KR102221187B1

KR102221187B1 - 털진득찰 추출물을 포함하는 장내균총 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102221187B1
Application number: KR1020180157146A
Authority: KR
Inventors: 판철호; 홍성철; 강경수; 김주연; 차광현; 권재영; 권학철; 최용수; 이은하; 박근완
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2021-03-03
Also published as: KR20200069743A

Abstract

본 명세서에는 털진득찰 추출물을 포함하는 장내균총 개선용 조성물이 개시된다. 상기 조성물은 장내 유익균의 생장을 촉진하고 장내 유해균의 생장을 억제함으로써 베타-글루쿠로니데이즈 및 트립토파네이즈의 활성을 억제하고 장내 단쇄지방산 함량을 증가시켜 주는 효과가 있다.

Description

털진득찰 추출물을 포함하는 장내균총 개선용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING INTESTINAL MICROBIOME COMPRISING SIEGESBECKIA PUBESCENS MAKINO EXTRACT}

본 명세서에는 털진득찰 추출물을 포함하는 장내균총 개선용 조성물이 개시된다.

인체의 장 건강은 인간의 건강에 밀접한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 여러 가지 요인에 의하여 장내 미생물과 장 세포의 상호작용의 균형이 무너지면 면역 반응의 불균형 등 여러 가지 부작용을 유발하게 되며, 이로 인해 장 질환, 대사성 질환, 면역 질환 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이러한 장내균총을 개선하기 위해 장내 유익균을 이용한 프로바이오틱스와 유익균의 먹이가 되는 화합물인 프리바이오틱스에 관한 연구가 지속적으로 진행되고 있다. 최근에는 부작용이 적은 천연물로부터 장내 유익균을 높이고 장내 유해균을 감소시킴으로써 장 건강을 개선하고자 하는 연구가 활발히 진행 중에 있다.

KR 10-1697260 B1

일 측면에서, 본 명세서는 털진득찰 추출물을 유효성분으로 포함하는 장내균총 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 명세서는 상기 장내균총 개선용 조성물을 포함하는 장 건강 개선용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서는 털진득찰 추출물을 유효성분으로 포함하는 장내 미생물의 배양 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 털진득찰 추출물을 유효성분으로 포함하는 장내균총 개선용 조성물을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드 (DMF), 염화메틸렌, 디메틸설폭사이드 (DMSO), 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 메틸렌클로라이드 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 장내 유익균의 생장을 촉진하거나 장내 유해균의 생장을 억제하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 베타-글루쿠로니데이즈 활성 억제, 트립토파네이즈 활성 억제 및 장내 단쇄지방산 함량 증가 중 하나 이상의 특징을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 프리바이오틱스인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 프로바이오틱스의 효능을 증강시키는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 배변 기능을 개선하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 털진득찰 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 50 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 약학 조성물인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 프로바이오틱스와 병용 투여하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 0.1 내지 2,000 mg/kg/day의 투여량으로 투여하는 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 털진득찰 추출물을 유효성분으로 포함하는 장내 미생물의 배양 배지 조성물을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 장내 미생물은 인축의 대변 시료로부터 얻은 것이고, 상기 조성물은 장내 미생물 배양액의 장내균총을 개선하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 장내 유익균의 생장을 촉진하고 장내 유해균의 생장을 억제하는 것일 수 있다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 털진득찰 추출물을 유효성분으로 포함하는 장내균총 개선용 조성물을 제공하는 효과가 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 상기 장내균총 개선용 조성물을 포함하는 장 건강 개선용 키트를 제공하는 효과가 있다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 털진득찰 추출물을 유효성분으로 포함하는 장내 미생물의 배양 배지 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 명세서의 일 실시예에 따른 털진득찰 물 추출물의 성분을 분석한 고성능액체크로마토그래피-자외선 (HPLC-UV) 크로마토그램 (254 nm) 및 고성능액체크로마토그래피-질량분석기 (HPLC-MS) 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 털진득찰과 동속이종의 식물인 진득찰 물 추출물의 성분을 분석한 고성능액체크로마토그래피-자외선 (HPLC-UV) 크로마토그램 (254 nm) 및 고성능액체크로마토그래피-질량분석기 (HPLC-MS) 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 털진득찰 물 추출물과 진득찰 물 추출물의 고성능액체크로마토그래피-자외선 (HPLC-UV) 크로마토그램 (254 nm)을 함께 도시한 그래프로, 동종이속 식물인 두 가지 식물의 추출물에 함유되어 있는 성분이 명백히 다른 것을 확인하였다.
도 4a는 본 명세서의 일 실험예에 따라 정상 배지 조건에서 장내균총 생장을 확인하기 위해 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 본 명세서의 일 실험예에 따라 고단백 배지 조건에서 장내균총 생장을 확인하기 위해 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 본 명세서의 일 실험예에 따라 정상 배지 조건에서 베타-글루쿠로니데이즈 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 본 명세서의 일 실험예에 따라 고단백 배지 조건에서 베타-글루쿠로니데이즈 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 명세서의 일 실험예에 따라 정상 배지 조건에서 트립토파네이즈 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 본 명세서의 일 실험예에 따라 고단백 배지 조건에서 트립토파네이즈 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 명세서의 일 실험예에 따라 고단백 배지 조건에서 단쇄 지방산 비율 및 총 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 "유효성분"은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

