KR100971305B1 - 신장 질환용 진단 표지로서의 호중구 젤라티나제 결합리포칼린 (ｎｇａｌ)의 측정 - Google Patents

Abstract

제공된 인간 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린 (NGAL)을 측정하여 신장 질환을 진단하는 방법.

Description

신장 질환용 진단 표지로서의 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린 (ＮＧＡＬ)의 측정 {DETERMINATION OF NEUTROPHIL GELATINASE-ASSOCIATED LIPOCALIN (NGAL) AS A DIAGNOSTIC MARKER FOR RENAL DISORDERS}

본 출원은 그 전문을 본 명세서에 참고로 포함시킨 2004년 12월 20일자 미국 가출원 제60/637,503호 및 2005년 9월 21일자 미국 가출원 제60/719,307호의 정규 출원이다.

본 발명은 신장 질환이 허혈 손상 (신장에 손상된 혈액 공급으로 인한) 또는 신독성제에의 노출에 의한 것 또는 이식된 신장의 거부를 포함하여 신장 기능의 약화를 초래하는 신장 질환의 경우에, 인간의 체액에서 이것의 이상 농도는 질환이나 질환군을 지시하는 것인 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린 (NGAL)을 측정하여, 인체 질환을 진단 및 관찰하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 특히 허혈 손상으로 인한 신장 반응의 초기 발견에 유용한데, 허혈 손상으로 인한 임상 또는 병적 결과는 전형적으로 급성 신부전 (ARF), 급성 세뇨관 괴사 (ATN) 또는 급성 세뇨관 간질성 신증 (ATIN)이고, 또한 이 방법은 치료 조치에 대한 반응을 포함하여 신장 질환 진행 과정을 관찰하는데 이용될 수 있다.

ARF, ATN 또는 ATIN을 초래할 수 있는 신장 허혈 손상의 발견은 지금까지 나트륨 분비 저하, 상승 및 상승 중인 혈액 중 크레아티닌 및 요소의 수치, 측정한다면 낮은 크레아티닌 청소를 보이는 혈액 및 소변에서의 화학적 검사 결과와 함께, 소변 감소증 및 액체 잔류 등의 임상 징후에 의존해왔다. 이들 징후는 만성 증상의 존재를 지시하는 것이다. 신세뇨관 손상에 대한 다양한 소변 표지 역시 분석되어 왔다. 이들 중에서 알파 1-마이크로글로불린, 베타 2-마이크로글로불린 (Penders 및 Delanghe JR, 2004) 및 N-아세틸-베타-D-글루코사미니다제 (NAG) (Kotanko 등, 2000)가 만성 ATN의 경우에 증가하였으나, 실험 동물이 허혈 손상 또는 독물에 손상된 후 단지 4일 또는 5일에 나타날 수 있을 뿐이다. ATN인 환자의 소변에서 신장 손상 분자-1 (KIM-1)도 역시 증가하였으나, 아무리 초기일지라도 경과 과정은 인간 환자에게서 확립되어 있지 않다 (Han 등, 2002). 시스테인이 풍부한 단백질 61 (CYR61)은 실험 동물의 허혈 손상 후 6~9시간 후의 소변에서 정점에 이른다 (Muramatsu 등, 2002). 그러나 인간에 있어서의 수치는 아직 알려지지 않았다. 연구되어오고 있는 다른 표지로는 클루스테린 (Aulitzky 등, 1992) 및 리포칼린형 프로스타글란딘 D 합성효소 (L-PGDS) (Tsuchida 등, 2004)를 들 수 있으나, ATN의 진단 또는 예견에 있어 이들의 유용함은 여전히 분명하지 않다. 허혈이나 신독성제에 신장이 노출된 후에 소변에서 이들 표지 분자의 출현 경과 과정이 통상적으로 느리기 때문에, 이들은 이들 손상으로부터 초래하는 초기 또는 임박한 신장 질환을 진단하기 위한 통상적인 용도로는 도입되지 않아 왔다.

호중구 젤라티나제 결합 리포칼린 (NGAL)은 또한 호중구 리포칼린 (NL; 인간 호중구 리포칼린의 경우에는 HNL), 리포칼린 2 (LCN2), 25 kDa 알파 2-마이크로글 로불린 관련 단백질 (래트에 있어서) 또는 24P3 (마우스에 있어서)으로도 알려져 있다. 래트에서, 이것의 유전자가 neu (HER2/c-erbB-2) 발암 유전자 (Stoesz와 Gould, 1995)에 의하여 개시된 유방암에서 과잉 발현되기 때문에, neu 관련 리포칼린 (NRL)으로도 지칭되어 왔다. NGAL은 다형핵 백혈구 알갱이로부터 첫 번째 분리된 25 kDa 당단백질이다 (Triebel 등, 1992; Kjeldsen 등, 1993). 이것은 이황가교를 함유하고 이량체 부분과 더 작은 삼량체 부분을 형성한다. 이것은 또한 기질 금속 단백질 분해효소 9 (MMP-9) 또는 젤라티나제 B로도 불리는 92 kDa 인간 호중구 타입 Ⅳ 콜라게나제와 결합하여, 단량체로서 식별가능한 115 kDa의 복합체를 형성하거나 (Monier 등, 2000; Yan 등, 2001) 이량체로서 식별가능한 125 kDa의 복합체를 형성한다 (Yan 등, 2001). 이들 복합체는 전립선암, 방광암, 신장암 및 유방암을 포함하는 각종 암 환자의 소변에서 확인되었다.

NGAL은 처음에 미생물, 특히 호중구의 탈과립 및 과립 단백질의 엑소사이토시스의 원인이 되는 화농성 박테리아를 침입할 때, 혈액으로부터 방출되는 호중구 활성화 표지로서 공개되었다. 그 때문에 인간의 혈장 또는 혈청 시료 중의 NGAL의 측정된 수치 상승은 개체가 염증, 특히 박테리아 감염에 의한 염증을 앓고 있다는 것을 지시하는 것으로 믿어진다 (Venge, 2000; 미국 특허 제6,136,526호; PCT 출원 제WO95/29404호). 이런 점에서, 그러나 이것의 청구된 특이적 호중구 유도와는 반대로, NGAL (24P3)은 마우스에 있는 타입 1의 급성기 단백질 (acute phase protain)로 확인되었고, 급성기 반응 동안 주로 간에서 발현되었다 (Liu 및 Nilsen-Hamilton, 1995).

