KR100646100B1

KR100646100B1 - 미생물 유래의 신규 프로모터의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR100646100B1
Application number: KR1020040098303A
Authority: KR
Inventors: 이홍원; 안정오; 최의성; 정준기; 이은교; 김천석; 홍지연; 이혁원
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2004-11-27
Filing date: 2004-11-27
Publication date: 2006-11-15
Also published as: KR20060059118A

Abstract

본 발명은 (1) 기질 제한 배지에서 미생물을 연속 배양하는 단계, (2) 상기 미생물의 증식이 정상상태에 도달하였을 때 배양물 중 과발현된 유전자를 확인하는 단계 및 (3) 상기 유전자의 프로모터를 확인하는 단계를 포함한 미생물 유래의 신규 프로모터의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 (a) 전술한 스크리닝 방법으로부터 확인된 신규 프로모터 및 목적 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계, (b) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계, (c) 이렇게 형성된 형질전환체 또는 형질감염체를 배양하는 단계 및 (d) 상기 배양물로부터 상기 목적 유전자에 의해 발현된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

기질 제한 배지, 연속 배양, 과발현, 프로모터 스크리닝

Description

미생물 유래의 신규 프로모터의 스크리닝 방법{Method of Screening Novel Promoters from Microorganisms}

도 1은 본 발명에 따른 신규 프로모터의 스크리닝 방법을 간략하게 도식화한 것이다.

도 2는 피키아 파스토리스를 인 제한 조건에서 연속 배양한 과정을 나타낸 것으로 120시간 이후에 인을 첨가하여 인 제한 조건에서 정상상태임을 확인한 것이다(희석속도 : 0.08h^-1).

도 3은 피키아 파스토리스를 칼륨 제한 조건에서 연속 배양한 과정을 나타낸 것이다(희석속도 0.014h^-1).

도 4a는 인 제한 조건에서 배양된 피키아 파스토리스의 배양물에서 분리한 전체 RNA를 전기영동한 결과를 나타낸 것이고, 도 4b는 칼륨 제한 조건에서 배양된 피키아 파스토리스의 배양물에서 분리한 전체 RNA를 전기영동한 결과를 나타낸 것이다(1: 0.14 h^-1, 2:0.08 h^-1,3:0.03 h^-1).

도 5a는 노던 블로팅으로 파이루베이트 디카르복실라제의 mRNA 발현양을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 5b는 노던 블로팅으로 Na⁺/Pi 심포터의 mRNA 발현양 을 확인한 결과를 나타낸 것이다(1: 0.14 h^-1, 2:0.08 h^-1,3:0.03 h^-1).

도 6은 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), 트란스레이션 일롱게이션 팩터1-α(TEF 1) 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 디히드로게나제(GADPH)의 프로모터를 이용한 경우 리포터 유전자의 상대적인 발현양을 나타낸 것이다.

본 발명은 미생물 유래의 신규 프로모터의 스크리닝 방법에 관한 것으로 보다 자세하게는 (1) 기질 제한 배지에서 미생물을 연속 배양하는 단계, (2) 상기 미생물의 증식이 정상상태에 도달하였을 때 배양물 중 과발현된 유전자를 확인하는 단계 및 (3) 상기 유전자의 프로모터를 확인하는 단계를 포함한 미생물 유래의 신규 프로모터의 스크리닝 방법 및 이로부터 확인된 프로모터를 이용한 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

현재까지 재조합 단백질의 생산을 위하여 대장균(Escherichia coli), 바실러스(Bacillus species), 효모(예: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces, Yarrowia lipolytica), 곰팡이(예: Aspergillus nigher) 등과 같은 다양한 미생물들이 숙주 세포로 사용되고 있다.

숙주 세포로서 효모(yeast)는 대장균(E. coli)에 비해 다음과 같은 장점이 있기 때문에 재조합 단백질 생산에 있어서 유용하게 사용되고 있다. 첫 번째로 대 장균과는 달리 효모 세포에서 생산된 단백질은 정확한 접힘(folding)이 이루어지고, 두 번째로 효모는 단백질의 안정성 및 기능에 매우 중요한 당화(glycosylation)를 수행할 수 있으며, 세 번째로 효모는 재조합 단백질을 세포 밖으로 분비 생산이 가능하므로 단백질의 회수 및 정제가 효율적으로 이루어질 수 있다. 또한, 효모는 내독소(endotoxin)를 생산하지 않기 때문에 의약용 단백질 생산시 독소의 위험성을 배제할 수 있다. 특히, 피키아 파스토리스는 균체성장 속도가 다른 효모에 비해 빨라 24 시간이면 최대로 생장하는 장점을 갖고 있다. 이와 같은 특징으로 인하여 효모는 재조합 단백질 생산에 있어 적합한 균주로 인식되고 있다. 따라서 효모를 재조합 단백질 생산을 위한 숙주 세포로 사용하기 위하여 새로운 단백질 발현 시스템의 개발이 필요하게 되었다.

단백질의 합성은 DNA에 암호화된 유전 정보가 RNA로 복사되는 전사(transcription) 과정을 통하여 개시된다. 상기 전사 과정은 유전자의 업스트림에 위치한 프로모터에 RNA 중합효소가 결합함으로써 시작된다. 모든 프로모터의 염기서열은 완전히 동일하지 않지만 공통된 형태를 갖고 있는 있는데 이런 염기서열을 공통염기서열(consensus sequence)이라 한다. 전사개시 부위에는 2개의 짧은 염기서열이 공통염기서열을 형성하고 있는데 그 중 하나인 "TATA box(TATAAT)"는 전사 개시점으로부터 10개의 염기쌍 앞에 위치하고 있으며, 다른 하나인 "TTGACA"는 전사 개시점으로부터 35개의 염기쌍 앞에 중앙점을 갖는 -35서열이다. 대부분 프로모터들은 공통염기서열의 실제 염기서열 및 전사 개시점과의 거리에서 차이가 있다. 이러한 다양성이 특정 프로모터에서 전사가 시작되는 빈도, 즉 프로모터의 강 도(promoter strength)를 결정하는 것으로 인식되고 있다.

