PL200268B1

PL200268B1 - Kompozycja przeciwporostowa, jej zastosowanie oraz sposób uwalniania związku przeciwporostowego

Info

Publication number: PL200268B1
Application number: PL353234A
Authority: PL
Inventors: Charlotte Horsmans Poulsen; Karsten Matthias Kragh
Original assignee: Danisco
Priority date: 1999-06-04
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2008-12-31
Also published as: EP1282669A2; KR100751791B1; KR20020010153A; NO328988B1; WO2000075293A2; US20130224820A1; AU5097800A; US20140363478A1; AU777162B2; NZ515111A; CN1364185A; EP1282669B1; JP4679776B2; DE60033187D1; MXPA01012448A; EP1811001B1; ES2391298T3; EP1811001A2; ES2280216T3; PL353234A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja przeciwporostowa, jej zastosowanie oraz sposób uwalniania zwi azku prze- ciwporostowego z kompozycji przeciwporostowej. Kompozycja przeciwporostowa charakteryzuje si e tym, ze zawiera: (i) materia l pow lokotwórczy; (ii) enzym oksydaz e otrzyman a z organizmu morskiego lub oksydaz e otrzyman a przez klonowanie i ekspresj e w rekombinantowym organizmie gospodarza genu koduj acego oksydaz e otrzyman a z organizmu morskiego; oraz (iii) enzym prekursorowy i substrat prekurso- rowy, które s a wybrane tak, ze substrat dla enzymu utleniaj acego jest generowalny przez dzialanie enzymu prekursorowego na substrat prekursorowy, przy czym zakres st ezenia wynosi od 0,0001 do 1000 U aktywno sci oksydazy na ml kompozycji prze- ciwporostowej i gdzie - materia l pow lokotwórczy jest wybrany spo sród zywic polichlorku winylu na bazie rozpuszczalnika, chlorowanych kau- czuków na bazie rozpuszczalnika, zywic akrylowych i metakrylowych na bazie rozpuszczalnika lub w uk ladach wodnych, kopo- limerów chlorek winylu - octan winylu w dyspersjach wodnych lub na bazie rozpuszczalnika, kopolimerów butadienu, kauczuków butadienowo-styrenowych, kauczuków butadienowo-akrylonitrylowych, kauczuków butadienowo-styrenowo-akrylonitrylowych, olejów schn acych, oleju lnianego, zywic alkidowych, asfaltu, zywic epoksydowych, zywic uretanowych, zywic poliestrowych, zywic fenolowych i ich mieszanin; - enzym prekursorowy jest wybrany spo sród enzymów dzia laj acych jak egzoenzymy, zdolnych do degradacji oligome- rycznych lub polimerycznych substratów na jednostki monomeryczne; - substrat prekursorowy wybrany jest spo sród oligomerów i polimerów substratów dla enzymów utleniaj acych; - substrat wybrany jest spo sród peptydów, L-aminokwasów, w eglowodanów/cukrów obejmuj acych heksozy, a korzystnie glukoz e, galaktoz e, laktoz e, 2-deoksyglukoz e, piranoz e, ksylan, celuloz e, inulin e, skrobi e, dekstran, pektyn e i ich mieszaniny; - i enzym i substrat s a dobrane tak, ze zwi azek przeciwporostowy jest generowalny przez dzia lanie enzymu na substrat. PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja przeciwporostowa. W szczególności wynalazek dotyczy kompozycji przeciwporostowej zawierającej enzym posiadający zdolność wytwarzania związku mającego działanie przeciwporostowe.

Zgodnie z opisem patentowym US-A-5071479, biocydy są wymagane w wielu różnych środowiskach, takich jak środki przeciwgrzybicze w farbach pokojowych, algicydy do świeżej wody, środki przeciwporostowe do konstrukcji morskich narażonych na kontakt z florą i fauną morską. Jak wiadomo, pleśń i grzybnia mogą wzrastać na farbach pokojowych i podobnych, wykorzystując jako pożywkę środowisko farby lub, w pewnych przypadkach, warstwy podpowierzchniowe, takie jak drewno. Z oczywistych powodów, może to powodować uszkodzenia pomalowanej powierzchni i/lub pogorszenie wyglądu pomalowanej powierzchni. Biocyd może być wprowadzony do farby i gdy grzybnia i owocniki grzyba stykają się lub przenikają przez błonę farby - wówczas, poprzez bezpośredni kontakt z biocydem w błonie, grzyb ulega zniszczeniu. W chłodniach kominowych wykorzystujących wodę bieżącą, jeśli brakuje skutecznych środków je zwalczających, mogą się rozwijać szlam, pleśń i algi.

Zgodnie z dyskusją w US-A-5071479, wzrastanie organizmów morskich na zanurzonych częściach kadłuba statku stanowi problem szczególny. Wzrastanie zwiększa opór tarcia kadłuba płynącego statku, co prowadzi do zwiększonego zużycia paliwa i/lub zmniejszenia jego szybkości. Wzrastające organizmy morskie gromadzą się tak szybko, że środek zaradczy w postaci czyszczenia i w razie potrzeby ponownego malowania w suchym doku jest generalnie uważ any za zbyt kosztowny. Alternatywę, którą praktykowano przez lata ze zwiększającą się skutecznością, stanowi ograniczenie stopnia porastania przez nakładanie na kadłub farby powierzchniowej zawierającej środki przeciwporostowe. Środki przeciwporostowe stanowią biocydy, które uwalniają się z powierzchni farby na powierzchni kadłuba przez dłuższy okres czasu w dawce śmiertelnej dla organizmów morskich. Farby przeciwporostowe zawodzą tylko kiedy stężenie biocydu na powierzchni farby spada poniżej dawki śmiertelnej i w przypadku nowoczesnych farb należy się spodziewać około dwuletniego okresu ich przydatności.

Biocyd szczególnie szeroko stosowany, zwłaszcza w przeciwporostowych środkach morskich, stanowi tributylocyna (TBT). Jednakże w przypadku stosowania w charakterze organicznych składników przeciwporostowo aktywnych w kompozycjach nawierzchniowych do zastosowań morskich, biocydów cynowych w ich obecnych stężeniach handlowych, rosną obawy o wywieranie przez nie niekorzystnego wpływu na środowisko. Wykazano, że ze względu na szeroko rozpowszechnione stosowanie w farbie do malowania dna statków w szczególności związków typu tributylocyny, przy stężeniach przekraczających 20% wag. w farbie, zanieczyszczenie okolicznych wód w wyniku wymywania osiągnęło poziom powodujący degradację omułków jadalnych i organizmów muszelkowych. Efekt ten stwierdzono wzdłuż francusko-brytyjskiej linii brzegowej i podobny efekt potwierdzono w wodach USA i Dalekiego Wschodu. W ramach ostatnich zaostrzeń urzędowych, z ograniczonymi wyjątkami, w łodziach wypoczynkowych o długości do 25 metrów nie jest dozwolone stosowanie farb przeciwporostowych zawierających wysokie stężenia tributylocyny.

₂

Badania wykazały, że dopóki dawki śmiertelne cyny utrzymuje się na poziomie poniżej 4 μg/cm dziennie, życie w wodzie w dłuższych okresach nie wydaje się być zagrożone. Jednakże jednocześnie stwierdzono, że dla skutecznej kontroli alg, jak również wyżej rozwiniętych organizmów morskich, konieczne jest uwalnianie z pomalowanej powierzchni dna statku minimalnej wymaganej dawki cyny około 9 do 16 μg/cm²/dzień. Zazwyczaj tę wyższą wymywaną dawkę uzyskuje się przy stężeniach związku tributylocyny około 15 do 20% wagowych farby.

