KR101008536B1 - 쿠커비투릴 유도체와 게스트 화합물의 비공유 결합을이용한 세포 구성 성분의 분리 및 정제 방법, 및 이를이용한 키트 - Google Patents

쿠커비투릴 유도체와 게스트 화합물의 비공유 결합을이용한 세포 구성 성분의 분리 및 정제 방법, 및 이를이용한 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 구성 성분의 분리 방법으로서, a) 게스트(guest) 화합물이 연결된 반응성 화합물을 세포와 접촉시키는 단계; b) 상기 세포를 용해시키는 단계; c) 상기 세포가 용해된 용액에 호스트(host) 화합물이 연결된 고체상(solid phase)을 첨가하여 혼합액을 준비하는 단계; d) 상기 혼합액으로부터 세포 구성 성분에 연결된 게스트 화합물과 고체상에 연결된 호스트 화합물의 결합쌍(binding pair)을 분리, 정제하는 단계; 및 e) 상기 결합쌍으로부터 상기 세포 구성 성분을 분리하는 단계;를 포함하며, 상기 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물은 반응성 화합물과 하기 화학식 2의 게스트 화합물이 공유결합된 것이며, 상기 호스트 화합물이 연결된 고체상은 고체상과 하기 화학식 1의 호스트 화합물이 공유결합된 것이며, 상기 반응성 화합물이 생체 성분, N-하이드록시석신이미드, 항원, 항체, 압타머(aptamer), 엽산 및 트랜스페린으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 화합물인 방법을 제공한다.

Description

쿠커비투릴 유도체와 게스트 화합물의 비공유 결합을 이용한 세포 구성 성분의 분리 및 정제 방법, 및 이를 이용한 키트{The method of separating and purifying cellular components using non-covalent bond between a cucurbituril derivative and a guest compound and an apparatus using the same}
본 발명은 세포 구성 성분의 분리 및 정제 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 호스트 화합물, 쿠커비투릴 유도체,과 게스트 화합물의 비공유 결합을 이용하여 세포 구성 성분을 선택적으로 분리하고 정제하는 방법 및 이를 이용한 장치에 관한 것이다.
사이클로덱스트린(미국 특허 제4539399호), 크라운에테르(한국특허 제026382호)와 같은 호스트 화합물(host compound)는 각종 게스트 화합물(guest compound)을 포접하는 능력을 갖고 있기 때문에, 특정 물질의 분리 및 제거 방법으로서 유용하다. 상기의 호스트 화합물이 컬럼 충진제로 이용되기 위해서는 실리카겔, 제올라이트, 산화티타늄, 셀롤로오즈와 같은 고분자 고체 기질에 공유결합을 통하여 연결하는 것이 필요하다. 고체 기질에 공유결합으로 연결된 호스트 화합물은 다양한 종류의 컬럼 크로마토그래피에서 컬럼 충진제의 정지상으로 이용되어 다양한 피측 정 시료의 분리에 이용된다.쿠커비투릴은 새롭게 주목받는 호스트 화합물로서 사이클로덱스트린 등과 달리 게스트 화합물로서 소수성 화합물 외에 다양한 종류의 친수성 화합물, 특히 아민이 치환된 생화학적 화합물들과 비공유결합을 형성할 수 있다(J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 11316; EP 1094065; J. Org. Chem. 1986, 51, 1440).
그러므로, 상기 쿠커비투릴 유도체를 이용하여 다양한 화합물들의 분리가 가능하다.
세포 구성 성분의 분리 방법으로서,
a) 게스트(guest) 화합물이 연결된 반응성 화합물을 세포와 접촉시키는 단계;
b) 상기 세포를 용해시키는 단계;
c) 상기 세포가 용해된 용액에 호스트(host) 화합물이 연결된 고체상(solid phase)을 첨가하여 혼합액을 준비하는 단계;
d) 상기 혼합액으로부터 세포 구성 성분에 연결된 게스트 화합물과 고체상에 연결된 호스트 화합물의 결합쌍(binding pair)을 분리, 정제하는 단계; 및
e) 상기 결합쌍으로부터 상기 세포 구성 성분을 분리하는 단계;를 포함하며,
상기 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물은 반응성 화합물과 하기 화학식 2의 게스트 화합물이 공유결합된 것이며,
상기 호스트 화합물이 연결된 고체상은 고체상과 하기 화학식 1의 호스트 화합물이 공유결합된 것이며,
상기 반응성 화합물이 생체 성분, N-하이드록시석신이미드, 항원, 항체, 압타머(aptamer), 엽산 및 트랜스페린으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 화합물인 방법이 제공된다:
<화학식 1>
Figure 112008027111464-pat00001
상기 식에서,
n은 6 내지 10의 정수이고, X는 O, S 또는 NH이며,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 H, OR, SR, NHR, COOH, O(CH2)aS(CH2)bNH2 또는 O(CH2)aS(CH2)bCOOH 이며, 상기 a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 상기 R은 H, C1-C30 알킬, C2-C30 알케닐, C2-C30 알키닐, C2-C30 카르보닐알킬, C1-C30 티오알킬, C1-C30 알킬티올, C1-C30 히드록시알킬, C1-C30 알킬실릴, C1-C30 아미노알킬, C1-C30 아미노알킬티오알킬, C5-C30 시클로알킬, C2-C30 헤테로시클로알킬, C6-C30 아릴, C6-C30 아릴알킬, C4-C30 헤테로아릴, 및 C4-C30 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되나, A1 및 A2가 동시에 수소가 아니며,
<화학식 2>
A3-B1-A4
상기 식에서,
A3은, 상기 화학식 1의 호스트 화합물과 비공유결합을 형성할 수 있는 작용기로서, 아다만탄, 페로센, 메탈로센, 카르보레인, 시클람, 크라운에테르, 아미노산, 펩티드, 알칼로이드, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 올리고뉴클레오티드, 로다민 또는 나노입자에서 하나의 말단 원자가 제거되어 얻어지는 작용기이며,
A4는 아민기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 작용기이며,
B1은 탄소수 1 내지 20의 알킬렌기, 탄소수 2 내지 20의 알케닐렌기, 탄소수 2 내지 20의 알키닐렌기, 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬렌기, 탄소수 6 내지 20의 아릴렌기, 탄소수 4 내지 7의 헤테로아릴렌기, 및 탄소수 1 내지 20의 알킬실릴렌기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제 1 작용기; 및 -NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-및 -S-S- 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 제 2 작용기;를 포함하나, 상기 제 2 작용기 중에서 -NH-를 반드시 포함한다.
