방부제는 화장품, 의약품, 생활용품, 식품 등 다양한 제품군의 품질을 장기간 유지하기 위해 필수적이고, 특히 유통기간이 비교적 길고 기름이나 물이 주성분으로 구성되어 있으며 미생물의 탄소원이 되는 글리세린이나 솔비톨 등과 질소원이 되는 아미노산 유도체 및 단백질 등으로 조성된 화장품의 경우는 더욱 필수적이다.
이에 화장품 제조 과정에서 뿐만 아니라 사용 중에 손가락에 의한 오염 또는 보관상의 부주의로 인한 오염 등의 2차 오염을 방지하기 위해 화학적 방부제를 첨가하는 것은 일반적이다.
그런데, 화장품, 의약품에 범용적으로 사용되는 화학적 방부제인 파라벤류의 방부제는 피부 알러지 (Andera Countti 등, Contact Dermatitis, 1997, 37;35~36.)와 환경호르몬으로서의 작용 가능성(Edwin 등, Toxicology and Applied Pharmacology, 1998, 153;12-19.) 및 내성균을 유발하는 문제점을 불러 일으킨다.또한, 생활필수품으로 사용되는 화장품의 특성과 관련하여 체내 축적과 알러지 반응의 주요 원인으로도 보고된 바도 있다.
파라벤과 같은 몇몇 합성화학성분이 에스트로겐을 무기력하게 한다는 것을 영국 Brunek 대학의 연구로부터 규명되어 인간을 비롯한 모든 생물체의 내분비계에 나쁜 영향을 미칠것이라는 우려가 점점 커지고 있으며, 특히, 여성들의 유방암과 관련되어 있어 그 문제점이 대두 되고 있다.
한편, 향신료, 식품류, 정유, 한약재 등으로부터 많은 천연 항균성 물질이 보고되고 있으며, 항균성 물질로는 페놀릭(phenolic), 폴리페놀(polyphenol), 퀴닌(quinine), 플라본(flavone), 플라보노이드(flavonoid), 플라보놀(flavonol), 탄닌(tannin), 쿠마린(coumarin), 테르페노이드(terpenoid), 알카노이드(alkaloid), 레세틴(lectin), 폴리펩타이드(polypeptide) 등으로 분류될 수 있다. 식물 유래 천연 물질의 항균력에 대한 작용 기작은 모두 밝혀지지 않았지만, 테르페노이드와 페놀릭은 미생물의 세포막을 파괴하는 기작을 통해 항균작용을 지닌다고 보고되었고, 페놀과 플라보노이드는 미생물의 대사작용에 필수적인 물질에 결합함으로써 미생물의 성장을 억제한다고 알려져 있다. 또한 쿠마린과 알카노이드는 유전자 수준에서 미생물의 성장을 억제한다고 알려져 있고 페놀릭 화합물(phenolic compound)은 낮은 수용성에도 불구하고 하이드로실 그룹(hydroxyl group)에 대해 항균활성이 높으 며, 모노테르페넨(monoterpene)류는 미생물 세포벽과 세포막에 대한 투과속도와 관계가 깊어 미생물의 세포막 구조 투과벽을 파괴함으로써 살균효과를 나타낸다고 한다(Mihee Cho 등, Food Science and Industry, 2005, Vol. 38-2).
최근에는 미생물 유래의 천연 항균물질 탐색에 대한 연구도 활발히 진행되고 있는데 이 중 유산균이 생성해 낸 항균성 펩타이드(peptide) 또는 단백질인 박테리오신(bacteriocin)이 가장 대표적이며, 이들은 인체에 섭취되면 소화기관 내에 존재하는 단백질 가수분해 효소에 의해 분해되므로 장내 유익균에 영향을 주지 않고, 잔류성이 없어 식품 등의 천연 보존제로 각광을 받고 있다.
그러나 대부분의 천연 방부제는 원료 자체의 안정성이 떨어질 수 있으며 합성 방부제에 비하여 다량 첨가해야 하는 문제점이 있고 박테리오신은 항균작용의 범위가 좁기 때문에 천연 보존제로서의 사용에 제한을 받는다. 이와 같은 문제로 천연 방부제인 편백 추출물인 히노키티올(Hinokitiol), 목련 추출물인 메그노놀 (Megnonol), 자몽종자추출물 DF-100 등의 극히 일부만이 상용화되고 있다.