이러한 프로모터는 재조합 단백질 생산의 효율성을 결정하는 중요 인자 중의 하나이다. 따라서 다양한 미생물에서 강력하고 특이적인 프로모터들을 검색하는 기술이 개발되고 있다. 최근에는 전통 생리학에 의존하는 시행착오 방식의 연구를 지양하고 미생물 유전자 정보 및 분석 기술을 활용하여 유전자 단위에서의 초고속(high-throughput) 분석을 통해 다양한 형태로 이용될 수 있는 프로모터를 개발하고 있다.

예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)로부터 영양 제한 조건에서의 연속 배양을 통해 전사에 영향을 미치는 유전자 클러스터를 확보하고 이 유전자의 기능을 규명한 연구가 보고된 바 있다(Piper, M. D. et al. J. Biol. Chem. 2002, vol.277, p.281). 또한 일반적 배양 온도(30~37℃)보다 낮은 저온 배양(20℃)시 유도되는 저온 쇼크 단백질(cold shock protein)의 발현 연구로부터 대장균에서의 고효율 단백질 발현 시스템을 개발하기도 하였으며(T. Berberich et al, Molecular Genetics and Genomics. 1997, vol.254, p.275), 세포 성장과 단백질 생산 단계를 분리하여 특별한 발현 유도 없이 독성 단백질 생산이 가능한 퓨사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 유래의 트립신 유사 프로테아제(trypsine-like protease) 프로모터를 개발하기도 하였다(Wei Shao et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, vol.94, p.2243).

대한민국공개특허 제 1997-043050호는 코리네형 글루타메이트 생산균의 유전자를 고수율로 발현시킬 수 있는 프로모터를 검출하기 위해서 코리네형 글루타메이 트 생산균에서 유래된 유전자의 프로모터를 스크리닝 및 분석하는 기능을 가진 재조합 플라스미드 벡터 및 상기 플라스미드 벡터에 코리네형 글루타메이트 생산균에서 유래된 유전자의 프로모터를 삽입하고 형성된 재조합 플라스미드 벡터를 코리네형 글루타메이트 생산균에 형질전환시키고 이 형질전환체와 비형질전환체 간에 그 유전자에 대한 효소 역가의 증가를 검정함을 특징으로 하는 프로모터의 스크리닝 방법을 개시하고 있다.

대한민국공개특허 제 1993-0004464호는 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 프로모터를 동정하기 위하여 스트렙토마이세스에 대한 선별마커, 이.콜라이(E.coli)에 대한 선별마커, 지시 유전자로서 프로모터가 없는 젠타마이신-내성 유전자, 지시 유전자의 상부 스트림에 있는 터미네이터 및 지시 유전자의 상부 스트림에 있는 다중 클로닝 부위를 포함하되 상기 지시 유전자의 5' 암호화 영역에 2개 이상의 TTA 코돈이 존재하는 이.콜라이 및 스트렙토마이세스에서 복제 가능한 프로모터 스크리닝 벡터 및 상기 프로모터 스크리닝 벡터의 지시 유전자 앞에 프로모터를 함유할 수 있는 DNA 단편을 연결시키고 상기 지시 유전자의 발현율을 통해 프로모터 활성을 측정함을 특징으로 하는 프로모터의 스크리닝 방법을 개시하고 있다.

그러나 상기 스크리닝 방법들은 모두 특정 세포에만 적용할 수 있기 때문에 스크리닝될 수 있는 프로모터가 제한적일 뿐만 아니라 각각의 프로모터를 스크리닝하기 위해서 그에 해당하는 벡터를 또한 매번 제조해야 하기 때문에 목적한 프로모터를 검출하는데 번거롭고 시간이 많이 걸리는 등의 문제점을 갖고 있다.

따라서 본 발명은 미생물의 종류에 상관없이 프로모터를 검출할 수 있고 한 세포로부터 동시에 여러 개의 프로모터를 검출할 수 있는 프로모터의 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 한 관점으로 (1) 기질 제한 배지에서 미생물을 연속 배양하는 단계, (2) 상기 미생물의 증식이 정상상태에 도달하였을 때 배양물 중 과발현된 유전자를 확인하는 단계 및 (3) 상기 유전자의 프로모터를 확인하는 단계를 포함한 미생물 유래의 신규 프로모터의 스크리닝 방법을 제공한다.

다른 관점으로 (a) 전술한 스크리닝 방법으로부터 확인된 신규 프로모터와 목적 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계, (b) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계, (c) 이렇게 형성된 형질전환체 또는 형질감염체를 배양하는 단계 및 (4) 상기 배양물로부터 상기 목적 유전자에 의해 발현된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

상기 "기질 제한 배지(또는 기질 제한 조건)"는 임의의 미생물의 생장에 필수적인 기질들 중 적어도 하나 이상의 기질이 미생물의 최소 요구량 이하로 포함된 배지를 의미하는 것으로 이러한 배지에서 미생물의 증식(proliferation)은 제한된다. 미생물의 생장에 필수적인 기질은 미생물마다 차이가 있지만 통상적으로 탄소원, 질소원, 각종 무기질 등이 포함된다. 본 발명에서 이용 가능한 기질 제한 배 지로는 질소원 제한 배지, 산소 제한 배지, 비타민 또는 아미노산과 같은 특정 영양소 제한 배지(특정 미생물이 그 화합물에 대하여 영양 요구성인 경우), 칼륨 제한 배지, 황 제한 배지 및 인 제한 배지 등이 포함된다.