미국 특허 출원 제2004/0219603호에는 신세뇨관 세포 손상의 개시를 초기에 발견하기 위한 소변 생체 표지자로서의 NGAL의 용도가 기재되어 있다. 그러나 신세뇨관 세포 손상이 NGAL 수치 상승의 원인으로서 전신 염증 또는 박테리아 감염과 구별될 수 있는지와 구별 방법을 기술하고 있지는 않다.

발명의 요약

신장 손상으로 인한 NGAL의 수치가 신장 기능에 영향을 미치지 않는 염증, 감염 또는 암 증상에 의한 NGAL 수치보다 통상적으로 더 높다는 놀라운 사실이 알려지게 되었다. 이것은 신장에 영향을 미치지 않는 다른 질환과 신장 질환을 구별하는, 환자의 신장 질환을 진단 및/또는 관찰하는 방법을 확립하게 하였다. 신장 질환은 신장 전체 또는 신장을 구성하는 1개 이상의 세포 구조 변화의 구조적 및 초미세구조적 상호 관련을 포함하여, 정상 건강 상태를 유지하는 조절 기작을 벗어나는 어떠한 기능의 변화를 의미한다. 이러한 질환의 비배타적인 예로서 급성 세뇨관 괴사 (ATN) 또는 급성 세뇨관 간질성 신증 (ATIN) 등의 신장 허혈과 관련된 증상을 들 수 있고, 원인이 무엇이든 간에 급성 신부전증 (ARF) 또는 만성 신부전증 (CRF), 원인이 무엇이든 간에 급성 및 만성 사구체 신염, 요로 폐색에 의한 신장병, 고혈압으로 인한 신장병, 자간전증이나 임신 독혈증과 관련된 신장병, 이식된 신장의 거부 또는 재발성 질환 및 신장의 선천적 및 종양성 질환도 역시 들 수 있다.

따라서, 본 발명은 환자의 체액 시료, 좋기로는 소변 시료 중의 인간 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린 (NGAL) 수치를 측정하는 것을 포함하여, 인간의 신장 손상을 진단 및/또는 관찰하는 방법을 제공한다. 만일 필연적으로 신장 기능에 영향을 미치지 않는 염증 또는 감염 증상 또는 암 등의 다른 질환으로 인한 NGAL의 특이적 더 작은 상승 수치보다 NGAL의 상승 수치가 더 높다면, NGAL의 상승 수치는 신장 손상을 지시하는 것이다. 따라서 제1 측면에서, 본 발명은 인간에 있어서 신장 질환의 가능성을 진단, 관찰 또는 측정하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 방법은 신장 질환과 신장에 영향을 미치지 않는 다른 증상 사이의 차이를 구별하며, 상기 방법은

ⅰ) 인간 체액 시료 중의 인간 NGAL 농도를 측정하는 단계와,

ⅱ) 상기 농도를 미리 측정된 컷오프(cutoff) 값과 비교하는 단계를 포함하고, 상기 컷오프 값은 신장에 영향을 미치지 않는 증상과 관련된 NGAL의 낮은 농도를 배제하도록 선택된 것으로, 컷오프 값보다 더 높은 농도는 신장 질환을 지시하는 것이다.

더욱이, 하나의 실시 상태로서 본 발명은 신장 질환의 상이한 정도 사이를 구별 가능하게 한다. 따라서 예를 들어, 하나의 실시 상태로서, 본 발명의 방법은 상기 농도를 제2의 컷오프 값과 비교하는 단계를 더 포함하는데, 상기 제2의 컷오프 값은 투석에 의한 치료를 필요로 할 가능성이 없는, 신장 질환의 정도가 경미한 신장 질환과 관련된 NGAL의 낮은 농도를 배제하도록 선택되고, 상기 컷오프 값보다 더 높은 농도는 투석 치료를 요할 가능성이 있는 더 심각한 질환을 지시하는 것이다.

ARF, ATN 또는 ATIN을 일으킬 수 있는 신장 손상에 대한 다른 표지 분자의 분석은 정례적인 임상 용도로는 도입되지 않아 왔는데, 이는 이들 다른 표지들이 신장 질환의 진행 과정 중 소변에서 너무 늦게 나타나서, 임상 의학자들이 질환의 진행을 깨닫는데 유용하지 않거나 예방 또는 치료 조치를 제시할 수 없기 때문이다. 이 문제는 신장 질환의 진행을 탐지하기 위하여 소변과 같은 인간 시료에서 NGAL을 분석하는 것을 이용하는 본 발명에 의하여 해결되었다.

이것이 손상의 개시 후 2 또는 3 시간 내에 소변에서 상승하는 수치로서, 소변 중 나타나는 신장 손상의 최초의 표지라는 것이 동물에 대한 연구를 통하여 제시된다. 따라서 본 발명에 따른 소변 NGAL의 분석은 ARF, ATN 또는 ATIN을 일으킬 수 있는 신장 손상을 검출하고, 이를 다른 질환과 구별하며, 진행률이 허용하면 진행을 뒤바꾸기 위한 적절한 조치를 취하는 방법을 제공한다.