털진득찰 (Siegesbeckia pubescens Makino)은 국화과 1년생 초본으로, 높이 50~100 cm 정도로 줄기는 곧게 서고 자색을 띠며, 가지에는 회백색의 긴 털이 밀생해 있다. 잎은 난형 또는 난상 삼각형에 서로 마주나고 잎자루가 있으며, 잎 끝은 뾰족하고 가장자리에는 불규칙한 톱니가 나 있다. 꽃은 가지 끝과 원줄기 끝에서 8~9월에 황색의 꽃이 피고 열매는 9~10월에 결실한다. 털진득찰은 보통 건조시켜서 한약제로 많이 쓰이고, 우리나라 남부 지방과 바닷가 주변에서 많이 자란다.

본 명세서에서 털진득찰은 털진득찰 그 자체뿐만 아니라 털진득찰의 가공물, 예를 들어 건조물, 분쇄물, 발효물 등 추가적인 가공에 의한 모든 형태를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 털진득찰은 추출물의 생성을 위해 그 뿌리, 줄기, 가지, 잎, 열매, 꽃 및 수피 등 식물의 전 범위에 걸쳐 제한이 없이 사용 가능하다.

상기 털진득찰 추출물은 털진득찰의 조추출물뿐만 아니라 추출물의 가공물, 예를 들어 건조, 농축, 분획, 발효 등 추가적인 가공에 의한 모든 형태를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 털진득찰 추출물은 시판되는 것을 구입하거나, 또는 당해 기술분야에서 사용되는 통상의 추출방법을 적절하게 선택, 조합, 부가 또는 변경하여 얻어질 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 추출물을 제조하는 방법은 초임계추출, 아임계추출, 냉침추출, 고온추출, 환류냉각추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등을 이용하는 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 환류 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 추출용매는 털진득찰 건조물의 약 1 내지 15배 정도에 해당하는 용매를 가하여 추출할 수 있으며, 구체적으로 약 10 배의 용매를 가하여 추출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아울러, 추출회수는 1 내지 5회일 수 있으며, 구체적으로 3회 반복 추출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 추출시간은 2 내지 100시간일 수 있으며, 구체적으로 10 내지 70시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

장내균총 개선용이란, 장내 유익균의 증식 또는 생장은 촉진하고 장내 유해균의 증식 또는 생장은 억제하되, 장내 유익균과 유해균의 균형을 유지하는 것을 의미한다.

미생물이 장기관 내에 서식하기 시작하여 그 집단이 평형에 도달함으로써 장내균총을 형성하게 된다. 장내균총을 구성하는 개개의 미생물들은 비타민 공급, 감염 방지 및 장 기능 등에 관여하고, 이로 인해 균총의 조성은 변비, 장 관련 질환의 발생 등과 깊은 관계가 있다고 알려져 있다 (Mistuoka T. Bifidobacteria Microflora, 1(1): 3, 1982).

장내 유익균이란, 장내에 서식하고 있으면서 인체에 유익한 효능을 미치는 미생물을 총칭할 수 있다. 예컨대, 장내 유익균은 프로바이오틱스를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 장내 유익균은 이에 제한되지 않고, 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium), 락토바실러스 속 (Lactobacillus), 락토코커스 속 (Lactococcus), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus), 아커멘시아 속 (Akkermansia), 패컬리박테리움 속 (Faecalibacterium), 또는 엔테로코커스 속 (Enterococcus)을 포함할 수 있다.

장내 유해균이란, 장내에서 서식하고 있으면서 장염 등과 같이 인체에 해로운 효과를 미치는 미생물을 총칭할 수 있다. 예컨대, 상기 장내 유해균은 이에 제한되지 않고, 대장균 (Escherichia coli), 푸소박테리움 속 (Fusobacterium), 클로스트리듐 속 (Clostridium), 스타필로코쿠스 속 (Staphylococcus), 또는 포피로모나스 속 (Porphyromonas)을 포함할 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 장내균총의 베타-글루쿠로니데이즈 (β-glucuronidase) 활성 억제, 트립토파네이즈 (tryptophanase) 활성 억제 및 장내 단쇄지방산 (short chain fatty acid) 함량 증가 중 하나 이상의 특징을 갖는 것일 수 있다. 베타-글루쿠로니데이즈 및 트립토파네이즈는, 장내 유해균의 마커로서, 베타-글루쿠로니데이즈 및 트립토파네이즈의 활성이 감소하면, 장내 유해균의 생장이 억제된 것임을 알 수 있다.