a) 호스트 화합물이 연결된 고체상; 및
b) 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물;을 포함하는 키트로서,
상기 호스트 화합물이 연결된 고체상은 고체상과 상기 화학식 1의 호스트 화합물이 공유결합된 것이며,
상기 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물은 반응성 화합물과 상기 화학식 2의 게스트 화합물이 공유결합된 것이며,
상기 반응성 화합물이 생체 성분, N-하이드록시석신이미드, 항원, 항체, 압 타머(aptamer), 엽산 및 트랜스페린으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물인 키트가 제공된다:
이하에서 본 발명의 바람직한 구현예에 따른 세포 구성 성분의 분리 및 정제 방법 및 이를 이용한 장치에 관하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일 구현예에 따르는 세포 구성 성분의 분리 방법은, a) 게스트(guest) 화합물이 연결된 반응성 화합물을 세포와 접촉시키는 단계; b) 상기 세포를 용해시키는 단계; c) 상기 세포가 용해된 용액에 호스트(host) 화합물이 연결된 고체상(solid phase)을 첨가하여 혼합액을 준비하는 단계; d) 상기 혼합액으로부터 세포 구성 성분에 연결된 게스트 화합물과 고체상에 연결된 호스트 화합물의 결합쌍(binding pair)을 분리, 정제하는 단계; 및 e) 상기 결합쌍으로부터 상기 세포 구성 성분을 분리하는 단계;를 포함하며, 상기 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물은 반응성 화합물과 하기 화학식 2의 게스트 화합물이 공유결합된 것이며, 상기 호스트 화합물이 연결된 고체상은 고체상과 하기 화학식 1의 호스트 화합물이 공유결합된 것이며, 상기 반응성 화합물이 생체 성분, N-하이드록시석신이미드, 항원, 항체, 압타머(aptamer), 엽산, 트랜스페린으로 및/또는 이들의 혼합물 등인 방법이다.
<화학식 1>
Figure 112008027111464-pat00002
상기 식에서,
n은 6 내지 10의 정수이고, X는 O, S 또는 NH이며,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 H, OR, SR, NHR, COOH, O(CH2)aS(CH2)bNH2 또는 O(CH2)aS(CH2)bCOOH 이며, 상기 a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 상기 R은 H, C1-C30 알킬, C2-C30 알케닐, C2-C30 알키닐, C2-C30 카르보닐알킬, C1-C30 티오알킬, C1-C30 알킬티올, C1-C30 히드록시알킬, C1-C30 알킬실릴, C1-C30 아미노알킬, C1-C30 아미노알킬티오알킬, C5-C30 시클로알킬, C2-C30 헤테로시클로알킬, C6-C30 아릴, C6-C30 아릴알킬, C4-C30 헤테로아릴, 및 C4-C30 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되나, A1 및 A2가 동시에 수소가 아니며,
<화학식 2>
A3-B1-A4
상기 식에서,
A3은, 상기 화학식 1의 호스트 화합물과 비공유결합을 형성할 수 있는 작용기로서, 아다만탄, 페로센, 메탈로센, 카르보레인, 시클람, 크라운에테르, 아미노산, 펩티드, 알칼로이드, 시스플라틴, 올살리플라틴, 올리고뉴클레오티드, 로다민 또는 나노입자에서 하나의 말단 원자가 제거되어 얻어지는 작용기이며,
A4는 아민기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 작용기이며,
B1은 탄소수 1 내지 20의 알킬렌기, 탄소수 2 내지 20의 알케닐렌기, 탄소수 2 내지 20의 알키닐렌기, 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬렌기, 탄소수 6 내지 20의 아릴렌기, 탄소수 4 내지 7의 헤테로아릴렌기, 및 탄소수 1 내지 20의 알킬실릴렌기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제 1 작용기; 및 -NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-및 -S-S- 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 제 2 작용기;를 포함하나, 상기 제 2 작용기 중에서 -NH-를 반드시 포함한다.
상기 분리 방법은 고체상 또는 세포 구성 성분에 선택적으로 공유결합된 호스트 화합물과 게스트 화합물이 조건에 따라 가역적으로 분리/결합되는 비공유 결합쌍을 형성함에 의하여, 세포 등으로부터 세포 구성 성분을 간단하게 선택적으로 분리 정제할 수 있다.
상기 a) 단계에서 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물은 세포와 접촉하여 세포 구성 성분에 다시 연결된다. 상기 반응성 화합물은 세포 구성 성분과 공유 결합을 통해 연결될 수 있는 반응기를 가지는 화합물 또는 특정 세포 구성 물질을 인지할 수 있는 화합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 반응성 화합물로 서 세포 구성 성분과 공유 결합을 형성할 수 있는 화합물을 사용함에 의하여 세포막 단백질 등을 분리할 수 있으며, 상기 반응성 화합물로서 특정 세포 구성 성분을 선택적으로 인지할 수 있는 화합물을 사용함에 의하여 PLD(Phospholipase), GPCR(G-protein couples receptor), PKA(protein kinase A), Munc-18 등과 같은 특정 단백질을 분리할 수 있다. 적절한 상기 반응성 화합물의 선택에 의하여, 결과적으로, 상기 화학식 2의 게스트 화합물이 연결될 수 있는 세포 구성 성분의 종류가 매우 다양해진다.
