KR100751791B1 - 조성물 - Google Patents

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KR100751791B1
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Abstract

(ⅰ) 표면 코팅 물질 ; (ⅱ) 해양 유기체로부터 얻어지거나 얻어질 수 있는 효소 ; 및 (ⅲ) (a) 효소에 대한 기질 ; 및/또는 (b) 전구체 기질에서 전구체 효소의 활동에 의해 효소에 대한 기질이 발생될 수 있도록 선택되는 전구체 효소와 전구체 기질을 포함하는 오염방지 조성에 있어서, 효소와 기질은 기질에서 효소의 활동에 의해 오염방지 조성이 발생될 수 있도록 선택됨을 특징으로 하는 오염방지 조 성이 제공된다.
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오염방지 조성, 코팅, 해양 유기체, 헥소즈 옥시다제, 효소, 기질, 전구체

Description

조성물{Composition}
본 발명은 오염방지(anti-fouling) 조성에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 오염방지 효과를 지닌 화합물을 생산할 수 있는 효소를 포함하는 오염방지 조성에 관한 것이다.
US-A-5071479에 토론된 대로 살생물제(biocide)는 집 페인트의 항진균제, 신선한 물 살조제(algicide)와 바닷물 식물과 동물에 노출된 해양 구조물에 대한 오염방지제와 같은 많은 다른 환경에서 필요하다. 알려진 대로, 곰팡이 또는 진균류는 집 페인트 등에서 성장할 수 있으며 영양분으로 페인트 메디움 또는 어떤 경우에는 영양분으로 나무와 같은 근원적인 기질을 이용한다. 명백한 이유 때문에, 이는 페인트칠된 표면에 손상 및/또는 페인트칠된 표면의 외관에 악화를 줄 수 있다. 살생물제는 페인트에 혼합될 수 있으며 진균류의 균사(mycelia)와 자실체(fruiting bodies)가 페인트 필름에 접촉하거나 통과하면, 필름의 살생물제 와 친밀한 접촉을 통해 진균류는 파괴된다. 신선한 물을 이용하는 냉각탑에서, 곰팡이와 조류는 그들의 성장을 막는 효과적인 화합물이 존재하지 않으면 발달될 수 있다.
US-A-5071479에 토론된 대로 배 선체의 침수된 부분에서 해양 유기체의 성장은 특별한 문제이다. 그러한 성장은 물을 통과시키는 선체의 마찰 저항력을 증가시켜, 증가된 연료 소모 및/또는 배 속도의 감소를 초래한다. 해양 생장물은 빠르게 축적되어 드라이-독(dry-dock)에 필요한 청소와 페인트 다시 칠하기의 보수는 일반적으로 값비싼 것으로 여겨진다. 여러 해를 거쳐 효율 증가와 함께 실행된 대안은 오염방지제가 혼합된 상부 코팅 페인트를 선체에 적용함으로써 오염의 범위를 제한하는 것이다. 오염방지제는 시간의 주기에 따라 선체 표면에서 해양 유기체에 치명적인 농도로 페인트의 표면으로부터 유리되는 살생물제이다. 오염방지 페인트는 페인트 표면에 이용 가능한 살생물제의 농도가 치명적인 농도 아래로 떨어질 때만 실패하며 2년 이상의 유용한 수명의 현대 페인트를 지닌 오염 방지 페인트가 기대된다.
해양 오염 방지에서 특별하게, 극히 광범위하게 사용되는 살생물제는 트리부틸 틴(tributyl tin(TBT))이다. 그러나, 물 속(해양) 응용에 대한 코팅 조성에서 오염 방지 활성 성분으로써 그들의 현재 상업상 레벨에서 그러한 유기 틴 살생물제 이용에 의한 환경적 효과에 대한 성장 중요성이 있다. 특별히 트리부틸틴-타입 화합물의 광범위한 사용에 기인하여, 배 바닥에 대한 페인트에서 20 중량%의 높은 농도에서, 리칭(leaching)에 기인하는 주변 물의 오염은 홍합(mussel)과 조개(shell) 유기체의 분해를 일으키는 그러한 레벨까지 도달한 것으로 나타났다. 이러한 효과는 프랑스-영국 해안선을 따라 관찰되었으며 동일한 효과는 미국과 먼 동해(Far East) 물에서 확인되었다. 제한된 예외로 대부분의 최근 규제 제한 하에서, 25 미터 길이 이상의 오락 보트는 높은 레벨의 트리부틸틴 화합물을 포함하는 오염방지 페인트를 사용하는데 더 이상 허가되지 않는다.
틴의 리칭 속도가 하루에 4 ㎍/㎠ 또는 그 아래로 유지될 수 있는 한, 물 속 생물은 긴 기간에 걸쳐 영향을 받는 것으로 나타나지 않는다고 연구되었다. 그러나, 배 바닥의 페인트칠된 표면으로부터 고도로 발달된 해양 유기체는 물론 해양 조류를 조절하기에 효과적이 되도록, 하루에 약 9 내지 16 ㎍/㎠ 의 틴의 최소 리칭 속도가 필요한 것으로 또한 발견되었다. 보통, 더 높은 리칭 속도는 약 15% 내지 20%의 페인트 무게에서 트리부틸틴 화합물 농도에서 달성된다.
TBT의 효율성 면에서, 오염방지 유기 틴 활성 성분에 대한 만족스러운 대용품이 없는 한, 25 미터 길이 이상의 큰 배는 오염을 최소화하기 위해 그러한 화합물을 여전히 사용하기로 규제 당국은 마지못해 동의했다. 따라서 TBT 기초 화합물에 대한 대체 살생물제를 제공하는 것이 바람직하다.
US-A-4297137은 오염방지 조성의 효과는 오염방지 성분의 방출을 완화함으로써 연장될 수 있음을 개시한다. 이 문서는 바닷물에 비가용성이며 페인트에 분산된 비연속적 고체 매트릭스에 균일하게 혼합된 해양 유기체에 독성인 적어도 하나의 물질을 포함하는 오염방지 페인트를 개시한다. 매트릭스는 억제되는 해양 유기체 및/또는 페인트와 접촉하는 박테리아 필름에 의해 자유로운 효소의 활동 하에서 바닷물에 가용성인 적어도 하나의 물질로부터 적어도 부분적으로 형성된다. 따라서 해양 유기체가 페인트 표면과 결합되면, 독성 물질이 방출되며 유기체는 억제된다. 선행 기술과 동일하게, US-A-4297137에서 관찰되는 독성 물질은 잘 알려진 구리와 TBT와 같은 틴 기초 화합물만을 포함한다.
Abarzua et al., Mar. Ecol. Prog. Ser., Vol. 123:301-312, 1995 "Biotechnological investigation for the prevention of biofouling. I. Biological and biochemical principles for the prevention of biofouling"은 조류와 해양 무척추동물(invertebrate)로부터 항균성, 항조류성(anti-algal), 항원생동물성(anti-protozoan) 및 안티-마크로파울링(anti-macrofouling) 성질을 지닌 생명유지제(biogenic agent)의 추출을 제안한다. 추출된 물질의 구조는 결정되어 합성될 수 있으며 합성된 물질은 생물오염의 방지에 사용될 수 있다고 제안한다. 추출 또는 합성의 방법은 제공되지 않는다.
EP-A-0866103은 항미생물 활성과 이 시스템을 이용하는 코팅 조성을 지닌 화 합물의 조절된 방출 방법을 개시한다. 방법은 효소와 기질의 매트릭스로의 혼합을 포함한다. 기질의 효소 활동은 화합물을 제공한다. 관찰된 실시태양에서 화합물은 다른 효소에 의해 활동될 수 있다. 기질과 효소는 항미생물 활성을 지닌 화합물을 생산한다.
US-A-5747078은 음식 산물에 관한 것이다. 심각한 건강 문제를 일으킬 수 있는 음식의 미생물 오염은 과산화수소의 지속적인 방출을 제공하는 락토퍼옥시다제(lactoperoxidase) 시스템을 포함하는 조성에 의해 억제될 수 있다고 문서는 가리킨다. 과산화수소는 옥시도리덕타제(oxidoreductase)와 산화 가능한 기질을 반응시켜 제조된다. 과산화수소는 락토퍼옥시다제에 의한 촉매작용 하에서 티오시아네이트(thiocyanate)와 반응하여 하이포티오시아네이트(hypothiocyanate)를 생산한다. 하이포티오시아네이트는 항미생물제로 작용한다. 이 문서는 고정 효소 시스템의 배경 기술을 제공한다. 문서는 오염 성질을 나타내는 항오염제 또는 어느 미생물에 관해 침묵한다.
본 발명은 선행 기술의 문제점을 완화시킨다.
