IT202000012310A1 - "metodica di funzionalizzazione di substrati solidi nanostrutturati per la rilevazione ultrasensibile di biomarcatori" - Google Patents
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Description
D E S C R I Z I O N E
del brevetto per invenzione industriale dal titolo:
"METODICA DI FUNZIONALIZZAZIONE DI SUBSTRATI SOLIDI NANOSTRUTTURATI PER LA RILEVAZIONE ULTRASENSIBILE DI BIOMARCATORI"
La presente invenzione ? relativa a una metodologia di funzionalizzazione di substrati solidi nanostrutturati per studi bioanalitici per la rilevazione ultrasensibile di macromolecole (es. biomarcatori).
Attualmente, la ricerca e la rilevazione ultrasensibile di biomarcatori nei fluidi biologici riveste molta importanza nella prevenzione, nella diagnosi, nella prognosi e nel monitoraggio della risposta terapeutica, soprattutto in campo oncologico. La presente invenzione si riferisce ad una metodica di funzionalizzazione di substrati solidi nanostrutturati per studi bioanalitici per la rilevazione ultrasensibile di macromolecole (es. biomarcatori). L'applicazione di tale metodica ha un grande impatto economico potenziale, potendo essere utilizzata per diverse applicazioni, anche in ambito clinico tra cui la rilevazione di biomarcatori in biopsie liquide che, a causa della minima invasiv?t?, stanno affiancando e in alcuni casi sostituendo le biopsie chirurgiche.
Una delle tecniche pi? efficienti per l'identificazione ultrasensibile di biomarcatori in matrici diverse, come fluidi biologici e alimenti, ? rappresentata dalla spettroscopia Raman amplificata da superfici (SERS). Questa tecnica si avvale essenzialmente dell'utilizzo di supporti di natura metallica opportunamente funzionalizzati con molecole di cattura (come ad esempio anticorpi e aptameri) che consentono l'interazione e la captazione degli analiti di interesse (antigeni o altri ligandi).
Generalmente, a tale scopo vengono utilizzate soluzioni colloidali di nanoparticelle di metalli plasmonici (come l'oro e l'argento) e sono gi? noti diversi metodi per la funzionalizzazione delle nanoparticelle con gruppi funzionali adatti a mediare il legame covalente e non delle nanoparticelle con anticorpi. Tuttavia, l'uso delle nanoparticelle colloidali presenta diversi svantaggi principalmente a causa della distribuzione non omogenea delle nanoparticelle e della forte tendenza a formare aggregati che, oltre alla generazione di artefatti, determina una bassa riproducibilit? dei risultati.
In alternativa, vengono utilizzati substrati solidi nanostrutturati che garantiscono una elevata riproducibilit? dei risultati e una maggiore facilit? di impiego. Anche pe l'uso di supporti solidi nanostrutturati si rende necessaria la funzionalizzazione, che consente di isolare l'analita di interesse da altre molecole eventualmente presenti nel mezzo di analisi. Tuttavia, la procedura di funzionalizzazione deve essere accuratamente calibrata sulla base di diversi fattori come il tipo di substrato, la natura dell'analita e della matrice da analizzare, e ci? riduce la versatilit? di molte di queste metodiche. La maggior parte dei metodi di funzionalizzazione si avvalgono di chimiche molto complesse che prevedono il legame diretto di gruppi funzionali al substrato e difficilmente eseguibili come metodi di routine in laboratori non specializzati.
Altri metodi di funzionalizzazione si avvalgono di molecole che mediano il legame tra il substrato e la molecola bioselettiva (es. anticorpi) come molecole linker di sintesi o molecole di natura proteica. Un esempio ? l'uso della proteina G che per? non consente il legame covalente anticorpo/substrato, requisito necessario per molte tipologie di analisi. D'altra parte, l'uso di linker bifunzionali offre il vantaggio di garantire un legame covalente e quindi stabile tra substrato e molecola bioselettiva. Tuttavia, l'uso di linker bifunzionali ? stato riportato finora soprattutto per la funzionalizzazione di nanoparticelle colloidali. Sebbene siano riportate alcune metodiche di funzionalizzazione di substrati solidi con linker bifunzionali, queste sono relative/ alla funzionalizzazione di substrati non nanostrutturati e presentano inoltre limitata versatilit?.
