KR100752107B1

KR100752107B1 - 피키아 파스토리스 유래의 ｔｅｆ 프로모터 및 이를 이용한이종 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR100752107B1
Application number: KR1020060011475A
Authority: KR
Inventors: 이홍원; 안정오; 정준기; 최의성; 김천석; 이은교; 홍지연; 이혁원; 박명수
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-11-16
Filing date: 2006-02-07
Publication date: 2007-08-24
Also published as: DE602006018054D1; EP1951877A1; EP1951877A4; US7816509B2; ATE486944T1; WO2007058407A1; EP1951877B1; KR20070052179A; US20090298122A1

Abstract

본 발명은 피키아 파스토리아 유래의 해독신장인자(TEF) 유전자의 프로모터, 상기 프로모터 및 이에 작동가능하게 연결된 이종 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 포함된 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 배양하고 이의 배양물로부터 이종 단백질을 분리하여 이종 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 TEF 유전자의 프로모터를 이용하면 유도성 물질 없이도 목적한 이종 단백질을 대량으로 제조할 수 있다.

피키아 파스토리스, 해독신장인자, 프로모터, 외래 단백질

Description

피키아 파스토리스 유래의 ＴＥＦ 프로모터 및 이를 이용한 이종 단백질의 제조방법{Translational Elongation Factor Promoter from Pichia Pastoris and Method for Producing Recombinant Protein Using the Same}

도 1은 다양한 미생물 유래 해독신장인자(TEF)의 공통 아미노산 서열을 근거로 한 디제네레이션 합성 프라이머의 제조방법을 도식화한 것이다(TEF1_SC, TEF1_CA, TEF1_YL, TEF1_SSC와 TEF1_AO는 각각 사카로마이세스 세레비시애, 칸디다 알비칸스, 야로이 리포리티카, 스키조사카로마이세스 세레비시애, 아스퍼질러스 오리재 유래 해독신장인자의 아미노산 서열의 일부분).

도 2a는 피키아 파스토리스의 회분식 배양에서의 균체 성장 곡선을 나타낸 것이고, 도 2b는 상기 회분식 배양 시간에 따른 해독신장인자 유전자에 대한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 피키아 파스토리스 유래 TEF 유전자의 프로모터 및 이에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자가 포함된 재조합 발현벡터 pTEF-AM-CLLip의 제조방법을 도식화한 것이다.

도 4는 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAP)의 프로모터 및 이에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자가 포함된 재조합 발현벡터 pGAP-AM-CLLip의 제조방법을 도식화한 것이다.

도 5a는 재조합 발현 벡터 pGAP-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스를 탄소원으로 포도당을 사용하여 회분식 배양한 결과를 나타낸 것이다(●: 균체농도, □: 포도당 농도, ■: 리파제 활성).

도 5b는 재조합 발현 벡터 pTEF-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스를 탄소원으로 포도당을 사용하여 회분식 배양한 결과를 나타낸 것이다(●: 균체농도, □: 포도당 농도, ■: 리파제 활성).

도 5c는 재조합 발현 벡터 pGAP-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스를 탄소원으로 글리세롤을 사용하여 회분식 배양한 결과를 나타낸 것이다(●: 균체농도, ○: 글리세롤 농도, ■: 리파제 활성).

도 5d는 재조합 발현 벡터 pTEF-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스를 탄소원으로 글리세롤을 사용하여 회분식 배양한 결과를 나타낸 것이다(●: 균체농도, ○: 글리세롤 농도, ■: 리파제 활성).

도 6은 재조합 발현 벡터 pGAP-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스와pTEF-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스의 유가식 배양을 통해 발현된 리파제의 활성을 비교한 것이다(■: pGAP-AM-CLLip으로형질전환된 피키아 파스토리스에서 발현된 리파제의 활성, □: pTEF-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스에서 발현된 리파제의 활성).

본 발명은 피키아 파스토리스 유래의 TEF 프로모터 및 이를 이용한 이종 단백질의 제조방법에 관한 것으로 보다 자세하게는 피키아 파스토리스 유래 해독신장인자(Translational Elongation Factor) 유전자의 프로모터, 상기 프로모터 및 이에 작동가능하게 연결된 이종 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 포함된 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 배양하고 이의 배양물로부터 이종 단백질을 분리하여 이종 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

단백질의 합성은 DNA에 암호화된 유전 정보가 RNA로 복사되는 전사(transcription) 과정을 통하여 개시된다. 상기 전사 과정은 유전자의 업스트림에 위치한 프로모터에 RNA 중합효소가 결합함으로써 시작된다. 모든 프로모터의 염기서열은 완전히 동일하지 않지만 공통된 형태를 갖고 있는데 이런 염기서열을 공통염기서열(consensus sequence)이라 한다. 전사개시 부위에는 2개의 짧은 염기서열이 공통염기서열을 형성하고 있는데 그 중 하나인 "TATA box(TATAAT)"는 전사 개시점으로부터 10개의 염기쌍 앞에 위치하고 있으며, 다른 하나인 "TTGACA"는 전사 개시점으로부터 35개의 염기쌍 앞에 중앙점을 갖는 서열이다. 대부분 프로모터들은 공통염기서열의 실제 염기서열 및 전사 개시점과의 거리에서 차이가 있다. 이러한 다양성이 특정 프로모터에서 전사가 시작되는 빈도, 즉 프로모터의 강도(promoter strength)를 결정하는 것으로 인식되고 있다. 이러한 프로모터는 단백질 생산의 효율성을 결정하는 중요 인자 중의 하나이다. 따라서 다양한 미생물에서 강력하고 특이적인 프로모터들이 개발되고 있다.

