KR20070109874A - 기질표면 처리 및 특이적 단백질 고정용 링커분자, 및 그제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기질 표면에 단백질을 고정하기 위한 링커분자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 단백질 고정화 리간드의 양 말단에 각각 기질에 결합하는 기능단과 단백질에 결합하는 기능단을 가지는 링커분자, 그 제조방법, 및 상기 링커분자를 매개로 단백질을 고정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 링커분자는 금, 은, 반도체, 세라믹, 유리, 실리콘 및 고분자로 구성되는 군으로부터 선택되는 기질에 자기조립 단분자층 (self-assembled monolayer)을 형성하여 단백질을 고정하는 과정에서 비특이적 결합을 최소화할 수 있어 바이오칩, 바이오센서 및 기타 단백질 고정용 담체 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
링커분자, 단백질칩, 단백질 고정화
Description
도 1은 금 박막 표면에 자기조립 단분자층을 형성하는 링커 1의 구조를 이용하여 링커가 기질에 배열되는 원리를 표현한 것이다 (A: 기질표면 부착을 위한 기능부분; B: 비특이적 결합 저해부분; 및 C: 셍체분자 고정화를 위한 기능부분).
도 2는 유리 표면에 자기조립 단분자층을 형성하는 글루타치온 (glutathione) 도입 링커분자의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 자기조립 단분자층을 형성하는 글루타치온 (glutathione) 도입 링커분자 1의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 4는 자기조립 단분자층을 형성하는 글루타치온 (glutathione) 도입 링커분자 2의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 5는 자기조립 단분자층을 형성하는 나이트릴로트리아세트산 (nitrilotriacetec acid) 도입 링커분자 3의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 6은 자기조립 단분자층을 형성하는 이미도다이아세트산 (imidodiacetic acid) 도입 링커분자 4의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 7은 자기조립 단분자층을 형성하는 베타싸이클로덱스트린 (β-cyclodextrin) 칩 표면처리용 링커분자 5의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 8은 금 박막에 결합된 자기조립 단분자층에 글루타치온 S-전이효소가 태그된 스타필로코칼 protein G를 고정화한 다음, 항원-항체 결합의 배향성을 나타낸 것이다 (EGFP: 녹색형광단백질(항원); GST: 글루타치온 S-전이효소; LA-GSH Ligand: 리포산-글루타치온 자기조립 단분자층; 및 Carboxylated Dextran: CM-5 (비어코아 제품). (a)는 본 발명에 따른 링커의 자기조립 단분자층을 이용한 것이고, (b)는 CM-5 칩 (Biacore 제품)을 이용한 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 자기조립 단분자층이 결합된 금 박막 표면에 글루타치온 S-전이효소가 태그된 스타필로코칼 protein G와 CM-5 표면에 고정된 스타필로코칼 protein G의 고정화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 자기조립 단분자층 금 박막 표면에 스타필로코칼 protein G를 고정한 후, 면역글로불린 (immunoglobulin) 단백질을 투여하여 실시간 항원-항체 결합을 표면 플라즈몬 공명현상으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 링커분자를 이용한 바이오칩을 형광 실험에 활용한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 분야
본 발명은 기질에 단백질을 고정하기 위한 링커분자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 단백질 고정화 리간드의 양 말단에 각각 기질에 반응하여 결합을 형성하는 기능단 및 단백질과 결합하는 물질을 가지는 링커분자, 그 제조방법, 및 상기 링커분자를 매개로 단백질을 고정하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
바이오 칩 또는 바이오센서를 구성하는 핵심 기술 중 하나가 단백질 고정화 기술이다. 단백질을 고체 기질 표면에 고정하는 기존의 방법은 방향성 없이 멤브레인에 물리적인 흡착이나 멤브레인, 혹은 비선택적인 화학반응에 의한 공유결합 형성 방식을 이용하고 있다. 최근에는 켈릭스크라운 유도체 (calixcrown derivative)를 이용하여 항체의 방향성을 조절하는 방식이 보고되었다 (Han, M. et al., Proteomics., 3:2289, 2003). 이 밖에 단백질에 바이오틴(biotin)을 결합시킨 후, 이 단백질을 스트렙타비딘(streptavidin)이나 아비딘(avidin)으로 처리된 고체표면에 적용시킴으로써 바이오틴-스트렙타비딘/아비딘 결합을 이용하여 단백질을 고정하는 방법이 발표되었으며, 고분자를 이용하여 비특이적인 결합을 줄여주는 방식도 등장하였다. 또한 금 박막을 사용할 경우 고가의 덱스트란 (dextran) 고분자 표면이 사용되는데, 이는 현재 사용되는 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용한 측정 방법에서 대표적으로 이용되고 있다.
그러나 이들 방법은 표면 처리에 많은 비용과 시간이 요구되며, 특정한 단백 질에 대하여 반응하는 것이 아니라 비특이적으로 모든 단백질을 고정시키며, 고정된 단백질의 배향성이 좋지 않다. 이 외에도 비특이적 결합을 방지하기 위하여 단백질을 고순도로 정제하여 사용해야 한다는 단점도 있다.
바이오센서나 바이오칩, 고정화용 담체에서 기질에 고정되는 단백질의 비특이적인 결합을 최소화하고자 올리고 또는 폴리에틸렌그룹을 이용하는 표면의 개발이 1990년대부터 꾸준히 진행되어왔다 (Witesides, G. et al. Chem . Rev., 105:1103, 2005). 이는 단백질의 비특이적 결합을 저해하는데 크게 기여하는 물질로, 이를 이용하여 단백질이나 세포를 고정하는 방법이 많이 사용되며, 이를 이용한 링커의 합성방법 및 응용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
비아코아(Biacore)사에서는 덱스트란으로 표면을 처리한 칩과 NTA를 덱스트란에 결합하여 표면을 처리한 칩을 개발하여 시판하고 있다. 기질에 고정된 NTA는 금속이온을 매개로 하여 히스티딘과 잘 결합함으로써 히스티딘을 가진 생체물질의 고정화가 가능하다. 그러나, 상기 바이오 칩은 비아코아사의 SPR센서를 이용하여야만 하고, 기질이 금 박막으로 국한되어 있으므로 활용도가 떨어진다.
종래 단백질 고정화 방법으로는, 플라즈마를 이용하여 기판위에 활성기(화학결합에 의해 단백질을 고정하기 위한 화학적 작용기)를 집적시켜 단백질을 고정하는 방법(한국특허 제448880호), 고체기판 표면에 졸-겔(sol-gel) 법을 이용하여 비표면적이 충분히 증가된 다공성 졸-겔 박막을 형성한 후에, 상기 다공성 박막에 물리적 흡착으로 단백질을 고정하는 방법(한국특허 제577694호), 플라즈마 반응에 의하여 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 표면에 항혈전성 단백질을 고정하는 방법(한 국특허 제491700호) 및 양이온성 아미노 잔기가 2개의 효소에 2개 이상 연속적으로 융합된 효소를 결합시키는 단백질 고정화 효소를 제공하여 단백질을 고정하는 방법(한국공개특허 제10-2003-0034136호) 등이 알려진 바 있다.
