CN109432509A - 一种抗炎及促成软骨分化的生物活性支架及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗炎及促成软骨分化的生物活性支架，包含以下组分：Rb1、TGF‑β、丝素蚕白和多孔支架。同时本发明还公开了所述生物活性支架的制备方法以及其在制备软骨缺损修复材料中的用途。本发明提供的生物活性支架利用蚕茧中提取的天然丝素蛋白作为介质，利用冷冻干燥技术使具有抗炎作用的人参皂苷单体(Rb1)，转化生长因子‑β(TGF‑β)及丝素蛋白晶形转变，固定在多孔支架中。当所述支架移植到软骨损伤和/或缺损区后，可以释放Rb1下调损伤区炎症，通过调节微环境起到更有利于损伤修复的作用；同时长期缓释的TGF‑β又可以诱导内源性的细胞成软骨分化，达到有效地软骨损伤修复的目的。

Description

一种抗炎及促成软骨分化的生物活性支架及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种抗炎及促成软骨分化的生物活性支架及其制备方法和用途。
背景技术
骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种最普遍的关节退行性疾病。其主要的病理特征包括：软骨降解，软骨下骨的不规则骨化及其继发性炎症。临床特征主要表现为：关节疼痛，僵硬，活动度受限等。目前，临床上的药物治疗方法对于缓解疾病的进展效果不大，到疾病晚期，大部分骨关节炎病人都不得不接受关节置换手术，但手术风险软大及术后容易出现并发症，且关节置换假体使用寿命的问题，使得长期疗效不佳等。于是，寻找一种有效的治疗方法则非常重要。
炎症因子在骨关节炎发病进展过程中发挥了重要的作用。比如：大量研究发现白细胞介素1－β(Interleukin-1β(IL-1β))及肿瘤坏死因子－α(Tumour necrosis factor-α(TNF-α))在骨关节炎发病过程中，在滑膜液的代谢及软骨降解过程中发挥了重要的作用。这两种炎症因子在关节中的表达量上调会刺激软骨细胞分泌基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase-13(MMP13))从而降解二型胶原及蛋白多糖；另一方面，炎症因子水平上升会直接刺激软骨细胞分泌二型胶原及蛋白多糖的能力下降，从而最终导致骨关节炎中软骨的降解。于是，寻找一种药物可以抑制炎症因子，调节关节微环境，对于缓解骨关节炎的进展和促进软骨的修复具有十分重要的意义。
在人参的药物研究中，其天然提取物如皂甘类及三萜类单体，现称为人参皂苷，作为主要的活性物质得到了广泛的关注。到目前为止，有超过40种人参皂苷被鉴定发现，它们根据其不同的结构特点表现出不同的生物活性作用。其中人参皂苷Rb1是在人参中含量最多的一种人参皂苷，研究表明其具有大量的生物活性功能，比如抗炎，抗凋亡和神经保护作用等。先前的体外实验表明Rb1可以缓解IL-1β或过氧化氢(H2O2)诱导的软骨细胞凋亡。体内研究表明Rb1延缓胶原诱导骨关节炎小鼠模型的骨关节炎的疾病进展。
除了下调继发性炎症，如何诱导干细胞成软骨定向分化，是骨关节炎软骨修复面对的一个重要问题。转化生长因子-β(TGF-β)是一种常见的成软骨分化的诱导因子，在经典的间充质干细胞成软骨诱导液中的主要成分。因此软骨损伤修复过程中提高损伤区TGF-β含量有利于诱导干细胞成软骨分化促进软骨修复。
目前，国内外均未报道具有抗炎及成软骨分化功能的生物活性支架。因此，急需一种可下调损伤区炎症水平，改善其微环境，同时可以诱导其内源性的干细胞成软骨分化，从而达到更好的软骨修复目的的生物活性支架。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种抗炎及促成软骨分化的生物活性支架，其能下调损伤区炎症因子水平，同时诱导内源性干细胞成软骨分化，具有抗炎及促成软骨分化的功能，可有效提高软骨损伤的修复效果。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种抗炎及促成软骨分化的生物活性支架，包含以下组分：Rb1、TGF-β、丝素蚕白和多孔支架。
优选地，所述Rb1、TGF-β和丝素蚕白的质量比为(0.1～10)：(1×10-5～0.002)：(10～200)。
优选地，所述Rb1、TGF-β和丝素蚕白饱和吸附在多孔支架中。
优选地，所述多孔支架原料选自明胶海绵、胶原、壳聚糖、海藻酸钠和透明质酸中至少一种。
优选地，所述多孔支架孔隙直径为50～600μm。
优选地，所述多孔支架为明胶海绵多孔支架。
本发明还提供了所述的生物活性支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)按比例称取Rb1、TGF-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液；
(2)取多孔支架，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后真空冷冻干燥，即得所述生物活性支架。
优选地，所述步骤(2)中多孔支架孔隙直径为50～600μm。
优选地，所述步骤(2)中真空冷冻干燥的温度为-10～-80℃，时间为1～7天。
本发明所述丝素蚕白可通过从蚕茧中提取获得，也可为市售的丝素蚕白产品。
优选地，所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：
A、脱胶：将桑蚕蚕丝放入的碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗；以上过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；
B、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白溶解于溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；
C、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；
D、将上述截留液离心，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。
优选地，所述步骤A中桑蚕蚕丝和碳酸钠水溶液的重量体积比为20g：1L。
优选地，所述步骤A中碳酸钠水溶液的浓度为2M。