본 발명에서는 한 양태로서 인이 결핍된 배지를 이용할 수 있다. 인은 DNA, RNA, 세포벽 및 인지질 등의 거대 분자는 물론 ATP와 같은 에너지 전달 매개체에 포함되어 있어 세포의 증식에 필수적인 영양물로 알려져 있다. 인 제한 배지 상태에서 미생물은 세포벽 또는 세포막에 있는 인을 DNA 또는 RNA로 이동시킨다.

다른 양태로서 칼륨이 결핍된 배지를 또한 이용할 수 있다. 칼륨은 주로 리보솜에 부착되어 있고 탄수화물의 대사에 관련된 효소의 조효소로 작용하는 한편 나트륨과 같은 양이온을 세포외로 배출하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 칼륨 제한 배지에 놓여진 미생물은 탄소원과 산소의 소비 속도를 증가하면서 대사를 빠르게 진행시킨다.

이상과 같은 인 또는 칼륨 제한 배지는 미생물의 증식은 억제하지만 질소원과 탄소원의 공급에 대하여 제한적이지 않기 때문에 단백질의 합성 대사에는 거의 영향을 미치지 않는다. 따라서 인 또는 칼륨 제한 배지는 본 발명에 따른 스크리닝 방법에 이용하는데 적합하다.

본 발명에 따른 스크리닝의 대상이 되는 "미생물"은 단세포 생물 뿐만 아니라 동물 및 식물에서 분리한 세포를 모두 포함한다. 본 발명에서는 재조합 단백질을 생산하는데 있어서, 상기 단백질을 대량 생산하는데 이용될 수 있는 프로모터를 스크리닝하고자 하는 것이므로 상기 미생물은 재조합 단백질을 제조함에 있어서 통 상적으로 이용되는 숙주 세포가 바람직할 것이다. 상기 숙주 세포의 예에는 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포 및 조직 배양된 인간 세포 및 각종 식물 세포 등이 포함된다. 본 발명에서는 상기 미생물로 효모를 이용하는 것이 바람직하며 피키아 파스토리스를 이용하는 것이 보다 바람직하다.

이러한 미생물은 기질 제한 배지에서 연속 배양하는 것이 적합하다. "연속 배양"은 배양기 내의 세포 농도, 배양액의 부피, 반응기내 기질 농도 등의 조건이 시간에 따라 변하지 않고 일정한 정상상태(steady-state)를 유지하면서 세포를 배양하는 방법을 의미한다. 연속 배양에서 세포의 대사상태는 안정하게 유지되기 때문에 기질 제한 배지에서 과발현되는 유전자를 일관성 있게 스크리닝할 수 있다.

상기 미생물의 "정상 상태"는 미생물의 대사와 증식이 일정하게 유지되는 상태를 의미하는 것으로 생장곡선 상에서 평행한 부분에 해당된다.

본 발명에 있어서, 이렇게 배양된 미생물에 의해 과발현된 유전자는 배양물 중 mRNA 또는 단백질을 정성 및 정량 분석하여 확인할 수 있다.

과발현된 유전자로부터 전사된 mRNA의 정성 및 정량 분석은 당업계에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면 PCR, RT-PCR, 노던 · 하이브리디제이션법, 도트 블롯 · 하이브리디제이션법, DNA 어레이를 사용하는 하이브리디제이션법, DNA 마이크로비즈법 등을 사용할 수 있다. 본 발명은 한 양태로 배양물로부터 전체 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 합성한 다음 cDNA의 양과 염기서열을 분석하여 과발현된 유전자를 확인한다. 추가로 상기 mRNA를 대상으로 상기 cDNA를 탐침자로 이용하는 노던 블로팅을 통하여 과발현된 유전자를 재확인할 수 있다.

과발현된 유전자에 의해 발현된 단백질의 정성 및 정량 분석 또한 당업계에 알려진 방법을 이용할 수 있다. 상기 분석은 해당 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합될 수 있는 항체를 사용하여 실시하는 것이 바람직하다. 해당 항체로는 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체를 모두 포함하며 공지 기술에 의해 수식된 항체 또는 항체의 유도체, 예를 들면 Fab 단편, 단일 사슬 항체를 포함한다. 상기 항원-항체 반응을 통하여 분석물을 동정(identification)하고 정량하는 경우에는 응집 분석(Agglutination assay), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 방사면역분석법(RIA), 효소면역검사법(EIA), 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 형광면역분석법(FLA) 및 면역침강법(Immunoprecipitation) 등을 이용할 수 있다.

한편, "과발현"이란 기질 제한 배지에서 배양되었을 때 발현되는 양이 세포의 생장에 필수적인 모든 기질을 충분한 양 포함하는 배지에서 배양되었을 때 발현되는 양과 비교하였을 때 적어도 1.1배 이상, 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상인 경우에 해당한다.