Wobec skuteczności TBT organa urzędowe niechętnie wyraziły zgodę, aby do czasu uzyskania skutecznego substytutu dla przeciwporostowych składników aktywnych organicznych związków cyny, w większych statkach, tzn. o długości przekraczającej 25 metrów, w dalszym ciągu dopuszczalne było stosowanie tych związków w celu zminimalizowania porastania. Istnieje zatem potrzeba znalezienia biocydów alternatywnych w stosunku do opartych na związkach TBT.

W opisie US-A-4297137 ujawniono, że działanie kompozycji przeciwporostowych można wydłużyć przez zwolnienie szybkości uwalniania składników przeciwporostowych. Dokument ten ujawnia farby przeciwporostowe zawierające co najmniej jedną substancję toksyczną w stosunku do organizmów morskich jednorodnie wprowadzoną do nieciągłej stałej matrycy, która jest nierozpuszczalna w wodzie morskiej i jest zdyspergowana w farbie. Matryca utworzona jest przynajmniej częściowo z co

PL 200 268 B1 najmniej jednej substancji, która staje się rozpuszczalna w wodzie morskiej pod działaniem enzymów uwalnianych przez organizmy morskie mające ulegać hamowaniu i/lub błonę bakteryjną przy zetknięciu z farbą. Zatem, kiedy organizm morski łączy się z pomalowaną powierzchnią, uwalnia się toksyczna substancja i wzrastanie organizmu ulega zahamowaniu. Podobnie jak we wcześniejszych ujawnieniach, substancje toksyczne objęte przez US-A-4297137 stanowią jedynie dobrze znane związki oparte na miedzi i cynie, takie jak TBT.

Abarzua i in., Mar. Ecol. Prog. Ser., t. 123: 301-312, 1995 „Biotechnological investigation for the prevention of biofouling. I. Biological and biochemical principles for the prevention of biofouling proponują ekstrahowanie środków biogenicznych posiadających własności przeciwbakteryjne, przeciwalgowe, przeciwpierwotniakowe i przeciwmakroporostowe z alg i morskich zwierząt bezkręgowych. Proponuje się określenie budowy ekstrahowanych środków, następnie ich syntetyzowanie i użycie syntetycznych środków do zapobiegania bioporastaniu. Nie zamieszczono żadnych wskazówek odnośnie ekstrakcji lub syntezy.

Dokument EP-A-0866103 ujawnia sposób kontrolowanego uwalniania związków posiadających aktywność biocydową (niszczącą mikroflorę i mikrofaunę) i wykorzystujące ten system kompozycje powierzchniowe. Dokument ten przedstawia jednoetapowy sposób obejmujący wprowadzanie enzymu i substratu do matrycy. Enzym odgrywa rolę substratu dostarczającego związek. W rozważanym wariancie na związek może działać kolejny enzym. Substrat i enzym(y) wytwarzają związek posiadający aktywność przeciwbakteryjną.

US-A-5747078 odnosi się do produktów spożywczych. Dokument daje wskazówkę, że bakteryjne zanieczyszczenie żywności i karmy, mogące powodować poważne problemy zdrowotne, można zahamować przez kompozycję zawierającą system laktoperoksydazy, zapewniający podtrzymywane uwalnianie nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru powstaje w reakcji oksydoreduktazy z utlenialnym substratem. Nadtlenek wodoru reaguje następnie z tiocyjanianem, katalizowanym przez laktoperoksydazę, wytwarzając podtiocyjanian. Podtiocyjanian może następnie działać jako środek przeciwbakteryjny. Dokument ten dostarcza podstaw na temat stosowania systemów unieruchomionych enzymów. Dokument ten milcząco dotyczy przeciwporostowych lub dowolnych mikroorganizmów, które wykazują właściwości porastania.

Obecny wynalazek łagodzi problem ze stanu techniki.

Aspekty obecnego wynalazku zdefiniowane są w załączonych zastrzeżeniach. Te i pozostałe aspekty są przedyskutowane poniżej.

Stwierdzono, że znalezienie zintegrowanego systemu generującego związek przeciwporostowy, wykorzystującego enzym z organizmu morskiego zapewnia trwały system, który:

• Wykazuje długotrwałą skuteczność w surowych warunkach takich jak środowisko morskie.

• Wymaga dla uzyskania danego efektu biocydowego mniejszej ilo ś ci substratu niż systemy znane ze stanu techniki.

Enzymy organizmów morskich, takie jak oksydaza heksozowa z glonów (HOX), posiadają niskie wartości Km w stosunku do glukozy, konkretnie 2,7 mM. Niska wartość Km oznacza, ze enzym posiada bardzo wysokie powinowactwo do glukozy. W przeciwieństwie do tego, nie morskie enzymy, takie jak nie morska oksydaza glukozowa (GOX), mogą wykazywać co najmniej dziesięciokrotnie wyższą wartość Km w stosunku do glukozy. Innymi słowy, znane systemy enzymatyczne mają znacznie niższe powinowactwo do glukozy niż systemy zgodne z wynalazkiem. W zastosowaniu przeciwporostowym stanowi to znaczącą różnicę, ponieważ enzym o wysokim powinowactwie do glukozy będzie zdolny do przekształcania całej obecnej glukozy. Z drugiej strony można przewidywać, że enzym o niż szym powinowactwie do glukozy umoż liwi wymywanie glukozy do otaczaj ą cego ś rodowiska. Wymywanie glukozy stanowi miernik pożądanej aktywności przeciwporostowej, ponieważ glukoza jest substratem dla organizmów porostowych. Wymywanie glukozy będzie zatem prowadzić do zwiększonego porastania.

• Dla uzyskania danego efektu biocydowego wymaga mniejszej ilości enzymu niż systemy znane ze stanu techniki.

Enzymy z organizmów morskich, takie jak HOX z alg, wykazują także niską wartość Km w stosunku do tlenu, ponownie niższą niż wartość Km w stosunku do tlenu systemów znanych z techniki, takich jak GOX. Wyższe powinowactwo do substratu ponownie daje przewagę HOX z alg. A to dlatego, że w zastosowaniach przeciwporostowych silniejsze obrastanie następuje w warunkach „zamknięcia, takich jak porty o niskiej wymianie wody i wysokim poziomie wzrastania glonów i innych organizmów porastających. Dokładnie w tych miejscach gdzie obrastanie jest najsilniejsze, zawartość tlenu

PL 200 268 B1 w wodzie takż e jest najniższa w porównaniu z otwartym morzem. Korzystne są zatem enzymy z organizmów morskich o wysokim powinowactwie do tlenu.

• Zapewnia wyższą aktywność w warunkach oczekiwanych temperatur roboczych.

W kompozycjach powłok powierzchniowych, takich jak farby przeciwporostowe, związek biocydowy (przeciwporostowy) zazwyczaj ma wykazywać aktywność w temperaturze pomiędzy 15 a 30°C. Dla kompozycji przeciwporostowych jest to temperatura wody morskiej, w której porastanie stwarza problem. W przeciwieństwie do systemów znanych z techniki, enzymy z organizmów morskich, takie jak HOX z alg, mają temperaturę optymalnej aktywności dokładnie zbliżoną do optymalnej temperatury porastania, zatem enzymy te doskonale nadają się jako środki przeciwporostowe. Temperatury optymalne przedstawiono w przykładzie 9.

• Wykorzystuje bezpieczne i ł atwo dostę pne substraty.

• Posiada lepszą tolerancję na sól, co prowadzi do dalszej polepszonej aktywności w środowisku wody morskiej.

• Jest odporny na degradację przez organizmy porastaj ą ce.