그러나 이러한 종래 방법은 화학적 공정에 의한 단백질의 변성, 물리적 흡착에만 의존하는 단백질 고정방법으로 인한 단백질 고정화 능력의 저하, 표면 개질 비용의 증대와 장시간 소요 및 대량 생산의 어려움 등과 같은 단점이 있다.
또한, 기질을 이용하여 고체상 지지대에 결합되어 있는 소수성 고분자 층에 단백질을 고정하는 방법(WO 2003/072752), 플라스틱 표면에서 완충성분을 이용하여 단백질을 고정하는 방법(EP 0916949) 및 알코올용액에서 소수성 표면을 가지는 고체표면에 단백질을 접촉시켜 단백질을 고정하는 방법(WO 2005/070968) 등이 공개된 바 있으나, 아직 본 발명이 속하는 기술분야에서 링커분자를 이용하여 기질표면에 재조합 단백질을 특이적으로 고정하는 방법은 알려진 바 없다.
따라서 상기 문제점들을 해결하고 순수하게 정제된 단백질뿐만 아니라 복잡한 단백질 혼합물인 세포 배양액으로부터 친화적 태그를 가지는 재조합 단백질을 특이적으로 기질표면에 고정할 수 있는 새로운 방법의 개발이 시급히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 표적 단백질에 대한 고도의 결합특이성과 함께 고도의 배향성을 부여하는 단백질 고정화 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 기질 에서 자기조립 단분자층을 형성하는 물질 및 단백질과 친화적 결합을 형성하는 물질이 각각 결합되어 있는 링커분자를 사용함으로써 고도의 배향성과 특이성을 가지는 단백질칩을 제작할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 기존의 기질표면에 단백질을 고정하는 과정에서 발생하는 배향성 결여, 비특이적 및 고정용 단백질에 대한 고가의 정제비용 등의 문제를 최소화할 수 있는, 기질표면에 단백질을 고정하기 위한 링커분자 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 링커분자를 이용한 단백질 칩, 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 링커분자를 이용한 고정화 단백질 및 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 단백질의 비특이적 결합을 저해하는 단백질 고정화 리간드(B)의 일측 말단에, 기질표면에서 자기조립 단분자층을 형성하는 물질(A)을 결합하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 고정화 리간드의 타측 말단에 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)을 결합하는 단계를 포함하는 기질에 단백질을 고정하기 위한, A-B-C 형태의 링커분자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 고정화 리간드(B)는 양 말단이 아민으로 치환된 올리고에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질은 단백질에 친화성인 물질로 태그된 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질에 친화성인 물질로 태그된 단백질은 글루타치온 S-전이효소로 태그된 단백질, 말토즈결합 단백질로 태그된 단백질 및 히스티딘으로 태그된 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 단백질의 비특이적 결합을 저해하는 단백질 고정화 리간드(B)의 양 말단에, 기질표면에서 자기조립 단분자층을 형성하는 물질(A) 및 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)이 각각 결합되어 있는, 기질에 단백질을 고정화하기 위한, A-B-C 형태의 링커분자를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 고정화 리간드(B)는 올리고에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커분자는 화학식(Ⅰ)의 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있고,
(Ⅰ)
여기서, X, Y는 단백질과 결합하는 물질이고, 다음 화학식 (III)의 기능단을 포함하며, n은 2 내지 100이다.
(
III
)
본 발명에 있어서, 상기 Y는 L-환원 글루타치온, 이미노다이아세트산 (iminodiacetic acid), 니트로트리아세트산 (nitrilotriacetic acid), 말토즈 유도체, 갈락토즈, 칼모듈린, 바이오틴, 키틴, 셀룰로즈, 씨-믹 (C-myc), 티오레독신 (thioredoxine), 인테인 (intain), S-펩타이드, 및 DNA로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식(I)의 구조식을 갖는 링커분자는 링커분자 1~5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커분자는 화학식(Ⅱ)의 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있고,
(Ⅱ)
여기서, 트리에톡시실란 부분은 유리표면에 고정되기 위한 기능단이고, X, Y 는 다음 화학식 (III)의 기능단을 포함하며, n은 2 내지 100이다.
(
III
)
본 발명에 있어서, 상기 Y는 L-환원 글루타치온, 이미노다이아세트산 (iminodiacetic acid), 니트로트리아세트산 (nitrilotriacetic acid), 말토즈 유도체, 갈락토즈, 칼모듈린, 바이오틴, 키틴, 셀룰로즈, 씨-믹 (C-myc), 티오레독신 (thioredoxine), 인테인 (intain), S-펩타이드, 및 DNA로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 상기 A-B-C 형태의 링커분자를 기질에 도입하여, 기질표면에서 자기조립 단분자층을 형성하는 물질(A)을 통해 기질상에 상기 링커분자의 자기조립 단분자층을 형성하고, 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)을 노출시키는 단계; 및 (b) 상기 노출된 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)에 단백질을 결합시키는 단계를 포함하는 단백질 칩의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 A-B-C 형태의 링커분자를 매개로 기질상에 단백질이 결합되어 있는 단백질 칩을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명은 상기 A-B-C 형태의 링커분자를 매개로 단백질 고정용 담체에 단백질을 고정하는 것을 특징으로 하는 단백질의 고정화 방법, 및 상 기 A-B-C 형태의 링커분자를 매개로 단백질 고정용 담체에 단백질이 결합되어 있는 고정화 단백질을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
일 관점에서, 본 발명은 (a) 단백질의 비특이적 결합을 저해하는 단백질 고정화 리간드(B)의 일측 말단에, 기질표면에서 자기조립 단분자층을 형성하는 물질(A)을 결합하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 고정화 리간드의 타측 말단에 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)을 결합하는 단계를 포함하는, 기질에 단백질을 고정하기 위한, A-B-C 형태의 링커분자를 제조하는 방법, 및 상기 방법에 의해 제조되고, 단백질의 비특이적 결합을 저해하는 단백질 고정화 리간드(B)의 양 말단에, 기질표면에서 자기조립 단분자층을 형성하는 물질(A) 및 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)이 각각 결합되어 있는, 기질에 단백질을 고정화하기 위한, A-B-C 형태의 링커분자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 고정화 리간드는 양 말단이 아민으로 치환된 올리고에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 단백질은 단백질에 친화성인 태그를 포함하는 단백질인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 단백질에 친화성인 태그는 글루타치온 S-전이효소와 말토즈결합 단백질과 같은 단백질, 히스티딘 등인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 링커분자는 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ의 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 화학식 I에서 n은 2~100이다.