이상과 같은 과정을 통하여 과발현된 유전자를 확인한 후 이 유전자의 프로모터는 상기 유전자의 염기서열에 대한 데이터베이스를 검색하거나 역방향 PCR(Inverse PCR)을 수행하는 등 당업계에 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 스크리닝 방법은 앞서 확인된 프로모터가 실질적으로 유전자를 과발현시킬 수 있는지 여부를 재확인하기 위하여 단계 (3) 이후에 상기 프로모터를 이용하여 리포터 유전자를 발현시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 단계는 당업계에 공지된 재조합 단백질 제조방법에 준하여 수행할 수 있다.

상기 리포터 유전자로는 lacZ(β-갈락토시다제), uidA(β-글루쿠로니다제), neo(네오마이신 포스포트랜스퍼라제), cat(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제), dhfr(디하이드로폴레이트 환원효소), aphIV(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제) 또는 lux(루시퍼라제)가 이용될 수 있다. 본 발명에서는 셀룰로오스 바인딩 도메인과 바실러스 스테레오썸머필러스 유래의 리파제가 연결된 융합 단백질을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 융합 단백질은 셀룰로오스 바인딩 도메인에 의해 분비 효율이 증가하며 분비된 리파제의 활성을 측정함으로써 단백질의 발현양을 정확히 측정할 수 있을 뿐만 아니라 세포에 독성을 일으키지도 않기 때문이다.

본 발명은 한 양태로 피키아 파스토리스에 대하여 상술한 스크리닝 방법을 실시하여 과발현되는 유전자의 프로모터를 확인하였다. 프로모터에는 3-포스포글리세레이트 키나제, 트란슬레이션 일롱게이션 팩터1-α, 글루코키나제, 티올-특이적 항산화 단백질, 트리오스포스페이트 이소머라제, Na⁺/pi 심포터, 헥소스 트란스포터 또는 파이루베이트 디카르복실라제를 코딩하는 유전자의 프로모터가 포함된다. 기질 제한 배지에서 세포들의 대사 변화는 세포의 종류 및 기원과 상관없이 유사하며, 전술한 단백질들은 모든 세포에 포함되어 있기 때문에 임의의 세포에서 유래된 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터는 모두 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에 따른 스크리닝 방법으로부터 확인된 프로모터는 강력한 발현을 유도할 수 있기 때문에 재조합 단백질 제조방법에 효과적으로 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 다른 관점으로 (a) (i) 기질 제한 배지에서 미생물을 연속 배양하는 단계, (ii) 상기 미생물의 증식이 정상상태에 도달하였을 때 배양물 중 과발현된 유전자를 확인하는 단계 및 (iii) 상기 유전자의 프로모터를 확인하는 단계를 포함한 미생물 유래의 신규 프로모터의 스크리닝 방법으로부터 확인된 프로모터와 목적 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계, (b) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계, (c) 이렇게 형성된 형질전환체 또는 형질감염체를 배양하는 단계 및 (d) 상기 배양물로부터 상기 목적 유전자에 의해 발현된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 명세서에서 "목적 유전자"는 전술한 재조합 단백질 제조방법을 통하여 제조하고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하며 그 종류와 유래에 있어서 특별히 제한적이지 않다.

본 발명의 명세서에서 “재조합 발현 벡터”는 일반적으로 목적 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동가능하게 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 당업계에 주지된 바와 같이 숙주 세포에서 상기 목적 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하 는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어야만 한다.

상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 숙주 세포에는 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포 등이 포함된다. 본 발명에 있어서, 상기 제조방법의 단계 (b)에서 숙주 세포는 단계 (a)의 미생물과 동일한 것이 바람직하다.

추가로 상기 제조방법의 단계 (b)에서는 재조합 발현 벡터를 Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, 1986과 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직한 예로는 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 이환(transvection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 스크래프 로딩(scrape loading), 총알식 도입(ballistic introduction) 및 감염(infection) 등을 포함한다.

상기 제조방법의 단계 (c)에서는 형질전환체 또는 형질감염체들을 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 배양한다. 예를 들어, 세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지 기술을 사용하여 탄소, 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 제조방법에 있어서 단계 (c)의 배양은 단계 (a)-(i)에서의 기질 제한 배지와 동일한 배지에서 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 확인된 신규 프로모터는 기질 제한 배지에서 해당 유전자의 발현을 강력하게 유도할 수 있기 때문이다.

상기 제조방법의 단계 (d)에서는 목적 유전자에 의해 발현된 단백질을 당업계에 공지된 단백질 분리방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 영양 배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

인(P) 제한 조건에서의 연속 배양

인 제한 조건에서 피키아 파스토리스의 과발현 유전자를 스크리닝하기 위하여 인이 제한된 배지(표 1 참조)를 사용하여 0.03h^-1, 0.08h^-1, 0.14h^-1의 다양한 희석속도(D)로 연속 배양을 수행하였다. 모든 배양은 회분식 배양으로 우선 균체를 24시간 증식시킨 후, 인 제한 배지를 전술된 바와 같이 희석속도를 달리하여 공급하였다. 희석속도가 0.03h^-1일 때는 배양시작 후 120시간 이후부터 균체농도(OD₆₀₀)와 잔여포도당(g/L) 농도가 각각 80과 45로 일정하게 약 100여 시간 유지되었고, 이와 같은 인 제한 조건에서 정상상태가 유지되고 있음을 알 수가 있었다. 희석속도가 0.08h^-1일 때는 50시간 이후부터 정상상태에 도달하였으며, 균체농도(OD₆₀₀)와 잔여포도당(g/L) 농도는 50과 10으로 유지되었다(도 2 참조). 희석속도가 0.14h^-1일 때는 36시간 이후부터 정상상태에 도달하였으며, 균체농도(OD₆₀₀)와 잔여포도당 (g/L)농도는 22와 35로 일정하게 유지되었다.