Enzymy z organizmów morskich, takie jak HOX z alg, są enzymami wyraźnie odpornymi na proteazę. Są w stanie przetrwać traktowanie pronazą (preparat proteazy o szerokim spektrum działania), nie tracąc swej aktywności. Ta odporność na proteazę uważana jest za szczególnie ważną w zastosowaniach przeciwporostowych, ponieważ enzym zachowuje w ten sposób odporność na degradację przez proteazę pochodzącą z organizmów porastających, które starają się przyczepić do pokrytej powierzchni.

W obecnym opisie określenie „porosty, odnoszące się do określeń „przeciwporost(y), „przeciwporostowy i „przeciwporostowe, obejmuje organizmy, które mogą przebywać i/lub wzrastać na powierzchni mającej podlegać działaniu obecnej kompozycji. Organizmy te obejmują mikroorganizmy, takie jak bakterie, grzyby i pierwotniaki, algi i organizmy takie jak algi, rośliny i zwierzęta. Organizmy mogą stanowić organizmy morskie.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja przeciwporostowa charakteryzująca się tym, że zawiera: (i) materiał powłokotwórczy; (ii) enzym oksydazę otrzymaną z organizmu morskiego lub oksydazę otrzymaną przez klonowanie i ekspresję w rekombinantowym organizmie gospodarza genu kodującego oksydazę otrzymaną z organizmu morskiego; oraz (iii) enzym prekursorowy i substrat prekursorowy, które są wybrane tak, że substrat dla enzymu utleniającego jest generowalny przez działanie enzymu prekursorowego na substrat prekursorowy, przy czym zakres stężenia wynosi od 0,0001 do 1000 U aktywności oksydazy na ml kompozycji przeciwporostowej i gdzie

- materiał powł okotwórczy jest wybrany spoś ród ż ywic polichlorku winylu na bazie rozpuszczalnika, chlorowanych kauczuków na bazie rozpuszczalnika, żywic akrylowych i metakrylowych na bazie rozpuszczalnika lub w układach wodnych, kopolimerów chlorek winylu - octan winylu w dyspersjach wodnych lub na bazie rozpuszczalnika, kopolimerów butadienu, kauczuków butadienowo-styrenowych, kauczuków butadienowo-akrylonitrylowych, kauczuków butadienowo-styrenowo-akrylonitrylowych, olejów schnących, oleju lnianego, żywic alkidowych, asfaltu, żywic epoksydowych, żywic uretanowych, żywic poliestrowych, żywic fenolowych i ich mieszanin;

- enzym prekursorowy jest wybrany spoś ród enzymów dział ają cych jak egzoenzymy, zdolnych do degradacji oligomerycznych lub polimerycznych substratów na jednostki monomeryczne;

- substrat prekursorowy wybrany jest spoś ród oligomerów i polimerów substratów dla enzymów utleniających;

- substrat wybrany jest spośród peptydów, L-aminokwasów, węglowodanów/cukrów obejmujących heksozy, a korzystnie glukozę, galaktozę, laktozę, 2-deoksyglukozę, piranozę, ksylan, celulozę, inulinę, skrobię, dekstran, pektynę i ich mieszaniny;

- i enzym i substrat są dobrane tak, że związek przeciwporostowy jest generowalny przez działanie enzymu na substrat.

W kompozycji korzystnie organizmem morskim jest glon morski, a zwłaszcza organizm morski stanowi Chondrus cripus.

W kompozycji korzystnie enzym stanowi oksydaza heksozowa. W kompozycji korzystnie enzym oksydaza heksozowa obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w ID SEKW. Nr 1 lub jej odmianę, homolog, pochodną lub jej fragment, która jest co najmniej w 75% identyczna z ID SEKW. Nr 1.

Kompozycja korzystnie charakteryzuje się tym, że substrat stanowi cukier, zwłaszcza cukier stanowi glukoza.

W kompozycji korzystnie enzym prekursorowy stanowi amyloglukozydaza.

PL 200 268 B1

W kompozycji korzystnie substrat prekursorowy stanowi skrobia.

Kompozycja korzystnie zawiera dodatkowo spoiwo do immobilizacji co najmniej jednego ze składników kompozycji, korzystnie do immobilizacji enzymu.

W kompozycji korzystnie enzym oksydazy wybrany jest spoś ród oksydazy glukozowej, oksydazy L-aminokwasowej, oksydazy D-aminokwasowej, oksydazy galaktozowej, oksydazy heksozowej, oksydazy piranozowej, oksydazy jabłczanowej, oksydazy cholesterolowej, oksydazy aryloalkoholowej, oksydazy alkoholowej, oksydazy latosterolowej, oksydazy asparaginianowej, oksydazy aminowej, oksydazy D-glutaminianowej, oksydazy etanoloaminowej, oksydazy NADH, oksydazy mocznikowej - urykazy i ich mieszanin.

Zastosowanie kompozycji określonej wyżej, jako powłoki, przy czym powłoka obejmuje ciekły nośnik do rozpuszczania lub zawieszania kompozycji.

Zastosowanie kompozycji określonej wyżej, do obróbki powierzchni wybranych spośród zewnętrznych wyrobów drewnianych, powierzchni zewnętrznych systemów centralnego ogrzewania i kadłubów statków morskich, obejmujące nanoszenie na tę powierzchnię wymienionej powłoki.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób uwalniania związku przeciwporostowego z kompozycji przeciwporostowej określonej wyżej, charakteryzujący się tym, że obejmuje

- wytwarzanie związku przeciwporostowego przez działanie enzymu oksydazy na substrat,

- przy czym substrat dla utleniającego enzymu wytwarza się przez dział anie enzymu prekursorowego na substrat prekursorowy.

Kompozycja według wynalazku zawiera enzym prekursorowy i substrat prekursorowy, przy czym enzym prekursorowy i substrat prekursorowy, według wynalazku generują substrat dla enzymu przez działanie enzymu prekursorowego na substrat prekursorowy. Ta kombinacja enzymu prekursorowego i substratu prekursorowego jest tutaj określana jako „generator substratu.

Enzym obecnego systemu można otrzymać lub możliwe jest jego otrzymanie z mikroorganizmów morskich.

Korzystnie, enzym obecnego systemu otrzymuje się lub możliwe jest jego otrzymanie z alg morskich. Korzystnie enzym obecnego systemu otrzymuje się lub możliwe jest jego otrzymanie z Chondrus cripus.

Korzystny związek przeciwporostowy stanowi nadtlenek wodoru.

Korzystny enzym stanowi oksydaza. Korzystnie, enzym wybrany jest spośród oksydazy glukozowej, oksydazy aminokwasowej, oksydazy D-aminokwasowej, oksydazy galaktozowej, oksydazy heksozowej, oksydazy piranozowej, oksydazy jabłczanowej, oksydazy cholesterolowej, oksydazy aryloalkoholowej, oksydazy alkoholowej, oksydazy latosterolowej, oksydazy asparaginianowej, oksydazy aminowej, oksydazy D-glutaminianowej, oksydazy etanoloaminowej, oksydazy NADH, oksydazy mocznikowej (urykazy) i ich mieszanin. Korzystny enzym stanowi oksydaza heksozowa.

