KR20140127525A

KR20140127525A - 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 함유하는 피부장벽기능강화 또는 피부자극완화용 조성물

Info

Publication number: KR20140127525A
Application number: KR1020130045945A
Authority: KR
Inventors: 김희용; 박명삼; 김명성
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2013-04-25
Publication date: 2014-11-04
Also published as: KR101495055B1

Abstract

본 발명은 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 함유하는 피부장벽기능강화 또는 피부자극완화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 부용 및 뚝갈 혼합 추출물은 세포증식 촉진, 항산화 효과, 항염 효과, 보습, 피부 가려움증 개선 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 부용 및 뚝갈 혼합 추출물은 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 화장료 조성물로 사용할 수 있다.

Description

부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 함유하는 피부장벽기능강화 또는 피부자극완화용 조성물{Compositions for enhancing skin barrier and reducing skin stimulus comprising mixture extract of Hibiscus mutabilis L. and Patrinia villosa Juss.}

본 발명은 부용 및 뚝갈 혼합 추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 함유하는 피부장벽기능강화 또는 피부자극완화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 피부의 자극을 유발하는 물질은 일상생활 속에서 많이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 피부와 관련된 제품은 자극이나 염증, 알레르기를 유발할 수 있는 물질을 함유하고 있는 경우도 많다. 또한 개인위생관리 및 피부 관리제품을 사용하는 사람 중 10% 이상이 피부에 대한 부작용을 호소하고 있으며, 1990년대 미국에서는 소비자를 대상으로 조사한 결과 50% 이상이 자신을 민감성 피부라고 생각하고 있는 것으로 나타났다. 더군다나, 최근의 화장품은 피부에 실질적인 효과를 줄 수 있는 기능성화장품(Cosmeceutical)에 치중하는 동향이어서 화장품 등의 개인관리 제품의 사용으로 인한 피부 부작용은 점점 증가할 것으로 보여진다.

이처럼 민감성 피부라고 느끼고 있는 비율이 증가하고 있는 요인은 UV, 흡연, 공해물질, 중금속 등의 물리, 화학적인 물질 및 외부환경 생활공간의 건조화, 개인의 알레르기 체질, 스트레스 등이 거론되고 있다. 이러한 물리, 화학적인 외부환경에 의해 세포 내 작용에 이상을 초래하거나 활성산소의 생성이 방어계의 용량을 초과할 정도로 과 생성될 경우 산화 스트레스가 야기되며, 피부 자극발생 및 노화를 촉진시키게 된다. 또한 화장품을 만들기 위해서는 다양한 원료들이 사용되며 통상적으로 20 종에서 50 여종까지의 원료를 사용하게 된다. 이들 원료들은 피부 자극 검사를 통하여 그 안전성이 입증되었으나 제품에 적용됨으로써 피부에 염증, 가려움증 및 알레르기 등의 자극을 일으킬 수도 있다. 이러한 반응들이 모든 사람에게 일어나는 것은 아니며, 특정인에게만 일어날 수도 있다.

이러한 요인으로 인하여 피부 자극이 가중되고 이는 피부의 염증 반응으로 나타나거나 알러지성 또는 아토피성 피부의 형태로 나타난다. 염증은 본래 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화하고 손상부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어목적으로 나타나는 것이며, 통증, 부종, 발적, 발열 등을 일으켜 기능 장애가 일어나게 된다. 이러한 염증은 일반적인 상태에서는 초기 상태가 지난 후 정상으로 돌아오나, 염증을 자극하는 자극제가 없어지지 않거나, 계속 염증 반응이 생기게 되면 세포손상 등 여러 가지 부작용이 생기게 된다. 항염증제에는 다양한 물질이 있으나, 피부 안전성 면에서나 화장료 배합시 안정성 면에서 부작용이 없는 항염 물질이 중요하다. 한편으로 최근 소비자의 지향이 자연 친화적 및 저자극으로 이행되고 있는 것도 민감성 피부에 대한 의식을 향상시키는 요인이 되고 있는 것으로 추측되고 있다. 따라서 화장품의 자극을 완화시켜 주는 물질에 대한 관심이 높아지고 있다. 이에 자외선 및 다양한 피부 자극위험 요인으로부터 피부를 보호해 줄 수 있는 자극완화원료의 중요성이 점점 높아져, 안전하고 효과가 우수한 천연물 유래의 자극완화소재 및 화장품 개발이 증가 되고 있다.

