MXPA01012448A - Composicion. - Google Patents

Abstract

Se provee una composicion anti-incrustaciones que comprende: (i) un material de revestimiento de superficie; (ii) una enzima obtenida o que se puede obtener de un organismo marino; y (iii) (a) un substrato para la enzima; y/o (b) una enzima precursora y un substrato precursor, en donde la enzima precursora y el substrato precursor se seleccionan de tal manera que un substrato para la enzima se puede generar por accion de la enzima precursora sobre el substrato precursor; en donde la enzima y el substrato se seleccionan de tal manera que un compuesto anti-incrustaciones se puede generar por accion de la enzima sobre el substrato.

Description

COMPOSICIÓN MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a una composición antiincrustaciones. En particular, la presente invención se refiere a una composición anti-incrustaciones que comprende una enzima capaz de producir un compuesto que tenga un efecto anti-incrustaciones. Como se describe en el documento US-A-5071479 se requeiren biocidas en muchos ambientes diferentes, tales como agentes antifungales en pinturas para el hogar, alguicidas de agua dulce, y agentes anti-incrustaciones para estructuras marinas expuestas a la flora y fauna del agua de mar. Como se sabe, el moho u hongo puede crecer en pinturas del hogar y similares y utiliza el medio de pintura como un nutriente o en algunos casos, el substrato subyacente, tal como madera, como el nutriente. Por razones obvias, esto puede ocasionar daño a la superficie pintada y/o deterioro en la apariencia de la superficie pintada. Un biocida se puede incorporar en la pintura y cuando los micelios y cuerpos fructíferos del hongo hacen contacto con la película de pintura o la penetran y por lo tanto a través de contacto estrecho con el biocida en la película, los hongos son destruidos. En torres de enfriamiento que utilizan agua dulce, los hongos mucilagenosos, mohos y algas se pueden desarrollar si no están presentes compuestos efectivos para combatir su crecimiento.