Enzym oksydazy heksozowej (HOX)

Oksydaza heksozowa (D-heksoza: O2-oksydoreduktaza, EC 1.1.3.5) (nazywana także HOX) stanowi enzym, który posiada zdolność utleniania D-glukozy i szeregu innych cukrów redukujących, w tym maltozy, laktozy i celobiozy w obecnoś ci tlenu, do odpowiadają cych im laktonów, z nastę pną hydrolizą do odpowiednich kwasów aldobionowych. Zgodnie z tym, HOX różni się od innej oksydoreduktazy, oksydazy glukozowej, która może przekształcać jedynie D-glukozę, z tym, że może wykorzystywać szerszy zakres substratów cukrowych. Utlenianie katalizowane przez HOX można zilustrować następująco:

D-glukoza + O₂ γ-D-glukonolakton + H₂O₂, lub D-galaktoza + O₂ γ-D-galaktonolakton + H₂O₂

HOX wytwarzany jest w naturze przez szereg gatunków alg morskich. Gatunki te występują między innymi w rodzinie Gigartinaceae. Stosowane tutaj określenie „HOX oznacza enzym, który posiada zdolność utleniania substratów wybranych z grupy składającej się z D-glukozy, D-galaktozy, D-mannozy, maltozy, laktozy i celobiozy.

Korzystnie, oksydazę heksozową można otrzymać lub otrzymuje się z alg morskich Chondrus cripus.

W jednym aspekcie enzym oksydazy heksozowej stanowi enzym objęty ujawnieniem w dokumencie EP-A-0832245.

PL 200 268 B1

Wytwarzanie oksydazy heksozowej (HOX)

Gen kodujący enzym HOX został sklonowany z alg morskich Chondrus crispus (Stougaard i Hansen, 1996, Hansen i Stougaard, 1997). Do wytwarzania enzymu HOX stosowano także drożdże metylotropowe Hamsenula Polymorpha (opracowane w Rhein Biotech, Disseldorf, Niemcy jako system ekspresyjny dla różnorodnych protein) (naturalne białko oczyszczano z alg morskich (Poulsen i Hostrup, 1998)). WO 96/40935 i WO 98/13478 również ujawniają klonowanie i ekspresję genu kodującego proteinę posiadającą aktywność HOX w rekombinantowych organizmach gospodarza.

W korzystnym wariancie, enzym oksydazy heksozowej obejmuje sekwencję aminokwasów obejmującą ID SEKW. Nr 1 lub jej odmianę, homolog, pochodną lub fragment. W korzystnej odmianie, enzym oksydazy heksozowej obejmuje sekwencję aminokwasu obejmującą ID SEKW. Nr 1.

W korzystnym wariancie, enzym oksydazy heksozowej jest kodowany przez sekwencję nukleotydową obejmującą ID SEKW. Nr 1 lub jej odmianę, homolog, pochodną lub fragment. W korzystnej odmianie, enzym oksydazy heksozowej jest kodowany przez sekwencję nukleotydu obejmującą ID SEKW. Nr 1.

W korzystnej odmianie, enzym oksydazy heksozowej kodowany jest przez sekwencję nukleotydu posiadającą zdolność hybrydyzacji do sekwencji nukleotydu obejmującej ID SEKW. Nr 1 lub jej odmiany, homologu, pochodnej lub fragmentu lub przez sekwencję dopełniającą sekwencję hybrydyzowalną. W korzystnej odmianie, enzym oksydazy heksozowej jest kodowany przez sekwencję nukleotydu zdolną do hybrydyzowania sekwencji nukleotydu obejmującej ID SEKW. Nr 1 lub sekwencji stanowiącej dopełnienie sekwencji zdolnej do hybrydyzowania.

Enzym, korzystnie enzym oksydazy heksozowej można wytwarzać w sposób opisany w brytyjskim zgłoszeniu patentowym nr 9927801.2. Odmiany / homologi / pochodne (sekwencje aminokwasów).

Korzystne sekwencje aminokwasów zgodnie z wynalazkiem obejmują ID SEKW. Nr 1 lub stanowią je sekwencje dające się otrzymać z enzymu HOX zgodnie z wynalazkiem, ale także obejmują podobne sekwencje otrzymane z dowolnego źródła, na przykład pokrewnych białek wirusa/bakterii, homologów komórkowych i peptydów syntetycznych, jak również ich odmian i pochodnych.

Tak więc, obecny wynalazek ujawnia odmiany, homologi i pochodne sekwencji przedstawionych tu aminokwasów, jak również odmiany, homologi lub pochodne sekwencji nukleotydów kodujących te sekwencje aminokwasów.

W kontekś cie obecnego wynalazku, za sekwencję homologiczną przyjmuje się sekwencję aminokwasów, która jest w co najmniej 75, 85 lub 90 procentach identyczna, korzystnie co najmniej w 95 lub 98 procentach identyczna na poziomie aminokwasów w stosunku do, na przykład co najmniej wyszczególnionej sekwencji aminokwasów obejmującej ID SEKW. Nr 1. W szczególności homologia powinna być zazwyczaj rozważana w odniesieniu do tych obszarów sekwencji, o których wiadomo, że są istotne dla aktywności enzymu, niż dla nieistotnych sekwencji sąsiednich. Obszary te obejmują, aczkolwiek nie są do nich ograniczone, domniemane domeny wiążące FAD w HOX, takie jak SGGH79C, LGGH146I i LGGH320A. Jakkolwiek homologię można takż e rozpatrywać pod kątem podobieństw (czyli reszt aminokwasów o podobnych własnościach/funkcjach chemicznych), w kontekście obecnego wynalazku korzystne jest wyrażanie homologii w znaczeniu identyczności sekwencji.

Porównań homologii można dokonywać na oko albo, częściej, przy pomocy łatwo dostępnych programów do porównywania sekwencji. Te dostępne w handlu programy komputerowe mogą obliczać procent homologii pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami.

Procent homologii można obliczyć w obrębie sekwencji ciągłych, to znaczy jedną sekwencję przyrównuje się do innej sekwencji i każdy aminokwas w jednej sekwencji bezpośrednio porównuje się z odpowiednim aminokwasem w drugiej sekwencji, jedna reszta na raz. Jest to nazywane przyrównaniem „bezwyłomowym („ungapped). Zazwyczaj takie bezwyłomowe przyrównania przeprowadza się jedynie w przypadku stosunkowo małej liczby reszt.

Jakkolwiek jest to bardzo prosta i spójna metoda, nie uwzględnia ona faktu, że na przykład, w ską diną d identycznej parze sekwencji, jedna insercja lub delecja powoduje wypadnię cie z przyrównania następnych reszt aminokwasowych, co potencjalnie skutkuje dużym zmniejszeniem procentowej homologii przy globalnym porównaniu. Konsekwentnie, większość metod porównywania sekwencji jest skonstruowana w sposób dający optymalne przyrównania, które uwzględniają możliwe insercje i delecje bez nadmiernego wpływu sankcji na wynik całkowitej homologii. UzyPL 200 268 B1 skuje się to wprowadzając „wyłomy w przyrównaniu sekwencji w celu zmaksymalizowania homologii miejscowej.

Jednakże te bardziej złożone metody wyznaczają „sankcje wyłomowe (kary za przerwę - gap penalties) dla każ dego wyłomu pojawiają cego się w przyrównaniu, tak ż e dla tej samej liczby identycznych aminokwasów przyrównanie sekwencji z możliwie małą liczbą wyłomów co odzwierciedla wyższe pokrewieństwo pomiędzy dwiema porównywanymi sekwencjami - da wyższy wynik niż w przypadku wielu wyłomów. Zazwyczaj stosuje się „pokrewne koszty wyłomu, które obciążają stosunkowo wysokim kosztem istnienie wyłomów i mniejszymi sankcjami każdą późniejszą resztę w wyłomie. Jest to najbardziej powszechnie stosowany system oceny wyłomów. Wysokie sankcje za wyłomy będą oczywiście powodować optymalizowane przyrównania z mniejszą ilością wyłomów. Większość programów przyrównujących umożliwia modyfikowanie sankcji za wyłomy. Jednakże, przy wykorzystywaniu takiego oprogramowania do porównywania sekwencji, korzystnie jest stosować wartości domniemane. Na przykład, stosując pakiet GCG Wisconsin Bestfit (poniżej) sankcja za wyłom dla sekwencji aminokwasowej wynosi -12 za wyłom i -4 za każdy kolejny.