면역화학적인 방법에 의하여 NGAL 수치를 측정하는 것이 좋다. 이러한 방법의 예로는 샌드위치 ELISA (효소 결합 면역 흡수 분석법), 측방 유동법 또는 딥스틱 (dipstick)을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

발명의 상세한 설명

우리는 인간의 소변 시료 중의 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린 (NGAL)의 농도가 전염 또는 염증 상태에 단지 약하게 영향을 받는다는 것을 알게 되었다. 그러나 NGAL 수치는 허혈 손상으로 인한 신장 질환시 뚜렷하게 증가하고 NGAL의 증가는 ATN에서 특히 높다. 더욱이 우리는 NGAL의 혈청 또는 혈장 수치가 필연적으로 전염성 또는 염증 상태를 반영하는 것이 아니고, 백혈병이나 백혈병 치료 결과로서 일어날 수 있는 것처럼 혈액 내의 호중구 개수가 극단적으로 낮아질 때조차 높아질 수 있다는 것을 알게 되었다. 무작위로 선출한 위독한 환자들의 혈액 및 소변의 점시료를 분석할 때, 인간 혈청 또는 혈장 중의 NGAL의 농도와 소변 중의 NGAL의 농도 사이에는 사실상 밀접한 관계가 있는 한편, 말초혈액 중의 호중구 개수 또는 대개 염증 표지로 이용되는 급성기 단백질인 C-반응성 단백질의 농도와 이들 수치 사이에는 거의 관계가 없다. 따라서, 특정 이론에 의한 뒷받침 없이, NGAL이 허혈 및 신장 NGAL 발현을 촉진시킬 수 있는 기타 영향에 응하여 신장에서 생성되어, 소변과 혈액으로 많은 양이 방출되므로, 미국 특허 제6,136,526호에 기재되어 있는 것처럼 염증 또는 바이러스 감염의 표지로서 혈청 또는 혈장 중의 NGAL 측정의 용도를 혼동하게 된다는 가설을 세울 수 있다.

따라서, 본 발명은 체액, 좋기로는 호중구가 제거된 인간 소변 시료에서, 특히 신장 허혈이나 독성제로 인한 신장 질환용 진단 표지로서 NGAL을 측정하는 것에 관한 것이다. 본 발명에서 NGAL의 농도가 신장 질환을 특별히 지시하기 위해서는, 신장 손상을 일으키지 않는 암이나 감염 또는 염증 상태를 초래할 수 있는 NGAL의 낮은 농도를 배제하기 시작하는 컷오프 값을 넘어야 한다.

하나의 실시 상태로 본 발명의 방법은 진단할 개체의 소변 시료, 좋기로는 원심 분리하여 호중구를 제거한 소변 시료 중의 인간 NGAL의 농도를 측정하는 단계 및 이렇게 측정된 농도를 외관상 건강하거나 염증 증상, 박테리아 감염 또는 암을 포함하는 기타 질환이 있을 수는 있으나 신장 질환은 없는 사람에게서 발견되는 소변 농도를 초과하도록 결정된 컷오프 값을 선택하여 이와 비교하는 단계를 포함한다. 측정된 NGAL 농도가 컷오프 값을 넘는다면, 이는 그 사람은 신장이 손상되어 있고 ARN, ATN 또는 ATIN으로 발전하였거나 발전할 수 있다는 것을 의미한다.

컷오프 값 아래의 소변 NGAL 수치는 건강한 개체 또는 염증, 감염 또는 암 증상이 있는 개체에게서 발견될 수 있기 때문에, 수용가능한 정도의 특이성으로는 신장 손상을 진단할 수 없는 컷오프 값은 250 ng/㎖ 이상, 250 ng/㎖ ~ 525 ng/㎖ 범위의 값으로, 예를 들어 275 ng/㎖, 300 ng/㎖, 325 ng/㎖, 350 ng/㎖, 375 ng/㎖, 400 ng/㎖, 425 ng/㎖, 450 ng/㎖, 475 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖가 좋다. 또 다른 실시 형태로서, 사용된 컷오프 값은 1 ㎍/㎖ 이상이다. 좋기로는, 소변 컷오프 값의 양의 예측치는 80% 이상, 예컨대 85% 이상, 예를 들면 90% 이상이다. 대신에 또는 추가로, 소변 컷오프 값의 음의 예측치는 좋기로는 80% 이상, 예컨대 85% 이상, 예를 들면 90% 이상이다.

또 하나의 실시 상태로서, 본 발명은 진단할 개체의 혈장 또는 혈청 시료 중의 인간 NGAL의 농도를 측정하는 단계, 및 이렇게 측정된 농도를 외관상 건강하거나 염증 증상, 박테리아 감염 또는 암을 포함하는 기타 질환이 있을 수는 있으나 신장 질환은 없는 사람에게서 발견되는 혈장 또는 혈청 농도를 초과하도록 결정된 컷오프 값을 선택하여 이와 비교하는 단계를 포함한다. 측정된 NGAL 농도가 컷오프 값을 넘는다면, 이는 그 사람은 신장이 손상되어 있고 ARN, ATN 또는 ATIN으로 발전하였거나 발전할 수 있다는 것을 지시하는 것이다.

혈장 또는 혈청 중 NGAL 농도의 컷오프 값은 신장에서의 컷오프 값과 유사하여, 250 ng/㎖ 이상, 예를 들면 300 ng/㎖ 이상 또는 250 ng/㎖ ~ 525 ng/㎖의 범위의 값으로, 275 ng/㎖, 300 ng/㎖, 325 ng/㎖, 350 ng/㎖, 375 ng/㎖, 400 ng/㎖, 425 ng/㎖, 450 ng/㎖, 475 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖가 좋다. 좋기로는, 혈장의 컷오프 값의 양의 예측치는 80% 이상, 예컨대 85% 이상, 예를 들면 90% 이상이다. 대신에 또는 추가로, 선택된 혈장 컷오프 값의 음의 예측치는 좋기로는 80% 이상, 예컨대 85% 이상, 예를 들면 90% 이상이다.

본 발명의 또 다른 면에서, 상기 방법은 투석을 요하는 일이 매우 드물고 통상적으로 소변 NGAL 수치 상승이 더 낮은 덜 심각한 신장 손상과, 어떤 형태로든 투석을 필요로 하기 쉽고 통상적으로 소변 NGAL 수치를 매우 높이는 심각한 신장 손상을 구별하는데 이용될 수 있다.

따라서, 그 컷오프 값 아래에서의 소변 NGAL 수치는 투석의 필요성이 예견되지 않고 더 경미한 신장 손상으로 진단되는 것인 제2의 더 높은 컷오프 값은 1000 ng/㎖ ~ 3000 ng/㎖ 범위의 수치, 예컨대 1250 ng/㎖, 1500 ng/㎖, 1750 ng/㎖, 2000 ng/㎖, 2250 ng/㎖, 2500 ng/㎖ 또는 2750 ng/㎖인 것이 좋다. 좋기로는, 더 높은 컷오프 값의 양의 예측치는 80% 이상, 예컨대 85% 이상, 예를 들면 90% 이상이다. 대신에 또는 추가로, 더 높은 컷오프 값의 음의 예측치는 70% 이상인 것이 좋다.