본 명세서에서 단쇄 지방산(Short-chain fatty acids)이란, 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 지방산을 의미할 수 있다. 예시적인 일 구현예에서, 상기 단쇄 지방산은 아세테이트, 프로피오네이트 (propionate), 이소부티레이트 (isobutyrate), 부티레이트 (butyrate), 이소발레이트 (isovalerate) 및 발레레이트 (valerate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 프리바이오틱스인 것일 수 있다. 본 명세서는 털진득찰 또는 털진득찰 추출물을 유효성분으로 포함하는 장내 유익균의 증식 촉진 및 장내 유해균의 생육 억제용 프리바이오틱스를 제공하며, 이는 프로바이오틱스의 효과를 증강시켜 주는 시너지 효과가 있다. 이때, 상기 프리바이오틱스는 섬유질, 올리고당, 플락토올리고당 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함할 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 프로바이오틱스의 효능을 증강하는 것일 수 있다.

상기 프로바이오틱스란, 체내에서 건강에 좋은 영향을 미치는 미생물을 의미하며, 프리바이오틱스란, 유익균을 포함하는 미생물에 의해 이용되어 미생물의 생육이나 활성을 촉진시킴으로써 숙주의 건강에 좋은 효과를 나타내게 하는 성분을 의미한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 배변 기능을 개선하는 것일 수 있다. 배변 기능 개선이란, 예컨대 불규칙한 배변을 규칙적으로 하거나, 변비 또는 설사 증세를 개선하는 것을 포함할 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인 것일 수 있다.

본 명세서에서 건강식품 조성물은 다양한 형태의 식품 첨가제 또는 기능성 식품을 제공한다. 구체적으로, 상기 조성물을 포함하는 침출차, 액상차, 음료, 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 또는 건강보조식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다.

또한, 식품 조성물은 유효성분이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화 방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조성분을 더 포함할 수 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 명세서의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.01 내지 5 중량%, 또는 0.01 내지 3 중량% 범위일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 변비의 예방 또는 치료용인 것일 수 있다.

본 명세서에 따른 조성물을 의약품에 적용할 경우 상기 조성물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제제로서는 정제, 환제, 과립제, 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여를 위한 제제로서는 주사제, 점적제, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 등을 들 수 있다. 본 명세서의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

또한, 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여할 수 있으며, 약학 조성물의 유효성분은 투여받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 내지 2,000 mg/kg이다.

장 질환의 원인으로는 체내 에너지 대사, 외부 물질에 대한 호스트의 방어 기작, 유전적 또는 환경적 요인, 스트레스 등 다양한 요소들이 있다. 예를 들어, 장 상피세포와 장내 미생물 간의 정상적인 상호작용이 무너지면, 그 결과 병원체가 장내 침입 시 과도한 면역 반응을 일으켜 장 점막에 염증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 다양한 외부 인자에 의하여 정상인의 장 점막에서 적절한 점막 유지 단백질과 면역 반응의 균형이 무너지면, 장막이 손상되고 막 투과도 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에 따른 조성물은 천연물을 이용하여 인체에 부작용이 없고, 장내균총을 개선하여 장 질환을 예방, 개선 또는 치료하고 장 건강, 장 기능을 향상시켜 주는 효과가 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 배변 활동에 도움을 주거나 또는 장 건강에 도움을 주는 것일 수 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 상기 장내균총 개선용 조성물을 포함하는 장 건강 개선용 키트를 제공한다.