한편, 희첨 (Siegesbeckia glabrescens Makino)은 한국, 일본, 타이완, 중국 등지에 분포하며, 들이나 밭 근처에 자라는 국화과의 다년생의 초목으로 진득찰, 징계초, 개차랍 등의 이명으로 불린다. 식품 의약품 안전청의 식품공전 원재료 분류의 주원료인 어린잎은 식용 가능한 원료로 등재되어 있으며 뿌리를 제외한 전초는 약용으로 널리 사용된다.
희첨은 주로 관절이 붓는 것을 억제하고 동물의 혈압을 내리는 효과가 있으며 유풍습성 관절염에는 당귀와 배합하여 사용할 뿐만 아니라 황달형 간염에 대한 효능도 확인되었다. 또한 민간에서는 생즙을 뱀독, 벌레독을 해독하는데 사용되고 사지마비, 반신불수 등의 치료 효과도 있다.
상기와 같은 희첨의 주요성분으로는 오리엔타라이드(orientalide), 푸베탈린(pubetalin), 다루틴(darutin), 다루토사이드(darutoside), 캄페스테롤(champesterol) 등이 알려져 있다. 최근 연구에서 희첨으로부터 분리된 디테르페네스(diterpenes)의 PTP1B (Protein tyrosine phosphatase 1B)의 효소 억제 활성이 보고되어 비만과 당뇨 등의 질환에 대한 치료 가능성을 확인하였고 (Kim S. 등, J.Enzyme Inhib. Med. Chem. 2006, 21(4); 379-383.), 사람 유래의 유방암세포인 MCF-7, MDA-MB-231에서 세포사를 유도함을 확인하였다 (Jun SY.등, Oncol Rep., 2006, 15(6);1461-1467). 또한, 국내 연구에서는 희첨 추출물의 혈당 강하 작용과 육모 효능 등이 보고된 바 있다.
한편 상기의 희첨으로부터 회수한 추출물을 함유한 천연 방부제 및 이를 함유하는 화장료 조성물은 개시된 바 없다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
<제조예 1>
희첨
추출물 제조
희첨의 지상부를 분쇄하여 분쇄물을 얻은 후, 분쇄물에 95% 에탄올을 10 중량%로 가하고 교반을 통하여 추출하였다. 침전물이 제거된 순수한 추출액을 회수하기 위하여 0.1~1㎛의 필터로 여과하여 희첨 추출액을 수득하였다. 수득한 희첨 추출액을 감압회전 농축기를 이용하여 에탄올을 일부 제거하고 0.1㎛의 필터로 여과하여 최종적으로 1.0 중량%의 희첨 추출물을 수득하였다.
<
실험예
1>
희첨
추출물의 항균 효능 평가
상기 제조예 1에서 제조된 희첨 추출물의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 9634, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 6633, 대장균(Escherichia coli) ATCC 25922 , 슈도모나스 에이루기노사(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27853, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538, 스타필로코커스 에피델미디스(Staphylococcus epidermidis) ATCC 12228, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC 10231, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) ATCC 16404에 대한 항균 효과를 디스크 확산법 (Paper disk diffusion method)를 이용하여 평가하였다.
상기의 균들을 뮬러르-힌톤(mueller-hinton) 액체배지에 37℃, 18~24시간 동안 전배양하였다. 미리 제조한 뮬러르-힌톤 고체배지를 45℃ 항온수조에 보관하였고 실험 하루 전에 15ml씩 분주하여 플레이트(plate)를 준비하였다. 상기의 전배양 한 균과 함께 배양에 사용한 액체배지를 5 X 106 CFU/ml가 되도록 희석한 후, 45℃ 항온수조에 보관했던 고체배지에 섞어주었다. 균 희석액을 접종한 고체배지를 미리 준비해둔 플레이트 위에 부어주고 상온에 정치한 후 굳게 되면 그 위에 직경이 8mm인 페이퍼디스크(paper disk)를 일정한 간격으로 올려두고 상기 제조예 1에서 제조한 희첨 추출물을 농도별로 50㎕씩 처리하여 37℃의 배양기에서 24시간 동안 배양하여 희첨 추출물의 항균 효능을 평가하였다.