Como se describe en el documento US-A-5071479, el crecimiento de organismos marinos sobre las partes sumergidas del casco de un barco es un problema particular. Dicho crecimiento incrementa la resistencia a la fricción del casco para pasar por el agua, tendiendo a incrementar el consumo de combustible y/o a una reducción en la velocidad del barco. Los crecimientos marinos se acumulan tan rápido que el remedio de limpiar y volver a pintar según se requiera en el muelle seco generalmente se considera demasiado costoso. Una alternativa que se ha puesto en práctica con eficiencia cada vez mayor con los años es limitar el grado de incrustaciones aplicando al casco una pintura de recubrimiento superior que incorpore agentes anti-incrustaciones. Los agentes anti-incrustaciones son biocidas que son liberados de la superficie de la pintura durante un periodo a una concentración letal para organismos marinos en la superficie del casco. La pintura anti-incrustaciones no tiene éxito sólo cuando la concentración del biocida disponible en la superficie de la pintura cae por abajo de la concentración letal y con pinturas modernas se espera una vida útil de hasta dos años. Un biocida ampliamente usado en forma extrema, particularmente en anti-incrustaciones marinas, es el tributilestaño (TBT). Sin embargo, existe una preocupación creciente acerca de los efectos ambientales causados al usar dichos biocidas de estaño orgánicos a sus niveles comerciales actuales como un ingrediente activo anti-incrustaciones en composiciones de recubrimiento para aplicaciones acuáticas (marinas). Se ha mostrado que, debido al uso ampliamente diseminado de compuestos de tipo tributilestaño en particular, en concentraciones tan altas como de 20% en peso en pinturas de partes inferiores de barcos, la contaminación del agua circundante debida a lixiviación ha alcanzado un nivel tal que ocasiona la degradación de mejillones y organismos con concha. Estos efectos se han detectado a lo largo de la línea costera francesa-británica y un efecto similar ha sido confirmado en las aguas norteamericanas y del Lejano Oriente. Bajo las restricciones reglamentarias más recientes, con excepciones limitadas, embarcaciones de esparcimiento de hasta 25 metros de longitud ya no se permite que usen pintura anti-incrustaciones que contengan altos niveles de compuestos de tributilestaño. La investigación ha mostrado que mientras que la velocidad de lixiviación del estaño se pueda manetener a o por debajo de 4 µg/cm^ por día, la vida acuática no parece ser afectada a largo plazo. Sin embargo, se ha encontrado que para que sea efectivo el control de algas marinas, así como organismos marinos desarrollados superiores, de la superficie pintada de los cascos de los barcos, se requiere una cierta velocidad de lixiviación mínima de estaño de aproximadamente 9 a 16 µg/cm^/día. Por lo general, esta velocidad de lixiviación superior se logra con una concentración de compuesto de tributilestaño a aproximadamente 15% a 20% en peso de pintura. En vista de la efectividad de TBT, las autoridades reglamentadoras han acordado en forma sobresaliente que mientras no haya un sustituto satisfactorio para los ingredientes activos de estaño orgánicos anti-incrustaciones, a los barcos más grandes, es decir, aquellos que tienen una longitud de 25 metros, se les permitirá usar dichos compuestos para reducir al mínimo las incrustaciones. Por lo tanto, existe el deseo de proveer biocidas alternativos a compuestos a base de TBT. El documento US-A-4297137 describe que los efectos de una composición anti-incrustaciones se pueden prolongar moderando la liberación de los constituyentes anti-incrustaciones. Este documento describe pinturas anti-incrustaciones que comprenden por lo menos una sustancia tóxica para organismos marinos uniformemente incorporada en una matriz sólida discontinua que es insoluble en agua de mar y dispersada en la pintura. La matriz está por lo menos parcialmente formada a partir de por lo menos una sustancia que se vuelve soluble en agua de mar bajo la acción de enzimas liberadas por los organismos marinos que van a ser inhibidos y/o por una película bacteriana en contacto con la pintura. Por lo tanto, cuando un organismo marino se asocia con una superficie pintada, la sustancia tóxica es liberada y los organismos son inhibidos. De manera similar a las descripciones de la técnica anterior, las sustancias tóxicas contempladas por el documento US-A-4297137 incluyen sólo los compuestos a base de cobre y estaño bien conocidos, tales como TBT. Abarzua et al., Mar. Ecol. Prog. Ser., Vol. 123: 301-312, 1995 "Biotechnological investigation for the prevention of biofouling. I. Biological and biochemical principies for the prevention of biofouling" propone la extracción de agentes biogénicos que tengan propiedades antibacterianas, antialgas, antiprotozoarios y antimacroincrustaciones de algas e invertebrados marinos. Se propone que la estructura de los agentes extraídos se puede determinar, subsecuentemente sintetizar y el agente sintetizado se puede usar en la prevención de bioincrustaciones. No se proveen enseñanzas de la extracción o de la síntesis. El documento EP-A-0866103 describe un método para liberación controlada de compuestos que tienen actividad antimicrobiana y composiciones de recubrimiento que utilizan este sistema. El método consiste en la incorporación de una enzima y un substrato en una matriz. La enzima actúa con el substrato para proveer un compuesto. En una modalidad contemplada, el compuesto se puede hacer accionar por otra enzima. El substrato y la enzima(s) producen un compuesto que tiene actividad antimicrobiana. El documento US-A-5747078 se refiere a productos alimenticios. El documento enseña que la contaminación microbiana de alimentos y forraje, que pueden ocasionar varios problemas de salud, pueden ser inhibidos por una composición que comprenda un sistema de lactoperoxidasa que provea liberación sostenida de peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno se prepara por la reacción de una óxido-reductasa con un substrato oxidable. El peróxido de hidrógeno después reacciona con tiocianato, bajo catálisis por lactoperoxidasa, para producir hipotiocianato. El hipotiocianato puede actuar como un agente antimicrobiano. Este documento provee una enseñanza de base de los sistemas de enzima inmovilizada. El documento no hace referencia a anti-incrustaciones o cualquier microorganismo que tenga propiedades de incrustaciones. La presente invención resuelve el problema de la técnica anterior. Aspectos de la presente invención se definen en las reivindicaciones anexas. Estos y otros aspectos se describen a continuación. Se ha encontrado que la provisión de un sistema integrado para la generación de un compuesto anti-incrustaciones que utilizan una enzima de un organismo marino provee un sistema estable que • tiene efectividad a largo plazo en ambiente adverso tal como ambientes marinos • requiere menos substrato que los sistemas de la técnica anterior para proveer un efecto antimicrobiano dado. Las enzimas de los organismos marinos, tales como la hexosa oxidasa (HOX) de algas, tienen valores de Km bajos para la glucosa, a saber 2.7 mM. Este Km bajo significa que la enzima tiene una afinidad muy alta para la glucosa. Por el contrario, enzimas que no son de origen marino tales como glucosa oxidasa (GOX) que no es de origen marino pueden tener por lo menos un valor de Km diez veces mayor para la glucosa. En otras palabras, los sistemas de enzimas anteriores tienen una afinidad mucho menor para la glucosa que el de la presente invención. En aplicaciones anti-incrustaciones, esto dará una diferencia significativa, ya que una enzima con una afinidad de glucosa alta podrá convertir toda la glucosa presente. Por otro lado, una enzima con una afinidad de glucosa inferior se preverá para permitir la lixiviación de la glucosa al ambiente circundante. La lixiviación de la glucosa contrarrestará la actividad anti-incrustaciones deseada debido a que la glucosa será un substrato para organismos incrustadores. La lixiviación de la glucosa por lo tanto conducirá a incrustaciones incrementadas. • requiere menos enzima que los sistemas de la técnica anterior para proveer un efecto antimicrobiano dado. Las enzimas de organismos marinos, tales como HOX de alga, también tienen un valor de Km bajo para oxígeno, nuevamente menor que el valor de Km para oxígeno de los sistemas de la técnica anterior tales como GOX. Nuevamente, esta afinidad superior para el substrato da al HOX de algas una ventaja. Esto se debe a que en las aplicaciones anti-incrustaciones la peor incrustación será en ambientes "cerrados" como en puertos con bajo intercambio de agua y alto crecimiento de algas y otros organismos incrustadores. Exactamente en estos lugares en donde las incrustaciones son peores, el contenido de oxígeno del agua también será el más bajo en comparación con el mar abierto. Las enzimas de organismos marinos con alta afinidad para el oxígeno serán por lo tanto ventajosas. • provee actividad mejorada a temperaturas de operación probables. En composiciones de recubrimiento de superficie tales como la pintura anti-incrustaciones, el compuesto antimicrobiano (anti-incrustaciones) tiene que ser activo entre 15 y 30°C. Para composiciones anti-incrustaciones, esta es la temperatura de agua de mar en donde las incrustaciones dan un problema. A diferencia de los sistemas de la técnica anterior, las enzimas de ios organismos marinos, tales como HOX de algas, tienen una temperatura óptima de actividad exactamente a la temperatura óptima para incrustaciones y estas enzimas por lo tanto son perfectamente adecuadas como un agentes anti-incrustaciones. La temperatura óptima se muestra en el ejemplo 9. • utiliza substratos seguros y fácilmente disponibles. • tiene tolerancia a la sal mejorada que conduce a una actividad mejorada adicional en ambientes marinos. • es resistente a la degradación por organismos incrustadores. enzimas de organismos marinos, tales como HOX de algas, son enzimas remarcablemente resistentes a la proteasa. Sobrevivirán el tratamiento con pronasa (una preparación de proteasa de amplio espectro) sin ninguna pérdida de actividad. Esta resistencia a la proteasa se considera especialmente importante en la aplicación anti-incrustaciones debido a que la enzima será por lo tanto resistente a la degradación por proteasas de los organismos antiincrustadores que están tratando de fijarse a la superficie recubierta. En la presente descripción, los "incrustadores" a los que se hace referencia por los términos "anti-incrustación(es)" "anti-incrustaciones" y "antiincrustadores" ¡ncluyen organismos que pueden habitar y/o crecer sobre la superficie que se va a tratar con la presente invención. Los organismos incluyen microorganismos tales como bacterias, hongos y protozoarios, así como algas y organismos tales como algas, plantas y animales. Los organismos pueden ser organismos marinos. La composición de la presente invención comprende una enzima precursora y un substrato precursor, en donde la enzima precursora y el substrato precursor generan un substrato para la enzima de la presente invención por acción de la enzima precursora sobre el substrato precursor. La combinación de la enzima precursora y substrato precursor se denomina de aquí en adelante "generador de substrato". La enzima de la presente invención se puede obtener o puede ser obtenible a partir de un microorganismo marino. Preferiblemente, la enzima de la presente invención se obtiene o se puede obtener de un alga marina. Preferiblemente, la enzima de la presente invención se obtiene o se puede obtener de Chondrus cripus. Preferiblemente, el compuesto anti-incrustaciones es peróxido de hidrógeno. Preferiblemente, la enzima es una oxidasa. preferiblemente, la enzima se selecciona de glucosa oxidasa, aminoácido L oxidasa, aminoácido D oxidasa, galactosa oxidasa, hexosa oxidasa, piranosa oxidasa, malato oxidasa, colesterol oxidasa, alcohol arílico oxidasa, alcohol oxidasa, latoesterol oxidasa, aspartato oxidasa, amina oxidasa, glutamato D oxidasa, etanolamina oxidasa, NADH oxidasa, ureato oxidasa (uricasa) y mezclas de las mismas, preferiblemente, la enzima es hexosa oxidasa.

Enzima hexosa oxidasa (HOX) La hexosa oxidasa (D-hexosa:?2-oxidoreductasa, EC 1.1.3.5) (también conocida como HOX) es una enzima que en presencia de oxígeno es capaz de oxidar la D-glucosa y varios otros azúcares reductores incluyendo maltosa, lactosa y celobiosa a sus lactonas correspondientes con subsecuente hidrólisis a los ácidos aldobiónicos respectivos. Por consiguiente, la HOX difiere de otra oxidoreductasa, la glucosa oxidasa que puede convertir solamente la D-glucosa, en que la enzima puede utilizar una gama más amplia de substratos de azúcar. La oxidación catalizada por HOX se puede ilustrar de la siguiente manera: D-glucosa + 02 ? ?-D-gluconolactona + H2O2, o D-galactosa + O2 ?- ?-D-galactonolactona + H2O2 La HOX es producida naturalmente por varias especies de algas marinas. Dichas especies se encuentran entre otras en la familia Gigartinaceae. Tal como se usa aquí, el término "HOX" denota una enzima que es capaz de oxidar los substratos seleccionados del grupo que consiste de D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, maltosa, lactosa y celobiosa. Preferiblemente, la hexosa oxidasa se obtiene o se puede obtener del alga marina Chondrus crípus. En un aspecto, la enzima hexosa oxidasa es una enzima cubierta por la descripción de EP-A-0832245.