한편, 부용은 아욱과(Malvaceae)의 식물로 중국이 원산이며, 주변의 산과 들에 자생한다. 부용은 본초강목 및 사천 중약지에 의하면 맛이 매우 쓰고 성질은 평하며, 독이 없는 약재라고 평하였다. 또한 본초도경에서는 부용을 악성종기, 화상, 해독, 종창과 같은 염증 치료에 사용되었다고 서술되어 있으며, 피부의 열을 사하는데 사용되는 약재라고 기술되었다. 중약대사전에 따르면 부용을 연고로 만들어 바르면 염증이 가라앉고 가려움이 해소된다고 한다. 부용은 국내에서 최근에 와서 관상용으로 화단 또는 조경용으로 도로의 화단에 식재하고 있는 식물이다. 성분으로는 꽃에 플라보노이드 배당체와 이소쿠에르씨트린(Isoquercitrin), 하이프린(hyprin), 하이페로사이드(Hyperoside), 루틴(Rutin), 베툴린산(Betulinic acid) 등이 함유되어 있다고 알려져 있고, 잎에는 페놀화합물, 탄닌, 환원당 등이 함유되어 있다고 알려져 있다(과학백과출판사, 약초의 성분과 이용, 일월서각, 1994, 중약대사전편찬위원회, 완역중약대사전, 도서출판정담, 1997]).

뚝갈은 마타리과(Valerianaceae)의 식물로 한국이 원산이며, 울릉도를 제외한 전국 각지에서 자라는 다년생 초본이다. 뚝갈은 뿌리가 달린 전초를 패장이라고 하여 약재로 사용하고 있다. 뚝갈은 맛이 쓰고, 성질은 평이하며, 청혈, 해독, 배농, 진정작용에 효과가 있다고 알려져 있다. 성분으로는 시니그린(Sinigrin), 모로니사이드(Morroniside), 로가닌(Loganin), 헤데라게닌(Hederagenin), 베타시토스테롤(beta sitosterol), 파트리넨(Patrinene), 이소파트리넨(isopatrinene 등이 함유되어 있다고 알려져 있다(정보섭, 신민교, 도해 향약대사전, 영림사, 1990).

종래, 피부 자극을 완화하기 위한 여러 가지 방법이 시도되어 왔으며, 예를 들면 피부 자극을 유발하는 물질을 제거하는 방법이 시도되었으나, 기능성 원료 자체가 자극원으로 작용하는 경우가 허다하기 때문에 이와 같은 연구에는 한계가 있다. 예를 들어 락틱산(Lactic acid), 글리콜산(Glycolic acid), 살리실산(Salicycic acid), 레티노이드(Retinoid) 등은 피부 세포 재생의 촉진 또는 항 주름의 효과를 위해 화장품에 함유되지만 피부 자극을 유발한다. 이에 따라 최근에는 NaOH나 KOH 등의 강알칼리를 자극 유발 기능성 원료에 첨가하여 산도를 중화시켜 자극을 완화하고자하는 연구가 많이 이루어졌으나, 이와 같은 처방은 기존의 원료의 효능을 저하시키는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 함유하는 피부장벽기능강화 또는 피부자극완화용 화장료 조성물을 개발하는 경우, 항산화 효과, 항염증 효과, 피부 가려움 개선 및 항균효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 항산화 효과, 항염증 효과, 피부 가려움 개선 및 항균효과를 갖는 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 함유하는 피부장벽기능강화 또는 피부자극완화용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 함유하는 피부장벽기능강화 또는 피부자극완화용 조성물을 이용한 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 함유하는 피부장벽기능강화 또는 피부자극완화용 조성물을 이용한 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 함유하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 조성물을 제공한다.

상기 부용은 아욱과(Malvaceae)의 낙엽성관목인 부용(Hibiscus mutabilis L.)으로 바람직하게는 부용의 전초를 건조한 것일 수 있고, 상기 뚝갈(Patrinia villosa(THUNB.) JUSS.)은 마타리과(Valerianaceae)의 식물로 다년생 초본으로 바람직하게는 전초 부분일 수 있으며, 시중에서 판매되거나 자연에서 직접 채취한 것일 수 있다.

피부장벽이란, 피부를 구성하는 구조 중 표피의 가장 바깥쪽에 있는 각질층에 존재하는 부분을 일컬으며 이는 각질층을 이루는 각질세포와 이들 세포 사이를 채우는 세포 간 지질로 이루어져 있다. 피부장벽 기능의 중추적인 역할을 하는 피부의 각질층은 외부 자극 및 외래 물질 침입에 대한 보호 장벽 역할을 하는 것으로서, 세포간지질(Intercellular lipids)을 통해 피부의 수분을 유지하고 피부장벽으로서의 기능을 수행한다. 본 발명의 혼합 추출물은 세포의 증식을 원활하게 하여 즉, 각질층의 분화와 증식을 원활하게 하여 피부장벽기능을 강화시킨다(표8).