Tak więc obliczenie maksymalnego procentu homologii wymaga przede wszystkim uzyskania optymalnego przyrównania, przy uwzględnieniu sankcji za wyłomy. Odpowiedni program komputerowy do przeprowadzenia takiego przyrównania stanowi pakiet GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, USA: Devereux i in., 1984, Nucleic Acid Research 12: 387). Przykład innego oprogramowania, które może służyć do porównań sekwencji obejmuje, ale nie stanowi ograniczenia, pakiet BLAST (patrz Ausubel i in., 1999, j.w. - Rozdział 18), FASTA (Atschul i in., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) i zestaw GENEWORKS z narzędziami porównawczymi. W przypadku BLAST i FASTA możliwe są przeszukiwania offline i online (patrz Ausubel i in., 1999, j.w., str. 7-58 do 7-60). Jednakże preferowane jest stosowanie programu GCG Bestfit.

Jakkolwiek ostateczny procent homologii można mierzyć pod kątem identyczności, sam proces przyrównywania zazwyczaj nie opiera się na porównaniach par „wszystko albo nic. Zamiast tego, generalnie stosuje się matrycę wyników skalowanego podobieństwa, która przypisuje wyniki każdej parze porównań w oparciu o podobieństwo chemiczne lub dystans ewolucyjny. Przykład takiej powszechnie stosowanej matrycy stanowi matryca BLOSUM62 - domniemana matryca do zestawu programów BLAST. Programy GCG Wisconsin generalnie wykorzystują zwyczajowo dostępne wartości domniemane lub tablice porównań symboli własnych, jeśli są załączone (dla dalszych szczegółów patrz instrukcja użytkowania). Korzystnie stosuje się powszechnie dostępne wartości domniemane dla pakietu GCG, a w przypadku innego oprogramowania, domniemaną matrycę, taką jak BLOSUM62.

Po uzyskaniu optymalnego przyrównania za pomocą oprogramowania, możliwe jest obliczenie procentu homologii, a korzystnie procentu identyczności sekwencji. Oprogramowanie zazwyczaj dokonuje tej czynności w ramach porównania sekwencji i podaje wynik liczbowy.

Określenia „odmiana lub „pochodna w odniesieniu do sekwencji aminokwasów, zgodnie z wynalazkiem obejmują dowolną substytucję, odmianę, modyfikację, zastąpienie, delecję lub addycję jednego (lub więcej) aminokwasów z lub do sekwencji, zapewniające uzyskanie sekwencji aminokwasów posiadającej aktywność enzymatyczną, korzystnie posiadającej co najmniej taką samą aktywność enzymatyczną, jak sekwencja aminokwasów obejmująca ID SEKW. Nr 1.

ID SEKW. Nr 1 w zastosowaniu w obecnym wynalazku może być modyfikowana. Zazwyczaj dokonuje się modyfikacji gwarantujących zachowanie aktywności enzymatycznej sekwencji. Można dokonywać substytucji aminokwasów, na przykład od 1, 2 lub 3 do 10 lub 20 substytucji, pod warunkiem, że zmodyfikowane sekwencje zachowają wymaganą aktywność enzymatyczną. Substytucje aminokwasów mogą obejmować zastosowanie analogów nie występujących w naturze.

ID SEKW. Nr 1 zgodnie z wynalazkiem może także obejmować delecje, insercje lub substytucje reszt aminokwasowych, które wprowadzają ukryte zmiany i skutkują funkcjonalnie równoważnym enzymem. Rozważenia substytucji aminokwasów można dokonywać na bazie podobieństwa polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilowości i/lub amfifilowego charakteru reszt tak długo, dopóki zachowana jest aktywność enzymatyczna enzymu HOX. Na przykład, ujemnie naładowany aminokwas obejmuje kwas aspartamowy i glutaminowy, dodatnio naładowany aminokwas obejmuje lizynę i argininę, a aminokwas z nienaładowanymi polarnymi grupami końcowymi posiadający podobne wartości hydrofilowości obejmuje leucynę, izoleucynę, walinę, glicynę, alaninę, asparaginę, glutaminę, serynę, treoninę, fenyloalaninę i tyrozynę.

PL 200 268 B1

Można dokonywać zachowawczych substytucji, na przykład zgodnie z poniższą tabelą. Aminokwasy z tego samego bloku w drugiej kolumnie i korzystnie w tym samym wierszu w trzeciej kolumnie mogą podlegać wzajemnej substytucji:

Alifatyczny	Niepolarny	GAP
ILV
	Polarny - nienaładowany	CSTM
NQ
	Polarny - naładowany	DE
KR
Aromatyczny		HFWY

Odmiany / homologi / pochodne (sekwencje nukleotydów)

Dla specjalisty będzie zrozumiałym, że w wyniku degeneracji kodu genetycznego, szereg różnych sekwencji nukleotydowych może kodować ten sam enzym HOX. Jest także zrozumiałym, że specjalista może, wykorzystując rutynowe techniki, dokonać zamiany nukleotydu, która nie wpłynie na enzym HOX kodowany przez sekwencję nukleotydową zgodnie z wynalazkiem, odzwierciedlając użycie kodonu dowolnego szczególnego organizmu gospodarza, w którym enzym HOX zgodnie z wynalazkiem ma być wyraż ony.

Określenia „odmiana, „homolog lub „pochodna w odniesieniu do sekwencji nukleotydów obejmującej ID SEKW. Nr 1 zgodnie z wynalazkiem obejmuje dowolną substytucję, odmianę, modyfikację, zastąpienie, delecję lub addycję jednego (lub więcej) kwasów nukleinowych z lub do sekwencji, zapewniających uzyskanie sekwencji nukleotydów kodującej enzym HOX posiadającej aktywność enzymatyczną, korzystnie posiadającej co najmniej taką samą aktywność enzymatyczną jak sekwencja aminokwasów przedstawiona ID SEKW. Nr 1 na wykazie sekwencji.

Jak wskazano powyżej, w odniesieniu do homologii sekwencji, korzystne jest co najmniej 75%, bardziej korzystnie co najmniej 85%, najkorzystniej co najmniej 90% homologii z sekwencją wskazaną w wykazie sekwencji przedstawionej w zgłoszeniu. Najbardziej korzystne jest co najmniej 95%, bardziej korzystnie co najmniej 98% homologii. Porównania homologii nukleotydów można dokonać zgodnie z powyższym opisem. Korzystnym programem porównywania sekwencji jest program GCG Wisconsin Bestfit opisany wyżej. Matryca wyników domniemanych przyjmuje wartość 10 dla każdego nukleotydu identycznego i -9 dla każdego niedopasowania. Sankcja za powstanie wyłomu wynosi -50, a sankcja za rozszerzenie wynosi -3 dla każ dego nukleotydu.

Wynalazek ujawnia także sekwencje nukleotydów posiadające zdolność selektywnej hybrydyzacji do przedstawionych sekwencji lub dowolnej odmiany, fragmentu lub jego pochodnej, lub do uzupełniania dowolnego z nich. Sekwencje nukleotydów mają korzystnie długość co najmniej 15 nukleotydów, bardziej korzystnie co najmniej 20, 30, 40 lub 50 nukleotydów.