상기 병용은, 털진득찰; 또는 털진득찰 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물과 프로바이오틱스를 포함하는 조성물을 동시에 투여하는 것, 또는 둘 중 어느 하나를 먼저 투여한 후 나머지 하나를 투여하는 것을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 프로바이오틱스는, 프로바이오틱스를 포함하는 건강식품 조성물 또는 약학 조성물의 형태일 수 있고, 예컨대, 유산균을 포함하는 유발효물일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 키트는 설명서를 더 포함하고, 상기 설명서에는, 상기 장내균총 개선용 조성물을 0.1 내지 2,000 mg/kg/day의 투여량으로 투여한다는 내용을 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 투여는 경구투여인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 장내 미생물을 시험관내 (in vitro)에서 배양하기 위한 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 장내 미생물의 생장 촉진용인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 장내 미생물 배양액의 장내균총을 개선하기 위한 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 장내 미생물은 인축의 대변 시료로부터 얻은 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 배양 배지 조성물은 인축 기타 생물의 장내 미생물의 생장을 촉진시켜 주는 것일 수 있으며, 상기 인축 기타 생물의 장내 미생물은 사람, 원숭이, 소, 한우, 젖소, 염소, 말, 양, 돼지, 마우스, 래트, 햄스터, 쥐, 기니피그, 개, 고양이, 사슴, 코끼리, 염소, 닭, 거위, 칠면조, 오리, 타조, 메추라기, 낙타, 토끼, 어류, 광어, 우럭, 도미, 장어, 참치, 넙치, 잉어, 송어, 향우, 미꾸라지, 개구리, 자라, 거북, 해삼, 성게, 우렁쉥이, 다슬기, 소라, 우렁이, 벌, 꿀벌, 메뚜기, 누에, 또는 선충의 장관에 존재하거나, 이를 시험관에서 인위적으로 배양한 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 장내 유익균의 증식 또는 생육을 촉진하고 장내 유해균의 증식 또는 생육을 억제하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 장내균총의 베타-글루쿠로니데이즈 (β-glucuronidase) 활성 억제, 트립토파네이즈 (tryptophanase) 활성 억제 및 장내 단쇄지방산 (short chain fatty acid) 함량 증가 중 하나 이상의 특징을 갖는 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 털진득찰 추출물 제조

털진득찰 (Siegesbeckia pubescens Makino)의 전초를 경상북도 영천에서 채집하여 건조 후 분쇄하였다. 건조된 식물체 150 g을 추출 용기에 넣은 다음, 증류수 1.5 L를 가한 후 2 시간 동안 환류추출을 실시하였고, 종이 여과지로 중력 여과하는 과정을 2회 반복 ('추출-여과' 2회)하여, 여과된 추출액 수득하였다. 상기 여과된 추출액을 감압 농축기에 넣고 용매를 완전히 증발시켜 농축하여 6.3 g의 털진득찰 물 추출물을 수득하였다 (수득률 4.2%).

또한, 상기 건조된 식물체 150 g을 추출 용기에 넣은 다음, 에탄올 1.5 L를 가한 후 2 시간 동안 환류추출을 실시하였고, 종이 여과지로 중력 여과하는 과정을 2회 반복 ('추출-여과' 2회)하여, 여과된 추출액 수득하였다. 상기 여과된 추출액을 감압 농축기에 넣고 용매를 완전히 증발시켜 농축하여 8.5 g의 털진득찰 에탄올 추출물을 수득하였다 (수득률 5.7%).

비교예 1. 진득찰 추출물 제조

털진득찰의 동속이종 식물로서 포기 전체에 털이 적고 꽃줄기에 선모가 나는 진득찰 (Siegesbeckia glabrescens Makino)을 경상북도 영천에서 채집하여 건조 후 분쇄하였다. 건조된 식물체 150 g을 추출 용기에 넣은 다음, 증류수 1.6 L를 가한 후 2 시간 동안 환류추출을 실시하였고, 종이 여과지로 중력 여과하는 과정을 2회 반복 ('추출-여과' 2회)하여, 여과된 추출액 수득하였다. 상기 여과된 추출액을 감압 농축기에 넣고 용매를 완전히 증발시켜 농축하여 18.8 g의 진득찰 물 추출물을 수득하였다. (수득률 11.8%)

실험예 1. 털진득찰 추출물 및 진득찰 추출물의 성분 분석

상기 실시예 1의 털진득찰 물 추출물로부터 하기 분석 조건에 따라 고성능액체크로마토그래피-자외선 (HPLC-UV) 크로마토그램과 고성능액체크로마토그래피-질량분석기 (HPLC-MS) 크로마토그램를 획득하였다. 도 1에서 상단은 털진득찰 물 추출물의 자외선 (UV) 검출기를 이용한 크로마토그램이며, 하단은 털진득찰 물 추출물의 HPLC-MS 크로마토그램이다.

또한, 상기 실시예 2에서 제조한 진득찰 물 추출물로부터 하기 분석 조건에 따라 고성능액체크로마토그래피-자외선 (HPLC-UV) 크로마토그램과 고성능액체크로마토그래피-질량분석기 (HPLC-MS) 크로마토그램을 획득하였다 (도 2 참조).

HPLC-MS 분석 조건은 다음과 같다.