본 발명에 있어서, 상기 부용 및 뚝갈 혼합 추출물은 종래 알려진 어떠한 추출방법으로 추출될 수 있으며, 예컨대 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌 글리콜 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 조성물을 제공한다.

동일한 추출법이라도 추출 용매에 따라 추출 수율의 차이가 발생하며 추출 수율은 향후 산업화에 있어서 생산비용과 연관되는 추출용매이므로 다양한 추출용매로 추출하여 그 수율의 확인이 필요하다. 그러므로 실시예 2와 같이 다양한 추출용매를 이용하여 부용 및 뚝갈의 혼합 추출물을 제조하여 그의 수율을 확인하였으며, 본 발명에서는 실시예 1에서 사용한 추출용매로 추출하였을 때 수득율이 가장 높아 효율적이라고 판단되어 실시예 1의 추출용매를 사용하여 실험하였다.

본 발명에 있어서, 상기 부용 및 뚝갈 혼합 추출물은 다양한 비율로 혼합 추출될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10 : 1 내지 10 중량(%) 비율로 혼합하여 추출하는 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 50 ~ 100℃에서 물과 에탄올을 혼합한 용매로 1 ~ 7 시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 공지된 추출법을 이용하여 추출될 수 있으며, 구체적으로 상기 추출물은 부용 및 뚝갈 각각의 건조물을 세절하여 혼합하고, 그 건조 중량의 1 ~ 15배 부피양의 용매를 부가하여 4 ~ 30℃에서 3 ~ 20일간 침적시켜 유효성분을 추출한 후, 감압 농축기로 농축하여 수득할 수 있다. 또한, 추출 시 용매가 증발되는 것을 방지하기 위하여 냉각 콘덴서를 구비한 추출기로 30 ~ 100℃에서 3 ~ 48시간 동안 가열 추출하거나, 5 ~ 30℃에서 1 ~ 5일간 침적시켜 추출하고, 감압 농축기로 농축하여 추출물을 수득하는 것도 가능하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 부용 및 뚝갈 혼합 추출물은 세포증식 촉진, 항산화 효과, 항염증 효과, 탈과립화 효과 및 항균 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 배양세포에 처리 시 세포증식이 촉진되는 것을 확인하였다. 따라서 피부장벽을 구성하는 세포의 증식이 원활히 이루어지므로 피부장벽기능강화 효과를 나타낸다.(표8).

본 발명의 실시예에 따르면, 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 배양세포에 처리 시 자유라디컬, 염증유발효소 및 세균 억제효과를 확인하였으며 이는 본 발명의 추출물이 피부자극을 일으킬 수 있는 요인들인 자유라디컬, 염증유발효소, 탈과립화 및 세균을 효과적으로 억제하므로 피부자극완화 효과를 나타낸다(표9 내지 표13). 또한 상기의 피부장벽기능강화 및 피부자극완화 효과 실험에서 부용 및 혼합 추출물이 부용 또는 혼합 추출물보다 더 뛰어난 효과를 나타내어 단독 추출물보다 본 발명의 혼합 추출물이 피부장벽기능강화 및 피부자극완화에 더 효과적임을 알 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 부용 및 뚝갈 혼합 추출물은 건조중량에 대하여 총 중량 대비 0.001 ~ 5 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 화장료 조성물을 제공한다. 부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 5% 이상 사용 시 비용적인 면과 화장품 성상의 안정성에 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료의 제형은 화장수, 크림, 에센스, 팩, 마스크쉬트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명에 따르면, 부용 및 뚝갈 혼합 추출물은 세포증식 촉진, 항산화 효과, 항염 효과, 보습, 피부 가려움증 개선 효과를 갖는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화 활성이 우수하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1 : 부용 및 뚝갈 혼합 추출물제조

부용 및 뚝갈은 대한민국 강원도 원주 및 인근 지역에서 채취하거나 대한민국 서울 경동시장(이케이디엠)에서 구매한 것이며, 별도 언급이 없는 한 용매 등은 대정화학(대한민국), 삼광화학(대한민국)에서 구입한 것이다.