Substrat

Substrat korzystnie wybrany jest spośród peptydów, L-aminokwasów i węglowodanów/cukrów, w tym heksoz, korzystnie glukozy, galaktozy, laktozy, 2-deoksyglukozy, piranozy, ksylanu, celulozy, inuliny, skrobi, dekstranu, pektyny i ich mieszanin.

W wysoce korzystnej odmianie kombinacja enzym/substrat wybrana jest spoś ród glukozy/oksydazy heksozowej, glukozy/oksydazy glukozowej, L-aminokwasu/oksydazy L-aminokwasowej, galaktozy/oksydazy galaktozowej, laktozy/e-galaktozydazy/oksydazy heksozowej, laktozy/e-galaktozydazy/oksydazy glukozowej, 2-deoksyglukozy/oksydazy glukozowej, piranozy/oksydazy piranozowej i ich mieszanin.

Związek przeciwporostowy generowany jest przez działanie enzymu na substrat obecny w kompozycji. Tak więc, związek przeciwporostowy może być generowany w procesie „jednoetapowym. W pewnych przypadkach substrat może być otrzymywany in situ. W tym przypadku kompozycja zawiera ponadto enzym prekursorowy i substrat prekursorowy, przy czym enzym prekursorowy i substrat prekursorowy dobrane są tak, że enzym prekursorowy generuje substrat. W tym ostatnim aspekcie związek przeciwporostowy generowany jest w procesie „dwuetapowym.

PL 200 268 B1

W procesie jednoetapowym enzym korzystnie wybrany jest spośród oksydazy heksozowej, oksydazy glukozowej, oksydazy L-aminokwasowej, oksydazy galaktozowej, oksydazy piranozowej i ich mieszanin.

W procesie jednoetapowym substrat korzystnie wybrany jest spośród heksoz, korzystnie glukozy, L-aminokwasu, galaktozy, 2-deoksyglukozy, piranozy i ich mieszanin.

W procesie jednoetapowym korzystna kombinacja enzym/substrat wybrana jest spośród glukozy/oksydazy heksozowej, glukozy/oksydazy glukozowej, L-aminokwasu/oksydazy L-aminokwasowej, galaktozy/oksydazy galaktozowej, 2-deoksyglukozy/oksydazy glukozowej, piranozy/oksydazy piranozowej i ich mieszanin.

W procesie dwuetapowym korzystny enzym stanowi oksydaza heksozowa.

W procesie dwuetapowym korzystny substrat stanowi glukoza.

W procesie dwuetapowym korzystny enzym prekursorowy stanowi amyloglukozydaza.

W procesie dwuetapowym korzystny substrat prekursorowy stanowi skrobia.

Zatem w procesie dwuetapowym korzystną kombinację substrat prekursorowy/enzym prekursorowy/enzym stanowi skrobia/amyloglukozydaza/oksydaza heksozowa.

Substrat prekursorowy w procesie dwuetapowym korzystnie wybrany jest spośród oligomerów i polimerów substratów dla enzymów utleniają cych, takich jak skrobia, laktoza, celuloza, dekstroza, peptyd, inulina i ich mieszaniny.

Dostarczenie substratów prekursorowych jest szczególnie korzystne, ponieważ zapewniają one podtrzymywane i/lub przedłużone uwalnianie substratu przez działanie enzymu prekursorowego na substrat prekursorowy.

Szczególnie preferowany substrat prekursorowy stanowi naturalna skrobia. Naturalna skrobia zapewnia gęste upakowanie kryształów i może być dogodnie stosowana w powłokach nawierzchniowych. Ponadto, naturalna skrobia jest nierozpuszczalna w wodzie.

Korzystny substrat prekursorowy stanowi również celuloza. Celuloza jest powszechnie stosowanym składnikiem farb, a zastosowanie celulozy jako substratu prekursorowego redukuje liczbę dodatkowych składników, które należy dodać do kompozycji farby.

Korzystnie, enzym prekursorowy w procesie dwuetapowym wybrany jest spośród enzymów działających jak egzoenzymy posiadających zdolność degradacji oligomerycznych lub polimerycznych substratów do jednostek monomerycznych, np. β-galaktozydazy, peptydazy, amyloglukozydazy i ich mieszanin.

Ewentualnie kompozycja zawiera także spoiwo dla immobilizacji co najmniej jednego ze składników, ewentualnie do immobilizacji enzymów.

Kompozycje według wynalazku można preparować w postaci powłok, lakierów, bejc, emalii i podobnych, dalej określanych ogólnie jako „powłoka(i) (materiał(y) powłokowy(e).

Tak więc, jeden aspekt obecnego wynalazku stanowi powłoka składająca się z kompozycji zdefiniowanej powyżej.

Powłoka przeznaczona jest do działania na powierzchnie wybrane spośród zewnętrznych wyrobów drewnianych, powierzchni zewnętrznych systemów centralnego ogrzewania i kadłubów statków morskich.

Powłoka może zawierać ciekły nośnik (rozpuszczalnik) do rozpuszczania lub dyspergowania kompozycji.

Ciekły nośnik może być wybrany spośród dowolnych cieczy, które nie zakłócają działania żadnego z zasadniczych składników kompozycji. W szczególności, ciekły nośnik nie powinien oddziaływać na aktywność zasadniczego(ych) enzymu(ów) i/lub związku przeciwporostowego. Odpowiednie ciekłe nośniki ujawnione są w US-A-5071479 i obejmują wodę oraz rozpuszczalniki organiczne, w tym węglowodory alifatyczne, węglowodory aromatyczne, takie jak ksylen, toluen, mieszaniny alifatycznych i aromatycznych węglowodorów posiadających temperaturę wrzenia pomiędzy 100 a 320°C, korzystnie pomiędzy 150 a 230°C; wyżej wrzące frakcje destylacji ropy naftowej, np. solwent nafta, destylowany olej smołowy i ich mieszaniny; alkohole takie jak butanol, oktanol i glikole; oleje roślinne i mineralne; ketony takie jak aceton; frakcje ropy naftowej takie jak spirytusy mineralne i nafta, chlorowcowane węglowodory, estry glikolowe, etery estru glikolowego, ich pochodne i mieszaniny.

Ciekły nośnik może zawierać co najmniej jeden rozpuszczalnik polarny, taki jak woda, w mieszaninie z niskowrzącym rozpuszczalnikiem organicznym olejowym lub typu olejowego, takim jak mie10

PL 200 268 B1 szanina rozpuszczalników alifatycznych i aromatycznych występujących w spirytusie, nazywanych potocznie także spirytusami mineralnymi.

Nośnik może zazwyczaj zawierać co najmniej jeden rozcieńczalnik, emulgator, środek zwilżający, środek dyspergujący i inne środki powierzchniowo czynne. Przykłady odpowiednich emulgatorów zostały opisane w US-A-5071479 i obejmują etery nonylofenolu i tlenku etylenu, polioksyetylenowane estry sorbitolu lub estry kwasów tłuszczowych i polioksyetylenosorbitanu, ich pochodne i mieszaniny.

Do kompozycji według wynalazku i/lub powłoki stanowiącej zastosowanie tej kompozycji, zgodnie z wynalazkiem, może być wprowadzony dowolny odpowiedni materiał powłokowy. Przykłady znanych na rynku materiałów stanowią żywice polichlorku winylu na bazie rozpuszczalnika, chlorowcowane kauczuki na bazie rozpuszczalnika, żywice akrylowe i metakrylowe na bazie rozpuszczalnika lub wody, kopolimery chlorek winylu - octan winylu w dyspersjach wodnych i na bazie rozpuszczalnika, kopolimery butadienu, takie jak kauczuki butadienowo-styrenowe, butadienowoakrylonitrylowe i butadienowo-styrenowo-akrylonitrylowe, oleje schnące, takie jak olej lniany, żywice alkidowe, żywice epoksydowe, żywice uretanowe, żywice poliestrowe, żywice fenolowe, ich pochodne i mieszaniny.