본 발명의 관점은 덧붙여진 청구항에 한정된다. 이것들과 다른 바람직한 관점들은 아래 토론된다.
해양 유기체로부터 효소를 이용하는 오염방지 조성의 발생에 대한 통합 시스템은 다음의 안정한 시스템을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
·해양 환경과 같은 거친 환경에서 긴 기간 효율성을 지님.
·주어진 항미생물 효과를 제공하는 선행 기술 시스템보다 기질을 덜 필요로 함. 조류 헥소즈 옥시다제(HOX)와 같은 해양 유기체로부터의 효소는 글루코즈에 대해 낮은 Km 값, 즉 2.7 mM을 갖는다. 이러한 낮은 Km은 효소가 글루코즈에 대해 매우 높은 친화력을 가짐을 의미한다. 대조적으로 비해양 글루코즈 옥시다제(GOX)와 같은 비해양 효소는 글루코즈에 대해 적어도 10배 더 높은 Km 값을 갖는다. 다른 말로는 선행 효소 시스템은 본 발명의 그것보다 글루코즈에 대해 훨씬 더 낮은 친화력을 가진다. 오염방지 응용에서, 높은 글루코즈 친화력을 지닌 효소는 존재하는 모든 글루코즈로 전환할 수 있으므로, 이는 중요한 차이를 줄 것이다. 반면에 낮은 글루코즈 친화력을 지닌 효소는 글루코즈의 리칭을 주위 환경에 허락하는 것이 예상된다. 글루코즈는 유기체를 오염시키는 기질이 되므로 글루코즈의 리칭은 바람직한 오염방지 활성에 반대할 것이다. 따라서 글루코즈의 리칭은 증가된 오염을 나타낼 것이다.
·주어진 항미생물 효과를 제공하는 선행 기술 시스템보다 효소를 덜 필요로 함. 조류 HOX와 같은 해양 유기체로부터의 효소는 또한 GOX와 같은 선행 기술 시스템의 산소에 대한 Km 값보다 더 낮은, 산소에 대해 낮은 Km 값을 갖는다. 이러 한 기질에 대한 높은 친화력은 조류 HOX에 잇점을 준다. 이는 오염방지 응용에서 가장 나쁜 오염이 낮은 물교환 및 조류와 다른 오염 유기체의 높은 성장을 지닌 항구와 같은 "닫힌(closed)" 환경이기 때문이다. 정확히 이러한 장소에서 오염이 가장 나쁘고, 물의 산소 함량은 또한 열린 바다에 비해 가장 낮을 것이다. 따라서 산소에 대한 높은 친화력을 지닌 해양 유기체로부터의 효소는 잇점을 줄 것이다.
·사용 온도에서 향상된 활성을 제공함. 오염방지 페인트와 같은 표면 코팅 조성에서 항미생물(오염방지) 화합물은 전형적으로 15와 30℃ 사이에서 활성이 된다. 오염방지 조성에 대해 이는 오염이 문제를 주는 바닷물 온도이다. 선행 기술 시스템과 대조적으로, 조류 HOX와 같은 해양 유기체로부터의 효소는 오염에 대한 최적 온도에서 정확하게 활성도의 최적 온도를 가지며 따라서 이러한 효소는 오염방지제로써 완전히 적합하다. 최적 온도는 실시예 9에 나타내었다.
·안전하고 쉽게 이용 가능한 기질을 이용함.
·해양 환경에서 더욱 향상된 활성도를 나타내는 향상된 염 내성을 가짐.
·오염 유기체에 의한 분해에 저항성임. 조류 HOX와 같은 해양 유기체로부터의 효소는 현저한 프로테아제 저항 효소이다. 그것은 활성도의 손실 없이 프로나제(pronase)(넓은 스펙트럼 프로테아제 프레퍼레이션)로 처리되어 살아남을 것이다. 효소는 코팅된 표면으로 부착되려는 오염방지 유기체로부터 프로테아제에 의한 분해에 저항성이므로 이 프로테이제 저항성은 오염방지 응용에서 특별히 중요한 것으로 간주된다.
본 명세서에서 용어 "anti-foul(s)", "anti-fouling", "anti-foulants"로 불리는 "foulants"는 본 조성으로 처리된 표면에서 거주 및/또는 성장하는 유기체를 포함한다. 유기체는 박테리아, 진균류, 원생동물과 조류와 같은 미생물 및 조류, 식물과 동물과 같은 유기체를 포함한다. 유기체는 해양 유기체가 될 수 있다.
본 발명의 조성은 전구체 효소와 전구체 기질을 포함하는데, 전구체 효소와 전구체 기질은 전구체 기질에서 전구체 효소의 활동에 의해 본 발명의 효소에 대한 기질을 발생한다. 전구체 효소와 전구체 기질의 결합은 여기서 후에 "기질 발생자(substrate generator)"로 불린다.
본 시스템의 효소는 해양 미생물로부터 얻어지거나 얻어질 수 있다.
바람직하게는 본 시스템의 효소는 해양 조류로부터 얻어지거나 얻어질 수 있다. 바람직하게는 본 시스템의 효소는 콘드루스 크리푸스(Chondrus cripus)로부터 얻어지거나 얻어질 수 있다.
바람직하게는, 오염방지 화합물은 과산화수소이다.
바람직하게는, 효소는 옥시다제이다. 바람직하게는, 효소는 글루코즈 옥시 다제, L 아미노산 옥시다제, D 아미노 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제, 헥소즈 옥시다제, 파이라노즈 옥시다제, 말레이트 옥시다제, 콜레스테롤 옥시다제, 아릴알코올 옥시다제, 알코올 옥시다제, 라토스테롤 옥시다제, 아스파르테이트 옥시다제, 아민 옥시다제, D 글루타메이트 옥시다제, 에탄올아민 옥시다제, NADH 옥시다제, 우레이트 옥시다제(uricase)와 그 혼합물로부터 선택된다. 바람직하게는, 효소는 헥소즈 옥시다제이다.
헥소즈 옥시다제(HOX) 효소
헥소즈 옥시다제(D-hexose: O2-oxidoreductase, EC 1.1.3.5)(HOX로 불림)는 산소 존재 하에서 D-글루코즈와 말토즈, 락토즈와 셀로비오즈를 포함하는 여러 다른 환원당을 대응 락톤으로 산화시켜 각 알도비오닉산(aldobionic acid)으로 가수분해할 수 있는 효소이다. 따라서, 효소가 당 기질의 넓은 범위를 이용할 수 있다는 점에서, HOX는 D-글루코즈만 전환할 수 있는 다른 옥시도리덕타제, 글루코즈 옥시다제와는 다르다. HOX로 촉매되는 산화는 다음과 같이 나타내어 질 수 있다:
D-glucose + O2 → γ-D-gluconolactone + H2O2 , 또는
D-galactose + O2 → γ-D-galactonolactone + H2O2
HOX는 여러 해양 조류 종에 의해 자연적으로 생산된다. 그러한 종은 특히 기가티나세애(Gigartinaceae) 패밀리에서 발견된다. 여기 사용된 대로, 용어 "HOX"는 D-글루코즈, D-갈락토즈, D-만노즈, 말토즈와 셀레비오즈로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기질을 산화시킬 수 있는 효소를 나타낸다.
바람직하게는, 헥소즈 옥시다제는 해양 조류 콘드루스 크리푸스(Chondrus cripus)로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다.
헥소즈 옥시다제의 한 면에서 효소는 EP-A-0832245 개시로 커버된 효소이다.
헥소즈 옥시다제(HOX) 생산
HOX 효소를 엔코드하는 유전자는 해양 조류 콘드루스 크리푸스(Chondrus cripus)로부터 클론되었다(Stougaard and Hansen 1996, Hansen and Stougaard, 1997). 메틸로트로픽(methylotrophic) 이스트 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)(developed at Rhein Biotech, Dusseldorf/Germany as an expression system for heterologous proteins)는 또한 HOX 효소를 생산하기 위해 사용되었다(본래 단백질은 해양 조류로부터 정제되었다(Poulsen and Hostrup, 1998)). WO 96/40935와 WO 98/13478은 또한 HOX 활성도를 지닌 단백질을 엔코드하는 유전자의 재조합 호스트 유기체에서 클로닝과 발현을 개시한다.
바람직한 실시태양에서, 헥소즈 옥시다제 효소는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 변이(variant), 상동(homologue), 유도체(derivative) 또는 단편(fragment)을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 헥소즈 옥시다제 효소는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 헥소즈 옥시다제 효소는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이(variant), 상동(homologue), 유도체(derivative) 또는 단편(fragment)에 의해 엔코드된다. 바람직한 실시태양에서, 헥소즈 옥시다제 효소는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 엔코드된다.