[Ⅰ]
[Ⅱ]
여기서, X, Y는 다음 화학식 [III]의 어느 하나를 택하여 사용할 수 있으며, 이는 아민이나 싸이올(SH)을 포함하는 단백질 혹은 화합물과 반응하는 기능단 (예: maleimide, maleimidopropionic acid 또는 N-hydroxysuccinimido ester) 인 것을 특징으로 할 수 있다.
[
III
]
본 발명에 있어서, 상기 화학식 [III]에는 L-환원 글루타치온, 이미노다이아세트산 (iminodiacetic acid), 나이트릴로트리아세트산 (nitrilotriacetic acid), 베타-사이클로덱스트린 (β-cyclodextrin)과 같은 말토즈 유도체, 갈락토즈 (galactose), 칼모듈린 (calmodulin), 바이오틴 (biotin), 키틴 (chitin), 셀룰로즈, 씨-믹 (C-myc), 티오레독신 (thioredoxine), 인테인 (intain), S-펩티드(S-peptide) 및 DNA로 구성되는 군에서 선택되는 것과 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 화학식 [Ⅰ]과 결합하는 기질은 금 또는 은인 것을 특징으로 할 수 있고, 화학식 [II]에 결합하는 기질은 실리콘, 유리 또는 세라믹인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 화학식 [Ⅰ]의 링커분자는 LA-GSH (리포산-글루타치온, 링커분자 1 또는 2), LA-NTA (리포산-나이트릴로트리아세트산, 링커분자 3), LA-IDA (리포산-이미노다이아세트산, 링커분자 4), 또는 LA-β-cyclodextrin (리포산-베타사이클로덱스트린, 링커분자 5)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 자기조립 단분자층을 형성하는 링커분자를 이용하여 형성된 바이오칩이나 바이오센서의 기질은 고정화되는 단백질의 배향성을 바르게 조절하며 측정 민감도를 높이는 등 다양하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 링커분자는 금, 은, 반도체, 세라믹, 유리, 실리콘 및 고분자로 구성되는 군으로부터 선택되는 기질에 자기조립 단분자층 (self-assembled monolayer)을 형성하여 단백질을 고정하는 과정에서 비특이적 결합을 최소화할 수 있어 바이오칩, 바이오센서 및 기타 단백질 고정용 담체 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 A-B-C 형태의 링커분자를 기질에 도입하여, 기질표면에서 자기조립 단분자층을 형성하는 물질(A)을 통해 기질상에 상기 링커분자의 자기조립 단분자층을 형성하고, 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)을 노출시키는 단계; 및 (b) 상기 노출된 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)에 단백질을 결합시키는 단계를 포함하는 단백질 칩의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조되고, 상기 A-B-C 형태의 링커분자를 매개로 기질상에 단백질이 결합되어 있는 단백질 칩에 관한 것이다.
본 발명에서, 링커분자는 구체적으로 단백질에 친화성인 태그를 갖는 재조합 단백질을 기질에 고정화시키는 방법에서 사용되는 자기조립 단분자층을 형성하는 화합물을 의미한다 (도 1). 도 1에서 (A) 부분은 기질에 자기조립 단분자층을 결합시키기 위한 물질로써, 구체적으로 도 3에서 보여주는 링커분자 1은 금이나 은 박막 표면에 잘 흡착되어 안정적이고, 단분자층을 형성할 수 있는 다이설파이드 (disulfide) 그룹을 포함하고 있다. 도 1의 (B) 부분은 단백질과 고체 표면과의 거리를 유지하게 함과 동시에 비특이적 결합을 억제하는 효율적인 스페이서 (spacer) 그룹으로 올리고에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 리간드를 이용함으로써 상기 목적을 달성할 수 있다. 마지막으로 도 1의 (C) 부분은 친화적 태그를 가지는 재조합 단백질을 고정하기 위한 물질로 구성된다.
한편, 대장균에서 다세포 생물 유래 단백질을 재조합 단백질 형태로 생산하 는 경우, 대부분 목적 단백질이 세포 내에서 활성이 없는 불용성 응집체(inclusion body)의 형태로 생산되는 단점이 있다. 상기 문제점을 해결하기 위하여 물에 대한 용해도가 높은 친화성 단백질 태그를 목적 단백질에 융합하여 발현시킴으로써 목적 단백질을 안정적으로 발현시키고 아울러 분리 및 정제도 용이하게 할 수 있는 기술이 개발되어왔다 (Nilsson, B. et al., Curr . Opion . Struct . Biol ., 2:569, 1992; Nygren, P. et al., Trends Biotechnol ., 12:184). 본 발명에서 사용되는 단백질에 친화성인 단백질로 태그된 재조합 융합 단백질은 상기 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명에서는 구체적으로 친화성 태그된 재조합 단백질을 효과적으로 기질에 결합시키기 위한 친화적 리간드 합성을 위해서 양쪽 말단이 아민으로 치환된 올리고에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜을 도 1의 (B) 부분의 합성을 위한 출발물질(단백질 고정화 리간드)로 사용한다.
도 1의 (A) 부분은 기질에 결합하기 위한 물질로써 금이나 은 박막에 대해서는 리포산을 사용하고, 세라믹, 유리 또는 실리콘 표면에 대해서는 상기 리포산 대신, 도 2에 나타낸 것과 같이, 트리에톡시실란 (trimethoxysilane)을 가지며 타측 말단에는 CONH, NCO, 또는 C(O)CH2를 가지는 링커를 사용할 수 있다.
도 1의 (C) 부분인 단백질과 친화적 결합을 하는 물질에는 글루타치온 S-전이효소가 태그된 단백질과 친화적 결합을 하는 글루타치온을 결합시키고, 말토즈결합 단백질 (maltose binding protein; MBP)이 태그된 단백질을 고정하기 위해서는 베타-사이클로덱스트린 (β-cyclodextrin)으로 결합시키며, 그리고 니켈 금속이온과 배위 결합하는 히스티딘이 태그된 단백질은 금속이온과 착화합물을 형성하는 나이트릴로트리아세트산 (nitrilotriacetic acid; NTA) 또는 이미노다이아세트산 (iminodiacetic acid; IDA)을 결합시킨다.
예를 들면, 글루타치온 S-전이효소 (glutathione S-transferase; GST)가 태그된 단백질과의 친화적 결합을 위해서 (C) 부분을 글루타치온 (glutathione)으로 수식한다. 이를 위해서, 도 3에 제시된 것과 같이, 리포산과 말레이미도프로피온산을 아민과 특이적으로 반응하는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 중간체 8과 18의 형태로 각각 제조한다.
α,ω-다이아미노 올리고에틸렌글리콜 11과 화합물 8을 반응시켜 중간체 9를 합성하고, 이어서 중간체 9와 화합물 18을 반응시켜 화합물 10을 제조하였다.