优选地，所述步骤B中丝素蛋白溶解于溴化锂水溶液后的质量浓度为16％。
优选地，所述步骤B中溴化锂水溶液的浓度为9M。
优选地，所述步骤C中作为透析液的去离子水的体积为所述含丝素蛋白的混合液体积的10倍。
本发明中这种通过同时释放Rb1和TGF-β改善丝素蛋白-多孔支架的成软骨性能的方法，能够充分发挥两者的作用，能取得更好的软骨损伤修复效果。
优选地，所述步骤D中将所述截留液于4℃，5000g，离心10分钟。
本发明还提供了所述的生物活性支架在制备软骨缺损修复材料中的用途。
本发明所述生物活性支架可用于制备软骨缺损修复材料，具有很好的抗炎及促成软骨分化的功能，可有效提高软骨损伤的修复效果。
本发明还提供了一种软骨缺损修复材料，包含所述的生物活性支架和修复材料领域可接受的辅料。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明提供了一种具有抗炎及促成软骨分化功能的生物活性支架，其含有抗炎药物人参皂苷单体(Rb1)，成软骨诱导因子(TGF-β)和丝素蛋白，可以有效解决软骨修复过程中损伤区成软骨分化效率低的缺点；(2)本发明生物活性支架能下调损伤区炎症因子水平，同时诱导内源性干细胞成软骨分化，具有抗炎及促成软骨分化的功能，可有效提高软骨损伤的修复效果。
说明书附图
图1为本发明生物活性支架抗炎效果实验结果图。
图2为本发明生物活性支架诱导干细胞成软骨分化实验结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明抗炎及促成软骨分化的生物活性支架的一种实施例，包含以下组分：Rb1、TGF-β、丝素蚕白和明胶海绵；所述Rb1、TGF-β和丝素蚕白的质量比为0.1：1×10-5：10。
所述生物活性支架的制备方法包括以下步骤：
(1)按比例称取Rb1、TGF-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液，使所述蛋白混合液中Rb1的浓度为0.1mg/ml，TGF-β的浓度为10ng/ml，丝素蚕白的浓度为10mg/ml；
(2)取孔隙直径为600μm的无菌干燥明胶海绵，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后于-80℃真空冷冻干燥1天，即得所述生物活性支架。
所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：A、脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入5L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；B、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以16％的质量浓度溶解于9M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；C、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用所述含丝素蛋白的混合液体积10倍的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；D、将上述截留液于4℃，5000g，离心10分钟，去除底部的未溶解丝素蛋白和其它存在的不溶性颗粒，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。
实施例2
本发明抗炎及促成软骨分化的生物活性支架的一种实施例，包含以下组分：Rb1、TGF-β、丝素蚕白和明胶海绵；所述Rb1、TGF-β和丝素蚕白的质量比为5：0.0001：110。
所述生物活性支架的制备方法包括以下步骤：
(1)按比例称取Rb1、TGF-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液，使所述蛋白混合液中Rb1的浓度为5mg/ml，TGF-β的浓度为100ng/ml，丝素蚕白的浓度为110mg/ml；
(2)取孔隙直径为200μm的无菌干燥透明质酸海绵，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后于-10℃真空冷冻干燥7天，即得所述生物活性支架。
所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：A、脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入5L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；B、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以16％的质量浓度溶解于9M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；C、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用所述含丝素蛋白的混合液体积10倍的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；D、将上述截留液于4℃，5000g，离心10分钟，去除底部的未溶解丝素蛋白和其它存在的不溶性颗粒，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。
实施例3
本发明抗炎及促成软骨分化的生物活性支架的一种实施例，包含以下组分：Rb1、TGF-β、丝素蚕白和壳聚糖多孔支架；所述Rb1、TGF-β和丝素蚕白的质量比为10：0.002：200。
所述生物活性支架的制备方法包括以下步骤：
(1)按比例称取Rb1、TGF-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液，使所述蛋白混合液中Rb1的浓度为10mg/ml，TGF-β的浓度为2000ng/ml，丝素蚕白的浓度为200mg/ml；
(2)取孔隙直径为50μm的无菌干燥壳聚糖多孔支架，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后于-40℃真空冷冻干燥3天，即得所述生物活性支架。
