KR100806926B1 - 토양으로부터 분리된 엔테로박터 암니지너스 ｇｇ０４６１ - Google Patents

Abstract

본 발명은 토양으로부터 분리한 신규한 엔테로박터 암니지너스 GG0461 균주(Enterobacter amnigenus , 기탁번호 KFCC 11379P)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 토양으로부터 질산염흡수능력이 우수한 신규 엔테로박터 암니지너스 GG0461을 분리하고 상기 균주의 공급 영양분에 따른 질산흡수능력을 조사함으로써 이를 이용한 미생물제제를 염류집적이 심각한 시설재배지에 살포시 질산염류를 감소시키는 뛰어난 효과가 있다.

질산염흡수, 엔테로박터 암니지너스, 토양미생물, 염류장애, 시설재배지, 염류제거

Description

토양으로부터 분리된 엔테로박터 암니지너스 ＧＧ０４６１{Isolated Enterobacter amnigenus GG0461 from soil}

도 1은 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 전자현미경 사진이다.

도 2는 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 16s rDNA 분석으로 동정한 염기서열 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 온도에 따른 성장을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 pH에 따른 성장을 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 탄소원에 따른 질산흡수율을 측정한 것이다.

도 6은 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 질소원과 글리세롤에 따른 질산제거능을 측정한 것이다.

도 7은 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 질산함량에 따른 질산흡수율을 측정한 것이다.

본 발명은 토양으로부터 분리된 질산흡수능력이 우수한 엔테로박터 암니지너스 GG0461에 관한 것이다.

수확증대를 목적으로 다비, 다투입재배 방법은 토양에 과다한 영양물질 유입으로 염류집적에 따른 작물의 생육장애를 유발한다. 이러한 현상은 전 국토의 토양에 광범위하게 나타나고 있으며, 특히 배수가 충분치 못한 비닐하우스 등 시설재배지에서는 염류용탈의 기회가 적어 염류집적의 심각성이 날로 증가하고 있다.

토양의 염류집적은 작물의 생육을 저해하여 농산물의 품질저하는 물론, 생산량의 감소를 초래한다. 최근 국내 시설농업에서 염류집적에 따른 피해현황은 심각한 수준으로 알려져 있어, 고추에서의 잎의 위축기형, 상추에서의 잎 성장위축, 관목화초 잎의 황록화와 낙엽짐 등 다양한 작물에서 피해가 보고되고 있다.

국내 토양에서의 염류장애는 질소질 비료의 과다시비에 의하여 주로 토양중 KNO₃의 집적에 의해 나타나는 독특한 현상으로, 외국의 염류장애가 간척지나 건조토양에서 나타나는 NaCl 염류장애인 것과는 차이가 있다. 따라서, 그간에 선진농업국에서 수행한 염류장애에 관한 연구결과와 생육개선 방법의 국내 도입에는 어려움이 있다.

국내 시설재배지 농업에서 양적, 질적으로 우수한 생산성을 지속적으로 유지하여 농산물의 가격 경쟁력을 높이기 위해서는 토양내 유입되는 과잉염류의 차단을 위한 과학적 시비방법, 토양중 집적된 염류의 효율적 제거방법, 염류장애에 따른 작물의 생육불량 원인에 대한 생리학적, 생화학적 분석 및 이를 극복할 수 있는 재배방법의 확립 등이 선행되어 종합적이고 체계적인 염류장애 극복 방법이 확립되어야 할 것이다.

또한 토양 중 집적한 과잉 질산 제거용 속효성 친환경 미생물제제의 개발이 조속한 시일 내에 이루어짐으로써 우리나라 시설재배지의 염류장애 극복방안 확립과 이에 따른 연작피해 경감으로 작물재배법 개선이 필요한 실정이다.

종래 질산흡수 또는 질산환원능력 있는 미생물은 토양으로부터 분리된 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 치오바실러스 속(Thiobacillus sp.) 등의 미생물에 관한 연구는 있으나 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 미생물에 관한 연구는 아직 미비하다.

따라서, 본 발명의 목적은 질산흡수능력이 우수한 신규한 엔테로박터 암니지너스 GG0461 균주(Enterobacter amnigenus , 기탁번호 KFCC 11379P)를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 엔터로박터 암니지너스 GG0461 균주를 함유하는 질산제거용 친환경 미생물제제를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 토양으로부터 질산흡수능력이 우수한 미생물 엔테로박터 암니지너스 GG0461를 분리 및 동정하고 상기 GG0461의 영양원에 따른 질산흡수능력 및 질산함량에 따른 질산흡수능력을 조사함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위를 본 발명의 실시예에만 한정하지는 않는다.