바람직한 실시태양에서, 헥소즈 옥시다제 효소는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이(variant), 상동(homologue), 유도체(derivative) 또는 단편(fragment) 또는 혼성 가능한 서열에 상보적인 서열에 혼성할 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 의해 엔코드된다. 바람직한 실시태양에서, 헥소즈 옥시다제 효소는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 또는 혼성 가능한 서열에 상보적인 서열에 혼성할 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 의해 엔코드된다.
효소, 바람직하게는 헥소즈 옥시다제 효소는 영국 특허 출원 제9927801.2호에 기술된 방법으로 제조될 수 있다.
변이/상동/유도체(아미노산 서열)
본 발명의 바람직한 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타나거나 본 발명의 HOX 효소로부터 얻어질 수 있는 서열이지만 또한 어느 소스 예를 들면 관련 바이러스/박테리아 단백질, 세포질 상동과 합성 펩타이드는 물론, 그의 변이 또는 유도체로부터 얻어진 상동 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명은 여기 나타낸 아미노산 서열의 변이, 상도 또는 유도체는 물론, 그러한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 변이, 상동 또는 유도체를 커버한다.
본 발명의 문맥에서, 상동 서열은 적어도 예를 들면 여기 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 걸친 아미노산 레벨에서 적어도 75, 85, 또는 90% 동일한, 바람직하게는 적어도 95 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 특별히, 상동성은 비필수 이웃 서열보다 효소 활성도에 필수적인 것으로 알려진 서열의 그러한 영역에 대해 전형적으로 고려되어야 한다. 이러한 영역은 SGGH79C, LGGH146I 및 LGGH320A 와 같은 HOX에서 추정 FAD 바인딩 도메인에 제한되지 않은 곳을 포함한다. 상동성은 또한 동일성으로 간주될 수 있지만(예를 들면, 동일한 화학적 성질/기능을 지닌 아미노산 잔기), 본 발명의 문맥에서 그것은 서열 동일성이라는 점에서 상동성으로 표현되는 것이 바람직하다.
상동성 비교는 눈, 또는 더욱 일반적으로는 쉽게 사용 가능한 서열 비교 프로그램으로 수행될 수 있다. 이러한 통상적으로 사용 가능한 컴퓨터 프로그램은 두 개 또는 그 이상 서열 사이의 % 상동성을 계산할 수 있다.
% 상동성은 인접 서열에 대해서 계산될 수 있는데, 예를 들면 한 서열이 다른 서열과 정렬되고 한 서열의 각 아미노산이 다른 서열의 대응 아미노산과 한번에 한 잔기씩 직접 비교된다. 이는 "언갭드(ungapped)" 정렬이라 불린다. 전형적으로, 그러한 언갭드 정렬은 잔기의 비교적 짧은 수에 대해서만 수행된다.
이것은 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 예를 들면 삽입 또는 삭제가 정렬된 다음 아미노산 잔기에 일어나는 동일한 쌍의 서열이 아닌 경우에 전체적인 정렬이 일어날 때 % 상동성에서 큰 감소가 잠재적으로 일어남을 참작하면 실패한다. 따라서, 대부분의 서열 비교 방법은 전체적인 상동성 스코어에 과도하게 페널티를 주지 않고 가능한 삽입과 삭제를 참작하는 최적 정렬을 생산하도록 고안된다. 이는 로컬 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬에 "갭(gaps)"을 삽입함으로써 달성된다.
그러나, 이러한 더욱 복잡한 방법은 정렬에서 나타나는 각 갭에 "갭 페널티" 를 할당하여, 동일한 아미노산의 동일한 수에 대해, 가능한 갭이 없는 서열 정렬은 - 두 개의 비교된 서열 사이에 높은 관련성을 반영하는 - 많은 갭을 지닌 것보다 높은 스코어를 달성할 것이다. "어파인 갭 코스트(Affine gap costs)"는 전형적으로 갭의 존재에 대해 비교적 높은 코스트를 부과하고 갭에서 각 잔기에 대해 더 작은 페널티를 부과하는데 사용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭을 지닌 최적화된 정렬을 생산할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 수정되도록 허락한다. 그러나, 서열 비교에 대해 그러한 소프트웨어를 사용할 때 디폴트(default) 값을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 GCG Wisconsin Bestfit package(아래 참고)를 사용할 때 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티는 갭에 대해 -12 및 각 익스텐션에 대해 -4이다.
따라서 최대 % 상동성의 계산은 갭 페널티를 고려한 최적 정렬의 생산을 필요로 한다. 그러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit package(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387)이다. 서열 비교를 행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST package(Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18 참고), FASTA(Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410)와 비교 도구의 GENEWORKS 슈트를 포함하지만 제한되지 않는다. BLAST와 FASTA 양쪽은 오프라인과 온라인 서칭에 이용 가능하다(Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60 참고). 그러나 GCG Bestfit 프로그램을 이용하는 것이 바람직하다.
최종 % 상동성은 동일성 면에서 측정될 수 있지만, 정렬 과정 그 자체는 전형적으로 올-오어-낫딩(all-or-nothing) 페어 비교에 기초한 것이 아니다. 대신, 스케일된 동일성 스코어 매트릭스는 일반적으로 화학적 동일성 또는 진화적 거리에 기초한 각 페어와이즈 비교에 스코어를 할당하는 데 사용된다. 일반적으로 사용되는 그러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스 - 프로그램의 BLAST 슈트에 대한 디폴트 매트릭스이다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 퍼블릭 디폴트 값 또는 공급된다면 커스텀 심볼 비교표를 사용한다(더욱 상세한 것은 사용자 매뉴얼 참고). GCG 패키지에 대한 퍼블릭 디폴트 값, 또는 다른 소프트웨어의 경우, BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.
소프트웨어가 최적 정렬을 생산하면, % 상동성, 바람직하게는 % 서열 동일성을 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 전형적으로 이것을 서열 비교의 부분으로 행하며 수적인 결과를 발생시킨다.
본 발명의 아미노산 서열에 관련하여 용어 "변이" 또는 "유도체"는 효소 활성도를 지닌, 바람직하게는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 동일한 효소 활성도를 지닌 결과 아미노산 서열을 제공하는 서열로부터 또는 그 서열로 하나(또는 그 이상)의 아미노산의 치환, 변이, 수정, 대체, 삭제 또는 첨가를 포함한 다.
서열번호 1은 본 발명에서 사용되기 위해 수정될 수 있다. 전형적으로, 수정은 서열의 효소 활성도를 유지하며 행해진다. 아미노산 치환은 예를 들면 1, 2 또는 3으로부터 10 또는 20으로 치환되며 수정된 서열은 필요한 효소 활성도를 유지한다. 아미노산 치환은 비자연적으로 발생하는 아날로그의 사용을 포함한다.
본 발명의 서열번호 1은 또한 변화와 기능적으로 동등한 효소를 가져오는 아미노산 잔기의 삭제, 삽입 또는 치환을 가진다. 계획적인 아미노산 치환은 HOX 효소의 효소 활성도가 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 앰피패틱(amphipathic) 성질의 동일성에 기초하여 행해진다. 예를 들면, 음성으로 하전된 아미노산은 아스파르틱산, 글루타믹산을 포함하고; 양성으로 하전된 아미노산은 라이신, 아르기닌을 포함하고; 동일한 친수성 값을 지닌 하전되지 않은 극성 헤드 그룹을 지닌 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신을 포함한다.
보존적 치환은 예를 들면 아래 표에 따라 행해진다. 두 번째 컬럼의 동일한 블록에 있는, 바람직하게는 세 번째 컬럼의 동일한 라인에 있는 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
지방족 비극성 G A P
I L V
극성-하전되지 않은 C S T M
N Q
극성-하전된 D E
K R
방향족 H F W Y

변이/상동/유도체(뉴클레오타이드 서열)
유전적 코드의 디제너러시(degeneracy)의 결과로 많은 다른 뉴클레오타이드 서열이 동일한 HOX 효소를 엔코드할 수 있는 것으로 당업자들에 의해 이해되고 있다. 부가적으로, 당업자들은 일상적인 기술을 사용하여 본 발명의 HOX 효소가 발현되도록 어느 특별한 호스트 유기체의 코돈 사용을 반영하기 위해 발명의 뉴클레오타이드 서열로 엔코드된 HOX 효소에 영향을 주지 않고 뉴클레오타이드 치환을 만든다고 이해되고 있다.
본 발명의 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 관련하여 용어 "변이", "상동" 또는 "유도체"는 효소 활성도를 지닌, 바람직하게는 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 동일한 효소 활성도를 지닌 결과 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 서열로부터 또는 그 서열로 하나(또는 그 이상)의 아미노산의 치환, 변이, 수정, 대체, 삭제 또는 첨가를 포함한다.