所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：A、脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入5L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；B、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以16％的质量浓度溶解于9M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；C、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用所述含丝素蛋白的混合液体积10倍的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；D、将上述截留液于4℃，5000g，离心10分钟，去除底部的未溶解丝素蛋白和其它存在的不溶性颗粒，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。
实施例4
本发明抗炎及促成软骨分化的生物活性支架的一种实施例，包含以下组分：Rb1、TGF-β、丝素蚕白和海藻酸钠多孔支架；所述Rb1、TGF-β和丝素蚕白的质量比为8：0.001：150。
所述生物活性支架的制备方法包括以下步骤：
(1)按比例称取Rb1、TGF-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液，使所述蛋白混合液中Rb1的浓度为8mg/ml，TGF-β的浓度为1000ng/ml，丝素蚕白的浓度为150mg/ml；
(2)取孔隙直径为400μm的无菌干燥海藻酸钠多孔支架，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后于-70℃真空冷冻干燥2天，即得所述生物活性支架。
所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：A、脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入5L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；B、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以16％的质量浓度溶解于9M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；C、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用所述含丝素蛋白的混合液体积10倍的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；D、将上述截留液于4℃，5000g，离心10分钟，去除底部的未溶解丝素蛋白和其它存在的不溶性颗粒，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。
实施例5
本发明抗炎及促成软骨分化的生物活性支架的一种实施例，包含以下组分：Rb1、TGF-β、丝素蚕白和胶原多孔支架；所述Rb1、TGF-β和丝素蚕白的质量比为3.5：1×10-4：80。
所述生物活性支架的制备方法包括以下步骤：
(1)按比例称取Rb1、TGF-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液，使所述蛋白混合液中Rb1的浓度为3.5mg/ml，TGF-β的浓度为100ng/ml，丝素蚕白的浓度为80mg/ml；
(2)取孔隙直径为500μm的胶原多孔支架，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后于-20℃真空冷冻干燥5天，即得所述生物活性支架。
所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：A、脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入5L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；B、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以16％的质量浓度溶解于9M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；C、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用所述含丝素蛋白的混合液体积10倍的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；D、将上述截留液于4℃，5000g，离心10分钟，去除底部的未溶解丝素蛋白和其它存在的不溶性颗粒，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。
实施例6
本实施例以实施例1中的生物活性支架为例，研究本发明生物活性支架的抗炎作用。
(一)实验方法
1、将大鼠软骨细胞系(C5.18)种植于实施例1所述生物活性支架(实验组1)和丝素蚕白-明胶海绵支架(丝素蚕白饱和吸附于明胶海绵多孔支架上制备而成)(对照组1)中(1×105cells/材料)，用α-MEM+10％FBS(V/V)培养基培养于37℃，5％CO2的细胞培养箱中；
2、培养1天后，将种植了大鼠软骨细胞的材料转移到无血α-MEM培养基中，再加入10ng/mL IL-1β(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)，继续培养24小时；
3、收集细胞，提取RNA，将RNA逆转录成cDNA，利用qRT-PCR检测MMP13和Col 10的表达水平(GAPDH作为内参)，用于评价生物活性支架的抗炎作用。所述MMP13、Col 10和GAPDH的检测引物序列信息如表1所示：
表1引物序列信息
(二)实验结果
实验结果如图1所示，结果表明，与对照组1(丝素蚕白-明胶海绵支架组)相比，实施例1所述生物活性支架(实验组1)可以显著下调MMP13和Col 10基因的表达水平，说明所述生物活性支架具有抗炎的作用，有利于缓解软骨的降解。本发明其他生物活性支架的抗炎效果与本实施例类似，具体数据省略。