대조군 1은 종래의 합성 방부제인 포타슘소르베이트(potassium sorbate), 대조군 2는 메틸 파라 벤젠 (methyl-para- benzene)로 상기 제조예 1에서 제조한 희첨 추출물과 같은 방법으로 항균 효능을 평가하였다.
Organism |
대조군 1 |
대조군 2 |
제조예 1 |
1,500ppm |
3,000ppm |
1,500ppm |
3,000ppm |
2,500ppm |
5,000ppm |
10,000ppm |
B.
cereus
|
13w |
13w |
14w |
15w |
14 |
15 |
16 |
B.
subtilis
|
13w |
13w |
14w |
15w |
13 |
14 |
15 |
E.
coli
|
10 |
11 |
11 |
11.5 |
10.5 |
11 |
11.5 |
P.
aeruginosa
|
- |
- |
- |
- |
11w |
12w |
13w |
S.
aureus
|
13w |
13w |
13w |
14w |
13 |
14 |
15 |
상기 표 1에서 본 발명의 희첨 추출물을 함유하는 천연 방부제 조성물의 항균 효능은 기존의 합성방부제인 대조군 1, 2와 동등 내지 다소 우수한 것으로 나타났으며(도 1), 농도의 차이는 있으나 희첨 추출물이 분리 정제된 물질이 아니므로 그 결과로부터 방부제로서 유의적인 의미가 있다 할 것이다.
<
실험예
2>
희첨
추출물의 미생물 생장 최소 억제 농도 평가
상기 제조예 1에서 제조한 희첨 추출물의 미생물 생장 최소 억제 농도를 평가하기 위해 고체배지 희석법 (Agar plate dilution method)을 수행하였다.
먼저 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 9634, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 6633, 대장균(Escherichia coli) ATCC 25922 , 슈도모나스 에이루기노사(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27853, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538, 스타필로코커스 에피델미디스(Staphylococcus epidermidis) ATCC 12228, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC 10231, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) ATCC 16404 균주를 뮬러르-힌톤 액체배지에 35℃에서 24시간(C. albicans의 경우, 48시간) 동안 전배양 하였다. 미리 제조하여 멸균한 뮬러르-힌톤 고체배지를 45℃ 항온수조에서 굳지 않게 유지하였고 페트리디쉬(Petri dish)에는 균 농도가 1 X 106 CFU/ml로 희석된 액체배지를 접종한 후, 포타슘 소르베이트(실험비교예 1)와 메틸 파라 벤젠(실험비교예 2)은 0.019~0.6%, 희첨 추출물(제조예 1)은 0.188~6%로 희석하여 접종하였다. 모두 접종한 페트리디쉬에 45℃ 항온수조에 보관 중이던 상기 고체배지를 15ml씩 분주하고 플레이트의 접종액과 잘 섞이도록 고르게 섞어 주었다. 충분히 정치하여 배지를 굳힌 후, 35℃에서 24시간(C. albicans의 경우, 48시간)동안 배양하였다.
각각의 균주에 대한 희첨 추출물의 최소억제농도 (MIC; Minimum inhibitory concentration)는 각 플레이트 내에서 육안으로 확인하여 균의 성장이 나타나지 않는 시료의 가장 낮은 농도로 결정하였다.
|
최소억제농도 (MIC) |
실험비교예 1 |
실험비교예 2 |
제조예 1 |
B. cereus ATCC 9634 |
> 0.6% |
0.15% |
3.0% |
B. subtilis ATCC 6633 |
> 0.6% |
0.30% |
3.0% |
E. coli ATCC 25922 |
> 0.6% |
0.30% |
3.0% |
P. aeruginosa ATCC 27853 |
> 0.6% |
0.30% |
3.0% |
S. aureus ATCC 6538 |
> 0.6% |
0.15% |
3.0% |
S. epidermidis ATCC 12228 |
> 0.6% |
0.30% |
1.5% |
C. albicans ATCC 10231 |
> 0.6% |
0.15% |
3.0% |
본 발명의 희첨 추출물을 함유하는 천연 항균 방부제는 폭넓은 균주에 대하여 상당히 우수한 항균력을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이는 합성 방부제인 포타슘 소르베이트와 메틸 파라 벤젠의 최소 억제농도에 비해 다소 높은 농도에서 억제되나, 이는 희첨 추출물이 다량의 성분을 함유하고 있다는 특징을 감안한다면 우수한 항균력으로 판단되었다.