사용장비: Agilent 1200 system

컬럼: RP C-18 HPLC 컬럼 (4.6x150 mm, 5μm)

용매: (a) 0.05% FA (Formic acid)를 함유한 아세토니트릴

(b) 0.05% FA를 함유한 물

이동상 조성: 0분 (a)용매:(b)용매 부피비 10:90으로 용출 시작

0분에서 30분 (a)용매 비율을 10%에서 100%로 증가

이동상 유속: 0.7 mL/min

검출기: UV (254 nm), MS (positive)

분석 결과, 털진득찰 물 추출물에서 나타나는 머무름 시간 5분에서 25분 사이에 뚜렷한 주요 성분들이 진득찰 물 추출물에서는 관찰되지 않았다. 도 3은 털진득찰 물 추출물과 진득찰 물 추출물을 동시에 비교한 크로마토그램이며, 공통적으로 존재하는 성분이 소량 존재하나 주요 성분과 함량에서 큰 차이가 있음을 확인하였다.

실험예 2. 털진득찰 추출물의 장내균총 개선 효과

본 실험예에서는 인체 유래 분변을 활용하여 장내균총을 배양하였으며, 배지 조성에 변화를 주어 장내균총을 파괴 또는 유지하였다. 이러한 변화는 인체에 특정 질환이 발생하였거나 식이요법이 잘못되었을 경우를 가정하여, 장내균총에 변화가 생겼을 때 털진득찰의 장내균총 개선 효능을 검증하고자 하는 것이다.

그 결과, 하기와 같이 털진득찰 추출물을 처리한 특정 처리군에서 장내균총이 개선됨을 확인하였다. 이러한 개선 효과는 장내균총이 좋지 않은 조건이 되었을 때 발생하는 효소인 글루크로니데이즈 (glucuronidase)와 트립토파네이즈 (tryptophanase)의 활성 변화를 통해 확인할 수 있으며, 또한, 장내균총이 만들어 내는 단쇄지방산 (short-chain fatty acid)의 함량 비율을 통해 장내균총의 개선 효과를 확인할 수 있다.

(1) 대변 유래 장내균총 배양 및 시료 처리

장내 미생물 배양을 위해 3개월 내에 항생제 처방을 받은 적이 없는 7명의 건강한 한국인 청년들로부터 10-30 g의 대변 시료를 확보하였고, 이를 30분 이내에 혐기성 작업대로 옮겨 신속하게 섞어 주었다. 동결보존을 위한 첨가제로 글리세롤을 넣어준 후 40 mL씩 분주하여 초저온 냉동고에 보관하였고, 이를 장내 미생물 배양을 위한 접종용 시료로 사용하였다.

장내 미생물의 배양 상태를 안정적으로 일정하게 유지하기 위해 생물 반응기를 이용한 연속식 혐기 배양을 수행하였다. 배양에 사용한 기본 배지는 표 1과 같고 고단백질 섭취군의 배지를 모사하기 위해서는 표 2의 배지를 사용하였다.

성분	함량 (g/L)
Peptone	1.3
Yeast extract	2
NaHCO₃	2
L-Cystein-HCl	0.5
Bile salts	0.5
Hemin	0.005
NaCl	0.8
KH₂PO₄	0.04
K₂HPO₄	0.04
MgSO₄	0.01
CaCl₂	0.01
Mucin	4
Arabinogalactan	5
Starch	5
Vitamin K1	10 (μL)

성분	함량 (g/L)
Peptone	1.3
Yeast extract	2
NaHCO₃	2
L-Cystein-HCl	0.5
Bile salts	0.5
Hemin	0.005
NaCl	0.8
KH₂PO₄	0.04
K₂HPO₄	0.04
MgSO₄	0.01
CaCl₂	0.01
Mucin	4
Casein	8
Starch	2
Vitamin K1	10 (μL)

구체적으로, 300 mL의 배지가 담긴 각 생물 반응기는 멸균 후 질소 가스 주입을 통해 혐기 상태로 유지시킨 다음 미리 준비된 장내 미생물 시료를 접종하였다. 24시간 동안 회분식 배양을 수행한 후 같은 조성의 배지를 이용하여 연속식 배양을 수행하였으며 배지의 총 머무름 시간은 24시간으로 유지되었다. 배양 온도는 37 ℃로 유지되었고, pH는 1 N 염산 용액과 1 N 수산화나트륨 용액을 이용하여 5.5로 유지되었다. 배양 용액은 매일 1회씩 시료를 회수하여 안정화 여부 확인을 위한 단쇄 지방산 (short chain fatty acid, SCFA) 분석에 이용하였고 총 30일 이상 배양을 유지하였다.