이와 관련하여 주목 받고 있는 메탄올자화 효모 중 하나인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 메탄올 대사 및 퍼옥시좀 생성 연구에 유용한 모델 생물체인 한편, 전통 효모 사카조마이세스 세레비시애를 능가하는 단백질 대량 생산 숙주 시스템이다. 또한, 피키아 파스토리스는 독특한 대사 및 생리 활성으로 인하여 환경친화적 생물공정에 활용할 수 있는 유용한 산업자원 중 하나로 인식되고 있다.

피키아 파스토리스는 메탄올을 포름알데하이드와 포름산염의 중간단계를 통한 이산화탄소로의 산화를 촉매한다. 이러한 반응은 알코올 산화효소(alcohol oxidase, AOX), 포름알데히드 탈수소효소(formaldehyde dehydrogenase, FLD) 및 포름산염 탈수소효소(formate dehydrogenase, FMDH)에 의해 각각 촉매된다. 피키아 파스토리스는 2개의 AOX 유전자(AOX1 유전자 및 AOX2 유전자)를 갖는다. AOX1 유전자의 조절 영역인 AOX1 프로모터는 고활성을 가지고 있어 메탄올을 이용하는 효모에서 이종 단백질을 고수준으로 발현시키기 위해 사용되고 있는데 반하여 AOX2 프로모터(미국특허 5,032,516)는 상대적으로 활성이 약한 것으로 알려져 있다(J. Tschopp et al. Nucleic Acids Res. 1987, vol.15, pp.3859-3876). 또한, FLD 유전자 조절 영역인 프로모터도 개발되었다(D. Resina et al. Journal of Biotechnology, 2004, vol.109, pp.103-113). 아울러, 다양한 미생물에서 강력한구성성 프로모터로 공지된 해당과정에 관여하는 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAP) 유전자의 프로모터가 피키아 파스토리스에서도 개발되었다(Waterham et al. Gene, 1997, vol.186, pp.37-44).

상술한 메탄올 대사에 관여하는 유전자의 조절영역인 프로모터들은 글루코오 스에 의해 억제되며, 메탄올에 의해 강력하게 유도되는 유도성 프로모터들이다. 따라서 메탄올 대사에 관련된 유전자의 프로모터들을 사용할 경우에는 전사를 유도하기 위해서 연소성이 높은 메탄올을 사용해야 하기 때문에, 화기에 주의해야 하며, 공장 설비시 특별한 조치 및 점검을 요한다. 또한, 피키아 파스토리스는 메탄올을 탄소원으로 사용하였을 경우 성장속도가 상당히 낮아 배양기간이 길어지는 단점이 있다. 따라서 최근에는 GAP 프로모터와 같은 유도성 물질이 없이도 발현을 유도할 수 있는 구성성 프로모터들을 선호하고 있다.

한편, 세포내 해독(translation) 과정에서 리보좀으로 아미노 아실(amino acyl) tRNA의 수송에 관여하는 해독신장인자(translation elongation factor 1-α, TEF)는 진핵 생물체에서 풍부한 단백질 중 하나로 알려져 있다(L. Slobin, European Journal Biochemistry, 1980, vol.110, pp.555-563). 또한, TEF 유전자의 프로모터는 구성성 프로모터로서 알려져 있으며, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 애쉬비아 고쉬피(Ashbya gossypii), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 및 야로위 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 등의 효모에서 외래 유전자의 발현을 위한 프로모터로 사용된 바 있다(S. Steiner et al. Molecular Gene Genetics, 1994, vol.242, pp.263-271; N. Kitamoto, Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, vol.50, pp.85-92; S. Muller et al. Yeast, 1998, vol.14, pp.1267-1283). 그러나, 피키아 파스토리스에서는 아직 TEF 프로모터의 사용이 보고된 바 없다.

본 발명자들은 피키아 파스토리스 유래의 TEF 유전자 및 이의 프로모터를 클로닝한 후 상기 프로모터를 이용하여 이종 단백질을 제조한결과 유도성 물질 없이도 우수한 구성성 프로모터로 알려진 GAP 유전자의 프로모터 보다, 또한 다른 종 유래 TEF 유전자의 프로모터 보다 개선된 수율로 이종 단백질을 얻을 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 한 관점으로서, 서열번호: 6에 기재된 핵산 서열과 70% 이상 동일한 핵산 서열로 구성된 프로모터를 제공한다.

