KR100830862B1 - 진세노사이드 Ｒｂ1을 유효성분으로 포함하는 골 및연골조직 파괴 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진세노사이드(ginsenoside) Rb1을 유효성분으로 함유하는 골 및 연골 조직 파괴 억제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 연골을 비롯한 연조직 및 골을 포함하는 경조직의 파괴를 막는 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 골 및 연골 조직 파괴 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 진세노사이드 Rb1은 파골세포(osteoclast)의 분화와 활성을 억제하며, 오스테오프로테그린(osteoprotegerin)의 분비를 촉진하고, 매트릭스 메탈로프로티에이즈-13(matrix metalloproteinase-13)의 분비를 억제함과 동시에 TIMP-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3)의 분비를 촉진함으로 연골을 비롯한 연조직 및 골을 포함하는 경조직의 파괴를 막으므로 연골 및 뼈 파괴를 동반하는 질환의 연골 및 뼈 보호에 대한 예방 및 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

진세노사이드 Rb1, 연골, 골절.

Description

진세노사이드 Ｒｂ1을 유효성분으로 포함하는 골 및 연골조직 파괴 억제용 조성물{A composition comprising ginsenoside Rb1 for inhibiting destroy of bone and cartilage tissue}

도 1은 진세노사이드(ginsenoside) Rb1에 의한 파골세포 분화 및 활성 억제 그래프이다.

도 2는 진세노사이드 Rb1에 의한 오스테오프로테그린(osteoprotegerin) 분비 활성 그래프이다.

도 3은 진세노사이드 Rb1에 의한 매트릭스 메탈로프로티에이즈-13(matrix metalloproteinase-13) 분비 억제 그래프이다.

도 4는 진세노사이드 Rb1에 의한 TIMP-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3) 분비 촉진 활성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 진세노사이드(ginsenoside) Rb1을 유효성분으로 함유하는 골 및 연골조직 파괴 억제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 연골을 비롯한 연조직 및 골을 포함하는 경조직의 파괴를 막는 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 골 및 연골조직 파괴 억제용 조성물에 관한 것이다.

진세노사이드(ginsenoside)는 인삼의 생리학적 혹은 약리학적 유효성분으로서 널리 알려져 있으며, 진세노사이드-Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3, Rh, F11 등이 있다(Nah, Korean J Ginseng Sci. 21, 1-12, 1997; Nah, Curr Tr Neurosc. 6, 17-30, 1998). 진세노사이드는 프로토파락소디올(protopanaxadiol), 프로토파락소트리올(protopanaxatriol), 올레오놀산(oleanolic acid) 그룹으로 나누어지며, 상기 그룹들의 진세노사이드의 개별적인 기능 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재 진세노사이드가 생체 내 혹은 생체 외 연구를 통하여 중추신경 억제 작용, 단백질 합성 촉진 작용, 부신피질 호르몬 분비 촉진 작용, 혈소판 응집 억제 작용, 중성지질의 흡수 촉진 작용, 면역 증강 작용 등의 다양한 효능을 발휘하는 것으로 알려져 있다(Nah, Korean J Ginseng Sci. 21, 1-12, 1997).

상기 진세노사이드 중 진세노사이드 Rb1은 사포닌 중 다마란(dammarane)계에 속하는 프로토파락소디올(protopanaxadiol)의 한 종류이다. 이 화합물은 특히 중추신경 진정작용이 우수하며, 소염작용이 있는 물질로 이미 오래전에 공지된 물질이다(Shibata S. et al., Economic and medicinal plant research, World Scientific, Philadelphia, pp 217-284, 1985).

또한, 진세노사이드 Rb1은 세포사 억제 유전자산물 Bc1-xL의 발현을 촉진하 고, 세포의 세포사멸(apoptosis) 또는 세포사멸 유사 세포사를 억제하여 세포보호 작용을 나타내는 것이 보고되었다.

한편, 골(bone)은 특별한 연결 조직으로 골격시스템을 형성하며 신체를 기계적으로 지지하고 근육활동과 운동을 용이하게 하며 내장기관을 보호한다. 골은 골격을 유지하고 장기를 보호하는 이외에 생화학적 대사를 조절하는 기관으로써 형성, 흡수, 역전, 형성의 단계가 계속 반복하는 활발한 대사가 일어나는 역동적인 기관이다(Raisv et al. Am J Med, 72; 193-202, 1982). 이러한 골 흡수(bone resorption)와 골 형성(bone formation)이 되풀이되는 과정을 골 개축(bone remodeling)이라 한다.