화합물 8과 α,ω-다이아미노 올리고에틸렌글리콜 11과의 반응에서는 α,ω-다이아미노 올리고에틸렌글리콜을 10배 이상 사용하여야 하나의 아민만 리포산과 결합한 1차 중간 생성물 9가 충분히 생성된다.
한쪽 아민이 리포산과 결합한 1차 중간 생성물 9와 말레이미도프로피온산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS) 18과의 반응은 1 대 1 비율로 이루어져 2차 중간 생성물 10이 만들어진다.
이렇게 제조된 화합물 10을 메탄올 용액에서 글루타치온 19와 반응시킴으로써 최종 목표물질인 링커분자 1을 제조하였다.
도 4에 제시된 링커분자 2는 도 3의 링커분자 1과 같은 방법으로 글루타치온 을 도입할 수 있다. 링커분자 2의 합성을 위하여 우선 화합물 20을 올리고에틸렌글리콜(또는 폴리에틸렌글리콜) 11과 반응시킴으로써 한쪽 말단이 t-butoxycarbonyl (Boc)로 보호된 다이아민 중간체 12를 합성한 후 반대쪽 아민기를 말레산 무수물 21과 반응시킴으로써 중간체 14를 제조하였다. 이어서 삼불화아세트산을 사용하여, Boc기를 제거함으로써 아민기를 재생시킨 중간체 15를 제조하였다. 중간체 15는 중간체 8과 반응시킴으로써 링커분자 6을 제조하는데 이용되었다. 링커분자 6은 글루타치온으로 처리하여 또 다른 링커분자 2를 제조하였다.
도 5의 링커분자 3은 히스티딘이 태그된 단백질을 고정하는데 사용되며 합성방법은 아래와 같다. 도 3 및 도 4에서 제시된 중간체 8과 중간체 12의 반응으로부터 형성된 중간체 16을 삼불화아세트산으로 처리하여 Boc 보호기를 제거함으로써 말단에 아민기가 재생된 중간체 9를 합성하였다. 중간체 9를 주석산무수물(succinic anhydride, 22)과 반응시켜 말단에 카르복실기를 가진 중간체 17을 합성하고, 이어서 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 중간체 7을 형성시킨 후 니트릴로트리아세트산(NTA, 화합물 23)으로 처리하여 최종 링커분자 3을 합성하였다.
도 6의 링커분자 4는 링커분자 3과 마찬가지로 히스티딘이 태그된 단백질을 고정할 수 있으며 도 4의 중간체 7에서 NTA (23) 대신 IDA (24)를 반응시킴으로써 제조된다.
도 7에 제시된 링커분자 5는 말토즈 결합단백질 (MBP)이 태그된 단백질을 고정하는데 사용되며, 도 3에 제시된 중간체 9에 모노토실 β-사이클로덱스트린을 반응시켜서 제조하였다.
시작물질 중 하나인, 다이아민으로 치환된 올리고에틸렌글리콜에서 에틸렌글리콜의 수는 2개 내지 원하는 수(수십 내지 수백) 만큼을 사용할 수 있다.
상기 반응으로 얻어진 링커분자를 이용하여 4시간 이내에 단백질에 친화적인 물질로 태그된 재조합 단백질의 고정을 위한 표면을 만들 수 있다. 본 발명에서 친화성 태그란 특정물질에 특이적으로 결합하는 태그를 의미하며, 예를 들면, 글루타치온 S-전이효소 태그, 말토즈결합 단백질 태그 및 히스티딘 태그 등을 들 수 있다. 이렇게 제조된 링커분자는 항원-항체, 단백질-단백질, 단백질-작은 분자간의 결합을 측정하는 바이오센서, 바이오칩 및 단백질 고정용 담체에 재조합 단백질 고정화를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 A-B-C 형태의 링커분자를 매개로 단백질 고정용 담체에 단백질을 고정하는 것을 특징으로 하는 단백질의 고정화 방법 및 상기 방법에 의해 제조되고, 상기 A-B-C 형태의 링커분자를 매개로 단백질 고정용 담체에 단백질이 결합되어 있는 고정화 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 고정용 담체로는 단백질 고정용 멤브레인, 비드 등을 들 수 있다.
본 발명에서는 기질에 자기조립 단분자층 형성에 의한 단백질 고정 여부를 확인하기 위하여 표면 플라즈몬 공명센서 실험을 수행하였다.
상기에 합성된 링커분자를 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide; DMSO)에 녹이고, 금 박막이 입혀진 표면 플라즈몬 공명 센서칩을 3시간 동안 침지시켜 자기조립 단분자층을 형성시킨다.
본 발명에서 자기조립이란 원자간 공유결합 또는 분자 상호인력에 의하여 자발적으로 나노구조를 형성함으로써 특정 구조를 이루어, 이들이 새로운 물성을 발휘하는 현상으로, 대표적으로 자기조립막 (self-assembled monolayer), DNA를 포함하는 바이오 물질, 나노 및 마이크로 입자 등이 이러한 현상을 나타낸다.
도 9에 나타난 바와 같이, 글루타치온 S-전이효소가 태그된 스타필로코칼 protein G를 침지시켰을 때의 표면 플라즈몬 공명 센서그램은 1300RU로 짧은 시간에 효과적인 단분자 단백질 층이 형성됨을 확인하였다.
많은 경우 단백질층이 형성되었다 할지라도 활성 부위가 표면에 고정되는 등 여러 가지 이유로 고정화 과정에서 단백질이 활성을 잃어버리는 경우가 발생하는데, 본 발명에서 사용된 글루타치온 S-전이효소 태그된 스타필로코칼 protein G의 활성은 용액 중의 항체를 특이적으로 결합하는지 여부로 판단할 수 있다.
도 8은 본 발명에 따른 자기조립 링커가 결합된 표면 플라즈몬 공명 센서칩 표면에 형성된 글루타치온 S-전이효소가 태그된 스타필로코칼 protein G가 용액 중에 존재하는 항체를 흡착시키는 과정을 나타내는 모식도이며, 도 10은 상용화된 CM-5에 비해서 본 발명으로 개발된 링커분자가 월등히 많은 항체를 고정시킴을 보여준다.
많은 경우 고정화된 단백질(여기서는 글루타치온 S-전이효소가 태그된 스타필로코칼 protein G)이 그 활성을 잃어버리는데, 그 원인 중 하나는 표면과 지속적인 접촉에 의하여 (비특이적 상호작용) 단백질의 3차 구조가 변형되거나 해체되기 때문이다.
올리고에틸렌글리콜은 이전부터 단백질의 비특이적 상호작용을 억제한다고 알려졌으며, 본 발명에서 사용된 비특이적인 결합을 최소화하는 도 1의 (B) 부분은 올리고에틸렌글리콜을 그대로 사용하고 있으므로, 단백질을 특이적으로 고정화시켜주는 물질인 도 1의 (C) 부분과 더불어 기질에 고정된 글루타치온 S-전이효소가 태그된 단백질의 활성 유지에 올리고에틸렌글리콜이 포함된 링커분자가 기여한다고 할 수 있다.