다른 관점으로서, 상기 프로모터 및 이에 작동가능하게 연결된 이종 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 포함된 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 상기 숙주세포를 배양하여 이종 단백질이 발현되도록 하는 단계 및 배양물로부터 상기 이종 단백질을 분리하는 단계를 포함한 이종 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 피키아 파스토리스의 해독 과정에서 아미노 아실 tRNA를 리보좀으로 수송하는데 관여하는 해독신장인자(Translation Elongation Factor; 이하, "TEF"라고 한다) 유전자는 균체의 지수기 성장기에 높은 발현율을 보이는 반면에 균체의 성장 정지기에는 낮은 발현율을 보이는 것을 확인하였다. 이는 TEF 유전자 가 유도성 물질 없이 균체의 성장과 더불어 강력하게 발현될 수 있다는 것을 의미하기 때문에 피키아 파스토리스 유래 "TEF 유전자의 프로모터"가 구성성 프로모터로서 이용될 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명은 피키아 파스토리스 유래 TEF의 유전자에 관한 것이다. 상기 TEF 유전자는 서열번호: 5에 나타낸 핵산 서열로 구성된다. 이러한 TEF 유전자는 서열번호: 5에 나타낸 서열을 참조하여 화학적으로 합성하거나, 피키아 파스토리스의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 5의 양 말단의 일정 부분에 상보적인 염기서열을 포함하는 프로모터를 이용하여 PCR을 수행함으로써 제조할 수도 있다. 본 발명에 따른 TEF 유전자는 피키아 파스토리스 유래이므로 피키아 속 미생물 유래 TEF 유전자를 검출하는 프로브로서 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 피키아 파스토리스의 발현에 관여하는 TEF 유전자의 프로모터에 관한 것이다. 상기 TEF 유전자의 프로모터는 서열번호: 6에 나타낸 핵산 서열로 구성되어 있다. 이와 관련하여 서열번호: 6에 나타낸 핵산 서열의 일부분만으로도 서열번호: 6에 나타낸 핵산 서열로 구성된 TEF 유전자의 프로모터로서 기능을 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 TEF 유전자의 프로모터는 서열번호: 6과 적어도 70% 동일한, 바람직하게는 적어도 80% 동일한, 보다 바람직하게는 90% 동일한, 보다 더 바람직하게는 95% 동일한 핵산 서열로 구성된다. 이러한 TEF 유전자의 프로모터는 서열번호: 6에 나타낸 서열을 참조하여 화학적으로 합성하거나, 피키아 파스토리스의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 6의 양 말단의 일정 부분에 상보적인 염기서열을 포함하는 프로모터를 이용하여 PCR을 수행함으로써 제 조할 수도 있다. 본 발명에 따른 TEF 유전자의 프로모터는 피키아 파스토리스 유래이므로 피키아 속 미생물 유래 TEF 유전자의 프로모터를 검출하는 프로브로서 이용될 수 있다. 아울러, 앞서 주지된 바와 같이 본 발명에 따른 피키아 파스토리스 유래 "TEF 유전자의 프로모터"는 구성성 프로모터로서 이용될 수 있다.

"프로모터(promoter)"는 유전자의 업스트림에 위치하는 RNA 폴리머라제가 결합하는 핵산 서열로서, 유전자의 발현을 위하여 반드시 필요한 기본적인 조절 서열이다. 일반적으로 프로모터는 두 가지 군으로 분류될 수 있다. 그 중에 하나인 "유도성 프로모터(inducible promoter)"는 유도성물질(inducer)이 존재하는 경우에 상기 프로모터의 조절 하에 놓인 유전자의 발현을 촉진할 수 있는데, 이와 같이 유도성 프로모터를 이용하여 유전자를 발현시키는 경우에는 값비싼 유도성 물질이 이용되어야만 하며, 경우에 따라 유도성 물질은 인체 또는 특정 숙주세포에 독성을 일으키는 문제가 있다. 또한, 유도성 물질을 투입하는 시간 및 배지내 유도성 물질의 농도 등 배양 과정 중에 고려하여야 할 사항이 많다는 단점이 있다. 이와는 대조적으로 "구성성 프로모터(constitutive promoter)"는 어떠한 특정 조건 없이, 즉 유도성 물질 없이 그의 조절 하에 놓인 유전자의 전사를 촉진할 수 있다. 따라서 유도성 물질의 이용에 따른 문제점을 극복할 수 있다.

한편, TEF 유전자의 발현양을 분석함으로써 본 발명에 따른 TEF 유전자의 프로모터가 이의 조절 하에 위치한 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 예측할 수 있다. 한 양태로서, TEF 유전자의 mRNA에 대한 정량 분석방법을 통하여 확인할 수 있는데, 상기 정량 분석방법은 당업계에 공지된 바에 따라 수행될 수 있다. 예 를 들면 RT-PCR, 노던 블롯 하이브리디제이션법, 도트 블롯하이브리디제이션법, DNA 어레이를 이용한하이브리디제이션법, DNA 마이크로비즈법 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 한 양태로서, 피키아 파스토리스를 배양하고 이의 배양물로부터 전체 mRNA를 분리한 후 이를 주형으로 해서 TEF 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행해서 cDNA를 합성한 다음 노던 블롯 분석하여 TEF 유전자의 발현양을 확인할 수 있다(실시예 2 참조).