상기 반응성 화합물이 공유결합된 화학식 2의 게스트 화합물과 세포를 접촉시키는 방법은 상기 게스트 화합물을 세포가 들어있는 용액에 첨가하는 것이 일반적이나, 당해 기술 분야에서 사용되는 다른 모든 방법이 사용될 수 있다.상기 b) 단계에서 세포의 용해는 용해액에 의하여 이루어지나 당해 기술분야에서 사용되는 다른 방법도 모두 사용될 수 있다. 상기 용해액은 당해 기술 분야에서 사용되는 용해액이라면 특별히 한정되지 않는다.
상기 c) 단계에서 호스트 화합물에 연결된 고체상의 첨가에 의하여 상기 호스트 화합물과 상기 a) 단계에서 첨가된 게스트 화합물이 용액 중에서 상호 비공유 결합에 의하여 결합쌍(binding pair)을 형성할 수 있다. 상기 결합쌍의 형성 여부는 IR 흡수 스펙트럼으로 확인할 수 있다.
예를 들어, 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체의 동공에 상기 화학식 2의 게스트 화합물이 삽입되어 상호 비공유 결합을 형성한다. 이러한 비공유 결합의 형성 여부는 용액의 pH에 의해 결정된다. 구체적으로, 쿠커비투릴 유도체인 상기 화학식 1의 호스트 화합물과 상기 화학식 2의 게스트 화합물이 결합쌍을 형성하기 위해서는 산성 조건의 용액이 요구되며, 상기 결합쌍이 분리되기 위해서는 염기성 조건의 용액이 요구된다. 달리 말하면, 상기 화학식 2의 게스트 화합물에 포함된 아민기가 수소화되는 조건에서는 상기 결합쌍이 형성되며, 상기 아민기가 탈수소화되는 조건에서는 상기 결합쌍이 분리된다. pH가 8 이하인 용액에서는 상기 쿠커비투릴 유도체 화합물과 게스트 화합물의 결합상수가 약 1010 ~ 1015 M-1이 되어 상기 화합물들이 대부분 서로 비공유적으로 결합된 상태로 존재한다. 그러나, pH가 8 초과인 용액에서는 상기 결합상수가 약 100 ~ 104 M-1이 되어 상기 화합물들이 대부분 해리된 상태로 존재한다. 즉, pH가 감소하여 용액이 산성으로 변할수록 쿠커비투릴 유도체와 게스트 화합물간의 결합상수는 증가하고 pH가 증가하여 용액이 염기성으로 변할수록 쿠커비투릴 유도체와 게스트 화합물간의 결합상수는 감소한다.예를 들어, n이 7인 쿠커비투릴 유도체 호스트 화합물과 아다만탄아민 또는 페로센 메틸아민 유도체인 게스트 화합물은 pH 8 이하에서 약 1012 M-1이상의 결합상수로 서로 비공유적으로 결합함에 반해, pH 8 초과에서 약 104 M-1이하의 결합상수로 서로 결합하지 않고 해리된 상태로 존재한다.
상기 d) 단계에서 상기 결합쌍을 상기 혼합액으로부터 분리, 정제하는 방법은 여과하는 방법, 자석을 사용하는 방법 등으로서 당해 기술분야에서 사용되는 모든 방법이 사용될 수 있으며, 상기 결합쌍에 포함된 고체상의 특성에 따라 다양한 방법이 사용될 수 있다.
상기 e) 단계에서 분리된 세포 구성 성분은 투석(dialysis) 등과 같은 추가적인 정제 단계를 통해 보다 순수한 형태로 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포 구성 성분은 세포막 단백질, 효소, 핵산, 단백질, 아미노산, 항체, 항원, 저해제, 비타민, 보조인자, 지방산, 세포막, 기질, 기질 유사물, 억제제, 조효소, 바이러스, 렉틴, 다당, 당단백, 수용체, 히스톤, ATP, ADP, 호르몬 수용체, 또는 글루타티온이 바람직하나, 반드시 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 세포 구성 성분 표면에 아민기 또는 카르복실기와 같은 말단 반응성 작용기를 가져 상기 반응성 화합물과 공유결합을 형성할 수 있는 화합물 또는 상기 반응성 화합물이 인지할 수 있는 화합물이라면 모두 가능하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 생체 분자는 세포막 단백질, 효소, 핵산, 단백질, 아미노산, 항체, 항원, 저해제, 비타민, 보조인자, 지방산, 세포막, 기질, 기질 유사물, 억제제, 조효소, 바이러스, 렉틴, 다당, 당단백, 수용체, 히스톤, ATP, ADP, 호르몬 수용체, 글루타티온이 바람직하다. 즉, 상기 세포 구성 성분은 상기 반응성 화합물,생체 분자,로도 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포 구성 성분 중에서 항원이 게스트 화합물에 연결된 다음 다시 항체와 연결되면, 상기 항원은 반응성 화합물의 역할을 한다. 상기 생체 분자 표면에 아민기 또는 카르복실기와 같은 말단 반응성 작용기를 가져 세포 구성 성분과 공유결합을 형성할 수 있는 것이 바람직하다.