또한, 후보 소재의 장내 미생물총 개선 효능을 신속하게 평가하기 위해 96웰 플레이트를 이용하여 배양을 수행하였다. 연속식 혐기 배양을 통해 안정적으로 유지되고 있는 장내 미생물 배양액 10 ㎕를 표 3과 같은 조성의 탐색용 배지 1 mL에 접종하였다. 이때 장내 미생물총 개선 효능 평가를 위한 털진득찰 추출물은 100 ㎍/mL의 농도 (0.2% DMSO)로 처리되었고 48시간 동안 37 ℃의 온도에서 배양되었다. 또한, 대조군으로써는 장내균총 개선 효과가 잘 알려져 있는 대표적인 프리바이오틱스 소재인 프락토올리고당 (Fructooligosaccharides, FOS, 1 mg/mL)을 사용하였으며, 이와 동시에 장내균총을 망가뜨리는 것으로 알려져 있는 항생제인 클로람페니콜 (10 또는 40 ㎍/mL)을 사용하여 장내균총 개선 효과를 비교하였다. 이후 미생물 배양액을 이용하여, 장내 미생물 생장 정도 측정, 유해균 효소 활성 측정, 단쇄 지방산 함량 측정 등을 통해 장내균총 개선 효능을 검증하였다.

성분	함량 (g/L)
Peptone	1.3
Yeast extract	2
NaHCO₃	2
L-Cystein-HCl	0.5
Bile salts	0.5
Hemin	0.005
NaCl	0.8
KH₂PO₄	0.04
K₂HPO₄	0.04
MgSO₄	0.01
CaCl₂	0.01
Mucin	0.8
Arabinogalactan	1
Starch	1
Vitamin K1	10 (μL)

(2) 장내 미생물 생장 정도 측정

프락토올리고당 (FOS), 항생제, 털진득찰 물 추출물, 털진득찰 에탄올 추출물이 처리된 배양액을 100 ㎕씩 96웰 플레이트로 옮긴 다음, Plate reader기를 이용하여 흡광도 600 nm에서 상대적인 미생물 생장 정도를 측정하였다.

그 결과, 종래 장내균총 개선 효과가 입증된 프리바이오틱스 소재인 프락토올리고당 (FOS)은 장내균의 생장을 높이는 반면, 장내균총을 망가뜨리는 것으로 알려져 있는 항생제 (클로람페니콜)는 장내균의 생장을 감소시켜 장내균의 생장이 좋을수록 장내균총 개선 효과가 높은 것을 알 수 있었다. 털진득찰 추출물은 프락토올리고당과 유사한 장내균 생장 결과를 나타내어 장내균총 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 털진득찰 추출물의 장내균총 생장 촉진 효과는 일반적인 정상 배지 조건뿐만 아니라 고단백질 섭취 모사 배지 조건에서도 유사하게 나타났다 (도 4a 및 4b 참조).

(3) 효소 활성 분석

프락토올리고당 (FOS), 항생제, 털진득찰 물 추출물, 털진득찰 에탄올 추출물이 처리된 장내 미생물 배양액을 이용하여 베타-글루쿠로니데이즈의 활성을 측정하였다. 베타-글루쿠로니데이즈 활성 측정은 장 건강 효능을 검증하기 위해 이용되는 표준 시험항목이다. 베타-글루쿠로니데이즈 활성이 높을수록 장내균총 내 유해균의 분포 비율이 높음을 의미하며, 베타-글루쿠로니데이즈 활성이 낮을수록 장내균총 내 유해균의 분포 비율이 낮음을 의미한다. 장내 미생물 배양액은 배양 용액과 함께 퍼멘터 (fermentor)에서 혐기 조건으로 배양, 유지하였다. 혐기 배양 용액 1.0 mL에 프락토올리고당 (FOS), 항생제, 털진득찰 물 추출물, 털진득찰 에탄올 추출물을 각각 처리한 후 장내 미생물 배양액 10 ㎕를 접종하였다. 혐기적 배양기에서 37 ℃로 48시간 배양한 후 효소액 시료로 사용하였다. 96웰 플레이트에 20 mM 4-nitrophenyl-β-D-glucuronide 40 ㎕를 첨가하고, 효소액 시료 160 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 60분간 반응시켰다. 0.5 N NaOH 200 ㎕를 가하여 반응을 종결시킨 후 3500 rpm에서 10분간 원심분리하였으며, 상층액을 취하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 장내 미생물의 생장 정도를 보정하기 위해 효소 활성을 장내균 생장 정도 (OD₆₀₀) 값으로 나눠줌으로써 최종 상대적인 베타-클루쿠로니데이즈 활성 (%)을 계산하였다.