더 나아가, 본 발명에 따른 TEF 유전자의 프로모터는 서열번호: 6과 적어도 70% 동일하기 때문에 다수의 염기서열로 존재할 수 있다. 따라서, 이들이 이종 단백질의 발현을 실질적으로 강력하게 유도할 수 있는지를 확인할 필요가 있다. 한 양태로서, 리포터 유전자를 TEF 유전자의 프로모터의 조절을받게 하여 발현시킨 후 상기 리포터 유전자의 발현양을 측정함으로써 확인할 수 있다. 이 때, 상기 리포터 유전자로는 lacZ(β-갈락토시다제), cat(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제), uidA(β-글루쿠로니다제), dhfr(디하이드로폴레이트 환원효소), neo(네오마이신 포스포트랜스퍼라제), aphIV(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제) 또는 lux(루시퍼라제)가 이용될 수 있다. 본 발명에서는 셀룰로오스 바인딩 도메인과 바실러스 스테레오썸머필러스 유래의 리파제가 연결된 융합 단백질(Ahn et al. Journal of Microbial. Biotechnol. 2003, vol.13, p.451)을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 융합 단백질은 셀룰로오스 바인딩 도메인에 의해 분비 효율이 증가함에 따라 분비된 리파제의 활성을 측정하는 것만으로 용이하게 단백질의 발현양을 정확히 측정할 수 있을 뿐만 아니라 세포에 독성을 일으키지도 않기 때문이다(실시예 3 참조).

리포터 유전자에 의해 발현된 단백질의 정성 및 정량 분석 또한 당업계에 알려진 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 리포터 유전자의 종류에 따라 다르지만, 해당 리포터 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합될 수 있는 항체를 사용하여 실시할 수 있다. 해당 항체로는 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체를 모두 포함하며 공지 기술에 의해 수식된 항체 또는 항체의 유도체, 예를 들면 Fab 단편, 단일 사슬 항체를 포함한다. 상기 항원-항체 반응을 통하여 분석물을 동정 및 정량하는 경우에는 응집 분석(agglutination assay), 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 웨스턴블롯, 형광면역분석법(FLA) 및 면역침강법 방사면역분석법(RIA), 효소면역검사법(EIA) 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 TEF 유전자의 프로모터는 앞서 주지된 바와 같이 유도성 물질 없이도 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자를 강력하게 발현시키므로 이종 단백질을 제조하는데 유용하게 이용될 수 있다.

이종 단백질을 제조하기 위해서는 TEF 유전자의 프로모터와 이에 작동가능하게 연결된 이종 단백질의 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터의 제조가 선행되어야 한다. 이러한 재조합 발현 벡터가 본 발명의 한 측면을 구성한다. 상기 재조합 발현 벡터는 공지되거나 상업적으로 입수 가능한 벡터를 이용하여 제조될 수 있는데, 이를 위하여 상기 벡터에 본래 포함된 프로모터와 본 발명에 따른 TEF 유전자의 프로모터를 치환하여 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 TEF 유전자의 프로모터와 벡터에 통상적으로 함유되는 조절 서열을 포함하도록 조합하여 제조할 수도 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 "벡터"는 이종 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 숙주세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주세포 내로 유입될 수 있어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여야 한다.

본 발명의 명세서에서 용어 "재조합 발현 벡터"는 일반적으로 이종 단백질이 숙주세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동가능하게 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 의미한다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어야만 한다. 바람직하게는 조절 서열, 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 벡터 내에 포함되게 된다.

본 발명의 명세서에서 "조절 서열"은 이종 단백질의 발현에 필수적이거나 이로운 핵산 서열들을 의미한다. 그러한 조절 서열에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 분비 서열, 업스트림(upstream) 활성화 서열 또는 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 서열, 프로펩타이드(propeptide) 서열 및 전사 종결인자 등을 포함한다. 본 발명에서 조절 서열은 최소한 프로모터를, 바람직하게는 프로모터와 분비 서열을 포함할 수 있다. 여타의 조절 서열들은 이종 단백질의 발현양을 더욱 증가시키기 위해서 선택적으로 포함될 수 있다.

상기 조절 서열 중 "분비 서열"은 발현된 단백질을 세포막 밖으로 수송되도록 유도하는 아미노산 서열로서, 이종 단백질의 분리 및 정제를 용이하게 하기 위 하여 사용되는 조절 서열이다. 일반적으로 세포막 밖으로 수송되는 표면 단백질 또는 분비 단백질은 세포막에서 시그날 펩티다제(signal peptidase)에 의해 절단되는 N-말단 서열을 가지고 있다. 본 발명에서는 분비 서열로서 이에 제한되는 것은 아니지만, 알파-인자 분비 서열(α-signal sequence), 킬러 톡신 리더 분비 서열(killer toxin leader signal sequence), 인버타제 분비 서열(invertase signal sequence), 알파-아밀라아제 분비 서열(α-amylase signal sequence) 등이 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 프로모터를 포함한 상기 조절 서열에 이종 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어야 숙주세포에서 발현될 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"이란 핵산 서열이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치된 상태를 의미한다. 예를 들면, 분비 서열이 성숙한 단백질의 분비에 참여함으로써 기능을 발휘했다면 그 단백질에 작동가능하게 연결된 것이다. 프로모터가 코딩 서열의 전사를 조절했다면 그 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 리보좀 결합 자리가 코딩 서열의 해독이 가능한 위치에 놓여져 있다면 그 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 분비 리더의 경우에는 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 접촉할 필요가 없다.