정상적인 경우 인체에서 파골세포(osteoclast)가 활성화되어 골을 흡수하면서 파괴하면, 조골세포(osteoblast)가 새로운 골을 형성한다(Roodman GD, Endocrinol Rev, 17, 308-332, 1996; Boyle W. J. et al., Nature, 423:337-342, 2003). 파골세포는 세포 표면 위에 RANK(receptor of activated NF-κB)를 가지고 있는데, RANK는 조골세포가 분비하는 RANKL(receptor of activated NF-κB ligand)과 결합하여 활성화된다. 파골세포의 활동은 오스테오프로테그린(osteoprotegerin:이하 "OPG"라 칭함)에 의하여 저해된다. OPG 역시 조골세포에서 분비되며 RANKL에 결합하여 RANK와 RANKL의 결합을 저해하여 파골세포의 활성화를 저해한다(Simonet, W.S. et al., Cell, 89, 309-319, 1997; Wagner E.F. and Karsenty, G., Curr. Opin, Genet., Dev.5, 527-532, 2001).

상기 골 개축 과정에는 다양한 단백질들이 관여하는데, 이 중 매트릭스 메탈로프로티에이즈(matrix metalloproteinase: 이하 "MMP"라 칭함)는 기저막 성분을 분해하는 효소로서 현재 20가지 이상의 MMP가 발견되어 있다. MMP는 아연을 함유하며, 콜라겐(collagen), 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 젤라틴(gelatin)과 같은 거대 생체고분자들을 분해할 수 있는 엔도펩티다아제류(endopeptidase)로서 콜라게나제(collagenase), 젤라티나제(gelatinase), 스트로멜리신(stromelysine) 및 막형(membrane type) MMP로 크게 분류된다. 이들은 모두 전구효소(proenzyme) 형태로 합성된 후 일부분이 자체적으로 분리되면서 활성화된다. 이 중 MMP-13은 콜라겐, aggrecane, 젤라틴 등으로 이루어진 연골의 구성 성분들을 분해하는 활성을 가지고 있다(Goldring S.R., Rheumatol(Oxf), 42, ⅱ11-6, 2003). 또한, MMP-13이 골 기질 단백을 분해해야 파골세포가 골 표면에 부착하여 골 흡수가 시작되는 것으로 알려져있다(Uchuda M, Shima M, Chikazu D et al., J Bone Miner Res, 16, 221-230, 2001).

상기 조골세포와 파골세포의 작용으로 인한 골 개축 시, 골 형성 양이 선행된 골 흡수 양과 일치하면 골 양의 소실이 없어 골의 양을 유지하게 된다. 그러나, 어떤 이유로든지 골 형성량이 골 흡수량보다 적을 때(골 흡수가 증가하거나 또는 골 형성이 골 흡수보다 적을 때) 골량의 감소를 초래하게 되는데(Wasnich, R.D. Am J Med, 91; 54s-58s, 1991), 이러한 불균형은 골 질환을 유발한다.

연골세포(chondrocyte)는 발생 과정에서 중간엽 세포(mesenchymal cell)로 부터 분화되어 연골 조직(cartilage)을 형성한다. 다른 유형의 조직과는 달리 연골은 연골세포 한 종류만으로 구성되어 있으며, 형성된 연골 조직은 관절 연골과 같이 영구적인 연골 조직으로 남아있거나 발생 과정에서 경골(bone) 형성을 위한 주형으로 작용한다. 즉 연골내 골화 과정(endochondral ossification)에서 분화되는 연골세포는 비대연골 세포(hypertrophic chondrocyte)로 성숙되고 이어 세포사멸에 의해 빈 공간을 남기게 되면 이 공간을 따라 혈관이 형성되어 조골세포가 유입됨으로서 경골을 형성하게 된다(Sandell L.J. and Adler P., Frontiers Biosci, 4, 731-742, 1999; DeLise A. M., Fisher L., and Tuan R.S., Osteoarthritis Cartilage, 8, 309-334, 2000). 관절 내 정상적인 연골세포는 대사적 활성은 있으나 증식 및 세포외기질(extracellular matrix: ECM) 성분들의 합성이나 분해 등이 매우 느리게 일어난다.