상기 효소로는 상기 효소는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 페록시다아제, 프로테아제, 아밀라아제, 크실란아제, 리파제, 에스테라제, 큐틴아제, 펙티나제, 케라티나제, 환원 효소, 산화 효소, 페놀록시다아제, 리폭시젠아제, 리그닌아제, 풀룰라아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제 및/또는 이의 조합이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 고체상은 고분자, 자성 입자, 고분자가 코팅된 자성 입자, 실리카겔, 아가로스겔, 고분자 또는 금이 코팅된 실리카겔, 지르코늄 산화물, 모노리틱 고분자, 금박막, 은박막, 유리, ITO(Indium Tin Oxide) 코팅된 유리, 실리콘, 금속 전극, 나노막대, 나노튜브, 나노와이어, 컬드란 검, 셀룰로오스, 나일론막, 세파로스, 세파덱스 또는 이들의 혼합물 등이 바람직하나, 아가로스겔이 특히 바람직하다. 또한, 상기 고체상은 표면에 말단 반응성 작용기를 가지는 것이 바람직하다. 상기 말단 반응성 작용기는 상기 화학식 1의 호스트 화합물과 공유결합을 형성한다. 이러한 말단 반응성 작용기는 할로겐기, 시아노기, 카르복실기, 아민기, 하이드록시기, 알릴옥시기, 티올기 및/또는 이들의 혼합물이 바람직하다. 상기 고체상은 비드(bead) 형태인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 화학식 1의 호스트 화합물은 하기 화학식 3 또는 4로 표시되는 것이 바람직하다:
<화학식 3>
Figure 112008027111464-pat00003
<화학식 4>
Figure 112008027111464-pat00004
상기, 식들에서 n 및 X는 상기에 정의된 대로이다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 화학식 1에서 n=7이고, X=산소 원자인 것이 바람직하다. 즉, 쿠커비트[7]릴 유도체가 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 화학식 2의 게스트 화합물은 하기 화학식 5 또는 6으로 표시되는 것이 바람직하다:
<화학식 5>
Figure 112008027111464-pat00005
<화학식 6>
Figure 112008027111464-pat00006
상기 화합식 5 및 6으로 표시되는 게스트 화합물이 반응성 화합물인 N-하이드록시석신이미드와 공유결합하면 하기 화학식 7 및 8로 표시되는 a) 단계의 반응성 화합물이 연결된 게스트 화합물이 얻어진다.
<화학식 7>
Figure 112008027111464-pat00007
<화학식 8>
Figure 112008027111464-pat00008
상기 화학식 5 내지 8의 화합물은 이황 결합이 분자 내에 추가될 수 있으며, 이활결합이 분자에서 제외될 수도 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 분리 방법에서 상기 b) 단계와 c) 단계 사이에 상기 고체상과 상기 화학식 1의 호스트 화합물을 연결하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 분리 방법에서 상기 d) 단계와 e) 단계 사이에 환원제로 이황결합을 분리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 화학식 8의 화합물이 사용될 경우이다. 상기 d) 단계는 상기 화학식 2의 게스트 화합물이 이황결합(-S-S-)을 포함하는 경우에 추가하는 것이 바람직하다. 상기 이황 결합의 분리에 사용되는 환원제는 DTT(dithiothreitol), 글루타사이온(glutathione), TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine) 등이 바람직하나, 반드시 이들로 한정되는 것은 아니며 당해 기술 분야에서 사용 가능한 환원제라면 모두 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포 구성 성분 분리 방법에서 상기 a) 단계 및 b) 단계 대신에 하기 a ) 세포를 용해시키는 단계 및 b ) 상기 세포가 용해된 용액에 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물을 첨가하는 단계가 적용될 수 있다: 즉, 상기 세포 구성 성분 분리 방법은 a ) 세포를 용해시키는 단계; b ) 상기 세포가 용해된 용액에 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물을 첨가하는 단계; c) 상기 세포가 용해된 용액에 호스트(host) 화합물이 연결된 고체상(solid phase)을 첨가하여 혼합액을 준비하는 단계; d) 상기 혼합액으로부터 상기 세포 구성 성분에 연결된 게스트 화합물과 상기 고체상에 연결된 호스트 화합물 사이의 결 합쌍(binding pair)을 분리, 정제하는 단계; 및 e) 상기 세포 구성 성분을 상기 결합쌍으로부터 분리하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포 구성 성분 분리 방법에서, 상기 a) 단계에서 게스트 화합물 대신에 호스트 화합물이 반응성 화합물에 연결되고, c) 단계에서 호스트 화합물 대신에 게스트 화합물이 고체상에 연결될 수 있다. 즉, 상기 호스트 및 게스트 화합물은 세포 구성 성분과 고체상에 택일적으로 결합될 수 있다.
보다 구체적으로 상기 분리 방법은, a ) 호스트 화합물이 연결된 반응성 화합물을 세포와 접촉시키는 단계; b) 상기 세포를 용해시키는 단계; c ) 상기 세포가 용해된 용액에 게스트 화합물이 연결된 고체상(solid phase)을 첨가하여 혼합액을 준비하는 단계; d ) 상기 혼합액으로부터 상기 세포 구성 성분에 연결된 호스트 화합물과 상기 고체상에 연결된 게스트 화합물 사이의 결합쌍(binding pair)을 분리, 정제하는 단계; 및 e) 상기 세포 구성 성분을 상기 결합쌍으로부터 분리하는 단계;를 포함한다:
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 분리 방법에서 상기 d) 단계의 정제에 사용되는 세척액이 메탄올, 트라이플루오르아세트산, 트라이에틸아민, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 톨루엔, 아세토니트릴, 크실렌, 클로로벤진, 테트라히드로퓨란, 디에틸에테르, 에탄올, 디글리콜 에테르, 실리콘 오일, 초임계 이산화탄소, 이온성 액체, N-메틸피롤리딘, 피리딘, 물, 암모늄 히드록시드, 디옥세인, 클로로포름 및/또는 이들의 조합인 용매를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 분리 방법에서 상기 d) 단계의 정제에 사용되는 세척액이 트리스-염산, 소듐클로라이드, EDTA, SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), triton X-100, triton X-114, Tween-20, Tween-80, Brij-35, Brij-58, 