CN109706093B - 解淀粉芽孢杆菌菌株、组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株、组合物和用途。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16748；保藏时间为：2018年11月15日。除高效降解淀粉外，该菌株的其它性状与野生型解淀粉芽孢杆菌株保持一致，符合实验目的要求。该菌株可用于高效降解作物秸秆、增加土壤腐殖质、提高土壤肥力、抑制有害微生物繁殖等。

Description

解淀粉芽孢杆菌菌株、组合物和用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株、组合物和用途。

背景技术

作物秸秆含有多种植物生长所需的营养元素，包括N、P、K等。秸秆还田后有利于增加土壤有机质含量、促进农业生态系统物质能量循环、提高农业可持续生产能力，是目前国家大力倡导的秸秆处理方式。然而，由于秸秆在土壤中腐解过程缓慢影响农田土壤整地播种质量，甚至降低作物产量。胡立峰等(2009)研究表明秸秆腐解不充分会影响下茬作物的生长。研究表明，利用秸秆腐熟剂腐熟作物秸秆，可以使秸秆的快速腐解，实现大量秸秆的快速还田(匡恩俊等，2014；张舒予等，2018)。秸秆腐熟剂是一种含有功能微生物的微生物肥料，具有促进作物秸秆快速腐解的作用 (匡恩俊等，2014)，在减轻和防止大量秸秆还田给作物生长带来不利影响的同时，可促进土壤养分积累，提高作物产量和品质(Witt etal., 2000)。然而，目前缺乏能够快速腐解作物秸秆的高效菌株。因此，本研究通过诱变筛选的方法筛选能够高效降解淀粉的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，为后期腐熟剂的生产和应用提供材料。

解淀粉芽孢杆菌除了具有解淀粉的能力，其还是一类重要的根际促生菌，在植物病害防治过程中发挥着重要作用(胡春江等，2004)，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物。解淀粉芽孢杆菌在农业中具有广泛的应用。Hiradate等研究发现解淀粉芽孢杆菌对桑树炭疽病具有较强的抑制作用。另外，研究还表明，解淀粉芽孢杆菌对玉米枯萎病、草莓灰霉病，设施蔬菜根结线虫，花生白绢病，小麦黄花病，山核桃根腐病，玉米叶斑病，水稻纹枯病，苹果斑点落叶病番茄枯萎病病等具有较强的抑制作用(段海明等2017；谷春艳，2017；刘刚2017)。在促进植物生长方面，解淀粉芽孢杆杆菌可以促进玉米(刘拴成等， 2010)、水稻(张荣胜，等2018)，增强植物的耐盐耐胁迫能力(陈淋 2016.)，提高茶叶的产量和品质(周晨光等，2014；白志等，2014)。

因此，研究利用解淀粉芽孢杆菌作为腐熟剂的功能菌不仅可以促进秸秆的降解、提高土壤有机质含量，还可以提高土壤的抗病性、促进作物的生长，对农田的可持续发展以及减肥减药具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明通过提供新的微生物菌株、培养物、组合物，以及可用于降解淀粉的方法解决前述需求。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种分离的解淀粉芽孢杆菌菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16748；保藏时间为：2018年11月15日。

该菌株的保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。

该菌株在LB培养基上，培养初期菌落乳白色，圆形，表面湿润粘稠；培养后期表面干燥有皱褶，菌落中间有突起，边缘不整齐且干燥、不透明。菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性，产芽孢。

该菌株通过紫外诱变来源于中国农科院农业资源与农业区划研究所的野生菌株菌株所获得。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种组合物，其含有如上所述的解淀粉芽孢杆菌菌株的培养物。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及降解淀粉的方法，其包括如下步骤：

使如上所述的组合物与含有淀粉的底物组合物在所述解淀粉芽孢杆菌菌株能够保持其体内淀粉酶活性的条件下接触。

本发明还涉及如上所述的组合物在秸秆降解及土壤改良方面的应用。

该菌株通过对野生型解淀粉芽孢杆菌的紫外线诱变获得。除高效降解淀粉外，该菌株的其它性状与野生型解淀粉芽孢杆菌株保持一致，符合实验目的要求。该菌株可用于高效降解作物秸秆、增加土壤腐殖质、提高土壤肥力、抑制有害微生物繁殖等。

本申请提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，菌株名为 007，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号 CGMCC No:16748；经保藏中心于2018年11月15日检测为存活菌株并保藏。

具体实施方式

本发明涉及一种分离的解淀粉芽孢杆菌菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16748；保藏时间为：2018年11月15日。