상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포는 본 발명의 다른 측면을 이룬다. 상기 숙주세포는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르 다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포 및 조직 배양된 인간 세포 및 식물 세포 등이 포함된다. 상기 숙주세포는 본 발명에 따른 TEF 유전자의 프로모터와 동일한 기원을 갖는 피키아 파스토리스가 바람직하다.

상기된 형질전환 또는 형질감염은 Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, 1986과 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있다. 바람직한 예로는 형질도입(transduction), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection),스크래프 로딩(scrape loading) 및 감염(infection) 등을 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 형질감염 또는 형질전환된 숙주세포를 배양하여 이종 단백질이 발현되도록 하는 단계 및 상기 발현된 이종 단백질을 분리하는 단계를 포함한 이종 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 숙주세포는 공지된 기술을 이용해서 이종 단백질의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포들은 적절한 배지와 목적 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에, 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 혹은 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양배지에서 진행한다. 적합한 배지는 상업적인 공급자로부터 입수 가능 하고, 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그 등에 기재된 성분 및 이들의 조성 비율에 따라 만들 수도 있다. 본 발명의 숙주세포는 회분식 또는 유가식 배양으로 배양될 수 있다.

"회분식 배양"은 모든 영양소가 발효 초기에 첨가되는 배양 방식 중의 하나를 의미한다. 회분식 배양에서 숙주세포는 배지 내의 필수 영양소 중 하나가 고갈될 때까지, 또는 발효에 더 이상 바람직하지 않은 조건(예, pH가 미생물 성장을 저해하는 값으로 감소되는 경우)이 형성될 때까지 증식할 수 있다.

"유가식 배양"은 하나 이상의 영양소를 발효 개시 직후 또는 배양물이 어떤 단계에 도달한 후에, 또는 공급된 영양소가 배양물로부터 고갈되는 경우, 배양물에 연속적으로 공급하는 방식의 배양을 의미한다. 유가식 배양에서는 예컨대 pH 조절을 이용하여 바람직한 성장 조건을 유지하도록 일반적으로 기준을 정하고, 필수 영양소를 배양물에 공급하여 1종 이상의 필수 영양소의 고갈을 방지한다. 영양소 공급 속도에 의해 결정되는 성장 속도로 효모 숙주세포는 계속 증식할 것이다. 일반적으로 단일 영양소, 탄소원이 성장의 제한인자가 된다. 다른 종류의 영양소 제한을 이용할 수도 있는데, 예를 들면 질소원에 의한 제한, 산소에 의한 제한, 비타민 또는 아미노산과 같은 특정 영양소에 의한 제한(미생물이 그 화합물에 대한 영양 요구성인 경우), 황에 의한 제한 및 인에 의한 제한 등이 있다.

이러한 배양물로부터 이종 단백질은 당업계에 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어서, 이종 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발, 또는 침전을 포함하는 전통적인 방법에 의해서 배양물 로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 이종 단백질은 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해도(예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

<실시예 1>

피키아 파스토리스 유래의 TEF 유전자 제조

도 1에 나타낸 바와 같이 사카로미세스 세레비시애, 칸디다 알비칸스, 스키조사라로마이세스 세레비시애의 해독신장인자의 공지된 염기서열(사카로미세스 세레비시애 TEF 유전자, Genebank No. AAB68129; 칸디다 알비칸스 TEF 유전자, Genebank No. EAK98693; 스키조사카로미메스 세레비시애 TEF 유전자, Genebank No. BAA11569)을 근거로 하여 피키아 파스토리스 유래의 TEF 유전자를 클로닝하기 위하 여 디제너레이션 합성(degenerated synthesized) 프라이머(서열번호: 1 및 2)를 (주) 제노텍으로부터 제조하였다.

피키아 파스토리스 GS115의 게놈 유전자를 주형으로 하고, 상기 디제너레이션 합성 프라이머를 이용한 PCR을 통해서 780bp의 DNA 단편을 수득하였다. 이 단편을 pSTBlue-1 벡터(Novagen)에 삽입시켰고 이렇게 형성된 재조합 벡터는 pST1으로 명명하였다. 이어서, 염기서열을 분석한 결과 피키아 아노몰라(Pichia anomola)의 TEF1-α 유전자와 92% 상동성을 보였다. 이는 상기에서 얻은 780bp의 유전자가 피키아 파스토리스의 TEF 유전자의 일부분임을 보여주는 것이다.