본 발명의 또 다른 면에서, 상기 방법은 체액에서의 NGAL 수치의 상승과 관련되거나 관련이 없는 또 다른 질환을 관찰 및/또는 치료 중인 환자에 있어서 신장 질환의 발병을 발견하는 데 이용될 수 있는데, 여기서 신장 질환은 합병증을 일으킬 수 있다. 이 경우에 환자의 내재 증상과 관련된 NGAL의 소변이나 혈장 또는 혈청 농도는 매일 또는 짧은 간격으로 관찰될 수 있고, 신장 질환의 발병은 전술한 수치를 넘는 NGAL의 소변이나 혈장 또는 혈청 농도의 증가에 의하여 지시될 것이다. 이런 상황에서, 신장 질환의 발병을 지시하는 NGAL 농도 상승 폭은 50 ng/㎖ 이상, 예를 들어 100 ng/㎖ 이상, 150 ng/㎖ 이상, 200 ng/㎖ 이상, 300 ng/㎖ 이상, 400 ng/㎖ 이상, 500 ng/㎖ 이상이 좋다.

본 발명의 또 다른 면에서, 상기 방법은 이들의 자연적 전개 및 치료 조치에 응하여 NGAL 수치 증가를 일으키는 신장 질환의 진행을 관찰하는데 이용될 수 있다. 이런 상황에서, 동시 발생하는 염증 또는 감염 또는 암 증상이 관찰기간 동안 상대적으로 안정적으로 남아있다면, NGAL 수치의 변화는 신장 손상 또는 재발 상태를 반영할 것이다. 관찰용 체액 시료의 채취 간격을 짧게 하여, 신장 손상을 더 빨리 지시받아, 더 빨리 치료 조치를 취하도록 할 수 있다. 신장 질환을 발견하기 위하여 체액에서 NGAL 수치를 관찰하는 것은 24시간 이내의 간격으로 수행하는 것이 좋고, 예를 들어, 외과 수술을 진행하는 동안 손상이 발생하는 것으로 알려져 있다면, 3시간 이하 또는 그보다 더 짧은 간격으로 간격을 더 짧게 하는 것이 더 좋다.

소변 시료와 같은 체액 시료 중의 인간 NGAL은 분석적인 특이성, 민감성 및 정밀성이 만족할만한 방법으로 측정될 수 있다. 양호한 방법은 인간 NGAL에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 분자를 이용하는 결합 분석법이다. 이러한 결합 분자로는 NGAL에 대한 다(多)클론성(性) 또는 모노클로널 항체 또는 다른 수단에 의하여 생성되는 NGAL 특이 결합 분자를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

양호한 방법으로서, 재조합 인간 NGAL에 대항하여 생성된 모노클로널 항체가 이용된다. 하나의 항체는 소변 시료와 같은 시료로부터 NGAL을 포획하기 위하여 고체 지지부에 결합하는 한편, 다른 하나는 염료 복합체와 같은 표지나 비오틴 또는 당해 기술 분야의 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의하여 탐지될 수 있는 효소에 결합한다. 고체 지지부로는 예를 들어 효소 면역 측정법 (ELISA)에 의한 폴리스티렌 또는 폴리비닐 클로라이드 표면, 또는 라텍스 (폴리스티렌) 입자, 또는 압축 폴리에틸렌 입자로 구성된 여과 프릿, 또는 다공성 니트로셀룰로오스 매트릭스, 또는 면역 분석에 있어 이용되는 적절한 지지부를 들 수 있다.

인간 소변 시료에서 본 발명에 따른 NGAL을 측정하는 양호한 수단으로는 딥스틱, 측방 유동 또는 미니칼럼 테스트를 들 수 있는데, 이는 신속하며 환자에 근접한 시료 분석을 가능하게 한다. 그러나 이 명세서를 읽는 당업자가 이해할 수 있듯이, 다른 수단 역시 NGAL의 측정에 사용될 수 있다.

양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 방법은 인체 또는 동물의 몸에 실시되는 외과적, 치료적 또는 진단 단계를 포함하지 않는다.

도 1

중환자실에 있는 60명의 성인 환자들에 있어 신장 질환의 진단에 대한 최대 소변 NGAL 값을 위한 수신기 작동 특성 (Receiver operating characteristics (ROC))곡선. 신장 질환이 있거나 신장 질환이 없어서 다른 자료로 분류될 수 있는 환자들만이 포함되었다.

도 2

도 1과 동일한 환자들에 있어 신장 질환의 진단에 대한 최대 혈장 NGAL 값을 위한 수신기 작동 특성 곡선.

도 3

신장 질환을 가진 것으로 임상 진단되고 중환자실에 있는 성인 환자 32명에 있어서, 투석 필요의 진단에 대한 최대 소변 NGAL 값을 위한 수신기 작동 특성 곡선.

도 4

복부 대동맥류 파열로 신속하게 수술받은 성인 남자 환자에 있어서 소변 NGAL 및 혈장 크레아티닌 값의 시간 경과.

도 5

신장 기능에 영향을 미치지 않는 패혈증이 있는 여성 환자에 있어서 소변 NGAL 및 혈장 크레아티닌 값의 시간 경과. 신장 질환의 진단을 위한 소변 NGAL 컷오프 값 (329 ng/㎖) 및 여성에 있어 혈장 크레아티닌을 위한 정상 상한 (0.088 mmol/L)이 나타난다.

다음의 비제한적인 실시예들을 본 발명을 설명하기 위하여 추가로 제공한다.