Era quindi sentita l'esigenza di disporre di una procedura di funzionalizzazione di substrati solidi nanostrutturati affidabile, versatile e pi? semplice di quelle attuali, in grado di fornire in tempi brevi l'ottenimento di una piattaforma di analisi di uso immediato, estremamente specifica per l'analita di interesse e in grado di soddisfare i requisiti delle tecniche di rilevazione ultrasensibile che ne richiedono l'uso e che, inoltre, non necessitasse di strutture specializzate per la sua esecuzione.
Gli inventori della presente invenzione hanno realizzato una metodica la quale, oltre a soddisfare le caratteristiche sopra elencate, ha anche il vantaggio di risultare estremamente economica.
Oggetto della presente invenzione ? una metodica di funzionalizzazione di substrati solidi nanostrutturati per la rilevazione ultrasensibile di biomarcatori, le cui caratteristiche essenziali sono riportate nella rivendicazione 1, e le cui caratteristiche preferite e/o ausiliari sono riportate nelle rivendicazioni 2, 3, 4 e 5.
Di seguito sono riportati degli esempi realizzativi a puro titolo illustrativo e non limitativo.
La metodica oggetto della presente invenzione consiste in almeno due reazioni successive che coinvolgono tre componenti principali : una mistura omogenea di molecole linker bifunzionali di sintesi, una soluzione omogenea o eterogenea di molecole selettive di natura proteica (es. anticorpi) e un substrato solido nanostrutturato. Le reazioni di funzionalizzazione richiedono inoltre l'utilizzo di una fase organica anidra e di un tampone di reazione salino atto a mantenere il pH in un intervallo compreso tra 6 e 7.
A titolo di esempio, esemplificativo ma non limitativo, per l'attuazione della invenzione si procede come di seguito descritto: la prima reazione di funzionalizzazione ? relativa al legame della molecola linker con il substrato solido nanostrutturato. Il linker utilizzato, noto in commercio come LA (dPEG3)MAL, presenta come gruppi funzionali l'acido lipoico e la maleimmide spaziati da tre molecole di glicole polietilenico (dPEG). Il substrato solido, noto in commercio come MatoS, ? costituito da una superficie di vetro silicato su cui ? deposto oro nanostrutturato. La zona attiva del substrato ha una superficie di 15 mm<2>. Il substrato viene alloggiato in una provetta e immerso in 400 ?l della soluzione di linker; la molecola linker viene solubilizzata in etanolo anidro alla concentrazione finale di 4 mM. La reazione viene protratta per 28 ore, alla temperatura di 21 ?C, sotto leggera agitazione e al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione il substrato viene sottoposto a lavaggi con etanolo anidro. La seconda fase della funzionalizzazione prevede il legame di una Immunoglobulina G (specifica verso l'analita che si vuole rilevare) con il gruppo funzionale maleimmide del linker. L' anticorpo viene solubilizzato alla concentrazione di 1,45 ?? in un buffer salino avente la seguente composizione: fosfato di sodio 10 mM, cloruro di sodio 100 mM, pH 6,0. La soluzione di anticorpo viene addizionata con tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) 1 mM e incubata per un'ora a 37 ?C. Il substrato viene alloggiato in una provetta contenente la soluzione di anticorpo ridotto e immerso per 2 ore a 25?C sotto leggera agitazione. Al termine dell'incubazione, il substrato funzionalizzato viene sottoposto a ripetuti lavaggi con acqua bidistillata e lasciato asciugare.
Quanto sopra riportato sta a indicare che la presente invenzione si riferisce a reagenti comprendenti sostanze e materiali che stanno tra loro in un determinato rapporto funzionale che, tuttavia, potrebbero anche comprendere altre sostanze e materiali senza uscire dalla portata della presente invenzione .