Producción de hexosa oxidasa (HOX) El gen que codifica la enzima HOX ha sido clonado del alga marina Chondrus crípus (Stougaard and Hansen 1996, Hansen y Stougaard, 1997). La levadura metilotrófica Hansenula polymorpha (desarrollada en Dusseldorf/Alemania como un sistema de expresión para proteínas heterólogas) también se ha usado para producir la enzima HOX (la proteína nativa se purificó a partir de algas marinas (Poulsen and Hostrup, 1998)). WO 96/40935 y WO 98/13478 también describen la clonación y expresión en organismos hospederos recombinantes de un gen que condifica una proteína con actividad de HOX. En una modalidad preferida, la enzima hexosa oxidasa comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 1 o una variante, homólogo, derivado o fragmento de la misma. En una modalidad preferida, la enzima hexosa oxidasa comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 1. En una modalidad preferida, la enzima hexosa oxidasa es codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO. 1 o una variante, homólogo, derivado o fragmento del mismo. En una modalidad preferida, la enzima hexosa oxidasa es codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO. 1. En una modalidad preferida, la enzima hexosa oxidasa es codificada por una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO. 1 o una variante, homólogo, derivado o fragmento de la misma o una secuencia complementaria a la secuencia hibridable. En una modalidad preferida, la enzima hexosa oxidasa es codificada por una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO. 1 o una secuencia complementaria a la secuencia hibridable. La enzima, preferiblemente la enzima hexosa oxidasa, se puede preparar de la manera decrita en la Solicitud de Patente Británica No. 9927801.2 Variantes/homóloqos/derivados (secuencia de aminoácidos) Las secuencias- de aminoácidos preferidas de la presente invención se exponen en SEQ ID NO. 1 o son secuencias obtenibles de la enzima HOX de la presente invención pero también incluyen secuencias homologas obtenidas de cualquier fuente, por ejemplo proteínas virales/bacterianas relacionadas, homólogos celulares y péptidos sintéticos, así como variantes o derivados de los mismos. Por lo tanto, la presente invención cubre variantes, homólogos o derivados de las secuencias de aminoácidos que aquí se presentan, así como variantes, homólogos o derivados de la secuencia de nucleótidos que codifica para esas secuencias de aminoácidos. En el contexto de la presente invención, una secuencia homologa se considera que incluye una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferiblemente por lo menos 95 ó 98% idéntica al nivel de aminoácidos sobre por lo menos, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 1 de la secuencia que aquí se lista. En particular, la homología debe ser considerada típicamente con respecto a aquellas regiones de la secuencia que se sabe que son esenciales para la actividad enzimática más que para secuencias vecinas no esenciales. Estas reglones ¡ncluyen pero no se limitan a los dominios de unión de FAD putativos en HOX tales como SGGH79C, LGGH146I y LGGH-320A. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades químicas/funciones similares), en el contexto de la presente invención se prefiere que expresan homología en cuanto a identidad de secuencia. Las comparaciones de homología se pueden conducir a simple vista, o muy generalmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas de computadora comercialmente disponibles pueden calcular el porcentaje de homología entre dos o más secuencias. El porcentaje de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia está alineada con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia es comparado directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se denomina alineación "sin espacios", típicamente, dichas alineaciones sin espacios se realizan sólo en un número de residuos relativamente cortos.

Aunque es un método muy sencillo y consistente, no considera que, por ejemplo, en otro par de secuencias idéntico, una inserción o deleción haga que los residuos de aminoácidos siguientes salgan de alineación, dando así por resultado potencialmente una gran reducción en porcentaje de homología cuando se realiza una alineación global. Consecuentemente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineaciones óptimas que consideren posibles inserciones y deleciones sin castigar la calificación de homología global. Esto se puede lograr insertando "esapcios" en la alineación de secuencias para tratar de aumentar al máximo la homología local. Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "castigos de espacios" a cada espacio que ocurre en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencias con pocos espacios como sea posible -que refleje la relación mayor reflejante entre las dos secuencias comparadas- logrará una puntuación mayor que una con muchos espacios, típicamente se usan "costos de espacios afines" que cargan un costo relativamente alto por la existencia de un espacio y un castigo más pequeño por cada residuo subsecuente en el espacio. Este es el sistema de puntuación de espacios más comúnmente usado. Los castigos de espacio altos desde luego producirán alineaciones optimizadas con menores espacios. La mayoría de los programas de alineación permitirán que se modifiquen los castigos de espacio. Sin embargo, se prefiere usar los valores por omisión cuando se usa dicho software para comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se usa el paquete de GCG Wisconsin Bestfit package (véase más adelante) el castigo de espacio por omisión para secuencias de aminoácidos es de -12 para un espacio y de -4 para cada extensión. El cálculo de un porcentaje de homología máximo por lo tanto requiere primero la producción de una alineación óptima, considerando castigos de espacio. Un programa de computadora adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux eí al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Ejemplos de otro software que puede llevar a cabo comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a el paquete BLAST (véase Ausubel ef al., 1999 ibid - capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el equipo GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para investigación fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. Aunque el porcentaje de homología final se puede medir en términos de identidad, el proceso de alineación mismo típicamente no se basa en una comparación de parees de todo o nada. En lugar de ello, generalmente se usa una matriz de puntuación de similitud en escala que asigna puntuaciones a cada comparación por pares con base en similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz comúnmente usada es la matriz BLOSUM62-la matriz por omisión para el equipo de programas. Los programas BLAST generalmente usan ya sea los valores por omisión públicos o un cuadro de comparación de símbolos al cliente si se suministra (véase manual del usuario para detalles adicionales). Se prefiere usar los valores por omisión públicos por el paquete GCG o en el caso de otro software, la matriz por omisión, tal como BLOSUM62. Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el voltaje de homología, preferiblemente en porcentaje de identidad de secuencia. El software típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico. Los términos "variantes" o "derivados" en relación con las secuencias de aminoácidos de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, remplazo de, deleción de o adición de 1 (o más) aminoácidos de o a la secuencia que provee la secuencia de aminoácidos resultante tiene una actividad de enzima, preferiblemente teniendo por lo menos la misma actividad de enzima que la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No. 1 La SEQ ID No. 1 puede ser modificada para usarse en la presente invención. Típicamente, se hacen modificaciones que mantienen la actividad de la enzima de la secuencia. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, de sustituciones 1 , 2ó 3 a 10 ó 20, siempre que la secuencia modificada retenga la actividad enzimática requerida. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos que ocurren en forma no natural.

La SEQ ID No. 1 de la presente invención también puede tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que produzcan un cambio silencioso y que dé por resultado una enzima funcionalmente equivalente. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos deliberadas con base en similitud en polaridad, carga, solubilidad, carácter hidrofóbico, carácter hidrofílico y/o la naturaleza anfifática de los residuos mientras la actividad enzimática de la enzima HOX sea retenida. Por ejemplo, aminoácidos relativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos positivamente cargados incluyen lisína y arginina; y aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de carácter hidrofílico similares incluyen leucina, isoleucina, valina, lisina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Se pueden hacer sustituciones conservativas, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente cuadro. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna preferiblemente en la tercera columna pueden sustituirse unos a otros.