부용 1.5Kg 및 뚝갈 1.5Kg을 혼합한 혼합물 3Kg을 삼베포에 담아 정제수 10.5Kg, 에탄올4.5Kg을 혼합한 용매 15Kg과 혼합하여 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃로 5시간 끓여서 추출한 후 50℃에서 약재를 압착 제거하였다. 그 추출액을 1㎛까지 여과하여 부용 및 뚝갈의 혼합 추출물을 얻었다. 오염되지 않도록 밀봉하여 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 여과(에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GF/C 293mm 여과지로 2번 여과)시켰다. 그리고 감압 농축기로 50℃에서 농축한 후 동결건조기(일신랩 사)로 동결 건조시켜 건조 중량 265.2g의 추출물을 제조하였다.

실시예 2 : 다양한 추출용매를 이용한 부용 및 뚝갈의 혼합 추출물 제조

하기 표 1의 용매로 하여 혼합 추출물을 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다.

	용매	수득량(g)
실시예 2-1	물	259.5
실시예 2-2	에탄올	205.9
실시예 2-3	70% 에탄올 수용액	218.6
실시예 2-4	30% 1,3부틸렌글리콜 수용액	220.8
실시예 2-5	30% 프로필렌글리콜 수용액	236.7

실시예 3 : 혼합 비율에 따른 혼합 추출물 제조

실시예 1의 용매로 하여 혼합 추출물을 실시예 1과 동일한 방법으로 하기 표 3의 혼합 비율에 따라 추출하여 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.

	혼합비율(부용:뚝갈)	수득량(g)
실시예 3-1	1 : 2(1Kg:2Kg)	261.9
실시예 3-2	1 : 5(500g:2500g)	288.1
실시예 3-3	2 : 1(2Kg:1Kg)	229.2
실시예 3-4	5 : 1(2500g:500g)	218.6

비교실시예 1, 2 : 부용 및 뚝갈의 각각추출물 제조

실시예 1의 용매로 하여 부용 및 뚝갈 각각 3Kg을 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 3에 기재하였다.

	약재	수득량(g)
비교실시예 1	부용	210.9
비교실시예 2	뚝갈	288.5

제조예 1 : 혼합 식물 추출물 함유 화장수 제조

실시예 3-2과 동일한 방법으로 제조한 혼합 추출물을 함유한 화장수(스킨로션)를 하기 표의 함량으로 하기 표 4의 함량으로 하기 방법에 의해 제조하였다.

번호	원료	함량(중량%)
1	실시예3-2 추출물	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에틸렌경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	방부제	0.4
8	향료	0.01
9	정제수	잔량

상기 표 중 9번 원료에 2, 3, 4, 7번 원료를 순서대로 투입하고 교반하여 용해물을 제조하였다. 그 후 5번 원료를 60℃로 가열하여 용해시킨 후, 8번 원료를 투입하여 용해한 후 상기 용해물에 투입하였다. 마지막으로 1, 6번 원료를 상기 용해물에 투입하여 충분히 교반한 후 숙성시켜 화장수를 제조하였다.

제조예 2 : 혼합 식물 추출물 함유 로션 제조

실시예 3-2과 동일한 방법으로 제조한 혼합 추출물을 함유한 영양로션을 하기 표 5의 함량으로 하기 방법에 의해 제조하였다.

번호	원료	함량(중량%)
1	실시예3-2 추출물	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	0.4
14	향료	0.1
15	정제수	잔량

상기 표 중 10, 11, 13, 15번 원료를 혼합교반 하면서 80 ~ 85℃로 가열하여 유화기에 투입하고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9번 원료를 80 ~ 85℃로 가열하여 유화기에 투입하여 유화시켰다. 유화가 끝나면 12번 원료를 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 후 14번 원료를 투입하고 35℃까지 냉각한 뒤 1번 원료를 투입하여 25℃까지 냉각한 후 숙성시켜 영양로션을 제조하였다.

제조예 3 : 혼합 식물 추출물 함유 크림 제조

실시예 3-2과 동일한 방법으로 제조한 혼합 추출물을 함유한 영양크림을 하기 표 6의 함량으로 하기 방법에 의해 제조하였다.

번호	원료	함량(중량%)
1	실시예3-2 추출물	1.0
2	스테아린산	2.0
3	세틸알콜	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0
8	왁스	1.0
9	유동파라핀	4.0
10	스쿠알란	4.0
11	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0
14	글리세린	3.0
15	트리에탄올아민	0.5
16	방부제	0.4
17	정제수	잔량

상기 표 중 12, 13, 15, 16, 17번 원료를 혼합교반 하면서 80 ~ 85℃로 가열하여 유화기에 투입하고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11번 원료를 80 ~ 85℃로 가열하여 용해한 후 유화기에 투여한 후 유화시켰다. 유화가 끝난 후 14번 원료를 투입하고 교반기로 교반하며 35℃까지 냉각한 뒤 1번 원료를 투입하여 25℃까지 냉각한 후 숙성시켜 영양크림을 제조하였다.