Kompozycje według wynalazku i/lub powłoki zgodnie z wynalazkiem, mogą zawierać pigmenty wybrane spośród pigmentów nieorganicznych, takich jak dwutlenek tytanu, tlenek żelaza, krzemionka, talk lub glinka chińska, pigmenty organiczne, takie jak sadza lub barwniki nierozpuszczalne w wodzie morskiej, ich pochodne i mieszaniny.

Kompozycje według wynalazku i/lub powłoki zgodnie z wynalazkiem, mogą zawierać materiały takie jak olej żywiczny, zapewniający kontrolowane uwalnianie związku przeciwporostowego, który jest bardzo słabo rozpuszczalny w wodzie morskiej.

Kompozycja według wynalazku i/lub powłoka zgodnie z wynalazkiem, może zawierać plastyfikatory, środki modyfikujące charakterystykę reologiczną, inne typowe składniki i ich mieszaniny.

Kompozycja według wynalazku i/lub powłoka zgodnie z wynalazkiem, szczególnie powłoka, zawiera ponadto środek wspomagający, tradycyjnie stosowany w kompozycjach w celu zabezpieczania materiałów narażonych na działanie środowiska morskiego. Te środki wspomagające mogą być wybrane spośród dodatkowych środków grzybobójczych, rozpuszczalników pomocniczych, dodatków ułatwiających proces technologiczny, takich jak środki przeciwpieniące, środki utrwalające, plastyfikatory, stabilizatory UV lub środki zwiększające trwałość, rozpuszczalne lub nierozpuszczalne w wodzie barwniki, pigmenty koloryzujące, sykatywy, inhibitory korozji, zagęszczacze lub środki przeciwsedymentacyjne, takie jak karboksymetyloceluloza, kwas poliakrylowy lub kwas polimetakrylowy, środki przeciw kożuszeniu, ich pochodne i mieszaniny.

Dodatkowe środki przeciwgrzybicze stosowane w kompozycji według wynalazku i/lub powłoce, zgodnie z wynalazkiem korzystnie są rozpuszczalne w ciekłym nośniku.

W jednym aspekcie wynalazek stanowi morski ś rodek przeciwporostowy skł adają cy się z kompozycji określonej powyżej.

Korzystnie, środek przeciwporostowy jest samopołyskowy.

W jednym aspekcie wynalazku, substrat lub generator substratu i/lub enzym są zamknię te, korzystnie w błonie półprzepuszczalnej.

Substrat/generator substratu i enzym mogą być zamknięte pojedynczo, niezależnie od siebie lub mogą być zamknięte razem. W pierwszym przypadku substrat/generator substratu i enzym mogą być aktywowane przez zanieczyszczenie. Na przykład zamknięty materiał może być dobrany tak, że przy zetknięciu z zanieczyszczeniem, substrat/generator substratu i enzym mogą ulegać uwalnianiu umożliwiającemu ich zetknięcie z innym substratem/generatorem substratu lub enzymem. W ten sposób można uzyskać kompozycję zapewniającą wyłącznie związek przeciwporostowy lub też znacznie korzystniejszą zapewniającą związek przeciwporostowy w momencie zetknięcia z zanieczyszczeniem.

Kompozycja według wynalazku może być dostarczana w postaci produktu gotowego do użytku lub koncentratu. Produkt gotowy do użytku może występować w postaci wodnej dyspersji, roztworu olejowego, dyspersji olejowej, emulsji lub preparatu aerozolowego. Koncentrat może być używany na przykład jako dodatek do powlekania lub też może być rozcieńczony przed użyciem za pomocą dodatkowych rozpuszczalników lub środków dyspergujących.

Preparat aerozolowy zgodnie z wynalazkiem można otrzymać w typowy sposób, wprowadzając kompozycję według wynalazku zawartą, rozpuszczoną lub zdyspergowaną w odpowiednim

PL 200 268 B1 rozpuszczalniku, w lotnej cieczy odpowiedniej do stosowania jako propelent, na przykład mieszaninie chloro- i fluoropochodnych metanu lub etanu, dostępnych w handlu pod nazwą „Freon lub sprzężonym powietrzu.

Zgodnie z dyskusją w US-A-5071479 kompozycja według wynalazku i/lub powłoka zgodnie z wynalazkiem, może zawierać dodatkowe składniki znane ze swej przydatności w środkach ochronnych i/lub powłokowych. Składniki takie obejmują środki utrwalające, takie jak karboksymetyloceluloza, alkohol poliwinylowy, parafina, kosolwenty, takie jak octan glikolu etylenowego i octan metoksypropylowy, plastyfikatory takie jak estry kwasu benzoesowego i ftalany, np. ftalan dibutylu, ftalan dioktylu i ftalan didodecylu, ich pochodne i mieszaniny. w zależności od konkretnego zastosowania kompozycja może ewentualnie zawierać barwniki, pigmenty koloryzujące, inhibitory korozji, stabilizatory chemiczne lub sykatywy (suszki), takie jak oktenian kobaltu i naftenian kobaltu.

Kompozycję według wynalazku i/lub powłokę zgodnie z wynalazkiem, można nanosić dowolną znaną techniką, obejmującą malowanie pędzlem, natryskiwanie, nakładanie wałkiem, zanurzanie i ich kombinacje.

Kompozycje według wynalazku można otrzymać w prosty sposób przez mieszanie różnych składników w temperaturze nie wywierającej na nie trwałego oddziaływania. Warunki wytwarzania nie mają znaczenia krytycznego. Można z powodzeniem stosować wyposażenie i metody zazwyczaj wykorzystywane przy produkcji powłok i podobnych kompozycji.

Wynalazek zostanie opisany jedynie przykładowo, poprzez następujące przykłady.

P r z y k ł a d y

Przeciwporostowe działanie kompozycji przeciwporostowych według wynalazku testowano zgodnie z następującymi przykładami. Przykłady te pokazują skuteczność obecnej kompozycji w zapobieganiu porastaniu. Przykłady dotyczą także optymalizacji przeciwporostowych własności obecnych kompozycji.

Oksydaza heksozowa (HOX) stosowana w każdym z obecnych przykładów jest dostępna z DaniscoCultor. HOX stanowi produkt fermentacji otrzymany z drożdży Hansenula Polymorpha przez ekspresję genu kodującego enzym HOX sklonowanego z alg morskich Chondrus crispus.

P r z y k ł a d 1 - wytwarzanie kompozycji przeciwporostowej („jednoetapowe)

Rozpuszczoną lub unieruchomioną oksydazę heksozowa lub inny enzym generujący nadtlenek wodoru, taki jak oksydaza glukozowa, badano jako związek przeciwporostowy generujący enzym w kompozycji przeciwporostowej. Oksydazę heksozową można unieruchomić na przykład przez przyłączenie do wymieniacza anionów, Q Sepharose FF™ (dostępnego z Pharmacia) przy użyciu 20 mM buforu trietanoloaminy, pH 7,3. Alternatywnie, oksydaza heksozowa lub alternatywne enzymy generujące nadtlenek wodoru mogą być kowalencyjnie związane z odpowiednim nośnikiem, takim jak aktywowana żywica epoksydowa Sepharose™ (Pharmacia, Sweden), aktywowana karbodiimidem agaroza (Bio-Rad, USA). Mogą być wykorzystywane inne tradycyjne metody unieruchomiania znane z techniki.