Variantes/homóloqos/derivados (secuencia de nucleótidos) Un experto en la técnica entenderá que numerosos nucleótidos diferentes pueden codificar la misma enzima HOX como resultado de la regeneración del código genético. Además, se debe entender que un experto en la técnica, usando técnicas de rutina, puede hacer sustituciones de nucleótidos que no afecten la enzima HOX codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención para reflejar el uso de codón de cualquier organismo hospedero particular enzima HOX de la presente invención se vaya a expresar. Los términos "variantes", "homólogos" o "derivados" en relación con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID No. 1 de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más) ácido nucleico de o a la secuencia que provee los códigos de secuencia de nucleótidos resultantes para una enzima HOX que tiene una actividad enzimática, preferiblemente que tiene una actividad que la secuencia de nucleótidos expresada en SEQ ID No. 1.de los listados de secuencias. Como se indicó anteriormente, con respecto a la homología de secuencias, preferiblemente hay por lo menos 75%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente aun por lo menos 90% de homología a Is secuencias mostradas en el listado de secuencias de la presente invención. Muy preferiblemente hay por lo menos 95%, muy preferiblemente por lo menos 98% de homología. Las comparaciones de homología de nucleótidos se pueden conducir como se describió anteriormente. Un programa de comparación de secuencias preferido es el programa GCG Winsconsin Bestfit anteriormente descrito. La matriz de puntuación por omisión tiene un valor de igualación de 10 para cada nucleótido idéntico y -9 para cada falta de igualación. El castigo de creación del espacio por omisión es de -50 y el espacio por omisión es de -3 para cada nucleótido. La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar selectivamente a las secuencias que aquí se presentan, o cualquier variante, fragmento o derivado del mismo, o al complemento de cualquiera de los anteriores. Las secuencias de nucleótidos son preferiblemente de por lo menos 15 nucleótidos de longitud, muy preferiblemente de por lo menos 20, 30, 40 o 50 nucleótidos de longitud.

Substrato Preferiblemente, el substrato se selecciona de péptidos, aminoácido L y carbohidratos/azúcares, incluyendo hexosas, preferiblemente glucosa, galactosa, lactosa, 2-desoxiglucosa, piranosa, xilano, celulosa, inulina, almidón, dextrano, y mezclas de los mismos.

En una modalidad altamente preferida, la combinación de enzima/substrato se selecciona de la glucosa/hexosa/oxidasa, glucosa/glucosa oxidasa, aminoácido Uaminoácido L oxidasa, galactosa/galactosa oxidasa, lactosa/ß-galactosidasa/hexosa oxidasa, lactosa/ß-galactosidasa/glucosa oxidasa, 2-desoxiglucosa/glucosa oxidasa, piranosa/piranosa oxidasa y mezclas de las mismas. En un aspecto, el compuesto anti-incrustaciones se genera por acción de la enzima sobre el substrato que está presente en la composición. Por lo tanto, el compuesto anti-incrustaciones es generado por un procedimiento de "un paso". Unos casos, el substrato se puede preparar in situ. En estos casos, la composición comprende además una enzima precursora y un substrato precursor en donde la enzima precursora y el substrato precursor se seleccionan de tal manera que la enzima precursora genera el substrato. En éste último aspecto, el compuesto anti-incrustaciones es generado por un procedimiento de "dos pasos". En el procedimiento de un paso, preferiblemente la enzima se selecciona de hexosa oxidasa, glucosa oxidasa, amonoácido L oxidasa, galactosa oxidasa, piranosa oxidasa y mezclas de los mismos. En un procedimiento de un paso preferiblemente el substrato se selecciona de una hexosa, preferiblemente glucosa, aminoácido L, galactosa, 2-desoxigIucosa, piranosa y mezclas de los mismos. En un procedimiento de un paso, preferiblemente la combinación de enzima/substrato se selecciona de glucosa/hexosa oxidasa, glucosa/glucosa oxidasa, aminoácido L/aminoácido L oxidasa, galactosa/galactosa oxidasa, 2-deoxiglucosa/glucosa oxidasa, piranosa/piranosa oxidasa, y mezclas de los mismos.

En el procedimiento de dos pasos, preferiblemente la enzima es hexosa oxidasa. En el procedimiento de dos pasos, preferiblemente el substrato es glucosa. En el procedimiento de dos pasos, preferiblemente la enzima precurosra es amiloglucosidasa. En el procedimiento de dos pasos, preferiblemente el precursor es almidón. Por lo tanto, en el procedimiento de dos pasos preferiblemente la combinación de substrato precursor/enzima precursora/enzima es almidón/amiloglucosidasahexosa oxidasa. Preferiblemente, el substrato precursor del procedimiento de dos pasos se selecciona de oligómeros y polímeros de substratos de enzimas oxidativas, almidón, lactosa, celulosa, dextrosa, péptido, ¡nulina y mezclas de los mismos. La provisión de substratos precursores se prefiere particularmente debido a que proveen liberación sostenida y/o prolongada del substrato por acción de la enzima precursora del substrato precursor. El almidón nativo es particularmente preferido como un substrato precursor. El almidón nativo provee cristales densamente compactados que pueden aplicarse fácilmente en revestimientos de superficie. Además, el almidón nativo es insoluble en agua.

La celulosa es también particularmente preferida como un substrato precursor. La celulosa es un componente común en pintura y el uso de celulosa como un substrato precursor reduce el número de componentes adicionales que se deben añadir a una composición de pintura. Preferiblemente, la enzima precursora del procedimiento de dos pasos se selecciona de enzimas de exo-acción capaces de degradar substratos oligoméricos o poliméricos a unidades monoméricas, por ejemplo, ß-galactosidasa, peptidasa; amiloglucosidasa y mezclas de los mismos. Opcionalmente, la composición comprende además un aglutinante para inmovilizar por lo menos uno de los constituyentes, opcionalmente para inmovilizar las enzimas. Las composiciones de la presente invención se pueden formular como revestimientos, lacas, tinturas, esmaltes y similares, de aquí en adelante denominados en forma genérica "revestimiento(s)". Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención provee un revestimiento que consiste de una composición como se definió anteriormente. Preferiblemente, el revestimiento se formula para tratamiento de una superficie seleccionada de un trabajo de madera exterior, superficie externa de un sistema de calentamiento central y un casco de una embarcación marina. El revestimiento puede incluir un vehículo líquido (solvente) para disolver o suspender la composición.

El vehículo líquido se puede seleccionar de cualquier líquido que no interfiera con las actividades de cualesquiera componentes esenciales de la composición. En particular, el vehículo líquido no interferiría con la actividad de la enzima esencial y/o compuesto anti-incrustaciones. Los vehículos líquidos adecuados se describen en US-A-5071479 e ¡ncluyen agua y solventes orgánicos que incluyen hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos aromáticos, tales como xileno, tolueno, mezclas de hidrocarburos alifáticos y aromáticos que tienen puntos de ebullición entre 100 y 32020C, preferiblemente entre 150 y 230°C; destilados de petróleo aromáticos altos, por ejemplo, solvente nafta, aceite de alquitrán destilados y mezclas de los mismos; alcoholes tales como butanol, octanol y glicoles; aceites vegetales y minerales; cetonas tales como acetona; fracciones de petróleo tales como espíritus minerales y queroseno, hidrocarburos clorados, esteres de glicol, éteres de éster glicólico, derivados y mezclas de los mismos. Ei vehículo líquido puede contener por lo menos un solvente polar, tal como agua, en mezcla con un solvente orgánico de baja volatilidad oleoso o en forma de aceite, tal como la mezcla de solventes aromáticos y alifáticos encontrada en espíritus blancos, también denominados comúnmente espíritus minerales. El vehículo puede contener típicamente por lo menos uno de un diluyente, un emulsificante, un agente humectante, un agente dispersante u otro agente activo de superficie. Ejemplos de emulsificantes adecuados se describen en el documento US-A-5071479 e ¡ncluyen éteres de óxido de etileno-nonilfenoi, esteres de polioxietilensorbitol o esteres de políoxietilensorbitán de ácidos grasos, derivados y mezclas de los mismos. Cualquier material de revestimiento de superficie adecuado se puede incorporar en la composición y/o revestimiento de ia presente invención. Ejemplos de materiales de revestimiento reconocidos en el comercio son resinas de cloruro de polivinilo en un sistema a base de solvente, hules clorados en un sistema a base de solvente, resinas acrílicas y resinas de metacrilato en sistemas a base de solvente o acuosos, sistemas de copolímero de cloruro de vinilo-acetato de vinilo como dispersiones acuosas o sistemas a base de solvente, copolímeros de butadieno tales como hules de butadieno-estireno, hules de butadieno-acrilonitrilo y hules de butadieno-estireno-acrilonitrilo, aceites de secado tales como aceite de linaza, resinas alquidálicas, asfalto, resinas epóxicas, resinas de uretano, resinas de poliéster, resinas fenólicas, derivados y mezclas de los mismos. La composición y/o revestimiento de la presente invención puede contener pigmentos seleccionados de pigmentos inorgánicos, tales como dióxido de titanio, óxido férrico, sílice, talco o arcilla china, pigmentos orgánicos tales como negro de humo o colorantes insolubles en agua de mar, derivados y mezclas de los mismos. La composición y/o revestimiento de la presente invención puede contener materiales tales como ácido colofónico para proveer liberación controlada del compuesto antl-incrustación, el ácido colofónico siendo a un grado muy ligero soluble en agua de mar.