상기 조건이 인 제한 조건에서 이루어진 정상상태임을 확인하기 위하여 정상상태에 도달하였을 때 무기인을 첨가하여 균체성장 및 잔여포도당의 농도변화를 관찰하였다(도 2). 배양 12시간째에 배양액에 KH₂PO₄를 0.2g 첨가한 후 2시간 간격으 로 균체성장과 포도당의 농도를 측정한 결과, 시간당 균체성장은 흡광도를 기준으로 2 씩 증가함을 보였고, 이 때 포도당 농도는 2g/L가 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 본 배양실험이 인 제한 조건하에서 정상상태에 도달한 것을 확인할 수 있었다. 배양이 완전하게 정상상태에 도달한 후, 배양물을 채취하여 균체로부터 과발현된 유전자를 스크리닝하였다.

피키아 파스토리스의 배양을 위한 배지 조성

성분	농도(g/L)
성분	전배양	본배양	인 제한 배지	칼륨 제한 배지
포도당	20	30	80~120	80~150
MgSO₄	-	1	1	1
효모 추출물	10	10	10	2~5
(NH₄)₂SO₄	-	10	10	10
KCl	-	1	1	-
Na₂HPO₄	-	-	-	2
박토펩톤	20	-	-	-
L-히스티딘	-	1	1	2

<실시예 2>

칼륨(K) 제한 조건에서의 연속 배양

칼륨 제한 조건에서 피키아 파스토리스의 과발현 유전자를 스크리닝하기 위하여 칼륨이 제한된 배지(표 1 참조)를 사용하여 0.03h^-1, 0.08h^-1, 0.14h^-1의 다양한 희석속도로 연속 배양을 수행하였다. 모든 배양은 회분식 배양으로 우선 균체를 증식시킨 후, 전술된 바와 같이 희석속도를 달리하여 칼륨 제한배지를 공급하였다. 희석속도가 0.03h^-1일 때는 배양시작 후 120시간 이후부터 균체농도(OD₆₀₀)와 잔여포도당(g/L) 농도가 80과 45로 일정하게 약 100시간 정도 유지되었고, 이와 같은 칼륨 제한조건에서 정상상태가 유지되고 있음을 알 수 있었다. 또한, 희석속도가 0.08h^-1일 때는 40시간 이후부터 균체농도(OD₆₀₀)와 잔여포도당(g/L) 농도가 각각 55와 20으로 일정한 정상상태를 유지하였다. 희석속도 0.14h^-1일 때는 48시간 이후부터 균체농도(OD₆₀₀)와 잔여포도당(g/L) 농도가 각각 30과 30으로 일정한 정상상태를 유지하였다(도 3). 배양이 완전하게 정상상태에 도달한 후 샘플링하여 균체로부터 과발현된 유전자를 스크리닝하였다.

<실시예 3>

배양물로부터 전체 RNA 및 mRNA의 분리

전술한 기질 제한 조건에서 얻어진 피키아 파스토리스의 배양물로부터 전체 RNA를 분리하였다. 원심분리(12,000rpm)를 이용하여 균체를 회수한 후 RNase가 없는 증류수로 균체를 세척하였고, 400㎕의 AE 완충액(sodium acetate 50mM, EDTA 10mM, pH 5.3)으로 현탁하였다. 이렇게 현탁된 균체액에 40㎕의 10% SDS(sodium dodecyl sulfate)와 AE 완충액으로 포화된 페놀(phenol) 440㎕를 혼합하여 5분 동 안 강하게 현탁한 후 65℃에서 4분간 방치하였다. 이 현탁액을 액체 질소에서 급냉한 후, 12,000rpm에서 10분간 윈심분리하여 상등액을 분리하였다. 상등액에 440㎕의 페놀/클로로포름(chloroform)/이소아밀알코올(isoamylalcohol)(25 : 24 : 1)을 첨가하여 5분간 현탁하였고 다시 12,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 분리하였다. 이 상등액 1/10 부피의 3M 아세테이트 완충액(pH 5.2)과 2.5배 부피의 95%에탄올을 첨가한 후 4℃에서 25분간 원심분리하여 RNA 침전물을 얻을 수 있었다. RNA 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 건조한 후 50㎕의 DEPC(Diethyl Pyrocaroborate)로 처리된 증류수로 현탁하여 정제된 전체 RNA를 얻을 수 있었다.

이상과 같이 실시예 1 및 실시예 2에서 수행된 연속 배양을 통하여 얻어진 균체로부터 전체 RNA를 분리해서 아가로오스 겔(formaldehyde gel)에 전기영동한 결과 70S와 80S 리보솜에 해당하는 밴드를 확인할 수 있었다(도 4a 및 4b).

위에서 분리한 전체 RNA로부터 mRNA를 Qiagen Oligotex Kit(미국)를 사용하여 분리하였다. RNA 용액(전체 RNA농도 0.25mg이하) 100℃와 RNase가 없는 증류수 250℃, 반응용액 OBB 250℃, Oligotex 현탁액 5℃를 섞은 후, 70℃ 히팅 블록(heating block)에서 3분간 반응시켰다. 그 다음 20~30℃에서 10분간 방치한 후, 13,000rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 얻어진 침전물(Oligotex:mRNA 복합체)에 400℃의 완충액 OW2를 넣어 현탁한 후, 용액을 스핀컬럼(spin column)에 채웠다. mRNA복합체는 스핀컬럼에 흡착되고 불순물은 원심분리를 이용하여 제거하였다. 스핀컬럼에 흡착된 mRNA는 20℃(70℃)의 완충액 OEB를 넣어 회수하였다.