도 9에 나타난 표면 플라즈몬공명 실험결과는 본 발명에 따른 글루타치온 링커분자의 효능을 나타낸다. 기존에 상용화된 표면 플라즈몬 공명 센서칩에 비해서 비슷하거나 다소 적은 정도의 글루타치온 S-전이효소를 고정하지만 연결된 단백질의 활성은 뛰어나다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1: 자기조립
단분자층을
형성하는
글루타치온
링커분자
1의 합성(도 3)
(1) N-
리포일
-2,2‘-(에틸렌-1,2-
다이옥시
)
비스에틸아마이드
(중간체 9)의 합성
375 ㎎의 리포산 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS) 에스테르 8을 20 ㎖의 메틸렌클로라이드에 녹인 후, 1.9 g의 2,2'-(에틸렌다이옥시)비스(에틸아민) [2,2’-(ethylene-1,2-dioxy)bis (ethylamine), 11]과 0.35 g의 트라이에틸아민 (triethylamine)을 가하고 상온에서 6시간 동안 교반하였다.
침전된 NHS를 여거하고 용매를 감압유거한 후, 잔류물을 20 ㎖의 클로로포름에 다시 녹인 용액을 증류수로 3번 씻어주었다. 유기층을 포화소금용액으로 한 번 더 씻어준 후, 무수 황산마그네슘 (anhydrous MgSO4)으로 건조하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그라피 (클로로포름:메탄올=2:1)로 정제하여 185 ㎎의 화합물 9를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
『1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.5 (m, 2H: -CH-CH2- CH 2 -CH2-CH2- COOH), 1.6 ~ 1.7 (m, 4H: -CH- CH 2 -CH2- CH 2 -COOH), 1.9 (sextet, J = 6Hz, 1H: -S-CH2- CH 2 -CH-S-), 2.2 (t, J = 9Hz, 2H: -CH2-CH2- CH 2 -COOH), 2.5 (sextet, J = 6 Hz, 1H: -S-CH2- CH 2 -CH-S-), 2.9 (t, J = 5Hz, 2H: -O-CH2- CH 2 -NH2), 3.1~3.2 (m, 2H: -S- CH 2 -CH2- CH -S-), 3.5 (m, 2H: -CONH- CH 2 -CH2-O-), 3.5~3.6 (m, 5H: 1H for -S- CH 2 -CH2-CH-S- and 4H for(-CH2-O- CH 2 -CH2-NH2 or -NHCO-)2), 3.6 (s, 4H: (- CH 2 -O-CH2-CH2-NH2 or -NHCO-)2』.
(2)
N-
리포일
-
N'
-(3-
말레이미도
)
프로피오닐2
,2‘-(에틸렌-1,2-
다이옥시
)
비스에틸아마이드
(중간체 10)의 합성
80 ㎎의 화합물 9를 10 ㎖의 메틸렌클로라이드에 녹인 후, 70 ㎎의 화합물 18과 50 ㎕의 트라이에틸아민을 가하고 상온에서 6시간동안 교반하였다. 침전된 NHS를 여거하고 용매를 감압유거한 후, 잔류물을 20 ㎖의 클로로포름에 다시 녹인 후 용액을 증류수로 3번 씻어주었다. 유기층을 포화소금용액으로 한 번 더 씻어준 후, 무수 황산마그네슘 (anhydrous MgSO4)으로 건조하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그라피 (클로로포름:메탄올=1:2)로 정제하여 73 ㎎의 화합물 10을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
『1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.5 (m, 2H: -CH-CH2- CH 2 -CH2- CH2-CONH-), 1.6 ~ 1.7 (m, 4H: -CH- CH 2 -CH2- CH 2 -CONH-), 1.9 (sextet, J = 6Hz, 1H: -S-CH2- CH 2 -CH-S-), 2.2 (t, J= 9Hz, 2H: -CH2-CH2- CH 2 -CONH), 2.5 (sextet, J = 6 Hz, 1H: -S-CH2- CH 2 -CH-S-), 2.6 (t, J=7 Hz, 2H: (-CH-CO-)2N-CH2- CH 2 - NHCO-, MPA part), 3.1~3.2 (m, 2H: -S- CH 2 -CH2- CH -S-), 3.5 (m, 4H: -(CONH- CH 2 -CH2-O-)2), 3.5~3.6 (m, 5H: 1H for -S- CH 2 -CH2-CH-S- and 4H for(-CH2-O- CH 2 -CH2-NHCO-)2, MPA part), 3.6 (s, 4H: (- CH 2 -O-CH2-CH2- NHCO-)2), 3.8 (t, J = 7 Hz, 2H: (-CH-CO-)2N- CH 2 -CH2-NHCO-, MPA part), 6.7 (s, 2H: (- CH -CO-)2N-CH2-CH2-NHCO-, MPA part)』.
(3) N-
리포일
-
N'
-(3‘-베타-(
글루타치온
S)-
숙신이미도)프로피오닐
-2,2‘-(에틸렌-1,2-
다이옥시
)
비스에틸아마이드
(1)의 합성
50 ㎎의 중간체 10을 10 ㎖의 메탄올에 녹인 후, 상온에서 교반하면서 30 ㎎의 글루타치온 19를 증류수 1 ㎖에 녹여 만든 용액을 0.01 ㎖/분의 속도로 1시간 40분 동안 적가한 후 1.5시간 동안 더 교반하였다. 용매를 감압유거한 후, 잔류물을 메탄올 및 에틸 에테르로 여러 번 씻어 내고 잔류물을 진공 건조하여 최종 생성물인 링커분자 1을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
『1H-NMR (300 MHz, D2O): 1.5 (m, 2H: -CH-CH2- CH 2 -CH2-CH2-CONH-), 1.6 ~ 1.7 (m, 4H: -CH- CH 2 -CH2- CH 2 -CONH-), 1.9 (sextet, J = 6Hz, 1H: -S-CH2- CH 2 -CH-S-), 2.1 (q, J=7.4, 2H in GSH), 2.2 (t, J = 9Hz, 2H: -CH2-CH2- CH 2 - COOH), 2.4~2.6 (1H for -S-CH2- CH 2 -CH-S-, 2H for (-CH-CO-)2N-CH2- CH 2 - NHCO-) and 2H in GSH), 2.7 (m, 1H in MPA), 3.0 (m, 2H in GSH and 1H in MPA) 3.1~3.2 (m, 2H: -S- CH 2 -CH2- CH -S-), 3.5 (m, 4H: -(-CH2-O-CH2- CH 2 - NHCO-)2), 3.5~3.6 (m, 5H: 1H for -S- CH 2 -CH2-CH-S- and 4H for (-CH2-O- CH 2 - CH2-NHCO-)2), 3.6 (s, 4H: (- CH 2 -O-CH2-CH2-NHCO-)2), 3.8 (m, 2H for (CH- CO-)2N- CH 2 -CH2-NHCO- and 1H in GSH), 3.9 (s, 2H in GSH), 4.0 (m, 1H in MPA), 4.5 (t, J=10 Hz, 1H in GSH)』.