La composición y/o revestimiento de la presente invención puede contener plastificantes, modificadores de características de reología, otros ingredientes convencionales y mezclas de los mismos. La composición y/o revestimiento de la presente invención, particularmente el revestimiento, comprende además un adyuvante convencionalmente empleado en composiciones usadas para proteger materiales expuestos a un ambiente acuático. Estos adyuvantes se pueden seleccionar de fungicidas adicionales, solventes auxiliares, aditivos de procesamiento tales como desespumadores, fijadores, plastificadores, estabilizadores de UV o incrementadores de estabilidad, colorantes solubles en agua o ¡nsolubles en agua, pigmentos de color, sicativos, inhibidores de corrosión, espesantes o agentes antisedimentación tales como carboximetilcelulosa, ácido poliacrílico o ácido poiimetacrílico, agentes antidesprendimiento y mezclas de los mismos. El fungicida(s) adicional(es) usado en la composición y/o revestimiento de la presente invención es preferiblemente soluble en el vehículo líquido. En un aspecto la presente invención provee un anti-incrustación marino que consiste de una composición como se definió antes. Preferiblemente, el anti-incrustación es autopulible. En un aspecto de la presente invención, el substrato o generador de substrato y/o la enzima son encapsulados. Preferiblemente, el substrato/generador de substrato y/o enzima son encapsulados por una membrana semipermeable. El substrato/generador de substrato y enzima se pueden encapsular individualmente en forma independiente uno de otro o se pueden encapsular juntos. En la modalidad formadora, el substrato/generador de substrato o enzimas puede ser activado por la incrustación, por ejemplo, el material encapsulante se puede seleccionar de tal manera que al contacto con la incrustación, el substrato/generador de substrato o enzima pueda ser liberado para hacer contacto con el otro del substrato/generador de substrato o enzima. De esta manera, se puede proveer una composición que sólo provea un compuesto anti-incrustaciones o incremente la provisión de un compuesto anti-incrustaciones cuando se ponga en contacto con la incrustación. La composición de la presente invención puede proveer como un producto listo para usarse o como un concentrado. El producto listo para usarse puede estar en forma de una solución acuosa, dispersión acuosa, solución oleosa, dispersión oleosa, emulsión o preparación de aerosol. El concentrado se puede usar, por ejemplo, como un aditivo para revestir o se puede diluir antes de usarse como solventes adicionales o agentes de suspensión. Una preparación de aerosol de conformidad con la invención se puede obtener de la manera usual incorporando la composición de la presente invención que comprende o que está disuelta o suspendida en, un solvente adecuado, en un líquido volátil adecuado o para usarse como propelente, por ejemplo la mezcla de derivados de cloro y flúor de metano y etano comercialmente disponibles bajo el nombre comercial "Freon", o aire comprimido. Tal como se describe en el documento US-A-5071479, la composición y/o revestimiento de la presente invención puede incluir ingredientes adicionales que se sabe que con útiles en conservadores y/o revestimientos. Dichos ingredientes incluyen fijadores tales como carboximetilcelulosa, alcohol polivinílico, parafina, co-solventes tales como acetato de etilenglicol y acetato de metoxipropilo, plastificadores tales como esteres de ácido benzoico y ftalatos, por ejemplo, ftalato de dibutilo, ftalato de dioctilo y ftalato de didodecilo, derivados y mezclas de los mismos. Colorantes opcionales, pigmentos de color, inhibidores de corrosión, estabilizadores químicos o sicativos (secadores) tales como octato de cobalto y naftenato de cobalto, también se pueden incluir dependiendo de las aplicaciones específicas. La composición y/o revestimiento de la presente invención se puede aplicar mediante cualquiera de las técnicas conocidas incluyendo cepillado, aspersión, revestimiento por rodillo, inmersión y combinaciones de las mismas. Las composiciones de la presente invención se pueden preparar simplemente mezclando los diversos ingredientes a una temperatura a la cual no son adversamente afectados. Las condiciones de preparación no son críticas. El equipo y métodos convencionalmente empleados en la fabricación de revestimientos y composiciones similares se pueden emplear de manera ventajosa. La invención se describirá ahora a manera de ejemplo únicamente en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS El efecto anti-incrustaciones de una composición anti-incrustaciones de la presente invención se prueba de acuerdo con los siguientes ejemplos. Estos ejemplos mostraron la efectividad de la presente composición para prevenir incrustaciones. Los ejemplos también proveen optimización de las propiedades anti-incrustaciones de las presentes composiciones. La hexosa oxidasa (HOX) usada en cada uno de los presentes ejemplos está disponible de DaniscoCultor. La HOX es un producto fermentado de la levadura Hansenula polymofha que expresa el gen que codifica la enzima HOX clonada de la alga marina Chondrus críspus.

EJEMPLO 1 Preparación de una composición anti-incrustaciones ("un paso") La hexosa oxidasa soluble o inmovilizada u otra enzima que genera peróxido de hidrógeno tal como la glucosa oxidasa, se prueba como una enzima que genera un compuesto anti-incrustaciones en una composición antí-incrustaciones. La hexosa oxidas puede ser inmovilizada, por ejemplo, uniendo a un ¡ntercambiador de aniones, Q Sepharose FF™ (disponible de Pharmacia) usando regulador de pH de trietanolamina 20 mM, pH 7.3. En forma alternativa, la hexosa oxidasa o las enzimas que generan peróxido de hidrógeno está unida covalentémente a un vehículo adecuado tal como Sepharose™ activado epóxido (Pharmacia, Suecia), agarosa activada por carbodiimida (Bio-Rad, E.U.A.). También se pueden usar otros procedimientos convencionales conocidos en la técnica para inmovilización. El intervalo de concentraciones usadas es de 0.0001 a 1000 U de actividad de hexosa oxidasa/ enzima que genera peróxido de hidrógeno por ml de composición anti-incrustaciones. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de H202 por minuto a 25°C. Para lograr su grado de adecuación para usarse en la presente invención, la actividad de la enzima se puede probar de la siguiente manera. La actividad de la hexosa oxidasa (HOX) se mide de acuerdo con el siguiente procedimiento.

La prueba de HOX se basa en la medición de peróxido de hidrógeno generado en la oxidación de la glucosa. El peróxido de hidrógeno oxida la o-dianisidina en presencia de peroxidasa para formar un colorante.