또한, 프락토올리고당 (FOS), 항생제, 털진득찰 물 추출물, 털진득찰 에탄올 추출물이 처리된 장내 미생물 배양액을 이용하여 트립토파네이즈 활성을 측정하였다. 트립토파네이즈 활성 측정은 장 건강 효능을 검증하기 위해 이용되는 표준 시험항목이다. 트립토파네이즈 활성이 높을수록 장내균총 내 유해균의 분포 비율이 높음을 의미하며, 트립토파네이즈 활성이 낮을수록 장내균총 내 유해균의 분포 비율이 낮음을 의미한다. 장내 미생물 배양액은 배양 용액과 함께 퍼멘터 (fermentor)에서 혐기 조건으로 배양, 유지하였다. 혐기 배양 용액 1.0 mL에 프락토올리고당 (FOS), 항생제, 털진득찰 물 추출물, 털진득찰 에탄올 추출물을 각각 처리한 후 장내 미생물 배양액 10 ㎕를 접종하였다. 혐기적 배양기에서 37 ℃로 48시간 배양한 후 효소액 시료로 사용하였다. Prydoxal phosphate 2.75 mg, disodium EDTA dehydrate 19.6 mg, bovine serum albumin 10 mg을 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 100 mL에 녹여 반응 혼합 용액을 제조하였다. 96웰 플레이트에 이 반응 혼합 용액 200 ㎕와 효소액 시료 100 ㎕, 40 mM 트립토판 200 ㎕를 잘 혼합하여 37 ℃에서 60분간 반응시켰다. 발색시약 (p-demethylaminobenzaldehyde 14.7 g, 95% 에탄올 948 mL, H2SO4 52 mL) 600 ㎕를 가하여 반응을 종결시킨 다음, 3500 rpm에서 10분간 원심 분리하였으며 상층액을 취하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 장내 미생물의 생장 정도를 보정하기 위해 효소 활성을 장내균 생장 정도 (OD₆₀₀) 값으로 나눠줌으로써 최종 상대적인 트립토파네이즈 활성 (%)을 계산하였다.

그 결과, 도 5a 내지 6b에 나타난 바와 같이, 털진득찰 추출물은 장내 유해균 효소 마커인 베타-글루쿠로니데이즈 및 트립토파네이즈의 활성을 낮춰 주는 효과가 있음을 확인하였다. 일반적으로 베타-글루쿠로니데이즈 및 트립토파네이즈 활성이 낮을수록 유해균이 분포가 낮음을 의미하며, 이는 곧 장내균총 개선 효과가 높은 것으로 판단한다. 종래 장내균총 개선 효과가 입증된 프리바이오틱스 소재인 프락토올리고당 (FOS)은 베타-글루쿠로니데이즈 및 트립토파네이즈 활성을 낮추는 반면, 장내균총을 망가뜨리는 것으로 알려져 있는 항생제 (클로람페니콜)는 장내균 배양액에서 베타-글루쿠로니데이즈 및 트립토파네이즈 활성을 증가시켰다. 털진득찰 추출물은 베타-글루쿠로니데이즈 및 트립토파네이즈 활성을 감소시켰으며, 이에 따라 털진득찰 추출물은 유익균 분포 비율은 높여 주고 유해균 분포 비율은 낮춰 주는 장내균총 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

(4) 지방산 대사체 분석

프락토올리고당 (FOS), 항생제, 털진득찰 물 추출물, 털진득찰 에탄올 추출물이 처리된 장내 미생물 배양액에서 단쇄 지방산 (short chain fatty acid, SCFA)의 함량 분석을 위하여, 가스크로마토그래피 (GC) 분석을 실시하였다. 분석 시료는 96웰 플레이트를 3500 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상징액 400 ㎕에 50% 황산 (sulfuric acid) 40 ㎕를 넣어 안정화시킨 후, 표준물질 (internal standard, 1% 2-methyl pentanic acid) 40 ㎕를 넣고 여기에 에틸에테르 (ethyl ether) 400 ㎕를 첨가하여 약 2분간 볼텍스 (vortex)를 가하여 혼합하였다. 이 시료를 원심분리한 후 상층부에 있는 에틸에테르 층을 회수하여 GC 분석을 실시하였다. 분석에 사용된 기기는 Bruker 450-GC 모델이며, 컬럼은 Supelco 사의 Nukol Fused silica capillary column (30 mm × 0.25 mm × 0.25 ㎛)을 사용하였으며, 가스크로마토그래피 분석 조건은 표 4와 같다.

	실험조건
Injector	225℃
Oven	Initial 110℃, 5.5℃/min, 15 min
Detector	FID, 225℃
Carrier gas	2.0 mL/min, helium flow 30 mL/min
injection	2 ㎕, 3:1 split

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 털진득찰 추출물은 단쇄 지방산 함량을 높이는 효과가 있었다. 일반적으로 단쇄 지방산 함량이 높을수록 장내균총 개선 효과가 높은 것으로 판단한다. 장내균총을 망가뜨리는 것으로 알려져 있는 항생제 (클로람페니콜) 투여 시 단쇄 지방산 함량이 현저하게 감소하였다. 반면, 무처리 대조군과 비교하였을 때, 털진득찰 추출물 처리 시 단쇄 지방산 함량이 높아 항생제 처리군과 극명하게 차이가 있는 것으로 나타났다. 이를 통해, 털진득찰 추출물은 유익균 분포 비율은 높여 주고 유해균 분포 비율은 낮춰 주는 장내균총 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다

본 명세서의 일 측면에 따른 조성물의 제제예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제제로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 연질캅셀제

털진득찰 추출물 150 mg, 팜유 2 mg, 팜경화유 8 mg, 황납 4 mg 및 레시틴 6 mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 1 캡슐당 400 mg씩 충진하여 연질캅셀제를 제조하였다.