La molecola linker di sintesi pu? consistere di almeno due gruppi funzionali, spaziati da una molecola preferibilmente con caratteristiche idrofiliche (es PEG) e di lunghezza non superiore a 10-20 nm. I gruppi funzionali devono essere adatti a mediare il legame covalente substrato nanostrutturato/molecola selettiva. Il gruppo funzionale coinvolto nel legame con il substrato nano
essere costituito da acido lipoico o da altre molecole che, oltre ad un elevata affinit? con i metalli come l'oro e l'argento, siano stabili nelle condizioni sperimentali richieste dalla successiva reazione di immobilizzazione covalente della molecola selettiva. I gruppi funzionali del linker possono avere le seguenti caratteristiche: Il gruppo funzionale coinvolto con il legame con il substrato nanostrutturato pu? essere rappresentato da molecole contenenti gruppi tiolici o contenenti diotilano come l'acido lipoico (1,2-Dithiolane-3-pentanoic acid) e l'acido l'acido asparagusico (1,2-dithiolane-4-carboxylic acid) per il legame con la superficie nanostrutturata o da molecole simili quando utilizzate ad una concentrazione di linker compresa tra 0,4 e 4 mM .
Il gruppo funzionale coinvolto nel legame con la molecola selettiva pu? essere costituito da molecole che consentano l'instaurarsi di un legame covalente, direzionale e tale da non ostacolare l'esposizione del sito attivo di legame della molecola selettiva. Molecole con queste caratteristiche sono rappresentate ad esempio dalla maleimmide o da altre molecole aventi gruppi tiolici reattivi, come le cianine e altri derivati della maleimmide, o da altre molecole come l'aloacetile, l'aziridina o il vinile solfone quando utilizzate a una concentrazione di linker compresa tra 0,4 e 4 mM .
La molecola selettiva pu? essere preferibilmente una immunoglobulina di classe G ma la metodica di funzionalizzazione pu? essere estesa anche ad anticorpi di altre classi, a proteine di natura non anticorpale e a frammenti polipeptidici e peptidi quando usati ad una concentrazione compresi tra 1,4 e 10 ??. In ogni caso, per l'attuazione dell'invenzione, ? necessario che le molecole selettive dispongano di residui di cisteine non impegnate in legami disolfuro o opportunamente trattate con agenti riducenti dei ponti disolfuro purch? privi di gruppi tiolici in quanto potrebbero competere con la maleimmide per legame con la molecola selettiva, un esempio ? dato dall'uso del TCEP se usato ad una concentrazione compresa tra 1 e 5 mM.
La fase organica anidra ? necessaria per la prima reazione di funzionalizzazione, ovvero per il legame del linker al substrato nanostrutturato . La fase organica pu? essere rappresentata da etanolo anidro o da altri solventi anidri come il cloruro di metilene, la N,N- dimetilacetamide e il dimetilsolfossido. L'assenza di acqua ? necessaria sia per la stabilit? e il mantenimento della reattivit? del gruppo funzionale durante la reazione di legame al substrato che per la sua conservazione sia a breve che a lungo termine.
Il tampone salino, utilizzato per la preparazione delle molecole selettive, ? necessario per la seconda reazione di funzionalizzazione, ovvero per il legame della molec selettiva con il substrato. Pu? essere costituito da fosfato e cloruro di sodio quando utilizzati a concentrazioni comprese tra 10 e 100 mM e tra 100 e 150 mM rispettivamente; ? fondamentale che durante la reazione il pH sia mantenuto a valori compresi tra 6 e 7.
Assolutamente necessaria per l'attuazione dell'invenzione ? la presenza di un substrato solido nanostrutturato. L'utilizzo di un supporto solido rende la metodica di funzionalizzazione, oggetto della presente invenzione, pi? semplice ed efficace rispetto alle metodiche di funzionalizzazione di nanoparticelle colloidali attualmente in uso. Il substrato pu? essere costituito da oro, o da altri metalli plasmonici nanostrutturati come l'argento o altri metalli, deposti su una superficie solida, che pu? essere in vetro silicato o anche in altri materiali come la plastica, la mica e la carta. La modalit? di deposizione del metallo nanostrutturato sulla superficie di supporto, che pu? rivestire importanza in corso di rilevazione analitica, non ha invece impatto sulla metodica di funzionalizzazione.