옥틸-베타-글루코사이드, OGT, CHAPS, CHAPSO, 소듐디옥시콜레이트, NP-40(Nonidet P-40), 프로티에즈인히비터(예를 들어, PMSF), 파이로포스페이트, 베타-글리세로포스페이트, 소듐플로라이드, 소듐바나데이트, 및/또는 이들의 혼합물을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에 따른 키트는 a) 상기 호스트 화합물이 연결된 고체상(solid phase); 및 b) 상기 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물;을 포함하는 키트로서, 상기 호스트 화합물이 연결된 고체상은 고체상(solid phase)과 상기 화학식 1의 호스트(host) 화합물이 공유결합된 것이며, 상기 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물은 반응성 화합물과 상기 화학식 2의 게스트(guest) 화합물이 공유결합된 것이며, 상기 반응성 화합물이 생체 성분, N-하이드록시석신이미드, 항원, 항체, 압타머(aptamer), 엽산, 트렌스페린 및/또는 이들의 혼합물이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 생체 성분은 세포막 단백질, 효소, 핵산, 단백질, 아미노산, 항체, 항원, 저해제, 비타민, 보조인자, 지방산, 세포막, 기질, 기질 유사물, 억제제, 조효소, 바이러스, 렉틴, 다당, 당단백, 수용체, 히스톤, ATP, ADP, 호르몬 수용체 및/또는 글루타티온인 것이 바람직 하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 고체상이 고분자, 자성 입자, 고분자가 코팅된 자성 입자, 실리카겔, 아가로스겔, 고분자 또는 금이 코팅된 실리카겔, 지르코늄 산화물, 모노리틱 고분자, 금박막, 은박막, 유리, ITO(Indium Tin Oxide) 코팅된 유리, 실리콘, 금속 전극, 나노막대, 나노튜브, 나노와이어, 컬드란 검, 셀룰로오스, 나일론막, 세파로스, 세파덱스 및/또는 이들의 혼합물이 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 화학식 1의 호스트 화합물이 하기 화학식 3 또는 4로 표시되는 화합물인 것이 바람직하다:
<화학식 3>
Figure 112008027111464-pat00009
<화학식 4>
Figure 112008027111464-pat00010
상기, 식들에서 n 및 X는 제 1 항에 정의된 대로이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 화학식 1에서 n=7이고, X=산소 원자인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 화학식 2의 게스트 화합물이 하기 화학식 5 또는 6으로 표시되는 화합물인 것이 바람직하다:
<화학식 5>
Figure 112008027111464-pat00011
<화학식 6>
Figure 112008027111464-pat00012
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 게스트 화합물 대신에 상기 호스트 화합물이 반응성 화합물에 연결되고, 상기 호스트 화합물 대신에 상기 게스트 화합물이 고체상에 연결될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
제조예 1: 고체상에 호스트 화합물(모노아민 쿠커비투[7]릴)의 고정화
모노아민 쿠커비투[7]릴(10 mg, 7.7 X 10-3 mmol)을 커플링 버퍼(2 mL, 0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.4)에 첨가하여 녹였다. 0.5 g의 시아노겐 브로마이드 엑티베이티드 아가로즈 비드(Cyaogen bromide activated agarose bead)를 HCl(1 mM, 50 mL) 수용액에 첨가하고 30분 동안 팽창시켰다. 상기 비드가 깨지지 않도록, 400 rpm 이하의 속력으로 원심분리하여 상층액을 제거하고 50 mL의 증류수를 첨가하여 세척하였다. 상기 비드를 4 mL 유리바이알에 옮겨담고, 상기 모노아민 쿠커비투[7]릴이 용해된 커플링 버퍼 2 mL를 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 천천히 회전시키며 방치하였다. 400 rpm 이하의 속력으로 원심분리 후 상층액은 제거하고 커플링 버퍼로 세척하였다. 에탄올아민(4 mL, 1 M)을 첨가하고 상온에서 2시간 동안 회전시키며 방치하여 남아있는 시아노겐 그룹을 비활성화시켰다. 아세테이트 버퍼(0.1M acetic acid, 0.5 M NaCl, pH 4)와 커플링 버퍼로 번갈아서 각각 5회 세척하였다. 상기 고정화 과정은 도 2에 개략적으로 도시되어 있다.
제조예 2: 반응성 화합물에 연결된 게스트 화합물의 합성
페로센-N-하이드록시석신이미드(Ferrocene-NHS)계 게스트 화합물
C. Padeste, A. Grubelnik, L. Tiefenauer Biosens. Bioelectron. 2000, 15, 431. 에 기술된 바와 동일하게 합성하였다. 상기 제조 방법은 하기 반응식 1로 기재된 바와 동일하다.
<반응식 1>
Figure 112008027111464-pat00013
제조예 3: 반응성 화합물에 연결된 게스트 화합물의 합성
아다만탄-N-하이드록시석신이미드(adamantane-S-S-NHS)계 게스트 화합물
아다만탄에틸렌디아민(N-(1-adamantayl)ethylenediamene)(10 mg, 5.2 X 10-2 mmol, TCI)와 디티오글리콜릭산(Dithiodiglycolic acid, 28 mg, 1.5 X 10-1 mmol)를 H2O 5 mL에 넣고 교반하며, EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, 9.8 mg, 5.2 X 10-2 mmol, aldrich) 와 HOBt, (N-Hydroxybenzotriazole, 7.0 mg, 5.2 X 10-2 mmol, aldrich)를 서서히 첨가한 후 2시간동안 교반하였다. 상기 반응물을 sephadex G-10을 이용하여 size-exclusion chromatography법으로 분리하여 10 mg 의 중간체 화합물(adamantane-S-S-carboxylic acid)을 54 % 수득률로 얻었다.
1H NMR(500 MHz, D2O): d = 1.71-2.14(m),2.66 (t),3.45(S), 3.50(m), 3.52(m)
EI-Mass [M +] calc.= 358.1, found = 358.1
이어서, 상기 중간체 화합물(adamantane-S-S-carboxylic acid) (10 mg, 2.8 X 10-2 mmol)를 5 mL의 H2O에 녹인 후 NHS(N-hydroxysuccinimide, 4 mg, 3.5 X 10-2 mmol, aldrich)를 넣고 상온에서 2시간동안 교반하여 결과물(adamantane-S-S-NHS)을 얻었다. 반응혼합물을 별도의 분리없이 바로 실시예 6에 사용하였다. 상기 중간체 및 결과물은 하기 반응식 2에 표시된 화합물들이다.