HOX ß-D-glucosa + H20 + 02 ? D-glucono-delta-lactona + H20 POD H2O2 + o-dianisidinared. 2-H20 + o-dianisidinar0 Reactivos 1. regulador de pH de fosfato 00 mM, pH 6.3. 2. 100 mM de glucosa (SIGMA, G-8270) en regulador de pH de fosfato 100 mM, pH 6.3. 3. o-Dianisidina (SIGMA, D-3352), 3.0 mg/ml en agua destilada. 4. Peroxidasa (SiGMA, P-8125), 0,10 mg/ml en regulador de pH de fosfato 100 mM, pH 6.3.

Prueba 120 µl de reactivo 1 150 µl de reactivo 2 10 µl de reactivo 3 10 µl de reactivo 4 y 10 µl de solución de enzima La prueba se realiza en una placa de microtitulación. La reacción se inicia mediante la adición de solución de enzima. La mezcla se incuba a 25°C durante 15 minutos con agitación. El testigo contiene todos los componentes con agua en lugar de la solución de enzima. La formación del colorante se mide en lector de placa de microtitulación a 405 nm. La lineaiidad de la reacción se puede verificar usando un programa de cinética sobre el lector de microtitulación. Una curva estándar de peróxido de hidrógeno se puede construir usando concentraciones variables de H202 (MERCK).

EJEMPLO 2 Preparación de una composición anti-incrustaciones (dos pasos") La glucosa y galactosa en concentraciones de 0.01 a 100 µg por ml de composición anti-incrustaciones se prueban como substratos para generar un substrato para hexosa oxidasa en los sistemas descritos en el ejemplo 1. A fin de proveer un sistema que genere substrato continuo, se usa almidón, preferiblemente granulos de almidón intactos de trigo, maíz o papa, en una concentración de 0.01 ng a 100 µg por mi de composición anti-incrustaciones, junto con amiloglucosidasa (GRINDAMYL™ AG 1500 Bakery Enzyme de DaniscoCultor u otro producto de amiloglucosidasa comercial). Los componentes están presentes en concentraciones que proveen de 0.000001 a 10 AUG por ml de composición anti-incrustaciones. 1 AUG definida como la actividad de amiloglucosidasa que libera 1 µmol de glucosa por minuto de maltosa (0.5% p/v) en 50 mM de acetato de sodio, pH 5.0 (ajustado con ácido acético concentrado) a 40°C. La prueba se detiene transfiriendo 200 µl de mezcla de prueba a 100 µl de cloruro de ácido clorhídrico 0.1 M y la cantidad de glucosa liberada se mide usando reactivo de glucosa deshidrogenasa (Merck No. 12193) u otro sistema de detección de glucosa.

EJEMPLO 3 Generación de peróxido de hidrógeno por pintura que contiene HOX Para probar la capacidad de la hexosa oxidasa (HOX) para generar peróxido de hidrógeno, se realizó el siguiente experimento.

A 11.0 g de pintura (pintura a base de agua para pared Sadolin Glans 7 y a base de aceite Histor 9010, respectivamente) se añadieron 0.2, 0.5 y 1 g, respectivamente, de HOX (producto fermentado DaniscoCultor de Hansenula polymofha) secado por aspersión sobre almidón (10 U/g). A la pintura a base de agua se añadieron también 5 g de agua por tratamiento. Se sumergieron (parte de la cabeza) pipetas de transferencia de plástico desechables (Sarsedt) en la pintura. Se dejó secar al aire las pipetas de transferencia durante 3 horas. La actividad de la hexosa oxidasa (HOX) se midió después por inmersión de la cabeza de la pipeta cubierta con pintura en un tubo de vidrio con 2 ml de reactivo de prueba de HOX, véase más adelante, la única actividad de HOX proveniente de la HOX en la pintura. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente. Como testigo se usó pintura sin HOX añadida. El resultado del experimento se muestra en el cuadro 1. La HOX es homogéneamente distribuida en la pintura, ya que la superficie completa de la pintura inmediatamente se torna roja cuando hace contacto con el reactivo de prueba de HOX. El desarrollo del color se observa inmediatamente indicando que la pintura no tiene ningún efecto inhibidor sobre la actividad de la HOX. Este experimento prueba que la HOX es capaz de generar peróxido de hidrógeno a partir del substrato añadido exógeno (aquí la glucosa) aún cuando es inmovilizada en una matriz de pintura después del secado.

CUADRO 1 Actividad Pintura a base de agua, testigo 0 0.2 g de HOX + 0.5 g de HOX ++ 1.0 g de HOX +++ Pintura a base de aceite, testigo 0 0.2 g de HOX + 0.5 g de HOX ++ 1.0 g de HOX +++ Control, reactivo de prueba más HOX libre +++ Ei intervalo de concentraciones usado es de 0.0001 a 1000 U de actividad de hexosa oxidasa o de una enzima generadora de popróxido de hidrógeno alternativa por ml de composición anti-incrustaciones.

EJEMPLO 4 Sistema de modelo para revestimiento El tubo de diálisis que contiene una composición antiincrustaciones se usa como un sistema de modelo para un revestimiento para prevenir las incrustaciones sobre la superficie de un matertial revestido. Una composición anti-incrustaciones dentro del tubo de diálisis se usa para generar una concentración de peróxido de hidrógeno sobre la superficie del tubo de diálisis efectivo para prevenir las incrustaciones. El tubo de diálisis usado tiene un valor de corte de aproximadamente 10000 Da. El tubo de diálisis es ya sea un tubo de diálisis o un cassette de diálisis (tal como Slide-A-Lyzer™ disponible de Pierce; II, E.U.A.). El tubo de diálisis se sumerge en un vaso de precipitado de vidrio con 1 a 5 litros de agua de mar o de un lago recogida como se describió antes. El vaso de precipitado se agita lentamente con un agitador magnético y se incuba a temperatura ambiente en proximidad con una ventana para permitir que la luz del día caiga sobre el mismo. Las incrustaciones sobre el tubo de diálisis se monitorean visualmente hasta cuatro días con base en la apariencia de la capa de crecimiento microbiano sobre el tubo de diálisis y se clasifica en una escala de 1 a 5 como se describió antes. Como un control negativo, se usa un tubo de diálisis que contiene agua corriente. «« Opcionalmente, la catalasa inmovilizada sobre piezas de membrana de nitrocelulosa, que han sido subsecuentemente bloqueadas con 0.1 % de Tween 20, se añaden al agua de mar o de lago para evitar acumulación de peróxido de hidrógeno en el agua que rodea el tubo de 10 diálisis. La concentración de catalasa usada en el intervalo de 0.000001 a 100 CU, donde 1 CU se define como la actividad de catalasa que degrada 1 µmol de peróxido de hidrógeno por minuto a 30°C en regulador de pH de fosfato 50mM, pH 7.0, como se describe para la catalasa en el catálogo de Sigma: Biochemicals Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents, 15 Sigma Chemical Company 1995, página 221. Las composiciones de la presente invención son efectivas para prevenir incrustaciones.

EJEMPLO 5 20 Estabilidad de HOX en la pintura Las cabezas de pipetas de transferencia pintadas descritas en el ejemplo 1 se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 minutos y después se sometieron a "prueba" en una mezcla de reactivo como se describe en el ejemplo 2.