실시예 1: NGAL 딥스틱 시험

표면이 폴리스티렌으로 이루어진 딥스틱의 분석 영역을 인간 NGAL에 대한 포획 항체로 코팅한다. 원심 분리하여 희석한 시료의 분액 (分液)을 제1 튜브 중의 NGAL의 효소 표지 검출 항체 용액에 첨가하고, 그 안에 딥스틱을 담근다. 효소 표지 검출 항체의 NGAL과의 복합체를 딥스틱에 결합하고, 이어서 수돗물로 세정하고 제2 튜브 중의 발색 기질 용액 중에 넣는다. 주어진 시간 안에 상기 기질 용액 중에서 전개된 색을 눈으로 읽어서 소변 시료 중의 NGAL 농도를 지시하는 색상 강도표와 비교하거나, 또는 예컨대 NGAL의 농도를 직접 지시하도록 프로그램될 수 있는 단순한 색도계로 읽는다.

실시예 2: NGAL 측방 유동 장치

다공성 니트로셀룰로오스 스트립 (strip)으로 이루어진 측방 유동 장치를 그의 말단부에서 도포된 NGAL의 포획 항체를 사용하여 피복하여 교차 밴드 (transverse band)로 삼는다. 검출 항체가 유도되는 종(種)의 항체에 대한 항체의 또 하나의 교차 밴드를 포획 항체 말단에 위치시키고 스트립 기능의 대조물로서 역할을 한다. 스트립의 인접 단부는 표지를 붙인 폴리스티렌 입자 또는 염료 복합체 입자에 결합 또는 흡착된 NGAL의 검출 항체를 함유하고 있다. 원심분리된 소변 시료의 분액을 스트립의 인접 단부에 도포하면, 검출 항체에 부착된 표지를 붙인 입자는 모세관 인력에 의하여 스트립을 따라 이동한다. 포획 항체의 밴드에 도달하면, NGAL을 결합한 이들 입자들만이 보존되어 검출 밴드를 이루게 된다. 검출 항체에 대한 항체의 대조 밴드에 도달한 입자들은 NGAL의 결합 여부에 관계 없이 검출 밴드를 생성하게 된다. 표지를 붙인 밴드의 강도는 유색 입자의 경우는 눈으로 읽을 수 있고, 또는 사용된 표지에 대하여 적절한 검출 장치를 이용하여 판독할 수 있다. 긍정적인 결과는 2개의 밴드 중에서의 표지의 축적 또는 발색에 의하여 나타나는 한편, 부정적인 결과는 단지 대조 밴드 중에서의 다른 표지 또는 발색에 의하여 나타난다. 대조 밴드 중에서의 발색 또는 다른 표지가 나타나지 않으면 부적절한 스트립 기능을 나타낸다. 시험의 감도는 적용된 시료를 희석하여 조절할 수 있는데, 이것은 측정된 컷오프 값 이상의 NGAL 농도만이 긍정적인 결과를 초래하도록 조정된다. 또한, 시험의 감도는 검출 항체를 표지한 입자 및 표지하지 않은 입자의 혼합물에 결합시킴으로써 조절할 수 있다. 정량 또는 반정량 결과를 장치로부터 판독할 수 있도록 일군의 스트립을 미리 설정하여 검출 장치에 의하여 판독할 수 있는 설정 코드를 갖출 수 있다. 당해 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있는 바와 같이, 이 측방 유동 기술의 개별적인 관점의 다양한 변형이 가능하다.

실시예 3: NGAL 미니칼럼 시험

미니칼럼은 체액과 세포를 통과 가능하게 하는 압축형 폴리에틸렌 입자로 만들어진 프릿 (frit)을 함유하고 있다. 상기 프릿을 인간 NGAL의 포획 항체로 피복한다. 희석된 시료가 자동식 액체 취급 수단에 의하여 고정된 유량과 부피로 도포되도록 하는 장치 내에 상기 미니칼럼을 통합시킨 후, 염료와 복합된 항체를 검출한다. 세정액의 통과 후, 프릿의 색상 강도를 빛 발산 광도 측정법으로 판독한다. 미리 보정할 필요 없이 기기에 의하여 정량적인 결과가 나타날 수 있도록 일군의 프릿을 미리 보정하여 미니칼럼에 상기 장치로 판독할 수 있는 설정 코드를 갖춘다.

실시예 4: NGAL 샌드위치 ELISA

표준 및 설정 물질로서 사용하기 위한 정제된 재조합 인간 NGAL을 킬드센 (Kjeldsen) 등에 의하여 설명된 바 (1996)와 같이 제조하였다. NGAL의 항체는 ㅋ키킬드센 등에 의하여 설명된 것들 (1993; 1996)이었다. 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 pH 9.4, 0.05 몰 탄산나트륨 완충액 중의 2 ㎍/㎖ 농도로 하여, 4℃에서, 100 ㎕/웰의 양으로 적용된 항체 211-1로 철야 피복하였다. 상기 웰을 비우고 0.05% Tween 20을 함유하는 pH 7.4, 인산 완충 식염수로 3회 세정하여 블럿 (blot)하였다. 희석 완충액 (소 알부민 0.1 mg/㎖를 함유하는 세정 완충 용액) 중의 보정기와 시료의 희석액을 100 ㎕ 부피로 상기 웰에 적용하고, 진탕 테이블 (shaking table)에서 실온으로 1 시간 배양하였다. 이어서, 웰을 비우고 전술한 바와 같이 세정하여 블럿하였다. 희석 완충액 중의 농도 0.25 ㎍/㎖인 바이오티닐화 항체 211-2를 100 ㎕/웰의 양으로 각 웰에 첨가하고, 진탕 테이블에서 실온으로 1 시간 배양하였다. 그리고 나서, 웰을 비우고 전술한 바와 같이 세정하여 블럿하였다. 희석 완충 액 중에서의 희석률이 1/2000인, 서양고추냉이 과산화 효소 (horseradish peroxidase)와 스트랩트아비딘 (streptavidin) (Zymed, CA)의 복합체를 100 ㎕/웰의 양으로 각 웰에 첨가하고 진탕 테이블에서 실온으로 1 시간 배양하였다. 웰을 비우고 전술한 바와 같이 세정하여 블럿하였다. 이어서, 테트라메틸벤지딘과 과산화수소 (TMB-ONE, Kem-En-Tech, 덴마크)를 함유하는 기질 용액을 100 ㎕/웰의 양으로서 각 웰에 첨가하고, 정확히 8분간 실온에서 암소 (暗所)에서 배양한 다음 각 웰에 1 몰 황산 50 ㎕를 첨가하여 색상 반응을 정지시켰다. 그리고 나서, 빛 흡수를 빼고, 파장 450 nm에서 웰의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기로 읽고, 650 nm에 서의 흡광도를 삭감하였다. 이어서, 기지 농도의 보정기의 흡광도 판독값으로부터 얻은 표준 곡선으로부터 시료 중의 NGAL의 농도를 산출하였다.