그러나 이러한 항상성의 유지는 연골세포의 퇴행성 반응에 기인하는 골관절염(osteoarthritis) 등 퇴행성 질환의 경우 아직 정확한 원인이나 분자적 조절 메카니즘은 규명되지 않았지만 정상적 연골세포와는 매우 다른 양상을 띄게 된다. 연골세포의 퇴행성 반응은 1) 연골세포에 의한 이화작용 및 동화작용 사이의 불균형으로 인한 염증성 싸이토카인(cytokine)의 분비와 이에 따른 MMP의 합성 및 활성화로 연골조직을 구성하는 ECM 성분들의 분해, 2) 연골세포의 특성이 소실되는 탈분화(dedifferentiation)에 의한 ECM 성분들의 합성 감소, 3) 연골세포의 세포사멸, 4) 염증성 싸이토카인의 분비에 의한 염증반응 등이며, 이러한 연골세포의 퇴행성 반응은 궁극적으로 연골 조직을 파괴하여 퇴행성 관절염 등을 유발한다(Poole A. R., Frontiers Biosci, 4, 662-670, 1999; Sandell L. J., and Aigner T., Arthritis. Res. 3, 107-113, 2001; Choy E. H., and Panayi G. S., N. Engl. J. Med. 344, 907-916, 2001; Martel-pelletier J., Alaaeddine N., and Pelletier J.P., Frontiers Biosci, 4, 694-703, 1999; Amin A. R., and Abramson S. B., Curr. Opin. Rheumatol, 10, 263-268, 1998). 관절 연골조직의 파괴는 기본적으로 관절 연골조직의 항상성 소실에서부터 시작된다(Smith D. R., Fron. Biosci. 4, 704-712, 1999). 정상적인 관절에서는 ECM 물질의 합성과 항상성 유지에 관여하는 이화학적 또는 동화학적인 경로가 균형을 이루고 있어 연골세포는 황산화된 프로테오글리칸(proteoglycan)과 타입 Ⅱ 콜라겐(type Ⅱ collagen) 등의 연골 특이적 ECM 단백질을 합성한다. 그러나 연골 ECM 성분들의 합성 및 분해의 항상성은 퇴행성 관절염과 같은 질환의 연골조직에서는 MMP 합성 및 활성화에 의해 파괴된다. 연골 파괴가 일어나는 조직에서는 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-13의 발현 및 활성이 증가되며 이러한 현상은 IL-1β 및 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α:TNF-α)와 같은 염증성 싸이토카인에 의해 유발된다(Choy E. H., and Panayi G. S., N. Engl. J. Med. 344, 907-916, 2001; Martel-pelletier J., Alaaeddine N., and Pelletier J.P., Frontiers Biosci, 4, 694-703, 1999). MMP 중 MMP-13은 연골조직의 파괴에 중요한 Aggrecan을 분해하고, 연골의 콜라겐을 분해하여 연골 파괴에 주된 역할을 한다

골 질환 중 골절은 뼈나 골 단판 또는 관절면의 연속성이 비정상적으로 끊어 진 상태로, 골의 깨짐을 일컫는다. 골절을 유발하는 원인으로는 교통사고 등의 외상, 산업장애에서 일어나는 안전사고, 골다공증, 골암, 대사이상증 등의 질병으로 인한 골의 변화 및 스포츠나 하중으로 인한 반복적인 골에 대한 스트레스 등이 있다. 또한, 골절 상태는 골절선(골 절단에 의해 발생된 뼈끝단을 따른 선)에 근거하여, 균열골절, 그린스틱(greenstick) 골절, 횡상 골절, 사상 골절, 나선상 골절, 분절골절, 분쇄골절, 견열골절, 압박골절, 함몰골절 등으로 분류된다.