<실시예 4>

기질 제한 조건에서 과발현된 유전자의 확인

A. 전체 mRNA의 농도 측정

인 제한 조건하에서 배양물로부터 희석속도에 따른 전체 RNA를 분리한 후 농도를 측정한 결과, 희석속도가 0.03h^-1 일 때 1.25㎍/mL이었다. 희석속도가 0.08h^-1 일 때 전체 RNA 농도는 1.94㎍/mL이었으며, 희석속도가 0.14h^-1 일 때 얻은 전체 RNA 농도는 3.02㎍/mL이었다. 한편, 칼륨 제한 조건하에서 배양물로부터 각각의 희석속도에 따른 전체 RNA를 분리한 후 농도를 측정한 결과, 희석속도가 0.03h^-1 일 때 1.45㎍/mL이었다. 희석속도가 0.08h^-1 일 때의 전체 RNA 농도는 1.78㎍/mL이었으며, 희석속도가 0.14h^-1 일 때는 전체 RNA 농도는 2.98㎍/mL이었다. 결과적으로, 희석속도가 빠를수록 전체 RNA 농도가 높아짐을 확인할 수 있었다.

B. cDNA 합성 및 cDNA 라이브러리의 제조

cDNA 합성은 Smart cDNA 라이브러리 합성 키트(Clonetech, 미국)를 사용하였다. 첫번째 가닥(first strand) cDNA를 합성하기 위하여 3㎕ mRNA에 CDS Ⅲ/3' PCR Primer 1㎕ 및 SMART IV Oligonucleotide 1㎕를 첨가하고 72℃에서 2 분간 반응시킨 후, 얼음에서 2 분간 방치하였다. 이 용액에 5 X First Strand Buffer 2 ㎕, dNTP Mix(10mM) 2㎕, PowerScript Reverse Transcriptase 1㎕을 첨가한 후 42℃에서 1 시간 동안 반응하였다. 그 다음 가성소다를 첨가하고 68℃에서 30분간 반응하여 첫번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 두번째 가닥 cDNA를 합성하기 위하여 앞서 합성된 첫번째 가닥 cDNA에 3차 증류수 71㎕, 50X dNTP Mix 2㎕, 5' PCR 프라이머 2㎕, 10X Advantage 2 PCR 완충액 10㎕, 50X dNTP Mix 2㎕, CDS Ⅲ/3' PCR Primer 2㎕, 50X Advantage 2 Polymerase Mix 2㎕를 첨가한 후 GeneAmp 480방법으로 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하였다. 상기 PCR은 72℃에서 10 분간 반응시킨 후 95℃에서 15초간, 68℃에서 8분간의 반응을 15회를 반복 수행하여 이중 가닥(double strand) cDNA를 합성하였다. 그 다음 프로테인아제 K(Proteinase K)를 처리하여 사용된 폴리머라제의 활성을 억제하였으며, 제한효소 SfiI을 사용해서 합성된 cDNA를 절단하여 pYGSF 벡터에 삽입하였다. 이렇게 형성된 pYGSF 벡터로 대장균 E.coli DH5α에 형질전환하여 cDNA 라이브러리를 완성하였다.

C. 기질 제한 조건에서 발현율이 높은 유전자의 확인

상기 형질전환된 대장균 E.coli DH5α로부터 플라스미드를 분리하여 제한효소 SfiI으로 절단하였다. 기질 제한 조건에서 각 희석속도에 따라 합성된 cDNA 라이브러리를 젤 상에서 확인해 본 결과 다양한 유전자가 합성됨을 확인할 수 있었다. 염기서열 분석결과를 볼 때, 영양 제한 조건과 희석 속도에 따라 과발현되는 유전자의 종류가 다양하며 희석속도가 증가함에 따라 발현율이 높은 유전자의 종류도 다양함을 확인할 수 있었다. 합성된 유전자 중 발현율이 높다고 판단되는 8가 지 유전자를 선별하였고 이를 표 2에 정리하였다.

이중 다른 균주로부터 유래한 3-포스포글리세레이트 키나제(3-phosphoglycerate kinase, PGK), 트란슬레이션 일롱게이션 팩터1-α(translation elongation factor1-α, TEF1-α) 유전자는 발현율이 높은 유전자로 알려져 있다.

기질 제한 조건에서 과발현된 유전자

유전자	기질 제한 조건
유전자	인	칼륨
3-포스포글리세레이트 키나제 (3-Phosphoglycerate kinase)	++++	+
글루코키나제 (Glucokinase)	++++	++
티올-항산화단백질 (Thiol-specific antioxidant protein)	++
트리오스포스페이트 이소머라제 (Triosephosphate isomerase)	+++++	+
Na⁺/pi 심포터 (probable Na⁺/pi symporter)	+++++
헥소스 트란스포터 (Hexose transporter)	++++	++++
파이루베이트 디카르복시라제 (Pyruvate decarboxylase)	++++++
트란슬레이션 일롱게이션 팩터1-α (Translation elongation factor1-α)	+	+++++

※ + : cDNA합성농도가 높은 정도를 나타낸다.

<실시예 5>

과발현 유전자의 재확인

실시예 4로부터 확인된 인과 칼륨 제한조건에서 얻어진 발현율이 높은 유전 자를 탐침자(probe)로 하여 그 유전자에 해당하는 mRNA 양이 많은지 노던 블로팅을 통하여 재확인하였다. TEF1-α 및 PGK는 발현율이 높은 유전자로 보고되어 있기 때문에 노던 블롯 분석에서 제외하였으며, 기질 제한 조건에서의 전체 RNA 농도를 1.25㎍/mL로 동일하게 맞춘 후 전기영동을 수행하였다. 탐침자로는 앞서 합성한 cDNA 라이브러리를 DIG로 표지한 유전자를 사용하였다.