본 발명은 토양으로부터 분리된 질산흡수능력이 있는 엔터로박터 암니지너스 GG0461 (Enterobacter amnigenus , 기탁번호 KFCC 11379P) 균주를 제공한다.

본 발명은 상기 엔터로박터 암니지너스 GG0461 균주를 함유하는 질산제거용 미생물제제를 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 엔터로박터 암니지너스 GG0461 균주를 분리 및 동정하는 단계; 상기 균주의 영양원에 따른 염류흡수능력을 조사하는 단계 및 질산함량에 따른 질산흡수능력을 조사하는 단계로 구성된다.

본 발명은 시설재배지와 하우스 토양에 집적된 염류를 토양 미생물을 이용하여 제거하기 위해 밭 및 시설재배지 토양에서 질산흡수력을 보이는 미생물을 분리하였으며 그 중 가장 질산흡수 효과가 우수한 균주를 선발하였다.

본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461 균주는 본 발명자들에 의해 2006년 11월 7일자로 한국미생물보조센터에 기탁번호 KFCC 11379P로 기탁되었다.

본 발명에서 상기 균주의 배양 조건별 성장곡선(growth factor)은 흡광도(optical density) 600 nm 에서 측정하였다.

본 발명에서 상기 균주의 배양 조건별 질산흡수 측정은 5.0 mM과 50.0 mM 질 산 스텐다드 솔루션을 이용하여 오리온(Orion) 960 농도측정기로 측정하였다.

이하, 본 발명은 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하나 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1: 질산흡수 미생물의 분리 및 동정

멸균된 2차 증류수 5 mL에 토양 1 g을 넣어 진탕한 다음 1,200 rpm에서 2분간 원심분리하여 상등액 1000배까지 희석하고, 그 희석액에서 50 ㎕를 취하여 PDA(potato dextrose agar) 평판배지에 도말하였다. 질산흡수 미생물을 분리하기 위하여 이미 KNO₃ 50 mM이 PDA 평판배지에 첨가되어 있었다. 상기 평판배지의 전기 전동 (Electrical conductivity, EC) 농도는 식물체가 염류장애를 받기에 충분한5.35 ds/m 이였다. 상기 평판배지를 28℃ 배양기에서 24시간 배양하면서 균총의 모양, 색깔, 크기로 선발하였다. 선발된 균주 중 KNO₃ 50 mM을 함유한 슈도모나스 아가 펙터(Pseudomonas agar factor; PAF) 배지에서 질산흡수능력이 가장 우수한 균주를 선발하여 전자현미경으로 형태를 관찰한 결과 [도 1]과 같이 0.5 내지 1 ㎛인 간균으로 확인되었다.

또 상기 균주의 생화학적 특성분석 결과 [표 1]과 같이 운동성, KOH, 카탈라제, 산 생성 및 사이트레이트 효율 테스트에서 양성반응을 나타났으며 16s rDNA 염기서열을 분석한 결과 [도 2] 및 [서열목록1]과 같았다. 상기 균주의 형태 관찰, 생화학적 특성분석 및 16s rDNA 분석으로 동정한 결과, 엔테로박터 암니지너스(Enterobacter amnigenus)으로 확인되었다.

본 발명의 발명자들은 상기 균주를 엔테로박터 암니지너스 GG0461로 명명하였으며 2006년 11월 7일자로 한국미생물보조센터에 기탁번호 KFCC 11379P로 기탁하였다.

본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 생화학적 특성

생화학적 특성	반응	생화학적 특성	반응
모양	간균	카제인 가수분해	-
운동성	+	젤라틴 가수분해	-
KOH 테스트	+	리트머스 밀크 반응	-
그람 염색	-	H2S 생산	-
카탈라제 테스트	+	인동 생산	-
스타치 가수분해	-	사이트레이트 효율	+
트리뷰티린 가수분해	-	보기스-프로스커 테스트	-
산 생성 테스트	+

실험예 1: 배양 조건에 따른 질산흡수능력 측정

본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461를 온도와 pH, 질산의 농도를 따른 질산흡수능력을 알아보기 위해 다양한 조건에서 배양하였다.

먼저 온도 조건에서 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 성장곡선(growth factor)을 알아보기 위해 기본 배지를 PAF 배지에 균주를 접종하고, 배양 온도를 10, 17, 27,37, 47℃로 조절하여 12시간 배양하였다. 그 결과 [도 3]에 나타난 것과 같이 37℃에서 배양한 균주의 밀도, 흡광도, 질산흡수 정도가 가장 높게 나타났다.