该菌株具有很强的解淀粉能力，其解淀粉能力的衡量指标如实施例“解淀粉能力强的菌株筛选”所描述，在给定条件下，具有5.0左右的透明圈大小(例如4.0～6.0)。

本发明请求保护上述保藏编号的解淀粉芽孢杆菌菌株，以及在适度范围内发生突变，且仍然具有很强的解淀粉能力的突变菌株。

所谓“解淀粉芽孢杆菌菌株的突变菌株”，是指基因组高度类似007菌株的基因组的解淀粉芽孢杆菌菌株。在本申请中，表述“本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株”涵盖了所述突变株。突变菌株可通过与SEQ ID NO：1所示的007菌株16S rRNA同源性≥99％(例如99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、 99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的同源性)的方式进行限定，也可以通过基因组方面高度类似涵盖：

一种解淀粉芽孢杆菌菌株的基因组同007菌株的基因组相比，包含至多150个突变事件，优选包含至多140个、130个、120个、110个、100 个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个或20个突变事件。突变事件被限定为SNP(单核苷酸多态性)或INDEL(插入、缺失，及两者的组合)。按如下方式确定突变事件的数量：将007菌株的基因组视为对照，鉴定存在于突变株基因组中的突变事件，每种突变事件(SNP或INDEL)代表一个突变事件(即，例如，插入含若干个核苷酸的序列只视作一个突变事件)。在该语境中，本发明的突变株的基因组序列由同007菌株相比所含突变事件的数量限定，除这种限定方式外，还可额外由其与007菌株的基因组序列的同一性百分比限定，其中同一性百分比在本文表示在一种菌株的基因组中发现存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比，具体地讲： a)在007菌株的基因组中发现并存在于突变菌株的基因组中的序列的百分比，或b)在突变菌株的基因组序列中发现并存在于007菌株的基因组中的序列的百分比。因此，与007菌株的不同之处只有插入(一个或多个)或只有缺失(一个或多个)的突变菌株，具有的基因组与007菌株的基因组的同一性百分比为100％，因为在一种菌株的基因组中完全发现了另一种菌株的整个基因组序列。在一个具体实施例中，由突变事件数量限定的本发明的突变株的基因组序列，与007菌株的基因组序列的同一性百分比为至少 90％、为至少91％、为至少92％、为至少93％、为至少94％、为至少 95％、为至少96％、为至少97％、为至少98％、为至少99％、为至少 99.1％、为至少99.2％、为至少99.3％、为至少99.4％、为至少99.5％、为至少99.6％、为至少99.7％、为至少99.8％、为至少99.9％、为至少 99.92％、为至少99.94％、为至少99.96％、为至少99.98％或为至少 99.99％，其中同一性百分比表示在一种菌株的基因组中发现并存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比；同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的，并且可使用基于 Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。

007菌株的基因组可通过本领域惯用的技术手段测得。

在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将解淀粉芽孢杆菌菌株扩大培养制成组合物(特别是微生物菌剂)的形式以扩大其应用范围。

本发明的组合物(优选地，在用作发酵剂培养物时)可为纯培养物或混合培养物。所以，本发明将纯培养物限定为这样一种培养物，其中全部或基本上全部培养物由本发明的同一种解淀粉芽孢杆菌菌株组成。在替代形式中，将混合培养物限定为这样一种培养物，其包含若干种微生物，具体地讲包含若干种细菌菌株，包括本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株。

所述组合物用于农业，可制成液体、冷冻或干燥粉末形式；或以本行业常用的制剂形式来表述，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。

任何载体都可使用，不论它们是固体或液体，只要它们是农业上和园艺上的农药常用的和生物学上惰性的即可。不限于任何特定的载体。

在一些具体的实施方式中，当所述组合物为冷冻或干燥粉末形式时，其包括固态载体；

固体载体的例子包括矿石粉诸如陶土、滑石、膨润土、沸石、碳酸钙、硅藻土和白炭(White carbon)；植物面粉如玉米面和淀粉；和高分子化合物如聚乙烯醇的聚亚烷基二醇。另一方面，典型的液体载体包括各种有机溶剂如癸烷和十二烷，植物油，矿物油和水。

在一些实施方式中，所述固态载体包括泥炭、草皮、滑石、褐煤、叶蜡石、蒙脱土、藻酸盐、压滤泥浆、锯屑、珍珠岩、云母、硅石、石英粉、钙基膨润土、蛭石、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、细沙以及粘土中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述组合物中包含助剂；

通常在农业和园艺用化学品中用作助剂的表面活性剂、粘合剂、稳定剂等等可以单独使用或需要时组合使用，作为稳定剂可以使用例如抗氧化剂和/或pH调节剂。在某些情况下中也可以使用光稳定剂。