상기에서 얻은 780bp의 DNA 단편을 탐침자로 하여 TEF1-α의 오픈리딩프레임과 프로모터의 염기서열을 얻기 위하여 역방향 PCR(Inverse PCR)을 수행하였다. 역방향 PCR을 수행하기 위해 합성 프라이머(서열번호: 3 및 4)를 제조하였으며, 역방향 PCR의 주형으로는 여러 종류의 제한효소로 절단된 피키아 파스토리스 게놈 유전자를 사용하였다. 역방향 PCR을 수행한 결과 젤 상에서 제한효소 EcoRI으로 절단한 게놈 유전자에서 확인되었다. 이렇게 얻어진 유전자를 pSTBlue-1 벡터에 클로닝하였고, 이렇게 형성된 재조합 벡터는 pST2로 명명하였다. 염기서열 분석 결과 TEF1-α 유전자의 오픈리딩프레임(서열번호: 5)을 얻을 수 있었고, TEF1-α의 오픈리딩프레임 앞부분 즉, 프로모터 부분(서열번호: 6)을 얻을 수 있었다. 상기와 같이 얻어진 프로모터를 PTEF라 명명하였다.

<실시예 2>

회분식 배양에서 TEF 유전자의 노던 블롯 분석

전사에 의해 유전자로부터 mRNA가 합성되므로 mRNA의 농도를 알게 되면 유전자의 발현율을 간접적으로 예측할 수 있다. 따라서 실시예 1로부터 확인된 TEF 유전자를 탐침자로 하여 균체의 성장기에 따라 TEF 유전자에 해당하는 mRNA 양이 많은지 적은지 노던 블롯 분석을 통하여 확인하였다. 구체적으로 피키아 파스토리스를 4% 글리세롤, 1% 효모 추출액, 2% 펩톤을 함유한 배지를 이용하여 30℃, pH 6.0에서 회분식 배양하였다(도 2a 참조). 배양 중 지정된 시간마다 샘플을 취하였으며, 샘플당 전체 RNA 농도를 1.25㎍/㎖로 동일하게 조정한 후 전기영동을 수행하였다. 여기서 탐침자로는 DIG로 표지된 서열번호: 5의 TEF 유전자를 이용하였다.

TEF 유전자의 노던 블롯 분석 결과는 도 2b에 나타내었다. 분석결과, TEF는 균체의 지수기 성장기에서는 모두 높은 발현율을 보였고, 균체의 성장 정지기에서는 낮은 발현율을 보였다. 이러한 결과는 TEF 유전자가 유도성 물질 없이 균체의 성장과 더불어 강력하게 발현됨을 보여주며, 또한 TEF 유래의 프로모터는 구성성 프로모터로서 사용할 수 있음을 보여준다.

<실시예 3>

TEF 프로모터를 이용한 재조합 발현 벡터 제조

앞서 클로닝된 TEF 프로모터의 활성을 확인하기 위하여 리포터 유전자(reporter gene)로서 리파제(Lipase) 효소의 유전자를 이용하였다. 보다 상세하게는 셀룰라아제 결합 도메인을 코딩하는 유전자가 결합된 형태의 리파제 L1F(CBD-L1-Lipase)를 이용하였는데, 이는 리파제 L1을 보다 안정적으로 발현할 수 있기 때문이다(Ahn et al. Journal of Microbial. Biotechnol. 2003, vol. 13, p.451). TEF 프로모터를 이용하여 리파제 유전자의 발현벡터를 제조하기 위해 pPIC9 벡터(Invitrogen, 미국)를 사용하였다.

도 3에 TEF 프로모터 조절하에 리포터 유전자인 리파제가 포함된 재조합 발현 벡터를 나타내었다. 우선, 신호서열인 α-아밀라제 및 리파제를 포함하는 유전자는 pYEGA-AM-CLLip(Ahn et al. Journal of Microbial. Biotechnol. 2003, vol.13, p.451)을 주형으로 하여, 서열번호: 7 및 서열번호: 8을 갖는 합성 프라이머(각각 제한효소 EcoRI 및 NotI 절단부위를 포함)를 이용한 PCR을 통해서 얻었다. 또한, 서열번호: 9 및 서열번호: 10을 갖는 합성 프라이머(각각 제한효소 BglII 및 EcoRI 절단부위를 포함)를 이용한 PCR을 통하여 TEF 프로모터 부분을 얻었다. 이렇게 얻어진 리파제 유전자는 EcoRI과 NotI으로 절단하였으며, PTEF 프로모터는 BglII과 EcoRI으로 절단하였다. 이렇게 절단된 리파제 유전자와 TEF 프로모터를 부분적으로 BglII와 NotI으로 절단된 pPIC9벡터에 연결시겼다. 그 결과 얻은 TEF 프로모터를 사용하고, 분비서열로 α-아밀라제를 사용하여 리파제를 세포밖으로 분비시키는 재조합 발현 벡터를 "pTEF-AM-CLLip"이라 명명하였다.