실시예
2: 자기조립
단분자층을
형성하는
글루타치온
링커분자
2의 합성 (도 4)
(1) N-
Boc
-2,2‘-(에틸렌-1,2-
다이옥시
)
비스에틸아민
(중간체 12)의 합성
1 g의 2,2’-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스(에틸아민) (11)을 50 ㎖의 메탄올에 녹이고, 0.736 g의 다이-터셔리-부틸 다이카보네이트(Di-tert-butyl dicarbonate, 20)와 0.75g의 트라이에틸아민을 30 ㎖의 메탄올에 녹인 용액을 0℃에서 천천히 적가한 후 상기 용액을 10시간 동안 상온에서 교반하였다.
용액을 감압유거한 후, 50 ㎖의 클로로포름에 다시 녹이고 탄산수소나트륨 수용액으로 두 번 씻어준 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 다시 용액을 감압농축한 후, 1.03 g의 화합물 12를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
『1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 1.4 (s, 9H: -CO-O-( CH 3 )3), 2.86 (t, 2H: -O-CH2- CH 2 -NH2, J = 5.1 Hz), 3.27~3.32 (m, 2H: -O-CH2 - CH 2 -NHCO-), 3.48~3.58 (m, 8H: NH2-CH2- ( CH 2 OCH 2 ) 2 - CH2-), 5.16 (broad s, 1H: -O-CH2-CH2- NH CO- O-(CH3)3)』
(2)
N-
Boc
-
N'
-
말레일
-2,2‘-(에틸렌-1,2-
다이옥시
)
비스에틸아마이드
(중간체 13)의 합성
상기 (1)에서 합성된 1g의 중간체 12를 20 ㎖의 메틸렌클로라이드에 녹인 후, 0.2 g의 말레산무수물(maleic anhydride, 21)과 50 ㎎의 다이메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine; DMAP)을 가하여, 상온에서 2시간 동안 교반 후, 감압 유거하였다. 잔류물을 50 ㎖의 메틸렌클로라이드에 녹이고 30 ㎖의 탄산수소나트륨 수용액으로 목적물을 추출한 후, 물층에 묽은 염산을 가하여 pH 3으로 산성화시켰다. 수용액을 다시 메틸렌클로라이드로 추출하여 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압 농축한 후, 최종적으로 0.65 g의 중간체 13을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
『1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 1.47 (s, 9H: -COO-(CH3)3), 3.32 (t, 2H:-O- CH2-CH2-NHCO-, J = 5.1 Hz), 3.55~3.68 (m, 10H: -N-CH2-(CH2OCH2)2- CH2-), 4.89 (broad s, 1H: CH-CONH-CH2), 6.26~6.44 (dd, 2H: CO-CH-CH- CONH-CH2, J = 13.1 Hz), 5.76 (broad s, 1H: -O-CH2-CH2-NHCO-O-(CH3)3), 9.78 (broad s, 1H: -CH-CH-COOH)』
(3) N,N-
말레이미도일
-
N'
-
Boc
-2,2‘-(에틸렌-1,2-
다이옥시
)
비스에틸
아마이드
(중간체 14)의 합성
상기 (2)에서 합성된 0.5 g의 중간체 13을 30 ㎖의 아세트산무수물에 녹인 후, 0.59 g의 아세트산나트륨을 가하여 120℃에서 45분 동안 교반하였다. 용액을 감압유거한 후, 잔류물을 메틸렌클로라이드에 녹이고, 물과 인산 완충액(pH 7.2)으로 세 번 씻어준 후, 무수 황산 마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압 농축하여 0.38 g의 중간체 14를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
『1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 1.44 (s, 9H: -COO-(CH3)3), 3.25~3.31 (m, 2H: -O-CH2-CH2-NHCO-), 3.47~3.75 (m, 10H: -N-CH2-(CH2OCH2) 2-CH2), 5.02 (broad s, 1H: CH2-NHCO-O-), 6.7 (s, 2H: -O -CH2-CH2 - N (-CH-CO-)2)』
(4)N,N-
말레이미도일
-
N'
-
리포일
-2,2‘-(에틸렌-1,2-
다이옥시
)
비스에틸
아마이드
(
링커분자
6)의 합성
상기 (3)에서 합성된 0.3 g의 화합물 14를 10 ㎖의 삼불화아세트산 (trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드 혼합액(1:1)에 녹이고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압유거한 후, 메틸렌클로라이드에 녹이고 감압유거하는 과정을 3번 반복하여 삼불화아세트산을 완전히 제거하고 잔류물을 진공 건조하여 140 ㎎의 중간체 15를 제조하였다.
75 ㎎의 중간체 15를 10 ㎖의 메틸렌클로라이드에 녹인 후, 100 ㎎의 리포산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (lipoic acid NHS ester, 8)와 140 ㎕의 트리에틸아민, 20 ㎎의 다이메틸아미노피리딘(DMAP)을 가하여, 상온에서 10시간 교반하였다. 용액을 감압유거한 후, 잔류물을 20 ㎖의 메틸렌클로라이드에 녹이고, 유기층을 증류수로 세 번 씻어주고 무수 황산마그네슘으로 건조한 후, 감압농축 하여 얻어진 잔류물을 실리카겔 크로마토그라피 (아세톤:메틸렌클로라이드 = 1:3)로 정제하여 60 ㎎의 링커분자 6을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였 다.