这些助剂的总含量可以是0wt％至80wt％，载体的含量是从100wt％减去有效成分和助剂含量后的值。

在一些具体的实施方式中，所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、丁基萘磺酸钠、海藻糖、甘油、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、烟酸、醇、缓冲盐、氯化钠、氨基酸、维生素类、蛋白质、多肽、多糖或单糖、酵母膏、白炭黑、茶皂素、脱脂奶中的一种或多种。

在一些具体的实施方式中，所述组合物还包含农业有效量的选自以下的化合物或组合物：营养素、肥料、杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂以及杀虫剂。

上述成分可与本申请所提供的菌株配合以实现更佳的技术效果。

在一些实施方式中，所述组合物还包含至少一种其他微生物，所述微生物选自可用于降解秸秆的真菌、细菌或放线菌。

真菌、细菌或放线菌的组成包括但不仅限于下述种类：

降解秸秆的真菌：

木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、分枝孢属(Sporotrichum)、轮枝孢霉(Verticillium)、镰刀菌属(Fusarium)、根霉(Rhizopus)等，以上真菌能分解纤维素和半纤维素，并在有氧中温下作用最强。还有降解木质素的洋蘑(Psalliota)、鬼伞菌(Coprinus)、茯苓 (Poria)、多孔菌属(Polyporus)、伞菌属(Agaricus)、糙皮侧耳(Pleurotus ostrcutus)、韧皮菌属(Sthreum)、白腐真菌等。

降解秸秆的细菌：

芽胞杆菌属(Bacillus)、类芽胞杆菌(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomones)、弧菌属(Vibrio)，微球菌属(Micrococcus)、链球菌属 (Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)、原粘杆菌属(Promyxobecterium)、纤维粘菌属(Cytophage)，生胞噬纤维菌属(Sporocytophase)、堆囊菌属 (Sorangium)、螺旋体属(Spiochaeta)等等。以上细菌能分解纤维素，部分能分解木质素如假单胞菌属。

降解秸秆的放线菌：

分枝杆菌(Mycobacterium)、诺卡氏菌(Nocardia)、小单孢 (Micromonospora)、链霉菌属(Streptomyces)等等，以上放线菌能分解纤维素。

在一些实施方式中，所述组合物中还可以添加用于降解纤维素的酶，例如C1酶、Cx酶(又叫B-1,4葡聚糖酶)和β-葡萄糖苷酶中的一种或多种。

这三种酶共同作用把纤维素降解成葡萄糖；降解半纤维素的酶主要也有三种酶。

在一些实施方式中，所述组合物中还可以添加用于降解半纤维素的酶，例如内切酶、外切酶和糖苷酶中的一种或多种。

这三种酶把半纤维素降解为单糖和糖醛酸。

在一些实施方式中，所述组合物中还可以添加用于降解木质素的酶，例如木质素过氧化物酶、依赖Mn(II)的过氧化物酶和醌还原酶中的一种或多种。

这些酶的产物是C1C2,C3片段、氢醌等。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种降解淀粉的方法，其包括如下步骤：

使如上所述的组合物与含有淀粉的底物组合物在所述解淀粉芽孢杆菌菌株能够保持其体内淀粉酶活性的条件下接触。

在一些实施方式中，该条件适宜本申请所提供的解淀粉芽孢杆菌菌株的生长及繁殖，例如采用LB或R2A培养基，在20℃～45℃的条件下培养。

上述稀释后的培养基的稀释倍数可以选择1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7；稀释剂可选择对所述菌株生长无害的液体，例如水。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及如上所述的组合物在降解秸秆中的应用。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及如上所述的组合物在提高土壤腐殖质中的应用。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及如上所述的组合物在促进秸秆原位还田或利用秸秆生产有机肥中的应用。

本发明所涉及的秸秆，包括玉米秸秆、稻草秸秆、麦秸秆、高粱秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆等等所有含有淀粉的农作物秸秆；

秸秆在进行微生物降解之前可先进行预处理，例如经过粉碎。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

1.紫外诱变剂量的确定

将活化好的解淀粉芽孢杆菌接种到含有1/5LB液体培养基(酵母提取粉：2.5g，胰蛋白胨：1g，NaCl：0.25％，pH:7.0±0.2定容至1L)的150ml 锥形瓶中培养过夜，用等量的0.9％的生理盐水洗涤两次，并用生理盐水悬浮，取6ml悬浮液于紫外交联仪(能量：10J/m2)分别照射0,6,12,18,36, 60,120s涂布平板并记录菌落数，实验结果如下：