제제예 2. 정제

털진득찰 추출물 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼 추출물 50 mg, 전분 96 mg 및 마그네슘 스테아레이트 4 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 40 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하고 타정기를 이용하여 정제로 타정하였다.

제제예 3. 과립제

털진득찰 추출물 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼 추출물 50 mg 및 전분 600 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 100 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 다음 포에 충진하였다. 내용물의 최종 중량은 1 g으로 하였다.

제제예 4. 드링크제

털진득찰 추출물 150 mg, 포도당 10 g, 홍삼 추출물 50 mg, 구연산 2 g 및 정제수 187.8 g을 혼합하고 병에 충진하였다. 내용물의 최종 용량은 200 ml로 하였다.

제제예 5. 건강식품의 제조

털진득찰 추출물.......................... 1000 ㎎

비타민 혼합물

비타민 A 아세테이트.......................70 ㎍

비타민 E ................................ 1.0 ㎎

비타민 B1................................ 0.13 ㎎

비타민 B2 ............................... 0.15 ㎎

비타민 B6................................ 0.5 ㎎

비타민 B12............................... 0.2 ㎍

비타민 C.................................. 10 ㎎

비오틴.................................... 10 ㎍

니코틴산아미드............................ 1.7 ㎎

엽산...................................... 50 ㎍

판토텐산 칼슘............................. 0.5 ㎎

무기질 혼합물

황산제1철................................. 1.75 ㎎

산화아연.................................. 0.82 ㎎

탄산마그네슘.............................. 25.3 ㎎

제1인산칼륨............................... 15 ㎎

제2인산칼슘............................... 55 ㎎

구연산칼륨................................ 90 ㎎

탄산칼슘................................. 100 ㎎

염화마그네슘.............................. 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강음료의 제조

털진득찰 추출물......................... 1000 ㎎

구연산.................................. 1000 ㎎

올리고당................................. 100 g

매실농축액................................ 2 g

타우린.................................... 1 g

정제수를 가하여 전체..................... 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다. 이후, 통상의 방법에 따라 건강음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 제제예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합 비율을 임의로 변형 실시하여도 무방하다. 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

이상, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

털진득찰 (Siegesbeckia pubescens Makino) 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 추출물은 물 및 에탄올 중 1 이상의 용매로 추출한 것인, 장내균총 개선용 프리바이오틱스 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 추출물은 에탄올 용매로 추출한 것인, 장내균총 개선용 프리바이오틱스 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 장내 유익균의 생장을 촉진하거나 장내 유해균의 생장을 억제하는 것인, 장내균총 개선용 프리바이오틱스 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 베타-글루쿠로니데이즈 활성 억제, 트립토파네이즈 활성 억제 및 장내 단쇄지방산 함량 증가 중 하나 이상의 특징을 갖는 것인, 장내균총 개선용 프리바이오틱스 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 프로바이오틱스의 효능을 증강시키는 것인, 장내균총 개선용 프리바이오틱스 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 배변 기능을 개선하는 것인, 장내균총 개선용 프리바이오틱스 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 털진득찰 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 50 중량%로 포함되는 것인, 장내균총 개선용 프리바이오틱스 조성물.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 프로바이오틱스와 병용 투여하는 것인, 장내균총 개선용 프리바이오틱스 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 0.1 내지 2,000 mg/kg/day의 투여량으로 투여하는 것인, 장내균총 개선용 프리바이오틱스 조성물.
장내 미생물의 배양 배지 조성물로서,
상기 조성물은 털진득찰 (Siegesbeckia pubescens Makino) 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 추출물은 물 및 에탄올 중 1 이상의 용매로 추출한 것이고,
상기 장내 미생물은 인축의 대변 시료로부터 얻은 것이고, 상기 조성물은 장내 미생물 배양액의 장내균총을 개선하는 것인, 장내 미생물의 배양 배지 조성물.
삭제
제 13항에 있어서,
상기 조성물은 장내 유익균의 생장을 촉진하고 장내 유해균의 생장을 억제하는 것인, 장내 미생물의 배양 배지 조성물.
제 13항에 있어서,
상기 조성물은 베타-글루쿠로니데이즈 활성 억제, 트립토파네이즈 활성 억제 및 장내 단쇄지방산 함량 증가 중 하나 이상의 특징을 갖는 것인, 장내 미생물의 배양 배지 조성물.