『1H-NMR (300 MHz, CDCl3):1.47(m,2H:-CH-CH2- CH 2 -CH2-CH2-CONH-), 1.59~1.76(m,4H:-CH- CH 2 -CH2- CH 2 -CONH-),1.90(sextet,J=6.6Hz,1H:-S-CH2- CH 2 -CH-S-),2.2(t,J=7.5Hz,2H:-CH2-CH2- CH 2 -CONH), 2.45(sextet,J=6.6Hz,1H:-S-CH2- CH 2 -CH-S-),3.06~3.21(m,2H:-S- CH 2 -CH2-CH-S-), 3.39~3.45 (m, 2H: -(CONH- CH 2 - CH2-O-),3.49~3.76(m,8H:-(CONH- CH2- CH 2 -O- CH 2 )2, 2H: -O-CH2- CH 2 -NCO-, 1H:-S-CH2-CH2- CH -S-),6.18 (broad s, 1H: CH2-CO NH -CH2-CH2-O-), 6.71 (s, 2H: -O -CH2-CH2-N(- CH -CO-)2)』
(5) N,N-(3‘-베타-(
글루타치온
S)-
숙신이미도)
-
N'
-
리포일
-2,2‘-(에틸렌-1,2-다
이
옥시)
비스에틸아마이드
(
링커분자
2)의 합성
상기 (4)에서 합성된 50 ㎎의 화합물 6을 10 ㎖의 메탄올에 녹인 후, 상온에서 교반하면서 1 ㎖의 증류수에 20 ㎎의 글루타치온을 녹인 용액을 적가한 후, 5시간 동안 교반하였다. 용매를 감압유거한 후 잔류물을 메틸렌클로라이드 및 메탄올로 여러 번 씻어 준 후, 진공 건조하여 최종 생성물인 링커분자 2를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
『1H-NMR (300 MHz, D2O):1.46(m,2H:-CH-CH2- CH 2 -CH2-CH2-CONH-), 1.57~1.74(m,4H:-CH- CH 2 -CH2- CH 2 -CONH-),1.90(sextet,J=6Hz,1H:-S-CH2- CH 2 -CH-S-),2.11~2.26(m,2H:NHCO-CH2- CH 2 -inGSH&2H:-CH2-CH2- CH 2 -COOH),2.40~2.59(m,1H:-S-CH2- CH 2 -CH-S-&2H:-NHCO- CH 2 -CH2-inGSH),3.1(m,1H:-S-CH2-CH2- CH -S-),3.15~3.26(m,4H:-NCO- CH 2 -CH-S- CH 2 -and2H:-S- CH 2 -CH2-CH-S-),3.32~3.47(m,2H:: -CONH- CH 2 -CH2-O-), 3.49~3.77 (m, 8H: -CONH-CH2-( CH 2 -O- CH 2 )2, 2H: -O-CH2- CH 2 -NCO-,1H:-NCO-CH2- CH -S-CH2,1HinGSH&1HinGSH),4.7(m,1H forGSH).』
실시예
3:
글루타치온
링커분자
칩의 제조
실시예 1에서 합성된 링커분자 1을 기질 표면에 고정하기 위해서, 금 박막 표면을 95% 황산과 30% 과산화수소 (부피비 3:1) 혼합용액에서 60℃로 30분간 처리한 후, 상온에서 1 mM의 링커분자 1을 포함한 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액에 3시간 이상 침지시켜 자기조립 단분자층을 형성시켰다. 자기조립 단분자층이 형성된 칩을 디메틸포름아미드 (dimethylformamide; DMF)와 3차 증류수로 세척하여 글루타치온 링커분자 칩을 제조하였다.
실시예
4:
글루타치온
S-전이효소 태그를 갖는
스타필로코칼
Protein
G의 제조
N-말단에 글루타치온 S-전이효소가 태그된 스타필로코칼 protein G 유전자의 제작을 위하여, 스타필로코칼 protein G 유전자의 일부를 포함하는 2개의 프라이머를 제작하였다. 스타필로코칼 protein G 유전자를 글루타치온 S-전이효소 태그 발현벡터인 pGEX 4T-1 (Amersham Pharmasia Biotech Inc., 미국)에 삽입하기 위하여 N-말단 프라이머에는 NdeⅠ(서열번호 1), C-말단 프라이머에는 XhoⅠ제한효소 절단부위를 도입하였다 (서열번호 2). 상기 프라이머쌍을 이용하여 스타필로코커스 속(Streptococcus sp. KCCM 41566) 지노믹 유전자로부터 PCR로 얻어진 단편을 해당 제한효소(NdeⅠ과 XhoⅠ)으로 절단한 후 제한효소로 잘려진 pGEX 4T-1 벡터에 삽입하여 pGST-protein G 벡터를 제작하였다.
프라이머
1 (센스)의 서열번호
5'-CATATGCACCACCACCACCACCACAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCT-3'
프라이머
2 (
안티센스
)의 서열번호
5'-CTCGAGTTATTCAGTTACCGTAAAGGTCTTAGTC-3'
제작된 pGST-protein G에 의해 형질전환된 E. coli BL21을 37℃에서 진탕배양하여 OD 600nm에서 흡광도가 0.6에 도달할 때, IPTG를 첨가하여 최종 농도 1 mM이 되도록 함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 4시간 후, 원심분리로 회수된 대장균 펠렛을 초음파 (Branson, Sonifier 450, 3㎑, 3W, 5min)로 파쇄하여 재조합 단백질 용액을 얻었다. 얻어진 단백질 용액을 완충액 (12 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% 글리세롤, 2.88 mM 머캅토에탄올, 0.4% SDS, 0.02% 브롬화페놀 블루)에 혼합하여 100℃에서 5분간 가열 후 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩하여 1시간 동안 전기 영동함으로써 재조합 단백질을 확인하였다.
실시예
5:
글루타치온
S-전이효소
태그된
스타필로코칼
Protein
G가 고정화된 금 박막 칩에서 항체 및 항원의 결합 측정
실시예 3에서 제작된 GSH 자기조립 단분자층 금 박막 표면을, 실시예 4에서 제조, 발현된 0.1 ㎎/㎖의 글루타치온 S-전이효소 태그된 스타필로코칼 protein G 단백질 용액에 침지시켜 30분간 반응하였다.
단백질이 고정화된 칩을 표면 플라즈몬 공명 센서(Biacore 3000)에 장착한 다음, 0.1 ㎎/㎖ 항체와 0.1 ㎎/㎖ 항원을 5 ㎕/min으로 반응시켜 결합을 실시간으로 확인하였다. 또한 상업적으로 판매되는 대표적인 CM-5 sensor chip (Biacore)에 글루타치온 S-전이효소 태그된 스타필로코칼 protein G 단백질을 고정시켜, 이의 반응도 확인하였다.
고정화 방법으로는 카르복실 그룹을 가지는 CM-5 표면을 0.1 M N-하이드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide; NHS)와 0.4 M 1-에틸-3-디메틸아미노프로필 카보디이미드 (1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide; EDC)의 혼합물에서 7분간, 7㎕/min으로 반응시켜 하이드록시숙신이미딜 에스테르 (N-hydroxysuccinimidyl ester)로 활성화시켰다. 활성화된 표면에 상기 글루타치온 S-전이효소로 태그된 스타필로코칼 protein G (GST-protein G 융합단백질)를 반응시켜 고정화시키고 남은 활성 잔기는 1 M 에탄올 아민(ethanolamine) 용액으로 칩 표면에 7분간 7 ㎕/min으 로 반응시켜 비활성화시켰다. 이후, 고정화 표면을 표면 플라즈몬 공명 센서(Biacore 3000)에 장착한 다음, 위와 동일하게 항체와 항원을 반응시켜 결합을 확인하였다.