2.解淀粉能力强的菌株筛选

取致死率为99.46％的时间点，重复活化-洗涤-紫外诱变的过程，并取 200μl诱变后的菌液接种到含有50ml富集液体培养基(酵母提取粉：0.5g，蛋白胨：0.5g，可溶性淀粉：1g，无水硫酸镁：0.024g，磷酸氢二钾， 0.3g，酪蛋白水解物：0.5g，pH:7.2±0.2，定容至1L)的150ml锥形瓶中，培养24h后，重复转接三次。取最后一次的培养液稀释到适合浓度，涂布至鉴定固体培养基(酵母提取粉：10g，蛋白胨：5g，NaCl：10g，可溶性淀粉：20g，琼脂18g，pH:7.0±0.2定容至1L)，培养24h。挑选22株产生透明圈较大的菌株，保存与4℃冰箱中。通过平板划线法，选取单菌落测定其透明圈大小，通过与对照相比，确定一株透明圈较大的解淀粉芽孢杆菌。结果如下：

3.诱变菌株与野生菌株产孢能力测定

将活化好的解淀粉芽孢杆菌和筛选到的解淀粉芽孢杆菌接种到含有 50ml R2A培养基中150ml的锥形瓶中，培养12h，将OD600调整到一致，接种到新的R2A培养基中培养48h，利用显微镜测定两株菌的产芽孢率的区别，实验结果如下：

4.诱变菌株与野生菌株生长速度对比

将活化好的解淀粉芽孢杆菌和筛选到的解淀粉芽孢杆菌接种到含有 50ml R2A培养基的150ml的锥形瓶中，培养12h，将OD600调整到一致，接种到新的含有50ml R2A培养基的150ml的锥形瓶中，每隔3h利用紫外分光光度计测定菌液的OD600，实验结果如下：

5.平板对峙法测菌株对立枯丝核菌的拮抗作用

立枯丝核菌经PDA培养基活化后，用镊子夹取菌块置于1/5LB培养基中心，将活化好的解淀粉芽孢杆菌和筛选到的菌株分别接种到培养基的四周，30℃培养3d。测定抑菌圈的大小，并记录实验结果。

6.测敏试纸法测菌株对抗生素的耐受性

菌株抗生素敏感性实验，将解淀粉芽孢杆菌培养过夜达到指数生长期，取100μl菌液涂布到1/5LB培养基上，将测敏试纸(OXOID)贴附在培养基表面，培养24h测定透明圈大小。

结论：通过对野生型解淀粉芽孢杆菌的紫外线诱变获得了一株高效产淀粉酶菌株007。该菌株在菌株的其它性状与野生型解淀粉芽孢杆菌株保持一致，符合实验目的要求。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

参考文献

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SEQUENCE LISTING

<110> 北京航天恒丰科技股份有限公司

<120> 解淀粉芽孢杆菌菌株、组合物和用途

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1442

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 1

gcctaataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga 60

cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg 120

ctaataccgg atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc 180

acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga 240

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tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600

gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg 660

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tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900

agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960

cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg 1020

gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080

atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg 1140

aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200

atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc 1260

agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1320

cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380

gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg aaggtgaacc 1440

at 1442

Claims (14)

1.分离的解淀粉芽孢杆菌菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No: 16748；保藏时间为：2018年11月15日。

2.组合物，其含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株的培养物。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体、冷冻或干燥粉末形式。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中包含助剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、丁基萘磺酸钠、海藻糖、甘油、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、烟酸、醇、缓冲盐、氯化钠、氨基酸、维生素类、蛋白质、多肽、多糖或单糖、酵母膏、白炭黑、茶皂素、脱脂奶中的一种或多种。

6.根据权利要求4所述的组合物，当所述组合物为冷冻或干燥粉末形式时，其还包括固态载体。

7.根据权利要求6所述的组合物，所述固态载体包括泥炭、草皮、滑石、褐煤、叶蜡石、蒙脱土、藻酸盐、压滤泥浆、锯屑、珍珠岩、云母、硅石、石英粉、钙基膨润土、蛭石、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、细沙以及粘土中的一种或多种。

8.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，其还包含农业有效量的选自以下的化合物或组合物：营养素、杀微生物剂以及杀虫剂。

9.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，其还包含至少一种其他微生物，所述微生物选自可用于降解秸秆的真菌或细菌。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，其还包含用于降解纤维素、半纤维素以及木质素的酶中的一种或多种。

11.降解淀粉的方法，其包括如下步骤：

使权利要求2~10任一项所述的组合物与含有淀粉的底物组合物在所述解淀粉芽孢杆菌菌株能够保持其体内淀粉酶活性的条件下接触。

12.权利要求2~10任一所述的组合物在降解秸秆中的应用。

13.权利要求2~10任一所述的组合物在提高土壤腐殖质中的应用。

14.权利要求2~10任一所述的组合物在促进秸秆原位还田或利用秸秆生产有机肥中的应用。