파이루베이트 디카르복시라제와 Na⁺/Pi 심포터에 대한 노던 블로팅 결과를 각각 도 5a 및 5b에 나타내었다. 파이루베이트 디카르복시라제는 희석속도 0.08h^-1에서 가장 높은 발현율을 보였고 희석속도가 낮은 0.03h^-1에서는 관찰되지 않았다. Na⁺/Pi 심포터는 희석속도에 상관없이 모두 관찰되었으나 낮은 희석속도에서 높은 발현율을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 기질 제한 조건과 희석속도에 따라 특이적으로 발현율이 높은 유전자가 존재하는 것으로 예상할 수 있었다.

<실시예 6>

과발현된 유전자의 프로모터 확인

기질 제한 조건에서 발현율이 높은 유전자를 선정하여 다음과 같이 유전자 클로닝을 수행하였다.

인의 제한 조건에서 발현율이 높은 유전자인 Na⁺/pi 심포터를 클로닝하고, 프로모터를 얻고자 역방향 PCR을 수행하였다. 역방향 PCR을 수행하기 위해 게놈 DNA 를 여러 종류의 제한효소로 절단하였다. 그 다음 NPS-1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 제한효소 KpnI으로 절단한 게놈 DNA에서 해당 DNA 밴드를 확인할 수 있었다. 염기서열 분석을 통하여 Na⁺/pi 심포터 프로모터 부분인 1kb 정도를 얻을 수 있었다.

칼륨 제한 조건에서 발현율이 높은 유전자인 트란슬레이션 일롱게이션 팩터 1-α(translation elongation factor1-α, TEF1-α)를 클로닝하였다. cDNA 라이브러리 합성을 통해 얻어진 780bp의 DNA 단편을 탐침자로 하여 역방향 PCR(Inverse PCR)을 수행하였다. 역방향 PCR을 수행하기 위해 프라이머를 제작하였고 이를 TEF-3이라 명명하였으며, 네스티드 프라이머는 TEF-4라 명명하였다(표 3 참조). 역방향 PCR을 수행하기 위해 게놈 DNA를 여러 종류의 제한효소로 절단하였다. 그 다음 TEF-3 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과 제한효소 EcoR I으로 절단한 게놈 DNA에서 해당 DNA 밴드를 확인할 수 있었다. 역방향 PCR을 통해 얻어진 DNA 단편을 pSTBlue-1 벡터에 클로닝하였다. 염기서열 분석 결과 TEF1-α 유전자의 개방 해독틀을 얻을 수 있었고 TEF1-α의 개방 해독틀의 앞부분 즉, 프로모터 부분인 450bp를 얻을 수 있었다.

또한, 인 제한 조건에서 발현율이 높은 유전자인 3-포스포글리세레이트 키나제(3-phosphoglycerate kinase, PGK)를 클로닝하였다. PGK 유전자 서열은 효모 또 는 곰팡이에서 이미 널리 알려져 있고, 효모나 곰팡이에서 유래한 PGK의 프로모터가 강력하게 작동하여 목적 유전자의 발현율을 증가시킨다는 내용이 보고된 바 있다. 피키아 파스토리스에서 유래한 PGK 유전자의 클로닝을 위하여 유전자은행(Genebank, NCBI, 미국)으로부터 기존에 보고된 바 있는 3-글리세레이트 키나제 유전자를 조사하였다. 피키아 파스토리스 유전자 염기서열 정보를 이용하여 PGK의 프로모터 부분으로 추측되는 1kb의 DNA를 PCR을 통해 얻을 수 있었다. 클로닝된 프로모터 부분을 PGK 프라이머로 염기서열 분석하여 PGK 프로모터임을 확인하였다.

본 발명에서 이용된 프라이머

프라이머이름	염기서열	서열 번호
GAP 10	5' - AAA CAC CAA GAA CTT AGT TTC G - 3'	1
PGK(F)	5' - GCG AGA TCT GCA TCG ATG ATC GGC GGC ATG GCC AAA G -3'	2
PGK(R)	5' - GCG GAA TTC TTT CGT AAT CAA TTG GGC TAT GCT AAG -3'	3
NPS-1(F)	5' - GCA AGA TCT AAT TTC CTC CAC CAG AGA GCC G- 3'	4
NPS-1(R)	5' - GCA GAA TTC TGT GAA TGA TTA TAA GAT GAG TAC - 3'	5
TEF-3(F)	5' - GAT TGA GCC ATC TTC CAA - 3'	6
TEF-3(R)	5' - GAT CTT TGG AGT CTC GAA - 3'	7
TEF-4(F)	5' - CTA TTG ACT CCA TTG AC - 3'	8
TEF-4(R)	5' - CTC TCT CAG CCT TAA GC - 3'	9
Lipase(F)	5' - GCA GAA TTC ATG ATG GTC GCG TGG TGG -3'	10
Lipase(R)	5' - ATA GCG GCC GCA AGC TTT TAA GGC CGC AAA CTC GC -3'	11