검출 한계 (0으로부터 오차 신뢰 한계 95%)가 2.4 pg/㎖인 분석 범위는 0.02 ng/㎖ 내지 1 ng/㎖이고, 정제된 보정기와 시료의 희석액 사이에 평행을 나타내었다. NGAL의 농도는 정상의 인간 혈청 풀(pool) 중에서 90 ng/㎖이고, 정상의 인간 소변 풀 중에서는 5.4 ng/㎖이었다.

추가의 실시예들은 신장 질환에 대한 진단치의 추정과 무작위로 중환자실 중의 성인 환자들의 소변 및 혈청이나 혈장에서 NGAL의 측정의 추정과 함께, 임상학적 및 증세원적(症勢原的; paraclinical) 상호관계를 나타내고 있다. 상기 실시예 4에 기재된 것과 모든 세부 사항이 유사한 샌드위치 ELISA 에 의하여 NGAL을 측정하였다.

실시예 5: 초기의 임상학적 및 증세원적 상호 관계

중환자실 중의 성인 환자들 중 무작위로 선택된 11명의 소변 및 혈청 일점(一點) 시료 중의 NGAL의 농도를 표 1에 나타내었는데, 이들을 임상학적 및 증세원적 자료와 비교한다.

[표 1] 11명의 환자의 소변 및 혈청 중의 NGAL 농도: 임상학적 및 증세원적 자료와의 상호 관계

환자 번호	진단	u-NGAL 순위 ng/㎖	s-NGAL 순위 ng/㎖	p-크레아티닌 순위 μM	호중구 순위 x 109/㎖	s-CRP 순위 ㎍/㎖
1	MT, 요량 감소증	10 8640	10 435	10 366	11 15.6	2 31
2	대동맥류 파열, 무뇨증, 혈액 투석	7 1490	9 342	11 605	7 9.6	6 71
3	B-cell ALL, 폐렴	9 3800	8 330	2 63	2 2.0	10 97
4	대변 복막염	8 2700	7 273	7 108	9 16	9 87
5	구균(S. aureus) 패혈증, ATN	11 15,700	11 922	6 103	8 13.9	8 81
6	AML, 패혈 쇼크	6 1030	5 146	9 164	1 <0.1	4 56
7	HRS 장구균(E. faecalis) 균혈증	3 900	3 92	3 82	5 6.7	1 19
8	혈종, ARDS	5 1000	4 114	8 154	6 9.5	3 37
9	MT	1 110	1 66	4 91	4 5.7	11 103
10	MT	4 950	6 147	5 98	3 5.0	7 81
11	비장 절제, 천공된 횡경막	2 130	2 79	1 30	10 19	5 62

정상치: s-NGAL 90 ng/㎖, u-NGAL 5.4 ng/㎖

ALL: 급성 림프성 백혈병; AML: 급성 골수성 백혈병; ARDS: 성인성 호흡 곤란 증후군; ATN: 급성 세뇨관 괴사; CRP: C-반응성 단백질; HRS: 간신 증후군; MT: 다발성 외상; p: 혈장; s: 혈청; u: 소변

순위 상관 (r)의 스피어만 (Spearman) 계수

u-NGAL/s-NGAL: r 0.945 P <<0.001

u-NGAL/p-크레아티닌: r 0.418 P 0.1

s-NGAL/호중구 개수: r 0.273, 비유의적

s-NGAL/s-CRP: r 0.064, 비유의적

모든 환자에게서 NGAL 소변 농도가 상승하였다. 혈청과 소변 NGAL 수치 사이에 밀접한 상관 관계가 있으나, 소변 NGAL과 혈장 크레아티닌 사이에는 중간 정도의 상관관계만이 있다. 임상학적으로 ATN이라고 진단된 경우는 혈장 크레아티닌에서 유의적으로 증가되지 않은 때에 소변 NGAL가 극히 높은 특징이 있었다. 혈장 NGAL과 호중구 개수 사이의 약한 상관 관계는 혈청 NGAL이 호중구의 반영이 아니라는 것을 보여준다. 특히, 3번 환자에 있어서 소변 및 혈청 NGAL의 양자가 모두 상승하였으나, 급성 림프성 백혈구 때문에 호중구 개수는 오직 2.0 x 10⁹/㎖이고, 특히 6번 환자에 있어서 급성 골수성 백혈병 때문에 호중구의 개수가 셀 수 없을 만큼 작았다. 더욱이, CRP와의 상관 관계의 결핍은 s-NGAL이 단지 급성기(急性期) 단백질이 아니라는 것을 보여준다. 저장된 시료의 반복적인 분석은 소변 시료의 안정성이 제한되는 한편, 혈청 시료에서는 더 안정적일 수 있다. 이러한 결과는 NGAL이 기관 손상, 특히 유일한 것은 아니지만 손상된 신장에서 생성된다는 것을 제시한다. 이것은 혈액으로 흘러들어가고 소변으로 배출된다. 그러나, ATN에서 신장 NGAL은 또한 직접 소변으로 들어가 매우 높은 NGAL 소변 농도를 생산한다.

시료 채취의 시기에 신장 질환의 어떤 임상 진단도 없었고 p-크레아티닌이 정상 범위 내에 있었던 3번 및 4번 환자들은, 대동맥류 파열 후 무뇨증 때문에 신장 투석을 받은 2번 환자보다 소변 NGAL 수치가 높았다. 임상적으로 ATN으로 진단된 5번 환자에게서도 역시 관찰되었던 것처럼, 2명의 환자 (3번과 4번)들은 심각한 감염, p-크레아티닌의 증가에 앞서 소변 NGAL의 증가 때문에, 신장 허혈 손상으로 발전할지도 모른다.