CUADRO 2 s« Actividad Pintura a base de agua, testigo 0 0.2 g de HOX + 0.5 g de HOX ++ 10 1.0 g de HOX +++ Pintura a base de aceite, testigo 0 0.2 g de HOX + 0.5 g de HOX ++ 1.0 g de HOX +++ 15 Control, reactivo de prueba más HOX libre +++ De los resultados del cuadro 2, está claro que la HOX era estable durante dos meses a temperatura ambiente en una matriz de pintura. 20 EJEMPLO 6 Prueba de revestimiento Preparación de un sistema de prueba para una composición anti-incrustaciones Muestras de 0.5 a 5 ml de agua de lago o agua de mar se recogieron en tubos de ensayo del lago Brabrandsoen cerca de Aarhus, Dinamarca, y del Mar Báltico cerca de Aarhus. El día en que se obtuvieron las muestras de agua, la composición antl-incrustaciones que se han de probar se añaden a los tubos de ensayo y se sellan con Parafilm™ . Los tubos de ensayo se incuban a temperatura ambiente en proximidad de una ventana para dejar que la luz incida sobre los mismos. Las incrustaciones se monitorean durante cuatro semanas con respesto a la apariencia de la capa de crecimiento microbiano sobre las paredes del tubo de ensayo. Para comparación, se usó un tubo de ensayo con 0.1 % de azida de sodio y un tubo de ensayo sin composición anti-incrustaciones como controles positivo y negativo, respectivamente. Estos tubos de ensayo se clasificaron como 1 y 5, respectivamente, en una escala de 1 a 5 para actividad altamente eficiente a actividad anti-incrustaciones. Se usa material de revestimiento anti-incrustaciones marinas comercial sin biocida anti-incrustaciones añadido. Las composiciones antiincrustaciones de conformidad con la presente invención se mezclan en el material de revestimiento y se aplican a la superficie de placas de metal, vidrio o plástico de acuerdo con las instrucciones del fabricante del material de revestimiento. Las placas revestidas se sumergen en agua en un lago o en agua de mar. Las incrustaciones sobre las placas se monitorean visualmente hasta durante 2 años con base en la apariencia de una capa de crecimiento microbiano sobre las placas y se clasifica en una escala de 1 a 5 como se describió antes. Como control negativo se usa un revestimiento sin composición anti-incrustaciones. Las composiciones de la presente invención son efectivas para prevenir las incrustaciones.

EJEMPLO 7 Estabilidad de compopsición anti-incrustaciones en agua de acuario A 10.0 g de pintura (Histor 9010 a base de aceite) se añadieron 500 mg de almidón (Merck 1253), 50 mg de HOX (producto fermentado DaniscoCultor de Hansenula polymorpha) secado por aspersión sobre almidón (10 U/g). Una pipeta de transferencia de plástico desechable (Sarstedt) se sumergió (parte de la cabeza) en la pintura. La pipeta de transferencia se dejó secar al aire durante 24 hr. Después se mantuvo en 250 ml de agua de un acuario en una botella Kautex durante dos meses. La botella se dejó reposar en una ventana a plena luz del día. Después de dos meses, la cabeza de la pipeta se lavó, se secó al aire y después se sometió a "prueba" en mezcla de reactivo de HOX completa. La HOX aún mostró actividad completa.

EJEMPLO 8 Prueba de sistema generador de substrato A fin de proveer un sistema generador de substrato, junto con HOX se usa almidón, preferiblemente granulos de almidón intactos de trigo, maíz o papa en una concentración de 0.01 ng a 100 µg por ml de composición anti-incrustaciones, así como amiioglucosidasa (GRINDAMYL™ AG 10000 Bakery Enzyme de DaniscoCultor u otro producto de amiloglucosidasa comercial) en concentraciones que proveen 0.000001 a 100 AGU por ml de composición anti-incrustaciones. A 10.0 g de pintura (Histor 9010 a base de aceite) se añadieron 500 mg de almidón (Merck 1253), HOX (producto fermentado DaniscoCultor de Hansenula polymorpha) secado por aspersión sobre almidón (10 U/g) y AMG (10000 AGU/g) como se indica en el cuadro. Una pipeta de transferencia de plástico desechable (Sarstedt) se sumergió (parte de la cabeza) en la pintura. La pipeta de transferencia se dejó secar al aire durante 3 horas. La actividad de la hexosa oxidasa (HOX) se midió después por inmersión de la cabeza de la pipeta cubierta con pintura en un tubo de vidrio con 2 ml de reactivo de prueba de HOX sin glucosa, para probar el reactivo véase el ejemplo 1 , la única actividad de HOX proveniente de la HOX en la pintura y el único substrato para HOX generada por AMG en la pintura hidrolizando el almidón en la pintura a glucosa. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 48 hr. Como testigo se usó pintura sin HOX y AMG añadida.

CUADRO 3 Actividad 50 g de HOX + 10 mg de AMG + 50 g de HOX + 20 mg de AMG + 50 g de HOX Testigo (sin enzimas) Los resultados del cuadro 3 muestran que la combinación de HOX y AMG funciona como se pretendía. AMG está generando glucosa a partir del almidón co-inmovilizado en la pintura y HOX está generando peróxido de hidrógeno a partir de la glucosa generada.

EJEMPLO 9 Actividad en función de la temperatura La hexosa oxidasa (HOX purificada) se evaluó para actividad como función de la temperatura y se comparó con una glucosa oxidasa comercial (Amano 081443/00018).

Procedimiento: Muestra: La muestra de enzima se disuelve en agua y se desala en una columna de PD10 usando regulador de pH de fosfato 20 mM, pH 6.3 y se diluye a 0.4 U/ml.

A un pozo de prueba de ELISA se añade: 150 µl de glucosa 100 mM en regulador de pH de fosfato 100 mM, pH 6.3 120 µl de regulador de pH de fosfato 100 mM, pH 6.3 10 µl de o-dianisidina (3 mg/ml en agua) 10 µl de peroxidasa (0.10 mg/ml en regulador de pH de fosfato 100 mM, pH 6.3) 10 µl de muestra Se probó durante 10 minutos y se midió a 405 nm.

Resultados Los resultados de la medición de la actividad como función de la temperatura se muestra en el cuadro 4 y la figura 1.