<
실시예
1>
희첨
추출물이 함유된
스킨의
방부력
평가
본 발명의 희첨 추출물을 함유한 스킨의 방부력을 평가하기 위해 실시예 1과 비교예 1, 2, 3을 하기 표 3과 같은 성분과 조성으로 제조하였다.
구 분 |
실시예 1 |
비교예 1 |
비교예 2 |
비교예 3 |
에탄올상 |
글리세롤 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
수상 |
정제수 |
100 중량% 까지 |
첨가제 |
향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
EDTA-2Na |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
방부제 |
포타슘 소르베이트 |
- |
1 |
- |
- |
메탈 파라 벤젠 |
- |
- |
0.3 |
- |
에탄올 |
- |
- |
- |
3 |
희첨 추출물 |
3 |
- |
- |
- |
<
실험예
3>
희첨
추출물이 함유된
스킨의
방부력
평가
상기 실시예 1에서 제조한 실시예 1과 비교예 1,2,3을 각각 100g씩 담은 후, 바실러스 서브틸리(Bacillus subtilis) ATCC 6633, 대장균(Escherichia coli) ATCC 2592222, 슈도모나스 에이루기노사(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27853, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC 10231 등의 혼합균액을 스킨 g당 8 X 105 마리 수가 되도록 첨가 혼합한 후, 4주 동안 35℃에서 보관하였다. 그 다음, 접종균수의 변화를 접종한 날로부터 1일, 3일, 5일, 10일, 13일, 20일, 27일, 34일이 경과할 때마다 확인하여 본 발명의 희첨 추출물이 함유된 스킨의 방부력을 평가하였다.
구분 |
실시예 1(CFU/g) |
비교예 1(CFU/g) |
비교예 2(CFU/g) |
비교예 3(CFU/g) |
접종 균수 |
8 X 105 |
8 X 105 |
8 X 105 |
8 X 105 |
1일 후 |
< 20 |
8 X 05 |
- |
5 X 105 |
3일 후 |
< 20 |
1.5 X 104 |
- |
3.5 X 104 |
5일 후 |
< 20 |
- |
- |
8 X 102 |
10일 후 |
< 10 |
- |
- |
1.5 X 102 |
13일 후 |
<1 0 |
- |
- |
< 50 |
20일 후 |
- |
- |
- |
< 20 |
27일 후 |
- |
- |
- |
< 20 |
34일 후 |
- |
- |
- |
- |
본 발명의 희첨 추출물 함유 스킨 화장품에 대한 방부력은 종래 방부제로 쓰이는 비교예 1, 2, 3에 비하여 동등 또는 그 이상의 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다. 실시예 1은 종을 접종한 1일 후부터 높은 항균성이 나타났고, 20일 후에는 균을 발견할 수 없었다.
따라서 본 발명의 희첨 추출물을 함유한 스킨이 부패 미생물에 대해 항균성이 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
<
실험예
4>
희첨
추출물이 함유된
스킨의
방부력
평가
상기에서 제조한 실시예 1과 비교예 1, 2, 3을 각각 100g씩 담은 후, 곰팡이균인 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) ATCC 16404를 스킨 g당 2 X 103 마리 수가 되도록 첨가 혼합한 후, 접종균수의 변화를 접종한 날로부터 1일, 3일, 5일, 10일, 13일, 20일, 27일, 34일이 경과할 때마다 확인하여 방부력을 평가하였다.
구분 |
실시예 1 (CFU/g) |
비교예 1 (CFU/g) |
비교예 2 (CFU/g) |
비교예 3 (CFU/g) |
접종 균수 |
2 X 103 |
2 X 103 |
2 X 103 |
2 X 103 |
1일 후 |
< 100 |
< 100 |
< 10 |
3.5 X 102 |
3일 후 |
< 0 |
- |
- |
3.5 X 102 |
5일 후 |
< 10 |
- |
- |
3.5 X 102 |
10일 후 |
- |
- |
- |
3.0 X 102 |
13일 후 |
- |
- |
- |
1.5 X 102 |
20일 후 |
- |
- |
- |
2.0 X 102 |
27일 후 |
- |
- |
- |
< 100 |
34일 후 |
- |
- |
- |
< 50 |
본 발명의 희첨 추출물을 함유한 스킨의 방부력은 종래의 합성 방부제로 사용되는 비교예와 비슷한 효과를 보였다. 이러한 결과를 토대로 희첨 추출물은 에탄올에 의해 미생물의 세포내로 투과하여 침투하고 효능 성분이 각 미생물에 작용하여 방부 효능을 하는 것으로 사료된다.