<실시예 7>

PGK 프로모터에 의한 리포터 유전자의 발현

본 발명에서 클로닝된 PGK 프로모터의 활성을 확인하기 위하여 리포터 유전자(reporter gene)로서 리파제 효소(L1-Lipase)의 유전자를 이용하였다. 보다 상세하게는 셀룰라아제 결합 도메인을 코딩하는 유전자가 결합된 형태의 리파제 L1(CBD-L1-Lipase)을 사용하였는데, 이는 리파제 L1을 보다 안정적으로 발현할 수 있기 때문이다. PGK 프로모터를 사용하였을 때 리파제 L1 유전자의 발현 강도를 살펴보기 위하여 pPIC9 벡터(Invitrogen, 미국)를 이용하였다. 이 벡터의 프로모터 부분인 AOX1과 신호서열(signal sequence)인 메이팅 팩터-α(Mating factor-α)부분을 제거하고 PGKp와 신호서열인 α-아밀라제(α-amylase) 그리고 리파제 L1(CBD-L1-Lipase)을 넣어 새로운 벡터를 제작하였고, 이 벡터를 pPIC9-PGK-CBD-L1-Lipase라 명명하였다. pPIC9-PGK-CBD-L1-Lipase를 피키아 파스토리스에 형질전환하여 활성을 측정하였고 이를 다른 프로모터와 비교한 결과를 표 4에 나타내었다. 신규 프로모터의 강도를 살펴보기 위한 기준으로 GAPDH 프로모터를 사용하였고 발현 조건은 통상적인 목적 유전자 발현 조건에서 비교하였다.

표 4에 나타낸 바와 같이 PGK 프로모터는 탄소원으로 포도당을 사용하였을 때 14U/ml의 활성을 보였고, 글리세롤을 사용하였을 때는 9.85 U/ml을 보였다. 이 결과는 프로모터 강도를 살펴보기 위해 기준 프로모터로 사용된 GAPDH 프로모터의 5.7%와 16.7%에 해당한다.

<실시예 8>

TEF1-α 프로모터에 의한 리포터의 유전자 발현

TEF1-α 프로모터를 이용하여 리파제 L1(CBD-L1-Lipase) 유전자의 발현벡터를 제작하였다. pPIC9벡터의 프로모터 부분인 AOX1과 신호서열인 메이팅 팩터-α부분을 제거하고 TEF1-α 프로모터와 신호서열인 α-아밀라제 그리고 리파제 L1(CBD-L1-Lipase)을 넣어 새로운 벡터를 제조하였고 이 벡터를 pPIC9-TEF-CBD-L1-Lipase라 명명하였다. pPIC9-TEF- CBD-L1-Lipase를 피키아 파스토리스에 형질전환하여 활성을 측정하였고, 이 결과를 표 4에 나타내었다.

TEF1-α 프로모터는 탄소원으로 포도당을 사용했을 때 66U/ml의 활성을 보여 GAPDH 프로모터의 87.4%의 강도를 보였다. 반면 글리세롤을 사용하였을 때는 165U/ml의 활성을 보여 GAPDH 프로모터보다 높은 115.1%의 강도를 보였다.

이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 본 발명자들이 확인한 신규 프로모터인 PGK 및 TEF1-α 프로모터는 재조합 단백질 생산이 가능한 프로모터이며, 기존에 사용되고 있던 GAPDH 프로모터와 비슷하거나 더 높은 발현율을 보일 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한 기질 제한 조건에서 배양한다면 TEF1-α 및 PGK 프로모터의 특성상 보다 효율적으로 재조합 단백질 생산이 가능할 것이다.

신규 프로모터를 사용한 재조합 리파제의 발현율 비교

프로모터	탄소원	활성(U/ml)	비활성(U/세포)	상대활성(%)
GAPDH	포도당	81	1.03	100
TEF		66	0.9	87.4
PGK		14	0.15	5.7
GAPDH	글리세롤	147	1.39	100
TEF		165	1.60	115.1
PGK		9.85	0.08	16.7

본 발명에 따른 새로운 프로모터 스크리닝 방법을 사용하면 다양한 세포로부터 강력한 신규 프로모터의 스크리닝이 가능해지며 이렇게 수득한 신규 프로모터는 보다 효율적으로 재조합 단백질을 생산하는데 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(1) 인 또는 칼륨이 결핍된 기질 제한 배지에서 피키아 파스토리스를 연속 배양하는 단계; (2) 피키아 파스토리스의 증식이 정상상태에 도달하였을 때 배양물로부터 모든 기질이 풍부한 배지에서 배양된 경우에 비하여 과발현된 유전자를 확인하는 단계 및 (3) 상기 유전자의 프로모터를 확인하는 단계를 포함한 피키아 파스토리스 유래의 신규 프로모터의 스크리닝 방법.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 단계 (2)는 배양물로부터 전체 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 합성한 후 cDNA의 양과 염기서열을 분석하여 과발현된 유전자를 확인하는 것을 특징으로 하는 피키아 파스토리스 유래의 신규 프로모터의 스크리닝 방법.
(a) (i) 인 또는 칼륨이 결핍된 기질 제한 배지에서 피키아 파스토리스를 연속 배양하는 단계, (ii) 피키아 파스토리스의 증식이 정상상태에 도달하였을 때 배양물로부터 모든 기질이 풍부한 배지에서 배양된 경우에 비하여 과발현된 유전자를 확인하는 단계 및 (iii) 상기 유전자의 프로모터를 확인하는 단계를 포함한 피키아 파스토리스 유래의 신규 프로모터의 스크리닝 방법으로부터 수득한 프로모터와 목적 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계; (c) 이로부터 형성된 형질전환체 또는 형질감염체를 배양하는 단계 및 (d) 상기 배양물로부터 상기 목적 유전자에 의해서 발현된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.