CUADRÓ 4 Los resultados de la actividad versus la temperatura ilustran claramente una diferencia en el perfil de actividad. La hexosa oxidasa tiene su temperatura óptima entre 25-35°C, que es casi coincidente con el óptimo para la temperatura óptima de las incrustaciones. Por el contrario, se ve que la GOX tiene una temperatura óptima a 50°C que está muy por arriba de las temperaturas que se pueden alcanzar en el mar. Todas las publicaciones mencionadas en la descripción anterior se incorporan aquí por referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistema descritos de la invención serán evidentes para loas expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con modalidades preferidas específicas, se debe entender que la invención tal como se reivindica no debe limitarse a dichas modalidades específicas. De hecho, se pretende que varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias- para los expertos en química o campos relacionados estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Nombre de la molécula: hoxpic 1644 pb ADN lineal Secuencia impresa: 1-1644 (completa) Fecha de impresión 4 de junio 1999 Descripción: 1 ATG GCT ACT TTG CCA CAA AAG GAC CCA GGT TAC ATT GTT ATT M A T L P Q K D P G Y I V I 43 GAC GTC AAC GCT GGT ACT CCA GAC AAG CCT GAC CCA AGA TTG D V N A G T P D K P D P R L 85 CCA TCC ATG AAG CAA GGT TTC AAC AGA AGA TGG ATT GGT ACC P S M K Q G F N R R W I G T 127 AAC ATC GAT TTC GTT TAC GTC GTT TAC ACT CCA CAA GGT GCT N I D F V Y V V Y T P Q G A 169 TGT ACT GCT TTG GAC AGA GCT ATG GAA AAG TGT TCT CCA GGT C T A L D R A M E K C S P G 211 ACC GTC AGA ATC GTT TCT GGT GGT CAC TGT TAC GAA GAC TTC T V R I V S G G H C Y E D F 253 GTT TTC GAC GAA TGT GTC AAG GCT ATT ATC AAC GTT ACT GGT V F D E C V K A I I N V T G 295 TTG GTT GAA TCT GGT TAC GAC GAC GAT AGA GGT TAC TTC GTC L V E S G Y D D D R G Y F V 337 TCT TCC GGT GAC ACC AAC TGG GGT TCC TTC AAG ACC TTG TTC S S G D T N W G S F K T L F 379 AGA GAC CAC GGT AGA GTT TTG CCA GGT GGT TCC TGT TAC TCC R D H G R V L P G G S C Y S 421 GTC GGT TTG GGT GGT CAC ATT GTC GGT GGA GGT GAC GGT ATT V G L G G H I V G G G D G I 63 TTG GCC AGA TTG CAC GGT TTG CCA GTC GAT TGG TTA TCC GGT L A R L H G L P V D W L S G 505 GTT GAA GTT GTC GTT AAG CCA GTC TTG ACC GAA GAC TCT GTT V E V V V K P V L T E D S V 547 CTT AAG TAC GTT CAC AAG GAT TCC GAA GGT AAC GAC GGT GAG L K Y V H K D S E G N D G E 589 TTG TTT TGG GCT CAC ACT GGT GGA GGT GGA GGT AAC TTC GGT L F W A H T G G G G G N F G 631 ATT ATC ACC AAA TAC TAC TTC AAG GAT TTG CCA ATG TCT CCA I I T K Y Y F K D L P M S P 673 AGA GGT GTC ATC GCT TCT AAC TTA CAC TTC TCT TGG GAC GGT R G V l A S N L H F S W D G 715 TTC ACT AGA GAT GCC TTG CAA GAT TTG TTG ACT AAG TAC TTC F T R D A L Q D L L T K Y F 757 AAG TTG GCT AGA TGT GAT TGG AAG AAT ACT GTT GGT AAG TTC K L A R C D W K N T V G K F 799 CAA ATC TTC CAC CAA GCA GCT GAA GAG TTT GTT ATG TAC TTG Q I F H Q A A E E F V M Y L 841 TAT ACA TCC TAC TCT AAC GAC GCC GAG AGA GAA GTT GCC CAA Y T S Y S N D A E R E V A Q 883 GAC AGA CAC TAT CAT TTG GAG GCT GAC ATT GAA CAG ATC TAC D R. H Y H L E A D I E Q I Y 925 AAA ACA TGC GAG CCT ACC AAA GCT CTT GGT GGT CAT GCT GGT K T C E P T K A L G G H A G 967 TGG GCT CCT TTC CCT GTT AGA CCT AGA AAG AGA CAC ACA TCC W A P F P V R P R K R H T S 1009 AAG ACT TCT TAT ATG CAT GAC GAG ACT ATG GAC TAC CCT TTC K T S Y H D E T M D Y P F 1051 TAC GCT TTG ACT GAG ACT ATC AAC GGT TCC GGT CCT AAT CAG Y A L T E T I N G S G P N Q 1093 AGA GGT AAG TAC AAG TCT GCT TAC ATG ATC AAG GAC TTT CCA R G K Y K S A Y M I K D F P 1135 GAC TTC CAG ATT GAT GTT ATC TGG AAA TAC CTT ACT GAG GTT D F Q I D V I W K Y L T E V 1177 CCT GAC GGT TTG ACT AGT GCC GAA ATG AAG GAT GCT CTT CTT P D G L T S A E M K D A L L 1219 CAG GTT GAT ATG TTC GGT GGT GAG ATT CAC AAG GTT GTT TGG Q V D M F G G E I H K V V W 1261 GAT GCT ACT GCA GTT GCT CAG AGA GAG TAC ATC ATC AAA CTG D A T A V A Q R E Y I I K L 1303 CAG TAC CAG ACA TAC TGG CAG GAA GAA GAC AAG GAT GCA GTT Q Y Q T .Y W Q E E D K D A V 1345 AAC TTG AAG TGG ATT AGA GAC TTT TAC GAG GAG ATG TAT GAG N L K W I R D F . Y E E M Y E 1387 CCT TAT GGT GGT GTT CCA GAC CCT AAC ACT CAG GTT GAG AGT P Y G G V P D P N T Q V E S 1429 GGT AAA GGT GTT TTT GAG GGA TGC TAC TTC AAC TAC CCT GAT G K G V F E G C Y F N Y P D 1471 GTT GAC TTG AAC AAC TGG AAG AAC GGT AAG TAT GGT GCC TTG V D L N N W K N G K Y G A L 1513 GAA CTT TAC TTT TTG GGT AAC CTG AAC AGA TTG ATC AAG GCC E L Y F L G N L N R L I K A 1555 AAA TGG TTG TGG GAT CCT AAC GAG ATC TTC ACA AAC AAA CAG K W L W D P N E I F T N K Q 1597 TCT ATC CCT ACT AAA CCT CTT AAG GAG CCT AAG CAG ACT AAA S I P T K P L K E P K Q T K 1639 TAG TAG

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición anti-incrustaciones que comprende: (i) un material de revestimiento de superficie; (ii) una enzima obtenida o que se puede obtener de un organismo marino; y (i¡¡) (a) un substrato para la enzima; y/o (b) una enzima precursora y un substrato precursor, en donde la enzima precursora y el substrato precursor se seleccionan de tal manera que un substrato para la enzima se puede generar por acción de la enzima precursora sobre el substrato precursor; en donde la enzima y el substrato se seleccionan de tal manera que un compuesto anti-incrustaciones se puede generar por acción de la enzima sobre el substrato.

2.- Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la enzima se obtiene o se puede obtener de un alga marina.

3.- Una composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque la enzima se obtiene o se puede obtener de Chondrus críspus.

4.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la enzima es hexosa oxidasa.

5.- Una composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la enzima hexosa oxidasa comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No 1 o una variante, homólogo, derivado o fragmento de la misma.

6.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el substrato es un azúcar.

7.- Una composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el azúcar es glucosa.

8.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición comprende una enzima precursora y un substrato precursor, en donde la enzima precursora y el substrato precursor se seleccionan de tal manera que el substrato precursor genere un substrato para la enzima por acción sobre el substrato precursor.

9.- Una composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la enzima precursora es amiloglucosidasa.

10.- Una composición de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizada además porque el substrato precursor es almidón.

11.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición comprende un aglutinante para inmovilizar por lo menos uno de los constituyentes de la composición, preferiblemente para inmovilizar la enzima.

12.- Un revestimiento que consiste de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

13.- Un revestimiento de conformidad con la reivindicación 12, formulado para el tratamiento de una superficie seleccionada de estructuras de madera exteriores, superficie externa de un sistema de calentamiento central y un casco de una embarcación marina.

14.- Un material anti-incrustaciones marino que consiste de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

15.- Un material anti-incrustaciones de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el material anti-incrustaciones es autopulible.

16.- Un método para liberar un compuesto anti-incrustaciones de un revestimiento de superficie, dicho método consistiendo en incorporar en un revestimiento (i) una enzima obtenida o que se puede obtener de un organismo marino; y (ii) (a) un substrato para la enzima; y/o (b) una enzima precursora y un substrato precursor, en donde un substrato para la enzima se puede generar por acción de la enzima precursora sobre el substrato precursor; en donde el compuesto anti-incrustaciones se genera por acción de la enzima sobre el substrato.

17.- Una composición como se describió substancialmente antes con referencia a los ejemplos.

18.- Un revestimiento como se describió substancialmente antes con referencia a los ejemplos.

19.- Un material anti-incrustaciones marino como se describió substancialmente antes con referencia a los ejemplos.

20.- Un método como se describió substancialmente antes con referencia a los ejemplos. ? f