<반응식 2>
Figure 112008027111464-pat00014
<중간체> <결과물>
제조예 4: 게스트 화합물과 항체(anti-Munc18)의 결합쌍 형성
상기 제조예 2에서 합성된 게스트 화합물(ferrocene-NHS ligand) (2.0 mg, 4.5 X 10-3 mmol)에 항체(Anti-Munc18)(0.1mg/1mL, 1mL)를 첨가하고, 4℃에서 4시간 동안 천천히 회전하며 방치하였다. 형성된 게스트 화합물-항체 결합쌍은 투석하여 정제하였으며, 적외선(IR) 분광광도계 확인 결과를 이용하여 리간드-항체 결합쌍이 형성되었음을 확인하였다. 이후, 하기 실시예 5의 실험에 사용하였다.
실시예 1: 세포막 단백질의 정제
(페로센-N-하이드록시석신이미드(Ferrocene-NHS)계 게스트 화합물 사용)
HEK293 세포를 플레이트에 배양한 후, 배양액을 모두 제거하였다. 5mL의 차가운 PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척하여 남아있는 배양액 성분을 모두 제거하였다. 제조예 2에서 제조된 게스트 화합물(2.0 mg, 3.8 X 10-3 mmol)를 5mL PBS 버퍼에 녹이고 HEK293 세포가 붙어있는 플레이트에 첨가하였다. 4℃에서 30 분 동안 방치하여 상기 게스트 화합물이 세포 표면의 단백질들과 공유결합하도록 유도하였다. 이어서, 플레이트로부터 게스트 화합물이 녹아있는 PBS를 모두 제거하고 새로운 PBS를 첨가하여 상기 단백질과 결합하지 않고 남은 게스트 화합물을 제거하였다. 상기플레이트에 0.1 M 글라이신 수용액을 첨가한 뒤 4℃에서 30 분 동안 방치하여 잔존하는 게스트 화합물의 반응성을 비활성화시켰다. 0.1 M 글라이신 수용액을 제거하고, PBS 버퍼를 첨가하여 세척하였다.이어서, 상기 HEK293 세포가 붙어있는 플레이트에 세포용해액(1 mL, 10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Tx-100, 1% sodium deoxycholate)을 첨가하였다. 플레이트 위의 세포 용해액을 모두 거두어 1.5 mL 튜브에 담고 초음파를 가하여 모든 세포를 용해시켰다. 이어서, 14000 rpm 의 속도로 원심분리하여, 0.7 mL의 상층액만을 취하였다. 상기 분리된 상층액에 상기 제조예 1에서 제조된 모노아민 쿠커비투[7]릴-아가로즈 비드(40 ㎕)를 첨가하여 4℃에서 4시간 동안 천천히 회전시키며 방치하여 혼합액을 얻었다. 상기 혼합액을 1000rpm의 속도로 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세포용해액을 첨가하여 세척하는 단계를 5회 반복하였다. 세척이 끝난 아가로 즈 비드(agarose bead)에 30 ㎕의 2X 샘플버퍼를 첨가한 뒤 95℃에서 5분간 가열하여 비드에 붙어있던 단백질들을 모두 떼어내었다. SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel phoresis)를 이용하여 단백질의 크기별로 구별하였다. 상기 분리 과정은 도 3에 개략적으로 도시되었다. 상기 실시예 1에 따라 분리된 단백질의 분리 결과는 도 4의 2번 컬럼에 보여진다.
실시예 2 : 세포막 단백질의 정제
(아다만탄-N-하이드록시석신이미드(adamantane-S-S-NHS) 게스트 화합물)
HEK293 세포를 플레이트에 배양한 후, 배양액을 모두 제거하였다. 5mL의 차가운 PBS로 2회 세척하여 남아있는 배양액 성분을 모두 제거하였다. 제조예 3에서 제조된 이황결합이 포함된 게스트 화합물(3.0 mg, 4.4 X 10-3 mmol)을 5mL PBS 버퍼에 녹이고 HEK293 세포가 붙어있는 플레이트에 첨가하였다. 4℃에서 30 분 동안 방치하여 리간드가 세포 표면의 단백질들과 공유결합하도록 유도하였다. 이어서, 상기 플레이트로부터 게스트 화합물이 녹아있는 PBS를 모두 제거하고 새로운 PBS를 첨가하여 단백질과 결합하지 않고 남은 게스트 화합물을 제거하였다. 상기 플레이트에 0.1 M 글라이신 수용액을 첨가한 뒤 4℃에서 30 분 동안 방치하여 잔존하는 게스트 화합물의 반응성을 비활성화시켰다. 0.1 M 글라이신 수용액을 제거하고, PBS 버퍼를 첨가하여 세척하였다. 상기 플레이트에 세포용해액(1 mL, 10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Tx-100, 1% sodium deoxycholate)을 첨가하였다. 플레이트 위의 세포용해액을 모두 거두어 1.5 mL 튜브에 담고 초음파를 가하여 모든 세포를 용해시켰다. 상기 용해액을 14000 rpm 의 속도로 원심분리하여, 0.7 mL의 상층액만을 취하였다. 상기 상층액에서 제조예 1에서 제조된 모노아민 쿠커비투[7]릴-아가로즈 비드(40 ㎕)를 첨가하여 4℃에서 4시간 동안 천천히 회전시키며 방치하여 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액을 1000 rpm의 속도로 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세포용해액을 첨가하여 세척하는 단계를 5회 반복하였다. 세척이 끝난 아가로즈 비드에 DTT 수용액 (40 ㎕, 1mM)을 첨가하여 리간드에 포함된 이황결합의 환원을 유도하였다. 20 ㎕ 상층액을 취하여 5X 샘플버퍼(5 ㎕) 첨가한 뒤 95℃에서 5분간 가열하고, SDS-PAGE를 이용하여 단백질의 크기별로 구별하였다. 상기 실시예 3에 따라 분리된 단백질의 분리 결과는 도 6의 2번 컬럼에 보여진다.