상기 가리킨 대로, 상동성에 관하여, 바람직하게는 여기 서열목록에 나타낸 서열에 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 상동성이 있다. 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 상동성이 있다. 뉴클레오타이드 상동성 비교는 상기 기술된 대로 행해질 수 있다. 바람직한 서열 비교 프로그램은 상기 기술된 GCG Wisconsin Bestfit 프로그램이다. 디폴트 스코어링 매트릭스는 각 동일한 뉴클레오타이드에 10, 각 미스매치에 대해 -9의 미스매치 값을 가진다. 디폴트 갭 크리에이션 페널티는 -50이며 디폴트 갭 익스텐션 페널티는 각 뉴클레오타이드에 대해 -3이다.
본 발명은 또한 여기 나타낸 서열, 또는 그의 변이, 단편 또는 유도체, 또는 상기 어느 것에 상보적인 것에 선택적으로 하이즈리다이징 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 적어도 15 뉴클레오타이드 길이이며, 더욱 바람직하게는 적어도 20, 30, 40 또는 50 뉴클레오타이드 길이이다.
기질
바람직하게는, 기질은 헥소즈, 바람직하게는 글루코즈, 갈락토즈, 락토즈, 2-데옥시글루코즈, 파이라노즈, 자일란, 셀룰로즈, 이눌린, 스타치, 덱스트란, 펙틴과 그의 혼합물을 포함하는 펩타이드, L 아미노산과 탄수화물/당으로부터 선택된다.
고도로 바람직한 실시태양에서 효소/기질 복합체는 글루코즈/헥소즈 옥시다제, 글루코즈/글루코즈 옥시다제, L 아미노산/L 아미노산 옥시다제, 갈락토즈/갈락토즈 옥시다제, 락토즈/β-갈락토시다제/헥소즈 옥시다제, 락토즈/β-갈락토시다제/글루코즈 옥시다제, 2-데옥시글루코즈/글루코즈 옥시다제, 파이라노즈/파이라노즈 옥시다제와 그의 혼합물로부터 선택된다.
한 면에서 오염방지 화합물은 조성에 존재하는 기질에서 효소의 활동으로 발생된다. 따라서 오염방지 화합물은 "원-스텝" 과정으로 발생된다. 어떤 경우에 기질은 인 시투(in situ)로 제조될 수 있다. 이러한 경우에, 조성은 전구체 효소와 전구체 기질을 더욱 포함하는데, 전구체 효소와 전구체 기질은 전구체 효소가 기질을 발생하도록 선택된다. 이 후자 면에서 오염방지 화합물은 "투-스텝" 과정으로 발생된다.
원-스텝 과정에서 바람직하게는 효소는 헥소즈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, L 아미노산 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제, 파이라노즈 옥시다제와 그의 혼합물로부터 선택된다.
원-스텝 과정에서 바람직하게는 기질은 헥소즈, 바람직하게는 글루코즈, L 아미노산, 갈락토즈, 2-데옥시글루코즈, 파이라노즈와 그의 혼합물로부터 선택된 다.
원-스텝 과정에서 바람직하게는 효소/기질 복합체는 글루코즈/헥소즈 옥시다제, 글루코즈/글루코즈 옥시다제, L 아미노산/L 아미노산 옥시다제, 갈락토즈/갈락토즈 옥시다제, 2-데옥시글루코즈/글루코즈 옥시다제, 파이라노즈/파이라노즈 옥시다제와 그의 혼합물로부터 선택된다.
투-스텝 과정에서 바람직하게는 효소는 헥소즈 옥시다제이다.
투-스텝 과정에서 바람직하게는 기질은 글루코즈이다.
투-스텝 과정에서 바람직하게는 전구체 효소는 아밀로글루코시다제이다.
투-스텝 과정에서 바람직하게는 전구체 기질은 스타치이다.
따라서 투-스텝 과정에서 바람직하게는 전구체 기질/전구체 효소/효소 복합체는 스타치/ 아밀로글루코시다제/헥소즈 옥시다제이다.
바람직하게는, 투-스텝 과정의 전구체 기질은 산화 효소, 스타치, 락토즈, 셀룰로즈, 덱스트로즈, 펩타이드, 이눌린과 그의 혼합물에 대한 기질의 올리고머와 폴리머로부터 선택된다.
전구체 기질의 공급은 그들이 전구체 기질에서 전구체 효소의 활동에 의해 지속적이고 및/또는 연장된 기질의 방출을 공급하므로 특별히 바람직하다.
천연 스타치는 전구체 기질로써 특별히 바람직하다. 천연 스타치는 표면 코팅에 쉽게 적용될 수 있는 조밀하게 팩된 크리스탈을 제공한다. 게다가, 천연 스타치는 물에 비가용성이다.
셀룰로오즈는 또한 전구체 기질로써 특별히 바람직하다. 셀룰로오즈는 페인트에서 일반적인 성분이며 셀룰로오즈 전구체 기질의 사용은 페인트 조성에 더해져야만 하는 부가적 성분의 수를 감소시킨다.
바람직하게는, 투-스텝 과정의 전구체 효소는 올리고메릭 또는 폴리메릭 기질을 모노메릭 유니트, 에를 들면 β-갈락토시다제, 펩티다제; 아밀로글루코시다제와 그의 혼합물로 분해할 수 있는 엑소-액팅(exo-acting) 효소로부터 선택된다.
선택적으로, 조성은 적어도 하나의 성분에 고정시키기 위한, 선택적으로 효소를 고정시키기 위한 바인더를 더욱 포함한다.
본 발명의 조성은 코팅(coatings), 래커(lacquers), 스테인(stains), 에나멜(enamels) 등으로 포뮬레이트 될 수 있으며, 이후로는 일반적으로 "coating(s)"으로 불린다.
따라서, 한 면에서 본 발명은 상기 정의된 조성으로 이루어진 코팅을 제공한다.
바람직하게는, 코팅은 아웃도어 우드 워크, 중앙 난방 시스템의 외부 표면, 해양 베셀의 선체로부터 선택된 표면의 처리에 대해 포뮬레이트 된다.
코팅은 조성을 용해하거나 현탁하기 위해 액체 비클(용매)을 포함할 수 있다.
액체 비클은 조성의 어느 필수 요소의 활성도를 방해하지 않는 액체로부터 선택될 수 있다. 특별히, 액체 비클은 필수 효소 및/또는 오염방지 화합물의 활성도를 방해하지 못한다. 적절한 액체 비클은 US-A-5071479에 개시되며, 물과 지방족 탄화수소와 자일렌과 톨루엔과 같은 방향족 탄화수소, 100과 320℃ 사이의, 바람직하게는 150과 230℃ 사이의 끓는점을 지닌 지방족과 방향족 탄화수소의 혼합물; 높은 방향족 석유 증류물, 예를 들면 나프타 용매, 증류된 타르 오일과 그의 혼합물; 부탄올, 옥탄올, 글리콜과 같은 알코올; 식물과 미네랄 오일; 아세톤과 같 은 케톤; 미네랄 스피리트(spirits)와 같은 석유 프랙션과 케로센(kerosene), 염소화 탄화수소, 글리콜 에스테르, 글리콜 에스터 에테르, 유도체와 그의 혼합물을 포함하는 유기 용매를 포함한다.
액체 비클은 일반적으로 미네랄 스피리트로 불리는 화이트 스피리트에서 발견되는 방향족과 지방족 용매의 혼합물과 같은 오일리(oily) 또는 오일-라이크(oil-like) 낮은-휘발성 유기 용매를 지닌 혼합물에서 적어도 하나의 물과 같은 극성 용매를 포함할 수 있다.
비클은 전형적으로 적어도 하나의 희석제, 유화제, 웨팅(wetting) 에이전트, 분산제 또는 다른 표면활성제를 포함할 수 있다. 적절한 유화제의 예는 US-A-5071479에 개시되며, 노닐페놀-에틸렌 옥사이드 에테르, 지방산의 폴리옥시에틸렌 솔비톨 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르, 유도체와 그의 혼합물을 포함한다.
어느 적절한 표면 코팅 물질은 본 발명의 조성 및/또는 코팅에 혼합될 수 있다. 트레이드-인정된 코팅 물질의 예는 용매 기초 시스템에서 폴리비닐 클로라이드 레진, 용매 기초 시스템에서 염소화 고무, 용매 기초 또는 용액 시스템에서 아크릴릭 레진과 메타크릴레이트 레진, 용액 분산액 또는 용매 기초 시스템으로써 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 코폴리머 시스템, 부타디엔-스티렌 고무와 같은 부 타디엔 코폴리머, 부타디엔-아크릴로니트릴 고무, 부타디엔-스티렌-아크릴로니트릴 고무, 린시드 오일과 같은 드라잉 오일, 알키드 레진, 아스팔트, 에폭시 레진, 우레탄 레진, 폴리에스테르 레진, 페놀릭 레진, 유도체와 그의 혼합물이다.