골절이 일어나면 혈관의 손상으로 부분적 출혈과 혈병이 형성되며 골절된 인접부위에 있는 골기질은 파괴되고 골세포도 죽게 된다. 따라서, 골절 치유 과정동안 혈병, 손상 받은 골세포 및 골기질은 파골세포에 의해 제거되며, 골절부위 주위에 있는 골외막(periosteum)과 골내막(endosteum)의 골선조세포(osteoprogenitor cell)는 활발하게 증식하여 골절 주변에 세포성 조직(cellular tissue)을 형성하고 이들은 골절된 부위로 들어간다. 골절된 부위의 결합조직에서는 작은 연골조각으로부터 연골내 골화 과정(endochondral ossification)이 일어나거나 막성골 발생과정(intramembranous ossification)을 통해 미성숙한 뼈(immature bone)가 형성된다. 따라서, 골절부위에서는 연골조직, 막성골 발생과정 및 연골내 골화 과정이 동시에 관찰된다. 이와 같은 방식에 의해 불규칙하게 형성된 미성숙골의 지주(trabecular)가 골절된 골의 양끝을 일시적으로 결합시켜 가골(bony callus)을 형성하고, 골절부위에 형성된 가골의 일차뼈 조직(woven bone)은 치유가 진행됨에 따라 점차적으로 흡수되어 층판골(lamellar bone)로 대체되면서 원래의 골 구조로 복구된다.

일반적으로 골절 치료 과정은 크게 염증기, 수복기 및 개축기(remodeling)로 분류된다.

첫째, 염증기는 골 주변의 조직이 손상되고, 골절 간극에 혈종이 차게 되어, 골절 부위에 염증이 발생된다.

둘째, 수복기는 골절 간극 내에서 혈종이 제거되어 육아(granulation) 조직으로 되고, 연가골(soft callus)이 형성되며, 점진적으로 골 형성 메카니즘에 의해 경가골로 치환되는 과정(연골내 골화), 및 골막에 존재하는 골 형성 세포에 의해 새로운 골이 형성되는 과정(섬유성/막성 골화)인 2개의 과정이 병행하여 진행된다.

셋째, 개축기(remodeling)는 형성된 새로운 골이 골 흡수 및 골 형성의 반복에 의해 장기간에 걸쳐 신장되는 한편, 골 변형이 교정되고, 골 결함 부위가 보강된다.

개축기 동안 형성된 새로운 골은 일정 정도의 강도를 가져, 일상생활이 덜 제한받게 되지만, 수복기는 오랜 기간이 걸려, 환자의 일상생활을 크게 제한한다. 따라서, 수복기 기간을 단축하는 것이 임상적으로 중요하며, 골절치료제는 이러한 복잡한 과정을 촉진시켜 완전한 뼈로의 재생을 촉진시키는 것이 중요하다. 상기 재생 과정 동안 골 개축이 불균형을 이루면서 파골세포가 활성화되어 골절 치료 과정이 지연되며, 연골을 포함하는 연조직 및 골을 포함하는 경조직을 파괴한다.

골질환 중 관절염은 크게 노화에 따른 퇴행성 관절염과 자기면역체계 이상에서 오는 류마티스성 관절염으로 나뉜다. 퇴행성관절염에서 관절연골조직의 파괴는 MMP 합성 및 활성화에 의해 파괴된다.

연골세포와 활막세포에서 MMP들은 잠재적 전-효소(latent pro-enzyme)로 합성되어 활성화되므로, 따라서 연골조직의 퇴행을 제어하기 위해서는 MMP의 활성을 억제함으로서 관절 ECM의 분해를 억제하는 경구적인 저해제의 개발이 관절염 치료에 중요한 목표가 될 수 있다. MMP의 활성은 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinase)에 의해 조절되며 골관절염 관절연골 조직에서 TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3의 발현이 증대되나 연골세포에 의해 생성된 MMP의 수준을 저해하기에는 불충분하다.

이에, 본 발명자들은 진세노사이드 Rb1이 파골세포의 분화 및 활성을 억제하며, 파골세포의 분화 및 활성을 억제하는 OPG(osteoprotegerin)의 분비를 촉진하며, 연골 구성성분의 분해능을 가진 MMP-13(matrix metalloproteinase-13)의 분비를 억제하며, TIMP-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3)의 분비를 증가시킴을 관찰하여 골 질환 예방 및 치료제로 이용될 수 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 골 보호제로서 진세노사이드 Rb1의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 골 조직 파괴 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 연골 조직 파괴 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 연골 및 뼈 파괴를 동반하는 골질환 예방 및 치료제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 파골세포 억제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 골 조직 파괴 억제용 조성물을 제공한다.

진세노사이드 Rb1는 프로토파락소디올(protopanaxadiol)계 사포닌으로, 하기 화학식으로 표지되는 화합물이다. 진세노사이드 Rb1은 당업자에게 알려진 방법으로 분리할 수 있으며, 시판 중인 것을 확보하여 사용할 수 있다.