TEF 프로모터의 강도를 비교하기 위한 대조군으로 공지된 GAP 프로모터를 사 용하였다. 공지된 피키아 파스토리스 유래의 GAP 프로모터의 유전자에 근거하여, 피키아 파스토리스의 게놈을 주형으로 하여 서열번호: 11과 서열번호: 12를 갖는 합성 프라이머(각각 제한효소 BglII 및 EcoRI 절단부위를 포함)를 이용하여 PCR 실시해서 GAP 프로모터를 클로닝하였다. 이렇게 얻어진 GAP 프로모터를 제한효소 BglII와 EcoRI으로 절단하였다. 이렇게 절단된 GAP 프로모터와 상기에서 EcoRI과 NotI으로 절단된 리파제 유전자를 부분적으로 BglII와 NotI으로 절단된 pPIC9벡터에 연결시켰다. 그 결과 얻은 GAP 프로모터를 사용하고, 분비서열로 α-아밀라제를 사용하여 리파제를 세포 밖으로 분비시키는 재조합 발현벡터를 "pGAP-AM-CLLip"이라 명명하였다(도 4 참조).

<실시예 4>

피키아 파스토리스의 형질전환

실시예 3에서 제조한 pTEF-AM-CLLip과pGAP-AM-CLLip로 각각 피키아 파스토리스 GS115를 형질전환시켰다. 형질전환은 리튬/TE 방법을 사용하였다(Hill et al. Nucl. Acids. Res. 1991, vol.19, p.5791). 피키아 파스토리스 GS115의 게놈상 his4 부분에 pTEF-AM-CLLip과 pGAP-AM-CLLip을 각각 삽입시키기 위하여, StuI으로 절단된 상기 발현 벡터들을 리튬/TE 방법에 의해 피키아 파스토리스에 각각 형질전환시켰다. 보다 자세하게는 StuI으로 절단한 발현 벡터와 캐리어 유전자(carrier DNA), PEG/LiAc들을 혼합하여 30℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후에 DMSO를 첨가 하여 42℃에서 15분간 반응하였다. 반응이 끝난 후, 원심분리하여 침전시킨 뒤 200㎕의 TE 용액에 현탁하였고, 이 현탁액을 His(-) 평판배지(포도당 2%, 효모질소원 0.67%, 히스티딘을 제외한 아미노산 혼합물0.077%, 아가2%)에 도말하여 2-3일간 배양하였다.

상기에서 얻은 형질전환체 중에서 재조합 발현 벡터 pTEF-AM-CLLip와 pGAP-AM-CLLip이 게놈상에 single copy로 삽입된 형질전환체를 각각 선정하여 리파제의 발현을 통한 TEF와 GAP 프로모터 강도를 비교분석하였다.

<실시예 5>

회분식 배양에서의 TEF와 GAP 프로모터 강도 비교

실시예 4에서 제조된pTEF-AM-CLLip로 형질전환된 피키아 파스토리스와 pGAP-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스를 회분식 배양하고 배양 중에 생산된 리파제의 발현양을 통하여 TEF와 GAP 프로모터의 강도를 비교하였다.

보다 상세하게는 상기 형질전환체들을 포도당 또는 글리세롤 4%, 효모 추출액 3%, 펩톤 1%를 함유한 배지를 이용하여 회분식 배양을 실시하였으며, 이렇게 형성된 균체를 제거한 배양물에서 리파제의 발현양을 비교하였다.

이 때, 회분식 배양 시간별로 균체의 건조 중량 리파제 활성 및 포도당의 농도를 측정하였다. 각각의 측정방법은 다음과 같이 수행되었다.

(1) 세포 건조량 측정: 배양액을 원심분리하여 세포를 얻은 후 등장액으로 세척하고, 80℃에서 건조하여 함량을 도달하였을 때의 무게를 측정하였다.

(2) 리파제의 정량법: 리파제의 역가는 pH-stat 방법을 사용하여 측정하였다.

(3) 글루코오스의 정량법: 글루코오스의 정량은 글루코오스 분석기를 이용하였다.

(4) 글리세롤의 정량법: 글리세롤의 정량은 글리세롤 분석 키트(Boehringer Mannheim, 독일)를 사용하였다.

도 5a 내지 5d는 형질전환체의 회분식 배양 결과를 도식화한 것이다. 모든 회분식 배양에서 pTEF-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스와 pGAP-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스는 유사한 균체 성장 곡선을 가졌으며, 리파제의 발현양도 거의 유사하였다. 하지만, 리파제의 발현양상은 pTEF-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스의 경우는 균체의 성장곡선과 거의 일치하였으며, 포도당이 고농도로 있을 때에도 작동되었다. 하지만, pGAP-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스의 경우는 지수성장기 후반부부터 발현되거나, 포도당의 농도가 낮을 때 발현되는 양상을 보였다. 이와 같은 결과는 강력한 구성성 프로모터로서 알려진 GAP 프로모터와 더불어 TEF 프로모터가 구성성 프로모터로서 사용될 수 있음을 보여준다. 또한, TEF 프로모터가 GAP 프로모터보다는 포도당의 농도에 상관없이 균체의 성장에 따라 이종 단백질을 발현시키므로 구성성 프로모터로서 더욱 효과적임을 보여준다.