본 발명의 조성 및/또는 코팅은 티타니움 옥사이드, 페릭 옥사이드, 실리카, 탈크, 차이나 클레이와 같은 무기 색소, 카본 블랙과 같은 유기 색소, 바닷물에 비가용성인 염료, 유도체와 그의 혼합물로부터 선택된 색소를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성 및/또는 코팅은 오염방지 화합물, 바닷물에 매우 조금 녹는 로진의 조절된 방출을 제공하기 위해 로진(rosin)과 같은 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성 및/또는 코팅은 가소제(plasticizer), 유동 특성 모디파이어(rheology characteristic modifier), 다른 종래의 성분과 그의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성 및/또는 코팅, 특별히 코팅은 물 속 환경에 노출된 물질을 보호하기 위해 사용된 조성에 일반적으로 사용된 보조제를 더욱 포함한다. 이러한 보조제는 부가적인 살균제, 보조 용매, 디포머(defoamer), 고정제, 가소제, UV-안정화제 또는 안정성 증가제, 물 가용성 또는 물 비가용성 염료, 색 염료, 건조제(siccative), 부식 방지제, 티커너(thickener) 또는 카르복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴릭산 또는 폴리메타크릴릭산과 같은 안티-세틀먼트(anti-settlement) 에이전트, 안티-스키닝(anti-skinning) 에이전트, 유도체와 그의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 조성 및/또는 코팅에 사용된 부가적 살균제는 바람직하게는 액체 비클에 가용성이다.
한 면에서 본 발명은 상기 정의된 조성으로 이루어진 해양 오염방지제를 제공한다.
바람직하게는, 오염방지제는 스스로 윤을 낼 수 있다.
본 발명의 한 면에서 기질 또는 기질 발생자 및/또는 효소는 캡슐화된다. 바람직하게는, 기질/기질 발생자 및/또는 효소는 반투과막으로 캡슐화된다.
기질/기질 발생자와 효소는 서로 독립적으로 캡슐화되거나 같이 캡슐화될 수 있다. 전자의 실시태양에서, 기질/기질 발생자 또는 효소는 오염제에 의해 활성화될 수 있다. 예를 들면, 캡슐화 물질은 오염제와 접촉한 것에서 선택될 수 있으며, 기질/기질 발생자 또는 효소는 다른 기질/기질 발생자 또는 효소와 접촉하기 위해 방출될 수 있다. 이 방법에서, 조성은 오염방지 화합물만을 제공하거나 오 염제와 접촉했을 때 오염방지 화합물의 제공을 증가시키며 제공될 수 있다.
본 발명의 조성은 사용하기 쉬운 산물 또는 농축물로 제공될 수 있다. 사용하기 쉬운 산물은 수용액, 용액 분산액, 오일 용액, 오일 분산액, 에멀젼 또는 에어로졸 제제 형태가 될 수 있다. 농축물은 예를 들면 코팅에 대한 첨가물로 사용되거나 첨가 용매 또는 현탁제와 사용하기 전에 희석될 수 있다.
발명에 따른 에어로졸 제제는 적절한 용매를 포함하거나 용해되거나 현탁된 본 발명의 조성을 추진제(propellant)로 사용되기에 적절한 휘발성 용액에 혼합하여 보통 방법으로 얻어질 수 있는데 예를 들면 상표 "Freon" 또는 압축 공기하에서 상업적으로 이용 가능한 클로린과 메탄의 불소 유도체와 에탄의 혼합물이다.
US-A-5071479에 토론된 대로 본 발명의 조성 및/또는 코팅은 방부제 및/또는 코팅에 유용한 것으로 알려진 부가적 성분을 포함할 수 있다. 그러한 성분은 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리비닐 알코올, 파라핀과 같은 고정화제, 에틸글리콜, 메톡시프로필 아세테이트와 같은 코-솔벤트, 벤조익산 에스테르, 디부틸 프탈레이트, 디옥틸 프탈레이트, 디도데실 프탈레이트 등의 프탈레이트와 같은 가소제, 유도체와 그의 혼합물을 포함한다. 선택적으로 염료, 칼라 색소, 부식 방지제, 화학적 안정화제 또는 코발트 옥테이트, 코발트 나프테네이트와 같은 건조제가 또한 특별한 응용에 포함될 수 있다.
본 발명의 조성 및/또는 코팅은 브러싱, 스프레잉, 롤 코팅, 디핑 및 그의 결합을 포함하는 공지의 기술에 의해 적용될 수 있다.
본 발명의 조성은 그들이 반대로 영향받지 않는 온도에서 다양한 성분을 간단히 혼합하여 제조될 수 있다. 제조 조건은 중요하지 않다. 코팅 및 동일한 조성의 제조에 일반적으로 사용되는 장비와 방법은 유리하게 사용될 수 있다.
발명은 이제 다음의 실시예에 의하여 기술될 것이다.

본 발명의 오염방지 조성의 오염방지 효과는 다음의 실시예들에 따라 테스트된다. 이러한 실시예들은 오염 방지에서 본 조성의 효율성을 보여준다. 실시예들은 또한 본 조성의 오염방지 성질의 최적화를 제공한다.
본 실시예 각각에 사용된 헥소즈 옥시다제(HOX)는 대니스코큘터(DaniscoCultor)로부터 시용 가능하다. HOX는 해양 조류 콘드루스 크리푸스(Chondrus cripus)로부터 클론된 HOX 효소를 엔코드하는 유전자를 발현하는 이스트 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로부터 발효된 산물이다.
(실시예 1) 오염방지 조성의 제조("원-스텝")
가용성 또는 고정된 헥소즈 옥시다제 또는 글루코즈 옥시다제와 같은 과산화수소 발생 효소는 오염방지 조성에서 오염방지제 화합물 발생 효소로써 테스트된다. 헥소즈 옥시다제는 예를 들면 20 mM 트리에탄올아민 버퍼, pH 7.3을 이용한 음이온 교환기, Q Sepharose FFTM(Pharmacia로부터 이용 가능한)에 결합하여 고정될 수 있다. 대안으로, 헥소즈 옥시다제 또는 대체 과산화수소 발생 효소는 에폭시 활성화된 SepharoseTM(Pharmacia, Sweden), 카보디이미드 활성화된 아가로즈(Bio-Rad, USA)와 같은 적절한 캐리어에 공유 결합된다. 고정을 위해 공지된 다른 방법 또한 이용될 수 있다.
사용된 농도의 범위는 오염방지 조성의 ml 당 0.0001 내지 1000 U의 헥소즈 옥시다제 활성도/과산화수소 발생효소이다. 효소 활성도의 한 유니트는 25℃에서 분당 1 μmol의 과산화수소를 생산하는 효소의 양으로 정의된다.
본 발명에서 사용하기 위한 그것의 적절함을 확인하기 위해 효소의 활성도는 다음과 같이 에세이될 수 있다. 헥소즈 옥시다제(HOX) 활성도는 다음 방법에 따라 측정된다.
HOX 에세이는 글루코즈의 산화에서 발생되는 과산화수소의 측정에 기초한다. 과산화수소는 염료를 형성하기 위해 퍼옥시다제 존재시 ο-디아니시딘(ο-dianisidine)을 산화시킨다.
HOX
β-D-glucose + H2O2 + O2 → D-glucono-delta-lactone + H2O 2
POD
H2O2 + ο-dianisidinered. → 2H2O + ο-dianisidineox.
시약
1. 100 mM 포스페이트 버퍼, pH 6.3
2. 100 mM D-글루코즈(SIGMA, G-8270) in 100 mM 포스페이트 버퍼, pH 6.3
3. ο-디아니시딘(SIGMA, D-3252), 3.0 mg/ml in 증류수
4. 퍼옥시다제(SIGMA, P-8125), 0.10 mg/ml in 100 mM 포스페이트 버퍼, pH 6.3
에세이
120 ㎕ 시약 1
150 ㎕ 시약 2
10 ㎕ 시약 3
10 ㎕ 시약 4 및
10 ㎕ 효소 용액
에세이는 마이크로타이터 플레이트에서 행해진다. 반응은 효소 용액의 첨가로 시작된다. 혼합물은 25℃에서 15분간 흔들어 배양된다. 블랭크 런은 효소 용액 대신 물과 모든 성분을 포함한다. 염료의 형성은 마이크로타이터 플레이트 리더에서 405 nm에서 측정된다. 반응의 선형도는 마이크로플레이트 리더에서 키네틱스 프로그램을 이용하여 체크될 수 있다.
과산화수소 표준 곡선은 프레쉬 과산화수소(MERCK)의 농도를 변화시켜 그려질 수 있다.