实施例7
本实施例以实施例1中的生物活性支架为例，研究本发明生物活性支架诱导成软骨分化的效果。
(一)实验方法
1、大鼠间充质干细胞(MSCs)培养
(1)取两周龄SD大鼠，引颈处死，浸泡于75％酒精消毒，分离肌肉取大腿股骨，两端剪开，用α-MEM+10％胎牛血清(V/V)培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液，梯度离心收集细胞；
(2)将收集到的细胞重悬，加入α-MEM+10％胎牛血清(V/V)培养基中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；
(3)待细胞长成细胞聚落后，进行细胞传代，每三天换一次培养液，取培养3-5代的细胞进行后续实验；
2、取步骤1获得的大鼠MSCs，种植于实施例1所述生物活性支架(实验组2)和丝素蛋白-明胶海绵支架(对照组2)中(5×104cells/材料)，用α-MEM+10％FBS(V/V)培养基培养于37℃，5％CO2的细胞培养箱中；
3、培养第三天取材，收集细胞，提取RNA，将RNA逆转录成cDNA，利用qRT-PCR检测Col 2a1的表达水平(GAPDH作为内参)，用于评价生物活性支架诱导成软骨分化的功能。所述Col 2a1和GAPDH的检测引物序列信息如表2所示：
表2引物序列信息
(二)实验结果
实验结果如图2所示，结果表明，与对照组2(丝素蚕白-明胶海绵支架组)相比，实施例1所述生物活性支架(实验组2)能显著提高成软骨标记基因Col2a1的表达水平，说明所述生物活性支架可有效诱导干细胞成软骨分化。本发明其他生物活性支架诱导干细胞成软骨分化的效果与本实施例类似，具体数据省略。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种抗炎及促成软骨分化的生物活性支架及其制备方法和用途
<130> 2018.9.13
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
agcccagaac atcatccctg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
caccaccttc ttgatgtcat c 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
tcctgatgtg ggtgaataca atg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
gccatcgtga agtctggtaa aat 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
atatcctggg gatccaggtc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
tccaggttca cctcttggac 20
<210> 7
<211> 20
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<400> 7
aacccaaagg acccaaatac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
ccggactgtg aggttaggat 20

Claims (10)

1.一种抗炎及促成软骨分化的生物活性支架，其特征在于，包含以下组分：Rb1、TGF-β、丝素蚕白和多孔支架。
2.根据权利要求1所述的抗炎及促成软骨分化的生物活性支架，其特征在于，所述Rb1、TGF-β和丝素蚕白的质量比为(0.1～10)：(1×10-5～0.002)：(10～200)。
3.根据权利要求1所述的抗炎及促成软骨分化的生物活性支架，其特征在于，所述Rb1、TGF-β和丝素蚕白饱和吸附在多孔支架中。
4.根据权利要求1所述的抗炎及促成软骨分化的生物活性支架，其特征在于，所述多孔支架原料选自明胶海绵、胶原、壳聚糖、海藻酸钠和透明质酸中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的抗炎及促成软骨分化的生物活性支架，其特征在于，所述多孔支架孔隙直径为50～600μm。
6.根据权利要求4或5所述的抗炎及促成软骨分化的生物活性支架，其特征在于，所述多孔支架为明胶海绵多孔支架。
7.根据权利要求1～6任一项所述的生物活性支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按比例称取Rb1、TGF-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液；
(2)取多孔支架，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后真空冷冻干燥，即得所述生物活性支架。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中真空冷冻干燥的温度为-10～-80℃，时间为1～7天。
9.根据权利要求1～6任一项所述的生物活性支架在制备软骨缺损修复材料中的用途。
10.一种软骨缺损修复材料，其特征在于，包含权利要求1～6任一项所述的生物活性支架和修复材料领域可接受的辅料。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2008003320A2 (en) * 2006-07-05 2008-01-10 Region Midtjylland Three-dimensional cell scaffolds
KR20080027604A (ko) * 2006-09-25 2008-03-28 주식회사 오스코텍 진세노사이드 Ｒｂ1을 유효성분으로 포함하는 골 및연골조직 파괴 억제용 조성물
CN104800885A (zh) * 2015-05-13 2015-07-29 中山大学 一种具有趋化功能的生物活性支架的制备和应用
CN108348646A (zh) * 2016-08-12 2018-07-31 高丽大学校产学协力团 用于预防或治疗软组织疾病的多孔聚合物微球及其制造方法

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