<화학식 1>

본 발명자들은 진세노사이드 Rb1의 뼈를 포함하는 경조직의 파괴를 막을 수 있는 효능이 있는지 알아보기 위하여, 골을 파괴시키는 세포인 파골세포의 분화 및 활성을 억제하는 효능이 있는지를 관찰하였고, 골 파괴를 억제하는 물질로 알려져 있는 오스테오프로스테그린(osteoprotegerin: 이하 “OPG"라 칭함)의 분비에 영향을 미치는지 확인하였다. 그 결과, 상기 진세노사이드 Rb1은 파골세포의 분화와 활성을 효과적으로 억제하므로(도 1 참조), 골 개축 과정에 있어서 불균형적으로 증가할 수 있는 파골세포 활성 능력을 저해하여 골 흡수를 막아 골절 치료 시 파골세포로 인한 골 및 연골 조직의 손상을 방지할 수 있다. 진세노사이드 Rb1은 OPG의 분비를 효과적으로 촉진하므로(도 2 참조), 증가된 OPG는 파골세포의 RANK(receptor of activated NK-κB)와 조골세포가 발현하는 RANKL(receptor of activated NK-κB ligand)의 결합을 차단하여 파골세포의 분화를 막는다. 이를 통해 파골세포의 골 흡수로 인한 골 손실을 효과적으로 막아 경조직의 파괴를 막을 수 있다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 연골 조직 파괴 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 아울러 연골의 구성성분을 분해하는 물질인 매트릭스 메탈로프로티에이즈-13(matrix metalloproteinase-13: 이하 “MMP-13"이라 칭함)의 분비 및 MMP의 저해제인 TIMP-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3)의 분비 정도를 조사하였다. 그 결과, 진세노사이드 Rb1은 MMP-13의 분비를 억제하고(도 3 참조), TIMP-3의 분비를 촉진시킴으로써(도 4 참조) MMP-13에 의한 연골 구성성분의 분해를 막으며, 파골세포의 골 표면 부착을 저지함으로서 연골을 비롯한 연조직의 파괴를 막는 것을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 그대로 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 염으로는 약제학적으로 허용 가능한 무독성 염이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탈술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등의 염 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 연골 조직 파괴 억제용 조성물은 골 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 연골 및 뼈 파괴를 동반하는 골질환 예방 및 치료제를 제공한다.

상기 골질환은 골절, 관절염, 치주염, 골다공증, 류마티스성 질환, 골 종양, 파젯 병, 퇴행성 연골 및 뼈 파괴 질환이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니며, 연골 및 뼈 파괴를 동반하는 질환의 연골 및 뼈 보호에 대한 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다(Dippe PA., Lohmander LS. Lancet. 365:965-973, 2005; Wieland HA., et al., Nat Rev Drug Discov. 4:331-344, 2005; Roh JS., et al., Orthop Clin North Am. 36:255-262, 2005; Gary S., Firestein NATURE 423:356-361, 2003).

본 발명의 골질환 예방 및 치료제는 상기 진세노사이드 Rb1에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가 지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 골질환 예방 및 치료제는 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

유효용량은 0.1-10 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.1-3 ㎎/㎏ 이며, 하루 1-3 회 투여될 수 있다. 용량은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 Rb1을 마우스에 경구 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성 시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 2 g/㎏ 이상인 것으로 나타나 안전한 물질로 판명되었다.

본 발명의 골질환 예방 치료제는 건강 식품 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 Rb1을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 진세노사이드 Rb1을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 진세노사이드 Rb1이 원료에 대하여 100 중량%, 바람직하게는 50 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에르트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물 의 비율은 본 발명의 조성물 100 중량부 당 일반적으로 약 0.01-0.04 중량부, 바람직하게는 0.02-0.03 중량부이다.

아울러, 본 발명은 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 파골세포 억제제를 제공한다.