(실시예 2) 오염방지 조성의 제조("투-스텝")
오염방지 조성 ml 당 0.01 내지 100 ㎍ 농도의 글루코즈와 갈락토즈는 실시예 1에 기술된 시스템에서 헥소즈 옥시다제에 대한 기질을 발생시키는 기질로써 테스트된다. 연속적인 기질 발생 시스템을 제공하기 위해, 오염방지 조성 ml 당 0.01 ng 내지 100 ㎍ 농도의 스타치, 바람직하게는 밀, 메이즈 또는 감자로부터의 인택트 스타치 그래뉼이 아밀로글루코시다제(GRINDAMYLTM AG 1500 Bakery Enzyme from DaniscoCultor or another commercial amyloglucosidase product)와 함께 사용된다. 성분은 오염방지 조성 ml 당 0.000001로부터 10 AGU까지 제공하는 농도에서 존재한다.
1 AGU는 50 mM 소디움 아세테이트, pH 5.0(농축 아세트산으로 조정된), 40℃에서 분당 말토즈(0.5% w/v)로부터 1 μmol의 글루코즈를 방출하는 아밀로글루코시다제 활성도로 정의된다. 에세이는 200 ㎕의 에세이 믹스를 100 ㎕의 0.1 M 염산 클로라이드로 옮기면 중지되며 방출된 글루코즈의 양은 글루코즈 디하이드로게나제 시약(Merck no. 12193) 또는 다른 글루코즈 검출 시스템을 이용하여 측정된다.
(실시예 3) HOX를 포함하는 페인트에 의한 과산화수소의 발생
과산화수소를 발생하는 헥소즈 옥시다제(HOX)의 능력을 테스트하기 위해 다음의 실험을 행하였다.
11.0 g의 페인트(각각 물-기초 벽 페인팅 사돌린 글란스 7과 오일 기초 히스터 9010)에 스타치(10 U/g)에 스프레이드라이된 0.2, 0.5 및 1 g의 HOX(한세눌라 폴리모르파로부터 대니스코큘터 발효된 산물)가 각각 첨가되었다. 물 기초 페인트에 또한 처리당 5 g의 물이 첨가되었다.
사용후 버릴 수 있는 플라스틱 트랜스퍼 피펫(Sarstedt)이 페인트에 딥된다(헤드 부분). 트랜스퍼 피펫은 3시간 동안 공기에 건조되었다.
헥소즈 옥시다제(HOX) 활성도는 피펫 헤드로 커버된 페인트를 2 mL의 HOX 에세이 시약을 지닌 유리 튜브에 담그어 측정되었는데, 아래를 참고하면 페인트의 HOX로부터 오는 HOX 활성도만이 측정되었다.
튜브는 상온에서 배양되었다.
블랭크로써 HOX가 첨가되지 않은 페인트가 사용되었다.
실험의 결과를 표 1에 나타내었다. HOX 에세이 시약과 접촉하면 페인트의 전체 표면은 즉시 빨간색으로 되므로, HOX는 페인트에 균일하게 분배된다. 페인트가 HOX 활성도에 어느 억제 영향을 주지 않음을 나타내는 색 발달이 즉시 관찰된다. 이 실험은 HOX가 건조 후 페인트 매트릭스에 고정될 때조차 외부로 첨가된 기질(글루코즈)로부터 과산화수소를 발생할 수 있음을 증명한다.
활성도
물 기초 페인트, 블랭크 0
0.2 g HOX +
0.5 g HOX ++
1.0 g HOX +++
오일 기초 페인트, 블랭크 0
0.2 g HOX +
0.5 g HOX ++
1.0 g HOX +++
콘트롤, 에세이 시약 플러스 프리 HOX +++

사용된 농도의 범위는 0.0001 내지 1000 U의 헥소즈 옥시다제 활성도 또는 오염방지 조성의 ml 당 대체 과산화수소 발생 효소이다.
(실시예 4) 코팅에 대한 모델 시스템
오염방지 조성을 포함하는 투석 튜빙은 코팅된 물질의 표면에서 오염을 방지하기 위한 코팅에 대한 모델 시스템으로 사용된다.
투석 튜빙 내의 오염방지 조성은 오염을 방지하는 데 효과적인 투석 튜빙의 표면에서 과산화수소의 농도를 발생시키는 데 사용된다. 사용된 투석 튜빙은 약 10000 Da의 컷 오프 값을 갖는다. 투석 튜빙은 투석 튜빙이거나 투석 카세트(such as Slide-A-LyzerTM available from Pierce; IL, USA)이다.
투석 튜빙은 상기 기술된 대로 수집된 호수 또는 바닷물 1 내지 5 리터의 유 리 비이커에 담그어진다. 유리 비이커는 마그네틱 스터러로 천천히 교반되며 거기에 빛이 비치도록 창문에 인접하여 상온에서 배양된다. 투석 튜빙에서 오염은 투석 튜빙에서 미생물 성장 층의 외관에 기초하여 4주 이상 시각적으로 모니터되며 상기 기술된 대로 1 내지 5 스케일로 레이트된다. 음성 콘트롤로는 탭(tap) 물을 포함하는 투석 튜브가 사용된다.
선택적으로, 0.1% Tween 20으로 블록된 니트로셀룰로즈 멤브레인 피스에 고정된 카탈라제는 투석 튜빙 주위의 물에서 과산화수소의 축적을 피하기 위해 호수 또는 바닷물에 첨가된다. 사용된 카탈라제의 농도는 0.000001 내지 100 CU의 범위이며, 1 CU는 Sigma 카탈로그에서 카탈라제에 대해 기술된 대로 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 7.0, 30℃에서 분당 1 μmol의 과산화수소를 분해하는 카탈라제 활성도로 정의된다: Biochemicals Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents, Sigma Chemical Company 1995, page 221.
본 발명의 조성은 오염을 방지하는 데 효과적이다.
(실시예 5) 페인트에서 HOX의 안정성
실시예 1에 기술된 트랜스퍼 피펫의 페인트칠된 헤드는 상온에서 2개월 동안 보관되었고 실시예 2에 기술된 대로 시약 믹스에서 "에세이" 되었다.
활성도
물 기초 페인트, 블랭크 0
0.2 g HOX +
0.5 g HOX ++
1.0 g HOX 결정되지 않음
오일 기초 페인트, 블랭크 0
0.2 g HOX +++
0.5 g HOX +++
1.0 g HOX +++
콘트롤, 에세이 시약 플러스 프리 HOX 결정되지 않음

표 2의 결과로부터 HOX는 건조 페인트 매트릭스에서 상온에서 2개월 동안 안정하다는 것이 명백해졌다.
(실시예 6) 코팅 테스트
오염방지 조성에 대한 테스트 시스템의 셋 업
호수 또는 바닷물 샘플의 0.5 내지 5 ml는 덴마크, 아르후스 근처 브라브란드소엔 호수와 발틱 씨 오프 아르후스로부터 테스트 튜브에 수집되었다. 물 샘플을 수집한 날, 테스트되는 오염방지 조성은 테스트 튜브에 첨가되고 그것은 파라필름으로 봉해진다.
테스트 튜브는 거기에 빛이 비치도록 창문에 인접하여 상온에서 배양된다. 오염은 테스트 튜브의 벽에서 미생물 성장 층의 외관에 기초하여 4주 이상 시각적으로 모니터된다. 비교를 위해서 0.1%의 소디움 아자이드를 지닌 테스트 튜브와 오염방지 조성이 없는 테스트 튜브가 양성과 음성 콘트롤로 각각 사용된다.
이러한 테스트 튜브는 오염방지 활성도가 없는 것에 고도로 효율적인 1 내지 5 스케일에서 각각 1과 5로 레이트된다.
첨가된 오염방지 살생물제가 없는 통상의 해양 오염방지 코팅 물질이 사용된다. 본 발명에 따른 오염방지 조성은 코팅 물질에 혼합되고 코팅 물질 제조사의 지시에 따라 금속, 유리와 플라스틱 플레이트의 표면에 적용된다.
코팅된 플레이트는 호수 또는 바닷물에 담그어진다. 플레이트 상의 오염은 플레이트에서 미생물 성장 층의 외관에 기초하여 2년 이상 시각적으로 모니터되며 상기 기술된 대로 1 내지 5 스케일로 레이트된다. 음성 콘트롤로는 오염방지 조성이 없는 코팅이 사용된다.
본 발명의 조성은 오염을 방지하는 데 효과적이다.
(실시예 7) 수족관 물에서 오염방지 조성의 안정성
10.0 g의 페인트(오일 기초 히스터 9010)에 500 mg의 스타치(Merck 1253), 스타치(10 U/g)에 스프레이드라이된 50 mg의 HOX(한세눌라 폴리모르파로부터 대니스코큘터 발효된 산물)가 첨가되었다.