도 8에는 상기 방법을 도식화하여 나타내었으며, 표면 플라즈몬 공명 센서를 이용하여 고정화 방법에 따른 단백질의 배향성과 단백질간의 결합에 미치는 영향을 비교한 결과, 실시예 3에서 제작한 칩이 시중에 판매되는 CM-5 칩보다 단백질에 바른 배향성을 가지고, 표면 고정화 시간이 빠르고 간단하며 더 높은 민감도를 나타내는 것을 확인하였다 (도 10).
상기 친화적으로 결합하는 글루타치온 링커의 자기조립 단분자층에 결합된 글루타치온 S-전이효소 태그된 스타필로코칼 potein G 단백질 (GST-protein G 융합단백질)과 화학적 결합을 하는 CM-5칩에 고정화된 글루타치온 S-전이효소 태그된 스타필로코칼 protein G 단백질은 각각 1300 RU 및 3350 RU로 약 2.5배 차이가 나지만, 도 10에서 나타낸 바와 같이, 항체가 결합하는 양은 각각 2300 RU 및 720 RU로 글루타치온-자기조립 단분자층에 고정화된 글루타치온 S-전이효소로 태그된 스타필로코칼 protein G 단백질이 더 우수한 배향성을 가지도록 고정화된 것을 알 수 있었다.
또한 상기 글루타치온-자기조립 단분자층을 이용하여 단백질이 결합된 형광 바이오칩의 활성을 측정하기 위해서 기질 표면에 글루타치온 S-전이효소 태그한 스타필로코칼 protein G를 고정화 시키고, 각각 0.1 ㎎/㎖의 항-바이오틴과 항-EGFP를 20개씩 스팟 어레이 한 후, 0.1 ㎎/㎖의 녹색 형광을 나타내는 단백질 EGFP를 침지시켜 항체에 결합시켰다. 반응이 끝난 칩은 488 nm 레이저를 이용하여 GenePix 4200 (Axon, USA)로 측정하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 왼쪽의 항-바이오틴 어레이에서 형광 시그널이 나타나지 않음으로서 비특이적 결합이 없음을 확인하였고, 오른쪽에서 시그널이 포화 상태로 나타남으로 특이적 단백질 결합반응이 잘 일어남을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따 라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 기질 표면에 단백질을 고정하기 위한 링커분자 및 그 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 링커분자는 기질의 접촉으로 자기조립 단분자층을 형성하고, 상기 자기조립 단분자층에는 특이적인 태그를 가진 단백질만 고정된다. 상기 고정된 단백질은 우수한 배향성을 가지면서도, 활성을 잃지 않게 결합될 수 있다. 본 발명으로 개발된 링커분자로 제작된 칩은 표적 단백질이 결합되지 않은 표면에 비특이적인 단백질 결합이 잃어나 지 않는 장점을 가지므로 단백질 칩을 제조할 때 단백질을 정제하는데 드는 시간과 비용을 줄이고, 단백질 활성 효율을 높이므로 매우 경제적이다.
Claims (16)
- 다음의 단계를 포함하는 기질에 단백질을 고정화하기 위한, A-B-C 형태의 링커분자를 제조하는 방법:(a) 단백질의 비특이적 결합을 저해하는 단백질 고정화 리간드(B)의 일측 말단에, 기질표면에서 자기조립 단분자층을 형성하는 물질(A)을 결합하는 단계; 및(b) 상기 단백질 고정화 리간드의 타측 말단에 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)을 결합하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 고정화 리간드(B)는 양 말단이 아민으로 치환된 올리고에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질은 단백질에 친화성인 물질로 태그된 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 단백질에 친화성인 물질로 태그된 단백질은 글루타치온 S-전이효소로 태그된 단백질, 말토즈결합 단백질로 태그된 단백질 및 히스티딘 으로 태그된 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 단백질의 비특이적 결합을 저해하는 단백질 고정화 리간드(B)의 양 말단에, 기질표면에서 자기조립 단분자층을 형성하는 물질(A) 및 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)이 각각 결합되어 있는, 기질에 단백질을 고정화하기 위한, A-B-C 형태의 링커분자.
- 제5항에 있어서, 상기 단백질 고정화 리간드(B)는 올리고에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 A-B-C 형태의 링커분자.
- 제5항에 있어서, 화학식(Ⅰ)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 링커분자:
(Ⅰ)여기서, X, Y는 단백질과 결합하는 물질이고, 다음 화학식 (III)의 기능단을 포함하며, n은 2 내지 100이다.
( III ) - 제7항에 있어서, 상기 Y는 L-환원 글루타치온, 이미노다이아세트산 (iminodiacetic acid), 니트로트리아세트산 (nitrilotriacetic acid), 말토즈 유도체, 갈락토즈, 칼모듈린, 바이오틴, 키틴, 셀룰로즈, 씨-믹 (C-myc), 티오레독신 (thioredoxine), 인테인 (intain), S-펩타이드, 및 DNA로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 링커분자.
- 제7항에 있어서, 화학식(I)의 구조식을 갖는 링커분자는 링커분자 1~5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 링커분자.
- 제5항에 있어서, 화학식(Ⅱ)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 링커분자:
(Ⅱ)여기서, 트리에톡시실란 부분은 유리표면에 고정되기 위한 기능단이고, X, Y는 다음 화학식 (III)의 기능단을 포함하며, n은 2 내지 100이다.
( III ) - 제10항에 있어서, 상기 Y는 L-환원 글루타치온, 이미노다이아세트산 (iminodiacetic acid), 니트로트리아세트산 (nitrilotriacetic acid), 말토즈 유도체, 갈락토즈, 칼모듈린, 바이오틴, 키틴, 셀룰로즈, 씨-믹 (C-myc), 티오레독신 (thioredoxine), 인테인 (intain), S-펩타이드, 및 DNA로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 링커분자.
- 다음 단계를 포함하는 단백질 칩의 제조방법:(a) 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 A-B-C 형태의 링커분자를 기질에 도입하여, 기질표면에서 자기조립 단분자층을 형성하는 물질(A)을 통해 기질상에 상기 링커분자의 자기조립 단분자층을 형성하고, 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)을 노출시키는 단계; 및(b) 상기 노출된 단백질과 결합하는 친화성 물질(C)에 단백질을 결합시키는 단계.
- 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 A-B-C 형태의 링커분자를 매개로 기질상에 단백질이 결합되어 있는 단백질 칩.
- 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 A-B-C 형태의 링커분자를 매개로 단백질 고정용 담체에 단백질을 고정하는 것을 특징으로 하는 단백질의 고정화 방법.
- 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 A-B-C 형태의 링커분자를 매개로 단백질 고정용 담체에 단백질이 결합되어 있는 고정화 단백질.
- 제15항에 있어서, 단백질 고정용 담체는 멤브레인 또는 비드 형태인 것을 특징으로 하는 고정화 단백질.
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