제조예 4 : 혼합 식물 추출물 함유 에센스 제조

실시예 3-2과 동일한 방법으로 제조한 혼합 추출물을 함유한 에센스를 하기 표 7의 함량으로 하기 방법에 의해 제조하였다.

번호	원료	함량(중량%)
1	실시예3-2 추출물	1.0
2	시토스테롤	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
4	세라마이드	0.7
5	스테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	농글리세린	5.0
9	마카다미아 오일	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.2
12	방부제	0.4
13	정제수	잔량

상기 표에서 2,3,4,6번 원료를 80℃에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질을 제조하였다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 1, 7, 8, 13번 원료를 혼합하고 80℃에서 균질화하여 마이크로플루다이져(Microfluidics Co. 미국)를 통과시키고, 이어 9번 원료를 50 ~ 60℃로 가온한 후 서서히 첨가하여 균질화 한 후 다시 마이크로플로다이져에 다시 통과시켰다. 그 후, 10, 11, 12, 13번 원료를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켜 에센스를 제조하였다.

실험예 1 : 세포 무독성 및 세포증식 촉진 효과 확인

실시예 1, 2, 3 및 비교실시예 1과 비교실시예 2의 추출물에 대하여 세포 독성 및 세포증식 촉진 효과를 측정하여 그 결과를 추출 조건설정에 근거로 사용하였다.

코람바이오텍(대한민국, 서울)에서 입수하여 배양하고 있는 세포(파이브로블라스트, 3T3)를 96웰 마이크로플레이트에 5,000 세포/웰로 분주하여 30분간 항온조에서 배양하고, 시료를 농도별 각각 0.01, 0.1, 1.0 %(W/V)로 투입하여 72시간 동안 배양하였다. 그리고 티아졸린 블루(Thiazoline blue)를 투여하고 4시간 동안 추가 배양하였다. 배양액을 모두 버리고 마이크로플레이트의 각 웰에 반응 정지액(acidic isopropanol)을 가하고 5분간 교반 한 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 주입량만큼 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 배지를 투여하여 세포 성장의 최적 조건으로 동시배양을 하였으며, 대조군의 세포증식을 100%로 하고 시료 투입 실험군의 세포 증식률을 계산하였다. 세포증식률은 하기식으로 산출하였고, 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.

[식]

	시료	추출물 농도(%)
	시료	0.01	0.1	1.0
세포 증식율(%)	실시예1	104.11	121.62	127.87
	실시예2-1	103.65	110.56	115.21
	실시예2-2	100.32	108.21	110.32
	실시예2-3	102.26	110.39	116.38
	실시예2-4	100.39	109.65	114.33
	실시예2-5	100.21	108.86	115.26
	실시예3-1	105.18	120.35	128.89
	실시예3-2	105.42	127.72	135.22
	실시예3-3	103.29	116.38	122.68
	실시예3-4	102.22	113.29	120.21
	비교실시예 1	101.8	106.28	109.82
	비교실시예 2	103.21	109.63	115.35

상기 표에서 보는 바와 같이, 실시예 1, 2, 3 및 비교 실시예 1, 2는 세포 독성을 나타내지 않으며, 농도 의존적으로 세포 증식율을 증가시킴을 알 수 있다. 상기의 세포 증식효과 실험에서 실시예 1, 2, 3의 추출물의 세포 증식효과는 모두 효과가 있다고 할 수 있으며, 그 중 실시예 3-2의 경우에는 다른 실시예 또는 비교 실시예 1, 2 보다 우수한 세포 증식효과가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의추출물에 의해 세포 증식이 촉진됨을 알 수 있다. 또한 본 실험과 각 실시예의 추출 수율을 근거로 하여 실시예 3-2을 이용하여 나머지 실험을 실시하였다.

실험예 2 : 항산화 효과 확인( 자유라디칼 소거 실험)

실시예 3-2과 동일한 방법으로 제조한 추출물에 대하여 자유라디칼 소거효과를 측정하여 항산화 효과를 확인하고자 하였다.