사용후 버릴 수 있는 플라스틱 트랜스퍼 피펫(Sarstedt)이 페인트에 딥된다(헤드 부분). 트랜스퍼 피펫은 24시간 동안 공기에 건조되었다. 카우텍스 병에서 수족관으로부터의 물 250 mL가 2개월 동안 보관되었다. 병은 낮동안 창가에 있었다. 2개월 후, 피펫 헤드는 세척되고 공기에 건조되어 완전한 HOX 시약 믹스에서 "에세이" 되었다. HOX는 여전히 완전한 활성도를 보여주었다.
(실시예 8) 기질 발생 컨셉트의 증명
연속적인 기질 발생 시스템을 제공하기 위하여 오염방지 조성 ml 당 0.000001로부터 100 AGU까지 제공하는 농도의 아밀로글루코시다제(AMG)(GRINDAMYLTM AG 1500 Bakery Enzyme from DaniscoCultor or another commercial amyloglucosidase product)는 물론 스타치, 바람직하게는 오염방지 조성 ml 당 0.01 ng 내지 100 mg 농도의 밀, 메이즈 또는 감자로부터의 인택트 스타치 그래뉼이 HOX와 함께 사용된다.
10.0 g의 페인트(오일 기초 히스터 9010)에 500 mg의 스타치(Merck), 스타치(10 U/g)에 스프레이드라이된 HOX(한세눌라 폴리모르파로부터 대니스코큘터 발효된 산물)와 표에서 가리키는 대로 AMG(10000 AGU/g)가 첨가되었다.
사용후 버릴 수 있는 플라스틱 트랜스퍼 피펫(Sarstedt)이 페인트에 딥되었다(헤드 부분). 트랜스퍼 피펫은 3시간 동안 공기에 건조되었다.
헥소즈 옥시다제(HOX) 활성도는 피펫 헤드로 커버된 페인트를 글루코즈 없이 2 mL의 HOX 에세이 시약을 지닌 유리 튜브에 담그어 측정되었는데, 실시예 1의 에세이 시약을 참고하고, 페인트의 HOX로부터 오는 HOX 활성도와 페인트에서 글루코즈에 대해 스타치를 가수분해함으로써 페인트의 AMG에 의해 발생되는 HOX에 대한 기질만이 측정되었다.
튜브는 상온에서 48시간 동안 배양되었다.
블랭크로써 HOX와 AMG가 첨가되지 않은 페인트가 사용되었다.
활성도
50 mg HOX + 10 mg AMG +
50 mg HOX + 20 mg AMG +
50 mg HOX -
블랭크(효소 없음) -

표 3에 나타낸 결과는 의도한 대로 HOX와 AMG 작업의 결합을 보여준다. AMG는 페인트에 같이 고정된 스타치로부터 글루코즈를 발생시키며 HOX는 발생된 글루코즈로부터 과산화수소를 발생시킨다.
(실시예 9) 온도 활성도
헥소즈 옥시다제(정제된 HOX)는 온도 함수에 대한 활성도로 평가되며 통상의 글루코즈 옥시다제(Amano 081443/00018)와 비교된다.
절차 :
샘플 : 효소 샘플은 물에 용해되고 20 mM 포스페이트 버퍼 pH 6.3을 이용하여 PD10 컬럼에서 디솔트되며(desalted) 0.4 U/ml로 희석된다.
엘리사 웰(Elisa well)에 첨가됨 :
150 ㎕ 100 mM 글루코즈 in 100 mM 포스페이트 버퍼, pH 6.3
120 ㎕ 100 mM 포스페이트 버퍼, pH 6.3
10 ㎕ ο-디아니시딘(3 mg/ml in 물)
10 ㎕ 퍼옥시다제(0.10 mg/ml in 100 mM 포스페이트 버퍼, pH 6.3)
10 ㎕ 샘플
30℃에서 10분 에세이되어 405 nm에서 측정됨
결과
온도 함수에 대한 활성도 측정의 결과를 표 4와 도 1에 나타내었다.
온도, 헥소즈 옥시다제 통상의 글루코즈 옥시다제
℃ 상대 활성도, % 상대 활성도, %
10 70 67
25 98 67
27.5 100 72
32.5 98 78
37.5 94 78
42 83 85
45 81 100
50 59 94

온도에 대한 활성도 결과는 활성도 측면에서 차이를 명백하게 예증한다.
헥소즈 옥시다제는 25∼35℃ 사이에서 최적 온도를 가지며 최대 오염 온도에 대한 최적과 거의 일치한다. 대조적으로 GOX는 50℃에서 최적 온도를 가지며 바다에서 도달할 수 있는 상기 온도와는 먼 것으로 보여진다.
상기 명세서 내에 언급된 모든 간행물들은 참고문헌에 의해 여기에 포함된다. 본 발명의 기술된 방법과 시스템의 다양한 변경과 변형은 발명의 범위와 정 신으로부터 벗어남이 없이 이 분야의 당업자에게는 명확할 것이다. 발명이 특정 바람직한 실시태양에 관련하여 기술되었을 지라도, 청구된 발명은 그러한 특정 실시태양을 부당하게 한정하는 것은 아니다. 실제로, 화학 또는 관련된 분야의 당업자가 명백하게 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형은 다음의 청구항 범위내에 있을 것이다.
<110> DANISCO A/S <120> Composition <150> GB 9913050.2 <151> 1999-06-04 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1644 <212> DNA <213> hoxpic <220> <221> CDS <222> (1)..(1638) <400> 1 atg gct act ttg cca caa aag gac cca ggt tac att gtt att gac gtc 48 Met Ala Thr Leu Pro Gln Lys Asp Pro Gly Tyr Ile Val Ile Asp Val 1 5 10 15 aac gct ggt act cca gac aag cct gac cca aga ttg cca tcc atg aag 96 Asn Ala Gly Thr Pro Asp Lys Pro Asp Pro Arg Leu Pro Ser Met Lys 20 25 30 caa ggt ttc aac aga aga tgg att ggt acc aac atc gat ttc gtt tac 144 Gln Gly Phe Asn Arg Arg Trp Ile Gly Thr Asn Ile Asp Phe Val Tyr 35 40 45 gtc gtt tac act cca caa ggt gct tgt act gct ttg gac aga gct atg 192 Val Val Tyr Thr Pro Gln Gly Ala Cys Thr Ala Leu Asp Arg Ala Met 50 55 60 gaa aag tgt tct cca ggt acc gtc aga atc gtt tct ggt ggt cac tgt 240 Glu Lys Cys Ser Pro Gly Thr Val Arg Ile Val Ser Gly Gly His Cys 65 70 75 80 tac gaa gac ttc gtt ttc gac gaa tgt gtc aag gct att atc aac gtt 288 Tyr Glu Asp Phe Val Phe Asp Glu Cys Val Lys Ala Ile Ile Asn Val 85 90 95 act ggt ttg gtt gaa tct ggt tac gac gac gat aga ggt tac ttc gtc 336 Thr Gly Leu Val Glu Ser Gly Tyr Asp Asp Asp Arg Gly Tyr Phe Val 100 105 110 tct tcc ggt gac acc aac tgg ggt tcc ttc aag acc ttg ttc aga gac 384 Ser Ser Gly Asp Thr Asn Trp Gly Ser Phe Lys Thr Leu Phe Arg Asp 115 120 125 cac ggt aga gtt ttg cca ggt ggt tcc tgt tac tcc gtc ggt ttg ggt 432 His Gly Arg Val Leu Pro Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Val Gly Leu Gly 130 135 140 ggt cac att gtc ggt gga ggt gac ggt att ttg gcc aga ttg cac ggt 480 Gly His Ile Val Gly Gly Gly Asp Gly Ile Leu Ala Arg Leu His Gly 145 150 155 160 ttg cca gtc gat tgg tta tcc ggt gtt gaa gtt gtc gtt aag cca gtc 528 Leu Pro Val Asp Trp Leu Ser Gly Val Glu Val Val Val Lys Pro Val 165 170 175 ttg acc gaa gac tct gtt ctt aag tac gtt cac aag gat tcc gaa ggt 576 Leu Thr Glu Asp Ser Val Leu Lys Tyr Val His Lys Asp Ser Glu Gly 180 185 190 aac gac ggt gag ttg ttt tgg gct cac act ggt gga ggt gga ggt aac 624 Asn Asp Gly Glu Leu Phe Trp Ala His Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asn 195 200 205 ttc ggt att atc acc aaa tac tac ttc aag gat ttg cca atg tct cca 672 Phe Gly Ile Ile Thr Lys Tyr Tyr Phe Lys Asp Leu Pro Met Ser Pro 210 215 220 aga ggt gtc atc gct tct aac tta cac ttc tct tgg gac ggt ttc act 720 Arg Gly Val Ile Ala Ser Asn Leu His Phe Ser Trp Asp Gly Phe Thr 225 230 235 240 aga gat gcc ttg caa gat ttg