본 발명의 파골세포 억제제는 진세노사이드 Rb1에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있으며, 파골세포의 활성으로 일어날 수 있는 모든 골질환에 유용하게 이용될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 파골세포 억제제는 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질 환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

유효용량은 0.1-10 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.1-3 ㎎/㎏ 이며, 하루 1-3 회 투여될 수 있다. 용량은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 진세노사이드 Rb1의 파골세포 분화 및 활성 억제

본 발명의 진세노사이드 Rb1이 파골세포의 분화 및 활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 칼슘-포스페이트로 피막된 플레이트(OAAS^TM, OCT Inc., 대한민국)에 파골세포 전구세포를 배양하여 파골세포의 표지효소인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase; 이하 "TRAP"이라 칭함) 활성을 분석하였다. 진세노사이드 Rb1은 일반적으로 알려져 있는 방법을 이용하여 분리하거나(Wei Guang Ma, et al., Phytochemistry 52, 1133-1139, 1990), 시판 중인 것을 확보하여(LKT Laboratories, INC, USA) 이를 물에 희석하여 하기 시험관 내(in vitro) 및 동물 실험을 수행하였다.

구체적으로, 마우스 골수세포를 분리하기 위하여 7~9주 된 웅성 마우스를 경부염전으로 희생시킨 후, 대퇴골과 경골을 무균 적출하고 연조직을 제거하며 장골의 양끝을 절단하였다. 26G 주사침을 이용하여 절단한 장골 끝의 골수강에 효소용액[0.1% 콜라게나아제(Gibco BRL, USA), 0.05% 트립신 및 0.5 mM EDTA(Gibco BRL, USA)] 1 ㎖를 주입하여 골수를 분리한 후, 37℃에서 30분간 교반하여 원심 분리를 통하여 골수세포를 회수하여 10% FBS(fetal bovine serum; Gibco BRL, USA)가 포함된 α-MEM 배지(α-minimum essential medium; Gibco BRL, USA)에 24시간 전 배양하였고, 이 후 미부착 세포를 회수하였다. 파골세포의 전구세포가 되는 미부착 세포를 웰당 2×10⁵개의 세포가 되도록 분주하여 배양하였다. 8일간 배양하는 동안 20 ng/㎖ 대식세포집락자극인자(macrophage-colony stimulating factor; M-CSF, Peprotech, USA)와 30 ng/㎖ RANKL(Peprotech, USA)이 포함된 α-MEM에 상기 진세노사이드 Rb1을 각각 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 ㎎/㎖ 처리하여 3 일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 파골세포의 생성을 검사하기 위하여 세포를 고정하여 TRAP 염색을 수행하였고, TRAP 양성(+)을 보이는 다핵세포의 수를 관찰하였다. 구체적으로, 세포배양 후 부착세포를 PBS로 세척한 다음 시트레이트-아세테이트-포름알데히드(citrate-acetate-formaldehyde)로 5분 동안 고정시키고 나프톨(naphthol) AS-BI 포스페이트(phosphate), 패스트 가르넷(fast Garnet) GBC 용액과 7 mM 타르타레 이트 완충액(tartrate buffer, pH 5)을 함유하는 37℃ 아세테이트 완충액(pH 5.0)에 1시간 동안 배양하여 TRAP 염색을 하였으며 3회 반복수행 하였다. 3개 이상의 핵을 가지는 TRAP 양성(+) 다핵세포들을 파골세포로 간주하였다.

결과는 표 1 및 도 1에 나타내었다.

진세노사이드 Rb1의 파골세포 분화 및 활성 억제

진세노사이드 Rb1 농도(㎎/㎖)	파골세포 분화 및 활성억제율(% to Con. ±SE)
0	0 ± 4.7
0.125	0.19 ± 1.36
0.25	84.79 ± 0.5
0.5	99.4 ± 0.16
1	100 ± 0
2	100 ± 0

표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Rb1을 처리하였을 때 대조군의 억제 비율을 0으로 하고 대조군에 비한 TRAP 양성 다핵세포 수의 억제 비율이 각각 0.25, 0.5, 1.0, 2 ㎎/㎖의 농도에서 84.79, 99.4, 100, 100%로 파골세포의 분화 및 활성을 현저히 억제하였다.

<실시예 2> 진세노사이드 Rb1의 오스테오프로티그린(osteoprotegerine) 분비 활성

본 발명의 진세노사이드 Rb1이 골 파괴를 억제하는 물질로 알려진 오스테오프로티그린(osteoprotegerin: 이하 "OPG"라 칭함)의 분비에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 사람 조골세포주인 MG-63 세포를 이용하여 분비되는 OPG의 양을 측정하였다.