그리고 pH 조절에 의한 질산흡수 정도를 알아보기 위해 PAF배지의 pH를 5.0 내지 9.0 조절하여 균주를 배양한 결과 [도 4]과 같이 pH 8까지는 질산흡수가 증가하였으나, pH 9.0에서는 pH 8.0에 비하여 오히려 감소하는 것으로 나타났다.

실험예 2: 배지 종류 및 영양원에 따른 질산흡수능력 측정

본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 탄소원에 따른 질산흡수능력을 측정하기 위하여 글리세롤, 아라비노스, 자일로즈, 프락토스, 갈락토스, 글루코스, 만니톨, 슈크로스, 말토스, 락토스,라피노스, 스타치, 셀룰로스를 각각 0.5 중량% 및 1.0 중량%씩 PAF 액체배지에 첨가하여 배양한 결과, [도 5]에서와 같이 글리세롤 0.5 내지 1.0 중량%가 첨가된 배지에서 90% 이상의 질산흡수능력을 나타냄으로써 다른 탄소원을 첨가했을 때보다 질산흡수능력이 월등히 높은 것을 할 수 있었다.

다음으로 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 질소원과 글리세롤 첨가에 따른 질산흡수능력을 조사하기 위해 글리세롤을 0.5 중량% 첨가한 PAF 액체배지에 질소원인 펩톤(Peptone), 트립톤(Tryptone), 유레아(Urea)를 각각 0.5 중량%씩 첨가하여 배양한 결과, [도 6]과 같이 유레아가 첨가된 배지에서 가장 높은 질산흡수능력을 나타냈으며, 그 다음은 펩톤과 트립톤 순으로 나타났다.

마지막으로 양이온에 따른 질산흡수율을 알아보기 위해 1가, 2가 양이온 17종 1 mM, 10 mM, 20 mM씩을 각각 배지에 첨가하여 질산흡수능력을 조사하였다. 그 결과는 표 2와 같이 1 mM의 Pb^{2 +}, Co^{2 +} 양이온 첨가 배지와 10 mM의 Na⁺, Ca⁺, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, Ba^{2 +}, Mn^{2 +} 그리고 20mM의 Na⁺, Ca⁺, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, Ba^{2 +} 첨가구에서 100% 활성을 나타냄으로써 양이온 첨가가 질산흡수에 큰 영향을 주는 것으로 확인하였다.

따라서 글리세롤, 유레아 및 양이온(Na⁺, Ca⁺, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, Ba^{2 +}, Mn^{2 +} )의 농도가 본 발명 엔터로박터 암니지너스 GG0461 균주의 질산흡수능력에 큰 영향을 미치는 것임을 확인할 수 있었다.

본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461의 메탈이온에서의 활성

메탈이온	활성(%)
	1 mM	10 mM	20 mM
Na+	-	100	100
Cs+	-	100	100
Ca2 +	-	100	100
Mg2 +	-	100	100
Ba2 +	-	100	100
Mn2 +	-	100	80
Ni2 +	-	22	26
Cu2 +	-	85	47
Hg2 +	0	0	-
Cd2 +	56	0	-
Zn2 +	92	35	-
Pb2 +	100	90	-
Co2 +	100	12	-
Sn2 +	86	15	-
Gd3 +	85	26	-
La3 +	92	21	-
Fe3 +	83	22	-

실험예 3: 질산함량에 따른 질산흡수율 측정

본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461이 질산함량에 따른 밀도와 질산흡수율을 알아보기 위해 질산의 농도를 50, 100, 500, 1000 mM로 조절하여 배양한 결과 [도 7]과 같이 질산의 농도가 50 mM에서 가장 높은 질산흡수율을 나타냈으며 농도가 높을수록 점차 낮아지는 경향을 나타냈다.

그러나 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461 균주는 질산의 농도가 50 mM와 100 mM에서 거의 유사한 증식을 나타냈다. 따라서 본 발명 엔테로박터 암니지너스 GG0461 균주는 질산의 농도가 100 mM 이하인 환경에서 질산흡수가 충분할 것으로 판단된다.

상기 실시예 및 실험예를 통하여 설명한 바와같이, 본 발명은 토양으로부터 분리한 질산흡수능력이 우수한 신규한 엔테로박터 암니지너스 GG0461 균주를 제공함으로써 질산오염 지하수 및 농용수 개선에 뛰어난 효과가 있으므로 작물재배 및 환경산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

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Claims (2)

1. 토양으로부터 분리된 질산흡수능력이 있는 엔테로박터 암니지너스 GG0461 균주(Enterobacter amnigenus , 기탁번호 KFCC 11379P).
2. 제 1항의 엔테로박터 암니지너스 GG0461 균주 또는 그 배양물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 질산제거용 미생물제제.

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