ttg act aag tac ttc aag ttg gct aga 768 Arg Asp Ala Leu Gln Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Arg 245 250 255 tgt gat tgg aag aat act gtt ggt aag ttc caa atc ttc cac caa gca 816 Cys Asp Trp Lys Asn Thr Val Gly Lys Phe Gln Ile Phe His Gln Ala 260 265 270 gct gaa gag ttt gtt atg tac ttg tat aca tcc tac tct aac gac gcc 864 Ala Glu Glu Phe Val Met Tyr Leu Tyr Thr Ser Tyr Ser Asn Asp Ala 275 280 285 gag aga gaa gtt gcc caa gac aga cac tat cat ttg gag gct gac att 912 Glu Arg Glu Val Ala Gln Asp Arg His Tyr His Leu Glu Ala Asp Ile 290 295 300 gaa cag atc tac aaa aca tgc gag cct acc aaa gct ctt ggt ggt cat 960 Glu Gln Ile Tyr Lys Thr Cys Glu Pro Thr Lys Ala Leu Gly Gly His 305 310 315 320 gct ggt tgg gct cct ttc cct gtt aga cct aga aag aga cac aca tcc 1008 Ala Gly Trp Ala Pro Phe Pro Val Arg Pro Arg Lys Arg His Thr Ser 325 330 335 aag act tct tat atg cat gac gag act atg gac tac cct ttc tac gct 1056 Lys Thr Ser Tyr Met His Asp Glu Thr Met Asp Tyr Pro Phe Tyr Ala 340 345 350 ttg act gag act atc aac ggt tcc ggt cct aat cag aga ggt aag tac 1104 Leu Thr Glu Thr Ile Asn Gly Ser Gly Pro Asn Gln Arg Gly Lys Tyr 355 360 365 aag tct gct tac atg atc aag gac ttt cca gac ttc cag att gat gtt 1152 Lys Ser Ala Tyr Met Ile Lys Asp Phe Pro Asp Phe Gln Ile Asp Val 370 375 380 atc tgg aaa tac ctt act gag gtt cct gac ggt ttg act agt gcc gaa 1200 Ile Trp Lys Tyr Leu Thr Glu Val Pro Asp Gly Leu Thr Ser Ala Glu 385 390 395 400 atg aag gat gct ctt ctt cag gtt gat atg ttc ggt ggt gag att cac 1248 Met Lys Asp Ala Leu Leu Gln Val Asp Met Phe Gly Gly Glu Ile His 405 410 415 aag gtt gtt tgg gat gct act gca gtt gct cag aga gag tac atc atc 1296 Lys Val Val Trp Asp Ala Thr Ala Val Ala Gln Arg Glu Tyr Ile Ile 420 425 430 aaa ctg cag tac cag aca tac tgg cag gaa gaa gac aag gat gca gtt 1344 Lys Leu Gln Tyr Gln Thr Tyr Trp Gln Glu Glu Asp Lys Asp Ala Val 435 440 445 aac ttg aag tgg att aga gac ttt tac gag gag atg tat gag cct tat 1392 Asn Leu Lys Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Glu Glu Met Tyr Glu Pro Tyr 450 455 460 ggt ggt gtt cca gac cct aac act cag gtt gag agt ggt aaa ggt gtt 1440 Gly Gly Val Pro Asp Pro Asn Thr Gln Val Glu Ser Gly Lys Gly Val 465 470 475 480 ttt gag gga tgc tac ttc aac tac cct gat gtt gac ttg aac aac tgg 1488 Phe Glu Gly Cys Tyr Phe Asn Tyr Pro Asp Val Asp Leu Asn Asn Trp 485 490 495 aag aac ggt aag tat ggt gcc ttg gaa ctt tac ttt ttg ggt aac ctg 1536 Lys Asn Gly Lys Tyr Gly Ala Leu Glu Leu Tyr Phe Leu Gly Asn Leu 500 505 510 aac aga ttg atc aag gcc aaa tgg ttg tgg gat cct aac gag atc ttc 1584 Asn Arg Leu Ile Lys Ala Lys Trp Leu Trp Asp Pro Asn Glu Ile Phe 515 520 525 aca aac aaa cag tct atc cct act aaa cct ctt aag gag cct aag cag 1632 Thr Asn Lys Gln Ser Ile Pro Thr Lys Pro Leu Lys Glu Pro Lys Gln 530 535 540 act aaa ta gtag 1644 Thr Lys 545

Claims (42)

  1. 삭제
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  21. (ⅰ) 코팅, 래커, 착색제 또는 에나멜 제형의 해양 선박 표면 코팅용 물질;
    (ⅱ) 전분, 유당, 셀룰로즈, 덱스트로즈, 펩타이드, 이눌린 및 그의 혼합물에서 선택된 기질 전구체와 상기 기질 전구체를 가수분해하여 기질을 생성하는 가수분해 효소; 및
    (ⅲ) 기질과 기질을 산화시켜 오염-방지 화합물을 발생시키는 산화효소
    를 포함하는 오염-방지 조성물에 있어서, 상기 기질 전구체는 기질의 올리고머 또는 폴리머임을 특징으로 하는 오염-방지 조성물
  22. 제 21항에 있어서, 상기 산화효소는 해양 조류로부터 수득됨을 특징으로 하는 조성물
  23. 제 21항에 있어서, 상기 산화효소는 콘드루스 크리푸스(Chondrus cripus)로부터 수득됨을 특징으로 하는 조성물
  24. 제 21항에 있어서, 상기 산화효소는 헥소즈 옥시다제임을 특징으로 하는 조성물
  25. 제 24항에 있어서, 상기 헥소즈 옥시다제는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 염기 서열로부터 코드화되는 아미노산 서열을 포함한 효소임을 특징으로 하는 조성물
  26. 제 21항에 있어서, 상기 기질은 당임을 특징으로 하는 조성물
  27. 제 26항에 있어서, 상기 당은 글루코즈임을 특징으로 하는 조성물
  28. 삭제
  29. 제 21항에 있어서, 상기 가수분해 효소는 아밀로글루코시다제임을 특징으로 하는 조성물
  30. 제 21항에 있어서, 상기 기질 전구체는 전분임을 특징으로 하는 조성물
  31. 제 21항 또는 제 24항에 있어서, 상기 오염-방지 조성물은 기질과 산화 효소와의 접촉을 위한 산화 효소를 고정화시키는 결합제를 더욱 포함함을 특징으로 하는 조성물
  32. 제 21항에 따른 조성물로 구성된 코팅
  33. 삭제
  34. 제 21항에 따른 조성물로 구성된 해양 오염-방지제
  35. 제 34항에 있어서, 상기 오염-방지제는 자가-광택가능함을 특징으로 하는 해양 오염-방지제
  36. (ⅰ) 해양 선박 표면 코팅용 물질 내에 혼합된 기질의 올리고머 또는 폴리머인 전분, 유당, 셀룰로즈, 덱스트로즈, 펩타이드, 이눌린 및 그의 혼합물에서 선택된 기질 전구체를 가수분해 효소에 작용시켜 기질 전구체를 가수분해하는 단계; 및
    (ⅱ) 기질 전구체를 가수분해시킨 기질을 산화효소로 산화시켜 오염-방지 화합물을 발생시키는 단계를
    포함하는 표면 코팅으로부터 오염-방지 화합물을 방출시키는 방법
  37. 제 21항에 있어서, 상기 기질 전구체는 수불용성임을 특징으로 하는 조성물
  38. 삭제
  39. 제 21항에 있어서, 상기 산화효소는 해양 생물체로부터 유래함을 특징으로 하는 조성물
  40. 제 24항에 있어서, 상기 헥소즈 옥시다제는 재조합 효소 유전자를 포함하는 숙주 내의 클로닝 및 발현에 의해 수득됨을 특징으로 하는 조성물
  41. 삭제
  42. 제 21항에 있어서, 상기 조성물은 염화비닐 수지, 염화고무, 아크릴 수지 및 메타크릴산 수지, 염화비닐-아세트산비닐 공중합체, 부타디엔 공중합체, 부타디엔-스티렌 고무, 부타디엔-아크릴로니트릴 고무, 부타디엔-스티렌-아크릴로니트릴 고무, 건조유, 아마인유, 알키드 수지, 아스팔트, 에폭시 수지, 우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 페놀 수지 및 그 혼합물에서 선택된 1종 이상의 표면 코팅용 물질을 더욱 포함함을 특징으로 하는 조성물
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