본 발명자들은 사람에서 유래된 조골세포주인 MG63 세포(ATCC No. HTB-94)를 미국세포주은행(ATCC, USA)에서 구입하여 10% FBS(Gibco BRL, USA)를 첨가한 DMEM (Gibco BRL, USA)배지로 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하여 OPG 분비량을 효소면역 측정법(ELISA)으로 측정하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트에 ㎖당 1×10⁴개가 되도록 세포를 분주하고, 24시간 후 실험군에 상기 진세노사이드 Rb1을 0.12, 0.25, 0.5, 1, 2 ㎎/㎖ 농도로 처리하였다. 48시간 후 세포 배양액 안의 OPG 양을 효소면역 측정법(ELISA)으로 측정하였으며 3회 반복수행 하였다.

결과는 표 2 와 도 2에 나타내었다.

진세노사이드 Rb1의 OPG 분비 활성

진세노사이드 Rb1 농도(㎎/㎖)	OPG 생성((pg/㎖ ± SD)
0	983.9 ± 88.2
0.125	1305.1 ± 200.0
0.25	1378.8 ± 181.9
0.5	1368.7 ± 99.3
1	1595.6 ± 207.8
2	2081.4 ± 283.6

표 2와 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 진세노사이드 Rb1은 낮은 농도(0.125 ㎎/㎖)에서 높은 농도 (2 ㎎/㎖)까지 농도 의존적으로 OPG의 분비량을 증가시켰으며, 최고 농도에서는 대조군에 비하여 2배 가량 OPG의 분비량을 증가시켰다. 이와 같이 분비가 증가한 OPG가 파골세포의 분화와 활성을 저해하는 것으로 보인다.

<실시예 3> 진세노사이드 Rb1의 매트릭스 메탈로프로티에이즈-13(matrix metalloproteinase-13) 분비 억제 활성

본 발명의 진세노사이드 Rb1이 인체 연골육종 세포주(human chondrosarcoma cell line)인 SW1353 세포에서 생성되는 기질파괴 물질인 매트릭스 메탈로프로티에이즈-13(matrix metalloproteinase-13: 이하 "MMP-13"이라 칭함)의 합성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같이 실시하였다.

본 발명자들은 사람에서 유래된 세포주인 SW1353 세포(ATCC No. HTB-94)를 미국세포주은행(ATCC, USA)에서 구입하여 10% FBS(Gibco BRL, USA)를 첨가한 DMEM (Gibco BRL, USA)배지로 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하여 실험에 사용하였다.

구체적으로, 96-웰 플레이트에 5×10⁵ 개/웰로 세포를 분주하고, 24시간 후에 PBS 완충용액(8 g Nacl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na₂HPO₄, 0.24 g KH₂PO₄/1 ℓ 증류수, pH 7.4)으로 세척한 후 FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지에서 24시간 동안 다시 배양하였다. 시험군에 상기 진세노사이드 Rb1을 0, 0.25, 0.5, 1 ㎎/㎖을 농도별로 1시간 동안 처리한 다음, 대조군과 시험군에 종양괴사인자-알파(TNF-a)를 처리하였다. 24시간 후 세포 배양액 안의 MMP-13의 양을 효소면역 측정법을 이용하여 측정하였으며 2회 반복수행 하였다.

상기 과정에 의한 진세노사이드 Rb1의 MMP-13 분비에 미치는 영향은 표 3과 도 3에 나타내었다.

진세노사이드 Rb1의 MMP-13 분비 억제 활성

진세노사이드 Rb1의 농도(㎎/㎖)	MMP-13 생성(% to Con.)
0	100
0.25	50.6
0.5	32.5
1	17.1

표 3과 도 3에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Rb1을 처리한 경우 낮은 농도(0.25 ㎎/㎖)에서 높은 농도 (1 ㎎/㎖)까지 농도 의존적으로 MMP-13 분비를 억제하였다. 진세노사이드 Rb1가 MMP-13의 분비를 억제함으로서 연골 구성성분의 분해를 막으며, 파골세포의 골 흡수 개시를 저해함을 알 수 있다.

<실시예 4> 진세노사이드 Rb1의 TIMP-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3) 분비 촉진 활성

본 발명의 진세노사이드 Rb1이 인체 연골육종 세포주(human chondrosarcoma cell line)인 SW1353 세포에서 생성되는 기질 파괴를 막는 물질인 TIMP-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3) 분비에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 실시하였다.