실시예 3: 항원 (Munc18) 의 정제
PC12 세포를 플레이트에 배양한 후, 배양액을 모두 제거하였다. 5ml의 차가운 PBS로 2회 세척하여 남아있는 배양액 성분을 모두 제거하였다. 세포용해액(1 mL, 10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Tx-100, 1% sodium deoxycholate)을 첨가한 뒤 1.5 mL 튜브에 담고 초음파를 가하여 모든 세포를 용해시켰다. 상기 용해액을 14000 rpm 의 속도로 원심분리하여, 0.7 mL의 상층액을 취하였다. 상기 상층액에 제조예 4에서 제조된 게스트 화합물-항체 복합체(30 ㎕)를 첨가한 뒤 4℃에서 24시간 천천히 회전하며 방치하였다. 제조예 1에서 제조된 모노아민 쿠커비투[7]릴-아가로즈 비드(40 ㎕)를 첨가하여 4℃에서 4시간 동안 천천히 회전시키며 방치하여 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액을1000 rpm의 속도로 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세포용해액을 첨가하여 세척하는 단계를 5회 반복하였다. 세척이 끝난 아가로즈 비드에 30 ㎕의 2X 샘플버퍼를 첨가한 뒤 95℃에서 5분간 가열하여 비드에 붙어있던 단백질을 모두 떼어내었다. SDS-PAGE를 이용하여 정제된 단백질이 68 KDa. 크기의 항원(Munc18)임을 도 6에서 확인하였다.
비교예 1 : 세포막 단백질의 정제
(페로센-N-하이드록시석신이미드(Ferrocene-NHS)계 게스트 화합물 사용)
게스트 화합물과 접촉하지 않은 HEK293 세포를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 세포막 단백질을 분리하였다. 상기 비교예 1에 따라 분리된 단백질의 분리 결과는 도 4의 1번 컬럼에 보여진다.
비교예 2 : 세포막 단백질의 정제
(아다만탄-N-하이드록시석신이미드(adamantane-S-S-NHS)계 게스트 화합물)
제조예 2에서 제조된 게스트 화합물과 접촉하지 않은 HEK293 세포를 용해한 용해액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 세포막 단백질을 분리하였다. 상기 비교예 2에 따라 분리된 단백질의 분리 결과는 도 5의 1번 컬럼에 보여진다.
상기 실시예 및 비교예들에 보여진 바와 같이 본 발명의 정제 방법에 의하여 생체 구성 성분을 용이하고 높은 선택성으로 분리할 수 있다.
도 1은 고체상에 연결된 호스트 화합물과 반응성 화합물에 연결된 게스트 화합물 사이에 형성된 상호 비공유 결합을 나타내는 개략도이다.
도 2는 제조예 1에 따른 아가로스 비드에 모노아민 쿠커비투[7]릴을 고정화시키는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 3은 실시예 1에 따른 세포 구성 성분의 분리 정제 방법의 개략도이다.
도 4는 실시예 1 및 비교예 1에 따라 분리 및 정제된 세포막 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 확인한 결과이다.
도 4는 실시예 2 및 비교예 2에 따라 분리 및 정제된 세포막 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 확인한 결과이다.
도 5는 실시예 3에 따라 분리 및 정제된 항원(Munc-18)을 SDS-PAGE를 통하여 확인한 결과이다.

Claims (22)

  1. 세포 구성 성분의 분리 방법으로서,
    a) 게스트(guest) 화합물이 연결된 반응성 화합물을 세포와 접촉시키는 단계;
    b) 상기 세포를 용해시키는 단계;
    c) 상기 세포가 용해된 용액에 호스트(host) 화합물이 연결된 고체상(solid phase)을 첨가하여 혼합액을 준비하는 단계;
    d) 상기 혼합액으로부터 세포 구성 성분에 연결된 게스트 화합물과 고체상에 연결된 호스트 화합물의 결합쌍(binding pair)을 분리, 정제하는 단계; 및
    e) 상기 결합쌍으로부터 상기 세포 구성 성분을 분리하는 단계;를 포함하며,
    상기 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물은 반응성 화합물과 하기 화학식 6의 게스트 화합물이 공유결합된 것이며,
    상기 호스트 화합물이 연결된 고체상은 고체상과 하기 화학식 1의 호스트 화합물이 공유결합된 것이며,
    상기 반응성 화합물이 생체 분자, N-하이드록시석신이미드, 항원, 항체, 압타머(aptamer), 엽산 및 트렌스페린으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 화합물인 방법:
    <화학식 1>
    Figure 112010050790208-pat00015
    상기 식에서,
    n은 6 내지 10의 정수이고, X는 O, S 또는 NH이며,
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 H, OR, SR, NHR, COOH, O(CH2)aS(CH2)bNH2 또는 O(CH2)aS(CH2)bCOOH 이며, 상기 a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 상기 R은 H, C1-C30 알킬, C2-C30 알케닐, C2-C30 알키닐, C2-C30 카르보닐알킬, C1-C30 티오알킬, C1-C30 알킬티올, C1-C30 히드록시알킬, C1-C30 알킬실릴, C1-C30 아미노알킬, C1-C30 아미노알킬티오알킬, C5-C30 시클로알킬, C2-C30 헤테로시클로알킬, C6-C30 아릴, C6-C30 아릴알킬, C4-C30 헤테로아릴, 및 C4-C30 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되나, A1 및 A2가 동시에 수소가 아니다.