DPPH(1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)법(Blois. M. S. Nature 181, 1190, 1958)을 사용하여 실험을 수행하였으며, DPPH와 퀘르세틴(Quercetin)은 시그마사(미국)의 것을 사용하였다. 0.2mM DPPH 메탄올 용액 1ml에 2ml의 실시예 3-2 추출물 또는 퀘르세틴(각각 5, 10, 20, 30ppm)의 에탄올 용액을 첨가하고 잘 교반한 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 그 후 517nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이 때 공시험으로 각 시료 대신 정제수를 사용한 군을 대조군으로 하였다. 상기 퀘르세틴을 처리한 군을 양성대조군으로 하였다. 하기식을 이용하여 자유라디칼 소거율을 구하고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

[식]

농도(ppm)	자유라디칼 소거율(%)
농도(ppm)	실시예 3-2	비교실시예1	비교실시예2	퀘르세틴
0	0	0	0	0
5	15.8	5.9	9.8	27.3
10	39.9	25.8	30.7	53.1
20	86.3	73.2	81.5	97.6
30	97.8	88.6	92.8

상기 표에서와 같이, 자유라디칼 소거 효과가 알려져 있는 퀘르세틴에 대해서 농도 의존적으로 효과를 나타내는 것으로부터 실험이 정상적으로 이루어졌음을 알 수 있다. 또한, 실시예 3-2 추출물과 비교실시예 1 및 비교실시예 2의 추출물도 농도 의존적으로 자유라디칼을 소거시키며, 그 결과 항산화작용을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 추출물에 의해 항산화 작용을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 자유라디칼 50% 소거 농도(SC50)를 계산한 결과 퀘르세틴의 경우 9.88ppm, 실시예 3-2의 경우 13.59ppm인데 반하여 비교실시예 1의 경우 16.49ppm, 비교실시예 2의 경우 15.06 ppm으로 실시예 3-2에 비하여 낮은 결과이므로 실시예 3-2의 혼합 추출물이 우수한 항산화 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로부터, 자유라디칼 50% 소거 농도(SC50)가 자유라디칼 소거에 양호한 효과를 나타내는 퀘르세틴에 근접하게 나타난 것으로 보아 본 발명의 추출물이 매우 효과적임을 재확인할 수 있다. 또한, 퀘르세틴은 단일 물질로, 추출되거나 합성될 경우 비용면이나 안전성 면에서 본 발명의 추출물이 더욱 효과적임을 알 수 있다.

실험예 3 : 항염증효과 확인( 리폭시게나아제 활성 억제 확인 실험)

실시예 3-2과 동일한 방법으로 제조한 추출물에 대하여 리폭시게나아제 활성 억제 실험을 실시하여 항염증 효과를 확인하고자 하였다.

TBARS법을 사용하여 하기와 같이 실험하였다. 실험에 사용한 리놀산(Linoleic acid), 리폭시게네이즈(Lipoxygenase), 티오바비툴산(Thiobarbitulic acid) 및 퀘르세틴은 시그마사(미국)의 것을 사용하였다. 1mM의 리놀산 1ml에 실시예 3-2, 비교실시예 1, 비교실시예2 및 퀘르세틴을 각각 0.05ml(각각 1, 5, 10, 20, 30ppm)를 첨가하고 리폭시게네이즈 0.95ml를 투여 후, 잘 교반하고 25℃에서 10분간 반응시켰다. 그리고 트리클로로아세트산(Tricholroacetic acid)을 0.5ml 투여하고 티오바비툴산 1ml 첨가하고 10분간 가열한 후 얼음물에서 2 ~ 3분간 냉각시켜 반응을 종결시켰다. 종결된 반응액에 부탄올 2ml를 넣고 4000g로 5분간 원심분리한 후 535nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 각 시료 대신 정제수를 사용하여 대조군으로 하였다. 하기식을 이용하여 리폭시게네이즈 활성 억제율을 구하고, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

[식]

농도(ppm)	활성억제율(%)
농도(ppm)	실시예 3-2	비교실시예1	비교실시예2	퀘르세틴
0	0	0	0	0
5	10.49	3.28	5.22	9.21
10	30.80	21.36	19.86	28.64
20	82.12	69.21	73.22	61.49
30	93.78	86.27	90.38	94.64