<
실험예
5>
희첨
추출물 함유
화장료의
안전성 및 자극 평가
상기에서 제조한 실시예 1과 비교예 3에 대해 인체에 대한 안전성 및 자극을 평가하고자, 건강한 성인 남녀 20명을 대상으로 인체첩포 시험 (Human patch test)을 실시하였다.
핀 쳄버 (Finn Chamber)에 실시예 1 및 비교예 3을 각각 20㎕로 적하시킨 후, 이를 시험 부위인 인체의 팔 안쪽에 얹어 테이프로 고정시켰다. 24시간 후, 첩포를 제거하고 다시 4시간이 경과한 다음 시험 부위의 피부반응을 하기 표 5와 같은 판정기준 및 수학식 1에 따라 판정하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
판정기준 |
- |
홍반이나 특이한 현상 없음 |
± |
주위보다 약간 붉어짐 |
+ |
주위보다 현저히 붉어짐 |
++ |
주위보다 심허게 붉어지고 부풀어 오름 |
자극도= [{(±)수 X 1} + {(+)수 X 2} + {(++)수 X 3}]/ 피시험자 수
구분 |
판정결과 |
자극도 |
++ |
+ |
± |
- |
실시예 1 |
0 |
0 |
2 |
18 |
0.1 |
비교예 3 |
0 |
0 |
8 |
12 |
0.4 |
본 발명의 희첨 추출물로 이루어진 천연 방부제를 함유하는 실시예 1은 주위보다 심하게 붉어지거나 부풀어 오르는 반응이 나타나지 않았고, 홍반이나 특이한 현상도 에탄올만을 함유하는 비교예 3보다 현저히 감소되었다. 이는 에탄올만 첨가 하였을 때의 피부 자극을 희첨 추출물의 효능 성분이 감소시켜주는 간접적 작용도 함유함을 의미하며, 상기의 결과로 본 발명의 희첨 추출물로 이루어진 천연 방부제를 함유하는 화장료가 인체에 안전하다는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
2>
희첨
추출물로 이루어진 천연 방부제를 함유하는
스킨
제조
상기 제조예 1에서 제조된 희첨 추출물을 함유하는 스킨을 통상 방법에 따라 제조하였고, 성분과 조성은 하기 표 8과 같다.
구분 |
실시예 2 (중량%) |
에탄올상 |
에탄올 |
2 |
폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 |
0.2 |
수상 |
정제수 |
100 중량% 까지 |
1,3-부틸렌글리콜 |
3.0 |
카보머 |
0.05 |
첨가제 |
향 |
적량 |
방부제 |
희첨 추출물 |
3 |
<
실시예
3>
희첨
추출물로 이루어진 천연 방부제를 함유하는 로션 제조
상기 제조예 1에서 제조된 희첨 추출물을 함유하는 로션을 통상 방법에 따라 제조하였고, 성분과 조성은 하기 표 9과 같다.
구분 |
실시예 3 (중량%) |
수상 |
정제수 |
100 중량% 까지 |
프로필렌글리콜 |
2.0 |
1,3-부틸렌글리콜 |
5.0 |
카보머 |
0.12 |
유상 |
스테아린산 |
0.5 |
유동 파라핀 |
0.5 |
스쿠알란 |
5.0 |
자기 유화형 모노스테아린산 |
1.0 |
세포스테아릴알코올 |
2.0 |
이소세틸옥타노에이트 |
2.0 |
디메틸실록산 |
0.3 |
모노스테아린산폴리옥시에틸렌클리콜 |
1.2 |
모노스테아린산소르비탄 |
0.5 |
첨가제 |
향 |
적량 |
방부제 |
희첨 추출물 |
3.0 |