실시예 6: 신장 질환에 있어서의 무작위로 선택된 중환자실 중의 성인 환자들의 소변 및 혈장 NGAL 측정의 진단학적 능력

중환자실 중의 109명의 연속된 환자로부터 매일 아침에 채취한 소변 및 혈장 시료에서 NGAL을 측정하였다. 퇴원 요약지와 정례적인 혈액 검사 결과에 기초하여, 입원 기간 동안 신장 질환이 있었는지 없었는지에 따라 이들 환자들 중 60명을 분류 (NGAL 자료에 따라 맹목적으로)하는 것이 가능하였다. 자료가 불충분하여 남아 있는 49명의 환자를 충분히 확실하게 분류할 수 없었기 때문에, 이들은 분석에서 배제하였다. 60명의 임상적으로 분류가능한 환자들로부터 채취한 소변 및 혈장 중의 NGAL 최대 농도를 표 2에 제시한다. 그리고 나서, 각각 분류된 환자로부터 채취한 소변 및 혈장 중에 도달된 NGAL 최대 농도의 신장 질환에 있어서의 진단학적 능력을 소변 및 혈장 값에 대한 수신기 작동 특성 (ROC) 곡선을 작도하여 측정하였다. 매일 소변 및 혈장 NGAL 값의 시간 경과도 또한 각 환자에 대하여 작도하고 혈장 크레아티닌 값 등의 실험실 자료와 비교하였다.

[표 2] 신장 질환이 있거나 신장 질환이 없는 것으로 임상 분류된 중환자실중의 60명의 환자들의 혈장 및 소변 중 NGAL의 최대 농도

	혈장NGAL ng/㎖	소변NGAL ng/㎖	임상학적 분류
환자 번호			신장 질환	패혈증	암	혈액 투석
1	92	50	-	-	-	-
2	1005	5000	+	-	-	+
3	151	183	-	+	-	-
6	1320	5000	+	+	-	+
7	777	3229	+	+	+	+
8	712	269	+	+	+	-
9	2941	5000	+	-	-	+
10	3092	5000	+	-	-	+
11	65	13	-	-	-	-
12	2117	5000	+	+	-	+
15	546	3128	+	+	+	-
17	110	10	+	-	-	-
18	135	68	-	-	-	-
19	191	2672	+	+	+	+
20	336	304	-	-	+	-
21	1434	5000	+	+	-	+
24	307	1042	+	-	-	+
29	71	50	-	-	-	-
30	320	874	-	-	-	-
39	1416	1073	+	+	-	-
41	181	42	-	-	-	-
42	115	29	-	-	-	-
43	436	176	+	-	-	-
44	446	680	+	-	-	-
45	270	37	-	-	-	-
46	1962	3222	+	+	+	+
47	222	89	-	+	-	-
48	1040	3974	+	-	-	+
49	228	48		-	-	-
51	256	519	+	-	+	+
52	294	685	+	+	+	-
53	586	1337	+	+	+	-
54	1376	2915	+	-	+	+
55	1276	5000	+	+	+	+
57	180	24	-	-	-	-
58	716	3431	+	-	-	+
59	108	9	-	+	-	-
60	1219	2713	+	+	+	+
65	460	1705	-	-	+	-
67	1470	5000	+	-	-	+
69	318	68	-	+	-	-
72	175	17	-	-	-	-
75	645	3360	+	-	+	+
80	322	328	-	+	+	-
82	216	30	-	+	-	-
83	259	34	-	+	-	-
84	25	20	-	-	-	-
85	1067	370	+	+	-	+
86	64	21	-	-	-	-
87	276	779	+	-	-	-
88	302	1024	-	+	-	-
91	236	17	-	-	-	-
93	1595	5000	+	+	-	+
97	3491	708	+	+	+	+
99	820	401	+	+	-	+
100	354	85	-	-	+	-
101	1144	5000	+	+	+	+
104	1844	2748	+	+	-	+
105	488	4473	+	-	-	+
108	111	46	-	+	-	-

도 1은 신장 질환의 진단에 대하여 최대 농도 소변 NGAL 값에 대한 ROC 곡선을 나타낸다. 곡선 아래 영역은 0.930이고, 그 값 아래에서는 소변 NGAL의 농도가 신장 질환을 진단하는 것이 아닌 것인 컷오프 값은 370 ng/㎖와 329 ng/㎖ 사이에서 결정되었다. 이 범위 내의 컷오프 값에서 진단 감도는 96.9%이었고, 진단 특이도는 89.3%이었다. 긍정적인 예상치는 91.2%이고, 부정적인 예상치는 96.2%이었다.

도 2는 신장 질환의 진단에 대하여 혈장 NGAL 최대치에 대한 ROC 곡선을 나타낸다. 곡선 아래 영역은 0.914이고, 그 값 아래에서는 혈장 NGAL 농도가 신장 질환을 진단하는 것이 아닌 것인 컷오프 값은 436 ng/㎖와 355 ng/㎖ 사이에서 결정되었다. 이 범위 내의 컷오프 값에서 진단 감도는 84.8%이었고, 진단 특이도는 96.3%이었다. 긍정적인 예상치는 93.1%이고, 부정적인 예상치는 83.9%이었다.

투석 필요의 진단

신장 질환이 있는 환자들을 관찰된 최대 농도 소변 NGAL 값에 따라 2개 군으로 나누었다. 제1군 (환자 11명)은 소변 NGAL 값이 1337 ng/㎖ 이하인 것이 특징이고 다른 임상학적 및 증세원적 자료에 의하여 판단할 때 신장 질환의 정도가 경미한 환자들을 포함하고 있었다. 이 군에서 3명의 환자들이 어떤 형태로든 혈액 투석을 받았다. 제2군 (환자 21명)은 소변 NGAL 값이 2672 ng/㎖ 이상인 것이 특징이고 임상학적으로 ATN 또는 ATIN이 있는 것으로 진단된 17명의 환자들을 포함하였다. 이 군에서 20명이 어떤 형태로든 혈액 투석을 필요로 하였다. 그러므로 그 값 아래에서는 소변 NGAL의 농도가 투석의 필요를 예측하는 것은 아니지만, 정도가 경미한 신장 질환의 진단일 수 있는 컷오프 값은 1338과 2672 ng/㎖ 사이이다.