상기 표 10에서와 같이, 리폭시게네이즈 활성 억제 효과가 알려져 있는 퀘르세틴에 대해서 농도 의존적으로 효과를 나타내는 것으로부터 실험이 정상적으로 이루어졌음을 알 수 있다. 또한, 실시예 3-2, 비교실시예 1 및 비교실시예 2의 추출물은 농도 의존적으로 리폭시게네이즈 활성을 억제하며, 그 결과 항염증 작용을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 추출물에 의해 항염증 작용을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 리폭시게네이즈 50% 활성 억제 농도(IC50)를 계산한 결과 실시예 3-2의 경우 14.91ppm인 반면에 퀘르세틴의 경우 16.46ppm, 비교실시예 1의 경우 17.36ppm, 비교실시예 2의 경우 16.65ppm이었다. 이와 같은 결과로부터, 실시예 3-2의 혼합 추출물이 각각의 단일 추출물보다 우수한 항염증 효과가 있으며, 리폭시게네이즈 활성 억제에 양호한 효과를 나타내는 퀘르세틴 보다 뛰어난 것으로 보아 본 발명의 추출물이 매우 효과적임을 알 수 있다.

실험예 4 : 항염증 효과 확인( 히아루로니다아제 활성 억제 확인 실험)

실시예 3-2와 동일한 방법으로 제조한 추출물에 대하여 히아루로니다아제 확성 억제 실험을 실시하여 항염증 효과를 확인하고자 하였다.

Morgan-Elson법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다. 히아루로니다아제(Hyaluronidase)의 최종 효소 활성을 400NF unit/ml, 히알루론산의 최종 농도를 0.4mg/ml로 하고, 활성제인 화합물 Compound 48/80 완충용액(0.1mg/ml)을 사용하여 히아루로니다아제 활성을 측정하였다. 실시예 3-2의 추출물을 완충용액에 용해하여 시료 용액(각각, 0.5, 1, 3, 5%)으로 하고, 대조군은 시료 용액 대신 녹차 추출물을 사용하였다. 또한, 각각의 공시험으로는 효소용액 대신 완충용액을 사용하였다. 하기식을 이용하여 히아루로니다아제 활성 억제율을 구하고, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

[식]

농도(%)	활성억제율(%)
농도(%)	실시예 3-2	비교실시예1	비교실시예2	녹차추출물
0	0	0	0	0
0.5	12.83	8.11	10.10	8.5
1	31.29	25.62	19.26	23.2
3	75.58	70.29	66.29	65.3
5	98.21	97.12	96.30	97.1

상기 표에서와 같이, 히아루로니다아제 활성 억제 효과가 알려져 있는 녹차추출물에 대해서 농도 의존적으로 효과를 나타내는 것으로부터 실험이 정상적으로 이루어졌음을 알 수 있다. 또한, 실시예 3-2, 비교실시예 1 및 비교실시예 2의 추출물은 농도 의존적으로 히아루로니다아제 활성을 억제하며, 그 결과 항염증 작용을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 추출물에 의해 항염증 작용을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 히아루로니다아제 50% 활성 억제 농도(IC50)를 계산한 결과 실시예 3-2의 경우 2.22%, 비교실시예 1의 경우 2.39%, 비교실시예 2의 경우 2.49%, 녹차의 경우 2.47%이었다. 이와 같은 결과로부터, 히아루로니다아제 50% 활성 억제 농도(IC50)가 히아루로니다아제 활성 억제에 양호한 효과를 나타내는 녹차추출물보다 효과가 우수하였으며, 또한 단일 추출물인 비교실시예 1, 비교실시예 2의 경우보다도 혼합추출한 실시예 3-2의 추출물이 매우 효과적임을 알 수 있다.

실험예 5 : 탈과립화 억제 효과 확인

실시예 3-2, 비교실시예 1과 비교실시예 2의 추출물에 대하여 하기 방법으로 실험하여 면역세포의 탈과립화 효과를 확인하고자 하였다. 실시예 3-2, 비교실시예 1과 비교실시예 2의 추출물을 RBL-2H3 세포주(Rat mast cell line; 코람바이오텍, 대한민국)에 처리하여 안티젠에 의한 탈과립화를 억제하는 효과를 확인하였다. RBL-2H3 세포주를 1% 어린 소 혈청(Fetal bovine serum)과 L-글루타민을 포함하는 둘베코(Dulbeccos)에 의해 수정된 이글(Eagle)의 배지(Dulbeccos' modified Eagle's medium, 이하 DMEM)를 이용하여 37℃, 5% CO² 인큐베이터에서 배양하며, 고착성을 갖는 세포를 트립신(Trypsin)-EDTA 용액을 사용하여 부유시키고, 이를 분리, 회수하여 실험에 이용하였다.