<실시예 6>

유가식 배양에서의 TEF와 GAP 프로모터의 강도 비교

고농도의 균체 배양 중에서 TEF와 GAP 프로모터의 강도를 비교하기 위하여, 상기 실시예 4에서 제조된 pTEF-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스와 pGAP-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스를 유가식 배양하였다.

유가식 배양에 사용된 생산 배지 조성

구분	초기배지(g/ℓ)	공급배지(g/ℓ)
포도당 또는 글리세롤	10	400
카제인 펩톤	40	200
효모 추출액	10	100

먼저, pH 5.5, 온도 30℃ 중 초기배지에서 형질전환된 피키아 파스토리스를 배양하고, 초기 포도당 또는 글리세롤 10g/ℓ가 모두 소비되었을 때 첨가배지를 공급하기 시작하였다. 공급 속도는 배양액 중 포도당 또는 글리세롤의 농도가 1g/ℓ 이하로 유지되고, 균체성장속도가 0.03~0.05/h가 유지되도록 균체 성장에 따라 6㎖/h에서 70㎖/h까지 단계적으로 증가시켰다.

포도당이나 글리세롤을 탄소원으로 사용한 유가식 배양 결과를 표 2에 나타내었다. 모든 유가식 배양에서탄소원을 제한기질로 사용하여, 공급배지를 공급한 후부터는 배지내의 탄소원의 농도 1g/ℓ이하로 유지되게 하였다. 배양결과 pTEF-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스와 pGAP-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스는 유사한 균체 성장을 보였다. 하지만, 리파제의 발현양은 회분식 배양에서와는 다르게 큰 차이를 보였다. 즉, pTEF-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스가 pGAP-AM-CLLip으로 형질전환된 피키아 파스토리스보다 리파제의 발현양이 약 1.5배 이상 높았다(도 6 참조). 이러한 결과는 GAP 프로모터가 구성성 프로모터로서 알려져 있지만, 이종 단백질의 과발현을 위해서는 균체성장속도, 탄소원의 종류, 탄소원의 배양 중에 적절한 농도 등이 고려되어야 하지만(Gyuseop et al. Biochemical Engineering Journal, 1998, vol.1, p.211), TEF 프로모터의 조절 하에서의 리파제의 발현은 균체의 성장과 유사하므로, 리파제의 발현이 균체성장과 더불어 증가한 것으로 사료된다.

사카로마이세스 세레비시애 유래의 TEF 프로모터는 강도가 GAP보다 25%밖에 안된다고 알려져 있는데(Mumberg et al. Gene, 1994, vol.156, p119), 유가식 배양에서는 본 발명에 따른 피키아 파스토리스 유래의 TEF 프로모터는 발현 촉진 강도가 오히려 1.5배 이상 높았다. 결과적으로, 본 발명에 따른 피키아 파스토리스 유래의 TEF 프로모터는 피키아 파스토리스에서 이종 단백질을 생산할 경우에 강력한 구성성 프로모터로서 알려진 GAP 프로모터보다 구성성 프로모터로서 더욱 강력하고, 포도당의 농도에 상관없이 균체의 성장에 따라 이종 단백질이 발현시키므로 사용하기 편리하다는 것을 확인할 수 있었다.

유가식 배양에서의 TEF와 GAP 프로모터의 강도 비교

	포도당		글리세롤
	균체농도 (A600)	리파제활성 (U/㎖)	균체농도 (A600)	리파제활성 (U/㎖)
Pichia pastoris/pTEF-AM-CLLip	397	188	348	280
Pichia pastoris/pGAP-AM-CLLip	393	100	376	201

본 발명에 따른 피키아 파스토리스 유래의 해독신장인자의 프로모터는 당업계에 강력한 구성성 프로모터로 공지된 GAP의 프로모터 보다 또한, 다른 종의 TEF의 프로모터보다 더욱 강력하게 단백질의 발현을 촉진함에 따라 단백질 생산시에 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 프로모터는 구성성 프로모터로서 이의 조절을 받는 유전자를 발현함에 있어서 유도성 물질을 이용하지 않아도 되기 때문에 배양 과정에서 유도성 물질을 이용하는 경우에 발생하는 여러 문제점을 극복할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호: 6에 기재된 핵산 서열과 90% 이상의 동일성을 가진 핵산 서열로 구성된 프로모터.
제 1항에 따른 프로모터 및 이에 작동가능하게 연결된 이종 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 포함된 재조합 발현 벡터.
제 2항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포.
제 3항에 있어서, 효모인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 4항에 있어서, 피키아 파스토리스인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 숙주세포를 배양하여 이종 단백질이 발현되도록 하는 단계 및 배양물로부터 상기 이종 단백질을 분리하는 단계를 포함한 이종 단백질의 제조방법.
서열번호: 5에 기재된 핵산 서열을 갖는 피키아 파스토리스의 TEF 유전자.