Per l'attuazione della invenzione, i substrati solidi nanostrutturati possono essere funzionalizzati utilizzando diverse concentrazioni di reagenti per l'ottenimento di una resa ottimale. Indipendentemente dalla concentrazione utilizzata, la prima fase della funzionalizzazione necessita di una incubazione con la molecola linker per un tempo che pu? andare dalle 12 alle 24 ore ad una temperatura compresa tra 18 e 25 ?C. La seconda fase della funzionalizzazione necessita un tempo di reazione tra le 2 e le 3 ore preferibilmente alla temperatura di 37 ?C.
Ognuna delle concentrazioni di cui sopra ? stata testata in diverse combinazioni utilizzando, come modello, substrati funzionalizzati con anticorpi diretti contro antigeni specifici. I test sono stati condotti immergendo il substrato funzionalizzato sia in soluzioni contenenti il solo antigene ricombinante che in campioni di siero positivi per l'antigene, per un tempo di incubazione tale da consentire la captazione dell'analita . Dopo accurati lavaggi, i substrati funzionalizzati sono stati analizzati mediante Spettroscopia SERS. Le analisi hanno dimostrato l'efficacia del metodo di funzionalizzazione ovvero la presenza e la stabilit? del legame anticorpo/substrato, dimostrata da differenze spettrali con i substrati non funzionalizzati, e il mantenimento della funzionalit? della molecola bioselettiva, dimostrata dalla efficace captazione dell'antigene. Gli stessi risultati sono stati ottenuti in analisi condotte su campioni di siero, dimostrando la stabilit? del legame anticorpo/substrato anche in presenza di matrici complesse per composizione biochimica.
Claims (5)
1. Metodologia di funzionalizzazione di substrati solidi nanostrutturati per studi bioanalitici allo scopo di una rilevazione ultrasensibile di macromolecole caratterizzata dal fatto di cons?stere di due reazioni successive (che necessitano rispettivamente di una fase organica anidra e di un tampone salino) di cui la prima ? atta a mediare il legame tra una molecola linker e il substrato e la seconda ? atta a mediare il legame tra una molecola bioselettiva e il linker immobilizzato sul substrato nanostrutturato. Tali reazioni coinvolgono tre componenti principali: (1) un substrato solido nanostrutturato d'oro quale il substrato noto commercialmente come MatoS; (2) una mistura omogenea di molecole linker bifunzionali di sintesi, quali il linker noto commercialmente come LA(dPEG3)MAL utilizzata ad una concentrazione di 4 mM, atte a mediare il legame covalente con molecole di cattura bioselettive di natura proteica quali anticorpi, proteine e peptidi; (3) una soluzione omogenea o eterogenea di molecole di cattura bioselettive, quali immunoglobuline di classe G, utilizzate ad una concentrazione di 1.45 ??.
2. Metodica di funzionalizzazione secondo la rivendicazione 1 quando il substrato solido ? costituito da una superficie di vetro silicato su cui ? deposto oro nanostrutturato, quale quello commercialmente noto come MatoS, ma anche substrati simili costituiti da plastica, mica, carta e ricoperti da altri metalli plasmonici nanostrutturati come ad esempio l'argento.
3. Metodica di funzionalizzazione secondo la rivendicazione 1 e 2 caratterizzata dalla presenza di una molecola linker bifunzionale costituita da due gruppi funzionali quando uno ? l'acido lipoico o molecole simili, quando caratterizzate dalla presenza di gruppi reattivi tiolici, e l'altro gruppo funzionale ? una maleimmide o molecole simili in grado di reagire con gruppi tiolici, e quando tali gruppi funzionali sono separati dalla molecola spaziatrice dPEG3 o atri spaziatori quando caratterizzati da idorfilicit?, quando il linker sia utilizzato ad una concentrazione compresa tra 0.4 e 4 mM .
4. Metodica di funzionalizzazione secondo la rivendicazione 1, 2 e 3 caratterizzata dal fatto che la molecola selettiva di cattura ? una immunoglobulina di classe G ma anche immunoglobuline di altre classi, proteine di natura non anticorpale, frammenti polipeptidici o peptidi ad una concentrazione compresa tra 1.4 e 10 ??.
5. Metodica di funzionalizzazione secondo la rivendicazione 1,2,3 e 4 quando la fase organica ? rappresentata da etanolo anidro o altri solventi anidri e il pH del tampone salino ? compreso tra 6 e
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