RBL-2H3 세포주를 활성인자(Dinitrophenol-conjugated human serum albumin (DNP-HSA)-specific Ig E)로 활성화 시킨 후, 활성화된 세포에 안티젠(DNP-HSA) 50ng/ml을 처리하고 실시예 3-2, 비교실시예 1과 비교실시예 2의 추출물을 각각 0, 5, 25, 125μg/ml로 처리하여 60분 동안 배양하였다. 이후 엘라이자 리더(ELISA reader)를 이용하여 배지 내로 분비된 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase) 양을 측정하였다. 베타-헥소사미니다제 분비 양의 억제는 면역세포의 탈과립화를 억제함을 의미한다. 즉, β-hexosaminidase 분비양이 감소하는 것은 면역세포의 탈과립화가 억제 되어짐을 의미하는 것이다. 하기 표의 면역세포 탈과립화 억제율은 하기식으로 구하였으며, 실시예 3-2, 비교실시예 1과 비교실시예 2의 추출물을 0μg/ml로 처리한 군, 즉 실시예 3-2, 비교실시예 1과 비교실시예 2의 추출물 무처리군을 대조군으로 하였다. 그 결과를 하기 표 12에 기재하였다.

[식]

농도(?/ml)	면역세포탈과립화억제율(%)
농도(?/ml)	실시예 3-2	비교실시예1	비교실시예2
0	0	0	0
5	29.8	10.5	18.2
25	76.8	50.2	59.6
125	96.2	86.3	91.2

표에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 3-2, 비교실시예 1 및 비교실시예 2의 추출물은 농도의존적으로 면역세포 탈과립화를 억제함을 알 수 있다. 또한, 면역세포탈과립화 50% 억제 농도(IC50)를 계산한 결과 실시예 3-2의 경우 37.6μg/ml, 비교실시예 1의 경우 60.01μg/ml, 비교실시예 2의 경우 51.12μg/ml로 실시예 3-2의 혼합 추출물이 각각의 단일 추출물인 비교실시예 1, 비교실시예 2의 경우보다 우수한 면역세포 탈과립화 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 6 : 항균 효과 확인

실시예 3-2, 비교실시예 1과 비교실시예 2의 추출물에 대하여 하기 방법으로 실험하여 항균 효과를 확인하고자 하였다.

실시예 3-2, 비교실시예 1과 비교실시예 2의 추출물을 5%함수에탄올(용해시킬 수 있는 최소한의 에탄올 함량)에 용해하여 0.1중량% 농도로 조절하여 항균력 평가의 시료로 사용하였다. 하기 표에 기재된 각각의 병원미생물(한국미생물보존센터,KCCM)을 액체 배양하여 soft agar배지(tryptone 1g, yeast extract 0.5g, NaCl 1g, agar 0.5g, D.W 100mL) 3mL에 혼합 한 후, LB 평판배지{tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, agar 15g, D.W(증류수) 1L}에 붓고 상기의 시료를 점적한 paper disk(직경 6mm)를 배지 중앙에 올려놓고 24시간 동안 배양한 후, clear zone의 길이를 재어 생육 억제환을 측정하였으며, 대조군은 희석용매인 D.W로 하였다. 그 결과를 하기 표 13에 기재하였다

	생육 억제환 원주(mm)
	실시예 3-2	비교실시예1	비교실시예2
대장균	18	10	12
황색포도상 구균	18	9	10
녹농균	16	10	10
바실러스균	20	15	13

상기 표에서 보는 바와 같이, 실시예 3-2, 비교실시예 1과 비교실시예 2의 추출물은 다양한 병원미생물을 억제함을 알 수 있다. 또한 실시예 3-2의 혼합 추출물이 각각의 단일 추출물인 비교실시예 1, 비교실시예 2의 경우보다 우수한 항균 효과가 있음을 확인하였다.

Claims

부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 함유하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 부용 및 뚝갈 혼합 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌 글리콜 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 부용 및 뚝갈 혼합 추출물은 1 내지 10 : 1 내지 10 중량(%) 비율로 혼합하여 추출하는 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 50 ~ 100℃에서 물과 에탄올을 혼합한 용매에서 1 ~ 7 시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 조성물.
부용 및 뚝갈 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 화장료 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 세포증식 촉진, 항산화 효과, 항염증 효과, 탈과립화 효과 및 항균 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 화장료 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 부용 및 뚝갈 혼합 추출물은 건조중량에 대하여 총 중량 대비 0.001 ~ 5 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 화장료 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 화장료의 제형은 화장수, 크림, 에센스, 및 팩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부장벽기능강화 및 피부자극완화용 화장료 조성물.