결과를 도 9에 나타낸다.

반응시간이 30초(□)의 경우, 피브리노겐 농도를 상승시켜도 신전률 감소에의 영향은 볼 수 없고, 신전률은 76.23%까지 밖에 감소하지 않았다. 이것은, 신전에 영향을 미칠 수 있는 충분한 양의 Des A 피브린이 30초의 반응시간에서는 생성하지 않았기 때문이라고 생각할 수 있다.

반응시간이 60초(○) 및 90초(△)의 경우, 피브리노겐 농도가 3mg/㎖가 되었을 때에 신전률의 대폭적인 감소를 볼 수 있었다(60초 : 12.53%, 90초 : 9.13%). 피브리노겐 농도를 더욱 상승시키면, 신전세포를 거의 볼 수 없게 되었다. 이것은, Des A 피브린 생성량의 증가에 따라 악성종양세포의 신전이 보다 강하게 억제된 것을 나타내고 있다.

한편, 피브리노겐 농도가 9mg/㎖를 넘으면 신전률이 상승하고, 농도 15mg/㎖에서는 신전률의 감소효과를 볼 수 없었다. 이것은, 고농도의 피브리노겐의 존재하에서는, 생성한 Des A 피브린이 웰에 코팅되기 전에 웰 위를 다량의 피브리노겐이 덮어 버리기(웰에 코팅되지 않는 Des A 피브린은 세정공정에 있어서 씻어내어져 버린다) 때문에, 피브리노겐 그 자체의 작용이 나타나고 있기 때문이라고 생각할 수 있다.

이상으로부터, Des A 피브린은 흑색종세포의 신전을 용량 의존적으로 억제하는 것이 이해된다.

[실시예 4] Des A 피브린의 악성종양세포의 유주에 대한 영향

악성종양세포의 유주는 종양전이의 기초가 되는 생물학적 행위이다. 악성도 가 높은 악성종양은 유주능력도 높다. 따라서, 본 실시예에서는, '스크래치 상처 분석법(scratch wound assay)' {Gynecol Oncol 89:60-72(2003)를 참조}를 이용하여, 2종류의 악성종양(흑색종 및 유방암) 세포의 유주에 대한 Des A 피브린의 영향을 평가하였다.

(1) 사용한 악성종양세포

유방암세포로서의 MMT060562 마우스 유방암세포(ATCC, VA, USA)는, 10% FBS 및 1% 비필수 아미노산용액(Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco, MD, USA)을 함유하는 MEM 배지(Gibco, MD, USA) 중에서 계대배양하여, 본 실험에 제공하였다.

(2) 세포 유주의 측정법

6-웰 플레이트의 웰(Corning, NY, USA)에 커버글라스를 놓고, 여기에, 2㎖의 10% FBS 함유 RPMI-1640 배지로 현탁한 2.5×10⁴개의 B16-BL6 흑색종세포, 또는, 2㎖의 10% FBS 함유 MEM 배지로 현탁한 2.5×10⁴개의 MMT060562 유방암세포를 뿌리고, CO₂ 인큐베이터속에서 24시간 배양하였다.

배양 후, 플라스틱제의 셀 스크레이퍼(cell scraper)를 이용하여, 세포가 증 식하고 있는 커버글라스에 폭이 0.5mm의 스크래치 라인을 만들고, 원래 그 스크래치 라인에 증식하고 있던 세포를 없애고, 나머지의 세포 단편을 PBS로 더 세정하였다.

흑색종세포 배양 웰에 대해서, 10% FBS 함유 RPMI-1640 배지로 희석한 0.05mg/㎖ 피브리노겐, 또는, Des A 피브린(0.05mg/㎖ 피브리노겐 및 2BU/㎖ 바트록소빈의 첨가에 의해 생성시켰다)을 각각 2㎖첨가하여, CO₂ 인큐베이터속에서 48시간 배양하였다.

유방암세포 배양 웰에 대해서, 10% FBS MEM 배지로 희석한 0.05mg/㎖ 피브리노겐, 또는, Des A 피브린(0.05mg/㎖ 피브리노겐 및 2BU/㎖ 바트록소빈의 첨가에 의해 생성시켰다)을 각각 2㎖첨가하고, CO₂ 인큐베이터속에서, 48시간 배양하였다.

배양 후, 라이트 염색(Wright staining)을 실시하고, 광학차현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 스크래치 라인상에 유주한 세포수를 계수하고, 커버글라스 평방mm당의 유주 세포수(세포수/㎟)로서 표시하였다.

한편, 피브리노겐 처리를 Des A 피브린 처리의 대조로 한 것은, 악성종양이 생체내에 존재하고 있는 경우, 악성종양세포의 주위에는 피브리노겐이 존재하고 있기 때문이다.

(3) 흑색종세포의 유주 억제

결과를 표 1에 나타낸다.

표 1. 흑색종세포의 유주

처리	유주 세포수(세포수/㎟)
피브리노겐	87±14
Des A 피브린	14±4^**

^**P<0.01 피브리노겐과의 비교

Des A 피브린 처리시의 유주 세포수(14±4개/㎟)는, 피브리노겐 처리시의 유주 세포수(87±14개/㎟)보다 의미 있게 적었다(P<0.01).

이상으로부터, Des A 피브린이, 흑색종세포의 유주를 효과적으로 억제하는 것이 이해된다.

(4) 유방암세포의 유주억제

결과를 표 2에 나타낸다.

표 2. 유방암세포의 유주

처리	유주 세포수(세포수/㎟)
피브리노겐	29±10
Des A 피브린	12±3^**

^**P<0.01 피브리노겐과의 비교

Des A 피브린 처리시의 유주 세포수(12±3개/㎟)는, 피브리노겐 처리시의 유주 세포수(29±10개/㎟)보다 의미 있게 적었다(P<0.01).

이상으로부터, Des A 피브린이, 유방암세포의 유주를 효과적으로 억제하는 것이 이해된다.

[산업상 이용가능성]

본 발명의 악성종양 억제제는, 상술의 실시예에서 나타나는 바와 같이, 악성종양세포의 신전 및 유주를 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 악성 종양의 억제에 유리하게 사용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> TOBISHI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> A pharmaceutical composition for inhibiting malignant tumor, containing Des A fibrin <130> Y1M-0401 <150> JP 2004-213635 <151> 2004-06-24 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> human <400> 1 Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg 1 5 10 15 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> AMIDATION <400> 2 Gly Pro Arg Pro 1

Claims

Des A 피브린을 함유하는 것을 특징으로 하는, 악성종양 억제제.
제 1 항에 있어서, 상기 Des A 피브린이, 피브리노겐에 트롬빈유사 효소를 작용시켜 얻을 수 있는 것인 악성종양 억제제.
제 2 항에 있어서, 상기 트롬빈유사 효소가 천연물 또는 유전자 재조합제인 악성종양 억제제.
제 2 항에 있어서, 상기 트롬빈유사 효소가 바트록소빈인 악성종양 억제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 악성종양의 세포가 상피성 악성종양세포인 악성종양 억제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 악성종양의 세포가 비상피성 악성종양세포인 악성종양 억제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 악성종양의 세포가 신경조직 유래 악성종양세포 또는 간엽계 조직 유래 악성종양세포인 악성종양 억제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 악성종양의 세포가 흑색종세포, 유방암세포 또는 섬유육종세포인 악성종양 억제제.