    <화학식 6>
    Figure 112010050790208-pat00031
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 구성 성분이 세포막 단백질, 효소, 핵산, 단백질, 아미노산, 항체, 항원, 저해제, 비타민, 보조인자, 지방산, 세포막, 기질, 기질 유사물, 억제제, 조효소, 바이러스, 렉틴, 다당, 당단백, 수용체, 히스톤, ATP, ADP, 호르몬 수용체 및 글루타티온으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 생체 분자가 세포막 단백질, 효소, 핵산, 단백질, 아미노산, 항체, 항원, 저해제, 비타민, 보조인자, 지방산, 세포막, 기질, 기질 유사물, 억제제, 조효소, 바이러스, 렉틴, 다당, 당단백, 수용체, 히스톤, ATP, ADP, 호르몬 수용체 및 글루타티온으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 고체상이 고분자, 자성 입자, 고분자가 코팅된 자성 입자, 실리카겔, 아가로스겔, 고분자 또는 금이 코팅된 실리카겔, 지르코늄 산화물, 모노리틱 고분자, 금박막, 은박막, 유리, ITO(Indium Tin Oxide) 코팅된 유리, 실리콘, 금속 전극, 나노막대, 나노튜브, 나노와이어, 컬드란 검, 셀룰로오스, 나일론막, 세파로스 및 세파덱스로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 고체상이 말단 반응성 작용기를 표면에 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 말단 반응성 작용기가 할로겐기, 시아노기, 카르복실기, 아민기, 하이드록시기, 알릴옥시기 및 티올기로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 고체상이 비드(bead) 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 호스트 화합물이 하기 화학식 3 또는 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    <화학식 3>
    Figure 112008027111464-pat00016
    <화학식 4>
    Figure 112008027111464-pat00017
    상기, 식들에서 n 및 X는 제 1 항에 정의된 대로이다.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1에서 n=7이고, X=산소 원자인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 d) 단계와 e) 단계 사이에 환원제로 화학식 2의 게스트 화합물에 포함된 이황결합을 분리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계 및 b) 단계 대신에 하기 a ) 단계 및 b ) 단계가 적용되는 것을 특징으로 하는 방법:
    a ) 세포를 용해시키는 단계;
    b ) 상기 세포가 용해된 용액에 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물을 첨가하는 단계;
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계에서 게스트 화합물 대신에 호스트 화합물이 반응성 화합물에 연결되고, c) 단계에서 호스트 화합물 대신에 게스트 화합물이 고체상에 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 d) 단계의 정제에 사용되는 세척액이 메탄올, 트라이플루오르아세트산, 트라이에틸아민, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 톨루엔, 아세토니트릴, 크실렌, 클로로벤진, 테트라히드로퓨란, 디에틸에테르, 에탄올, 디글리콜 에테르, 실리콘 오일, 초임계 이산화탄소, 이온성 액체, N-메틸피롤리딘, 피리딘, 물, 암모늄 히드록시드, 디옥세인 및 클로로포름으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 d) 단계의 정제에 사용되는 세척액이 트리스-염산, 소듐클로라이드, EDTA, SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), triton X-100, triton x-114, tween-20, tween-80, Brij-35, Brij-58, 옥틸-베타-글루코사이드, OGT, CHAPS, CHAPSO, 소듐디옥시콜레이트, NP-40(Nonidet P-40), 프로티에즈인히비터, 파이로포스페이트, 베타-글리세로포스페이트, 소듐플로라이드 및 소듐바나데이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. a) 호스트 화합물이 연결된 고체상; 및
    b) 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물;을 포함하는 키트로서,
    상기 호스트 화합물이 연결된 고체상은 고체상(solid phase)과 하기 화학식 1의 호스트(host) 화합물이 공유결합된 것이며,
    상기 게스트 화합물이 연결된 반응성 화합물은 반응성 화합물과 하기 화학식 6의 게스트(guest) 화합물이 공유결합된 것이며,
    상기 반응성 화합물이 생체 분자, N-하이드록시석신이미드, 항원, 항체, 압타머(aptamer), 엽산 및 트렌스페린으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물인 키트:
    <화학식 1>
    Figure 112010050790208-pat00020
    상기 식에서,
    n은 6 내지 10의 정수이고, X는 O, S 또는 NH이며,
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 H, OR, SR, NHR, COOH, O(CH2)aS(CH2)bNH2 또는 O(CH2)aS(CH2)bCOOH 이며, 상기 a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 상기 R은 H, C1-C30 알킬, C2-C30 알케닐, C2-C30 알키닐, C2-C30 카르보닐알킬, C1-C30 티오알킬, C1-C30 알킬티올, C1-C30 히드록시알킬, C1-C30 알킬실릴, C1-C30 아미노알킬, C1-C30 아미노알킬티오알킬, C5-C30 시클로알킬, C2-C30 헤테로시클로알킬, C6-C30 아릴, C6-C30 아릴알킬, C4-C30 헤테로아릴, 및 C4-C30 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되나, A1 및 A2가 동시에 수소가 아니다
    <화학식 6>
    Figure 112010050790208-pat00032
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 생체 분자가 세포막 단백질, 효소, 핵산, 단백질, 아미노산, 항체, 항원, 저해제, 비타민, 보조인자, 지방산, 세포막, 기질, 기질 유사물, 억제제, 조효소, 바이러스, 렉틴, 다당, 당단백, 수용체, 히스톤, ATP, ADP, 호르몬 수용체 및 글루타티온으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 고체상이 고분자, 자성 입자, 고분자가 코팅된 자성 입자, 실리카겔, 아가로스겔, 고분자 또는 금이 코팅된 실리카겔, 지르코늄 산화물, 모노리틱 고분자, 금박막, 은박막, 유리, ITO(Indium Tin Oxide) 코팅된 유리, 실리콘, 금속 전극, 나노막대, 나노튜브, 나노와이어, 컬드란 검, 셀룰로오스, 나일론막, 세파로스 및 세파덱스로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 호스트 화합물이 하기 화학식 3 또는 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 키트:
    <화학식 3>
    Figure 112008027111464-pat00021
    <화학식 4>
    Figure 112008027111464-pat00022
    상기, 식들에서 n 및 X는 제 1 항에 정의된 대로이다.
  20. 제 16 항에 있어서, 상기 화학식 1에서 n=7이고, X=산소 원자인 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 삭제
  22. 제 16 항에 있어서, 상기 게스트 화합물 대신에 상기 호스트 화합물이 반응성 화합물에 연결되고, 상기 호스트 화합물 대신에 상기 게스트 화합물이 고체상에 연결된 것을 특징으로 하는 키트.
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