본 발명자들은 사람에서 유래된 세포주인 SW1353 세포(ATCC No. HTB-94)를 미국세포주은행(ATCC, USA)에서 구입하여 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 DMEM(Gibco BRL, USA)배지로 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하여 실험에 사용하였다.

구체적으로, 96-웰 플레이트(well plate)에 ㎖당 1×10⁴개가 되도록 세포를 분주하고, 24시간 후 실험군에 상기 진세노사이드 Rb1을 0.12, 0.25, 0.5, 1, 2 ㎎/㎖ 농도로 처리하였다. 24시간 후 세포 배양액 안의 TIMP-3 양을 효소면역 측정법(ELISA)으로 측정하였으며 3회 반복수행 하였다.

상기 과정에 의한 진세노사이드 Rb1의 TIMP-3 분비에 미치는 영향은 표 4과 도 4 에 나타내었다.

진세노사이드 Rb1의 TIMP-3 분비 활성

진세노사이드 Rb1의 농도(㎎/㎖)	TIMP-3 분비량(mg/㎖±SE)
0	10.4±2.6
0.25	8.1±0.6
0.5	38.5±9.0
1	49.2±12.7

표 4과 도 4에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Rb1을 처리한 경우 낮은 농도(0.25 ㎎/㎖)에서 높은 농도 (1 ㎎/㎖)까지 농도 의존적으로 TIMP-3 분비를 촉진하였다.

<실험예 5> 진세노사이드 Rb1에 의한 급성독성 시험

본 발명에 이용된 진세노사이드 Rb1의 안정성을 확인하고자, 경구 투여시의 독성 실험을 수행하여 이를 확인하고자 하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) 마우스를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 5 마리씩의 동물에 본 발명의 진세노사이드 Rb1을 물에 녹여서 2, 1, 0.5 g/㎏의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과 진세노사이드 Rb1은 마우스에서 2 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 2 g/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<제제예 1> 약학적 제제의 제조

1. 환의 제조

본 발명의 조성물 70 중량부

벌꿀 20 중량부

전분 1 중량부

상기 조성 및 함량으로 통상적인 방법을 사용하여 환을 제조하였다.

2. 정제의 제조

본 발명의 조성물 100 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상시의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

본 발명의 조성물 100 mg

옥수수 전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 2> 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5-10 중량부, 구연산 0.05-0.3 중량부, 카라멜 0.005-0.02 중량부, 비타민 C 0.1-1 중량부의 첨가물을 혼합하고, 여기에 본 발명의 조성물 79-94 중량부를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85-98℃에서 20-180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5-0.82 중량부를 주입하여 본 발명의 조성물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5 중량부), 올리고당(2 중량부), 설탕(2 중량부), 식염(0.5 중량부), 물(75 중량부)과 같은 부재료와 본 발명의 조성물 79-90 중량부를 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채쥬스의 제조

본 발명의 조성물 5 g을 토마토 또는 당근쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4. 과일쥬스의 제조

본 발명의 조성물 1 g을 사과 또는 포도쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

본 발명의 진세노사이드(ginsenoside) Rb1을 유효성분으로 함유하는 골 및 연골조직 파괴 억제용 조성물은 파골세포(osteoclast)의 분화와 활성을 억제하며, 오스테오프로테그린(osteoprotegerin)의 분비를 촉진하여 골 조직의 파괴를 억제하고, 매트릭스 메탈로프로티에이즈-13(matrix metalloproteinase-13)의 분비를 억제함과 동시에 TIMP-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3)의 분비를 촉진함으로 연조직의 파괴를 억제함으로써, 연골 및 뼈 파괴를 동반하는 질환의 연골 및 뼈 보호에 대한 예방 및 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (10)

1. 진세노사이드(ginsenoside) Rb1을 유효성분으로 함유하는 골절, 골종양, 골다공증 및 파젯병으로 구성된 군으로부터 선택되는 경조직 파괴 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 파골세포의 분화 및 활성 억제에 의한 것을 특징으로 하는 예방 및 치료용 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 오스테오프로테그린(osteoprotegerin) 분비 촉진에 의한 것을 특징으로 하는 예방 및 치료용 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 함유하는 골절, 치주염을 제외한 치주질환, 골다공증, 골 종양, 파젯 병, 및 뼈 파괴 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 뼈 파괴를 동반하는 골질환 예방 및 치료제.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

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