도 3은 투석을 요하는 신장 질환의 진단에 대하여 최대 농도 소변 NGAL 값에 대한 ROC곡선을 나타낸다. 곡선 아래 영역은 0.807이고, 그 값 아래에서는 소변 NGAL 농도가 투석의 필요를 진단하는 것이 아닌 것인 컷오프 값은 1338 ng/㎖와 2672 ng/㎖의 사이에서 확인되었다. 이 범위 내의 컷오프 값에서 진단 감도는 87.0%이고, 진단 특이도는 88.9%이었다. 양의 예상치는 95.2%이고, 음의 예상치는 72.7%이었다.

NGAL 값의 시간 경과

매일 소변 및 혈장 NGAL 값의 시간 경과를 작도하여 개별 분류된 환자들의 임상학적 및 증세원적 자료와 비교할 때, 이전 수치를 넘어 소변 NGAL의 86 ng/㎖, 125 ng/㎖ 및 200 ng/㎖의 상승은 퇴원 요약지에 기록되거나 혈장 크레아티닌 수치 증가에 의하여 보여지는 것과 같은 신장 기능의 악화와 관련이 있다는 것이 관찰되었다. 이전 수치를 넘어서 소변 NGAL의 200 ng/㎖ 이상 상승은 또한 이들 상승이 329 ng/㎖의 컷오프 값을 넘는 소변 NGAL 수치를 가져올 때, 신장 기능의 약화와 관련되었다. 상승 폭과 관련하여 급성 신부전증에 대한 진단치를 의미 있게 분석할 만큼 이러한 형태의 간헐적인 소변 NGAL의 상승을 분명하게 보이는 환자들의 수가 충분히 크지 않다.

일부 경우에, 소변 NGAL의 증가와 신장 기능을 약화시키는데 기여하는 혈장 크레아티닌의 증가 사이에 유사점이 있었다. 도 4는 복부 대동맥류 파열로 갑자기 수술받은 성인 남자 환자의 혈장 크레아티닌과 소변 NGAL이 유사하게 증가함을 나타낸다. 여기서 출혈 및 대동맥 클램핑 (clamping)으로 인한 신장에서의 허혈 손상이 앞서 제1의 혈장 및 소변 시료를 채취한 날에 발생하여서, 소변 NGAL 및 혈장 크레아티닌의 초기 수치는 모두 신장 질환의 정도를 지시하였다.

이전 값을 넘어 200 ng/㎖ 이상 상승하나 컷오프 값인 329 ng/㎖ 아래에 남아 있는 소변 NGAL 값은 이것이 필연적으로 신장에 영향을 미치는 것이 아닌 패혈증 등의 또 다른 증상으로 인한 것일 수도 있기 때문에, 급성 신부전증을 진단하는 것이 아니다. 도 5는 소변 NGAL의 증가를 나타내는데, 이는 혈장 크레아티닌 수치가 중환자실에서 임상 과정 동안 정상 범위 내로 잘 유지되었다는 사실에 의하여 뒷받침되듯이, 신장 기능에 영향을 미치지 않는 패혈증의 발전과 관련이 있었다.

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Claims (22)

1. ⅰ) 인간의 체액 시료 중 인간 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린 (NGAL)의 농도를 측정하는 단계와,

   ⅱ) 상기 상기 단계 i)에서 측정한 NGAL 농도와 미리 결정된 컷오프(cutoff) 값의 차이를 표시하는 단계를 포함하고,

   상기 컷오프 값은 250 ng/㎖ ~ 525 ng/㎖ 범위인

   인간의 신장 질환 가능성을 관찰 또는 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 시료는 소변 시료인 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 시료는 혈장 또는 혈청 시료인 것인 방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 단계 ⅰ)과 ⅱ)를 반복하는 단계를 더 포함하는 것인 관찰 방법.
8. 제1항에 있어서, 24 시간 내에 ⅰ) 및 ⅱ) 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는 것인 관찰 방법.
9. 제1항에 있어서, 신장 질환의 치료를 시작하거나 끝낸 후에 ⅰ) 및 ⅱ) 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는 것인 관찰 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 신장 질환은 허혈 후 신장 손상인 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 신장 질환은 급성 신부전증, 급성 세뇨관 괴사 또는 급성 세뇨관 간질성 신증을 일으킬 수 있는 질환인 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 신장 질환은 신독성제에 의한 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 i)에서 측정한 NGAL의 농도를 제2 컷오프 값과 비교하는 단계를 더 포함하고, 상기 제2 컷오프 값은 투석에 의한 환자의 치료를 필요로 하는 신장 질환 정도와 관련이 없는 낮은 NGAL 농도를 배제하도록 선택된 값으로서 1000 ng/㎖ ~ 3000 ng/㎖ 범위인 방법.
14. 삭제
15. 제1항에 있어서, NGAL은 NGAL에 특이적으로 결합하는 분자에 의하여 측정되는 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 체액은 소변인 것인 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 체액은 혈액 또는 혈장 또는 혈청인 것인 방법.
18. ⅰ) 인간의 체액 시료 중 인간 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린 (NGAL)의 농도를 측정하는 단계와,

    ⅱ) 소정의 시간 후에 동일인으로부터 채취한 추가 체액 시료로 단계 ⅰ)을 반복하는 단계와,

    ⅲ) 단계 ⅱ)에서 결정된 NGAL 농도가 단계 i)에서 결정된 NGAL 농도에 비하여 50 ng/㎖ 이상 높은 지의 여부를 표시하는 단계를 포함하는,

    인간의 신장 질환 발병을 관찰하기 위한 정보를 제공하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 단계 iii)은 단계 ⅱ)에서 결정된 NGAL 농도가 단계 i)에서 결정된 NGAL 농도에 비하여 100 ng/㎖ 이상 높은 지의 여부를 표시하는 것인 방법.
20. 제18항에 있어서, ⅱ)와 ⅲ) 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
21. 제18항에 있어서, 상기 소정의 시간은 24 시간 이하인 것인 방법.
22. 삭제

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