Zakres stosowanych stężeń wynosił od 0,0001 do 1000 U aktywności oksydazy heksozowej/enzym generujący nadtlenek wodoru na mililitr kompozycji przeciwporostowej. Jedna jednostka aktywności enzymatycznej jest definiowana jako ilość enzymu wytwarzająca 1 μmol H₂O₂ na minutę w temp. 25°C.

Dla upewnienia się co do przydatności enzymu w obecnym wynalazku, oceny jego aktywności można dokonać następująco. Aktywność oksydazy heksozowej (HOX) mierzy się zgodnie z następującą procedurą.

Oznaczenie HOX oparte jest na pomiarze nadtlenku wodoru generowanego podczas utleniania glukozy. Nadtlenek wodoru utlenia o-dianizydynę w obecności peroksydazy w reakcji barwnej.

HOX β-D-glukoza + H₂O + O₂ —> D-glukono-delta-lakton + H₂O₂POD

H2O2 + o-dianizydynared. —-> 2 H2O + o-dianizydynaox.

Odczynniki

1. bufor fosforanowy 100 mM, pH 6,3

2. D-glukoza 100 mM (SIGMA, G-8270) w buforze fosforanowym 100 mM, pH 6,3

3. O-dianizydyna (SIGMA, D-3252), 3,0 mg/ml w wodzie destylowanej

4. Peroksydaza (SIGMA, P-8125), 0,10 mg/ml w 100 mM buforze fosforanowym, pH 6,3

PL 200 268 B1

Oznaczenie

120 μΐ odczynnika 1

150 μΐ odczynnika 2 10 μΐ odczynnika 3 10 μl odczynnika 4 i 10 μl roztworu enzymu

Oznaczenie prowadzono na płytce do mikromiareczkowania. Reakcję inicjowano przez dodanie roztworu enzymu. Mieszaninę inkubowano, wytrząsając, w temp. 25°C przez 15 minut. Ślepa próba zawierała wszystkie składniki z wodą zamiast roztworu enzymu. Powstawanie barwnika śledzono na talerzu do mikromiareczkowania, odczytując wynik przy 405 nm. Liniowość reakcji sprawdzano stosując program do badania kinetyki na czytniku do mikromiareczkowania.

Krzywą wzorcową dla nadtlenku wodoru sporządzano stosując różne stężenia świeżego H2O2 (MERCK).

P r z y k ł a d 2

Glukozę i galaktozę w stężeniach od 0,01 do 100 μg na ml kompozycji przeciwporostowej testowano jako substraty do generowania substratów dla oksydazy heksozowej w układzie opisanym w przykładzie 1. W celu uzyskania układu generującego substrat w sposób ciągły, skrobię, korzystnie nienaruszony granulat skrobiowy z pszenicy, kukurydzy lub ziemniaków, w stężeniu od około 0,01 ng do 100 μq na ml kompozycji przeciwporostowej, stosowano razem z amyloglukozydazą (enzym piekarniczy GRINDAMYL™ AG 1500 z DaniscoCultor lub inny dostępny w handlu produkt amyloglukozydazy). Składniki występowały w stężeniach zapewniających od 0,000001 do 10 AGU na ml kompozycji przeciwporostowej.

AGU definiowana jest jako aktywność aminoglukozydazy, która uwalnia 1 μmol glukozy na minutę z maltozy (0,5% wag/obj) w 50 mM octanie sodu, pH 5,0 (nastawionym za pomocą stężonego kwasu octowego) przy 40°C. Próbę przerywano przenosząc 200 μl mieszaniny badanej do 100 μl 0,1 M kwasu solnego i mierzono ilość uwolnionej glukozy stosując odczynnik dehydrogenazy glukozowej (Merck nr 12193) lub inny system wykrywania glukozy.

P r z y k ł a d 3 - generowanie nadtlenku wodoru przez farbę zawierającą HOX

W celu przetestowania zdolności generowania nadtlenku wodoru przez oksydazę heksozową (HOX) przeprowadzono następujący eksperyment.

Do 11,0 g farby [farba ścienna wodna Sadolin Glans 7 (Sadolin - farba bazująca na poli(metakrylanie metylu) i olejowa Histor 9010 (farba alkidowa z klasy farb poliestrowych)], dodano odpowiednio 0,2, 0,5 i 1 g HOX (produkt fermentacji Hansenula Polymorpha z DaniscoCultor) spryskując nią skrobię (10 μg). Do farby wodnej dodawano także 5 g wody na każdą próbę.

Przenośną plastykową pipetę jednorazowego użytku (Sarstedt) zanurzano (część przednia) w farbie. Pipety pozostawiano do wysuszenia na powietrzu na 3 godziny.

Aktywność oksydazy heksozowej (HOX) mierzono zanurzając przód pipety pokryty farbą w szklanej rurce z 2 ml odczynnika HOX, patrz poniżej. Aktywność HOX pochodziła wyłącznie od HOX zawartej w farbie.

Rurki inkubowano w temperaturze pokojowej.

Jako ślepą próbę stosowano farbę bez dodatku HOX.

Rezultaty eksperymentu przedstawiono w tabeli 1. HOX była jednolicie rozproszona w farbie, gdyż cała powierzchnia farby natychmiast po zetknięciu z odczynnikiem HOX stała się czerwona. Powstawanie koloru obserwowano natychmiast, co wskazuje, że farba nie hamuje aktywności HOX. Eksperyment dostarcza dowodu, że HOX jest w stanie generować nadtlenek wodoru z substratu zewnętrznego (tutaj glukoza), nawet gdy jest unieruchomiona w matrycy wysuszonej farby.

T a b e l a 1

	Aktywność
1	2
Farba na bazie wody, ślepa próba	0
0,2 g HOX	+
0,5 g HOX	++

PL 200 268 B1 cd. tabeli 1

1	2
1,0 g HOX	+++
farba olejowa, ślepa próba	0
0,2 g HOX	+
0,5 g HOX	++
1,0 g HOX	+++
kontrola, odczynnik plus wolny HOX	+++

Zakres stosowanych stężeń wynosi od 0,0001 do 1000 U aktywności oksydazy heksozowej lub alternatywnego enzymu generującego nadtlenek wodoru na mililitr kompozycji przeciwporostowej.

P r z y k ł a d 4 - układ modelowy do powlekania

Rurki dializacyjne zawierające kompozycję przeciwporostową zastosowano jako układ modelowy do powlekania dla zapobiegania porastaniu powierzchni powleczonego materiału.

Kompozycję przeciwporostową znajdującą się w rurkach dializacyjnych stosowano do generowania stężenia nadtlenku wodoru na powierzchni dializatora, skutecznie zapobiegającego porastaniu. Stosowany dializator ma wartość przerywania około 10000 Da. Dializator stanowi albo dializator rurkowy lub kaseta dializacyjna (taka jak Slide-A-Lyzer™, dostępna z Pierce; Illinois, USA).

Dializator zanurzony był w szklanej zlewce wypełnionej 1 do 5 litrami wody z jeziora lub morskiej, pobranej zgodnie z opisem. Zlewkę szklaną powoli mieszano mieszadłem magnetycznym i inkubowano w temperaturze pokojowej w pobliżu okna, umożliwiającego padanie światła dziennego. Porastanie dializatora kontrolowano wizualnie przez 4 tygodnie na podstawie wyglądu wzrastającej warstwy mikroorganizmu w dializatorze i oceniano w skali od 1 do 5, zgodnie z powyższym opisem. Jako kontrolę negatywną stosowano dializator z wodą wodociągową.

Do wody z jeziora lub morskiej dodawano ewentualnie katalazę unieruchomioną na kawałkach błony nitrocelulozowej, którą następnie blokowano za pomocą 0,1% Tween 20 (ester polioksyetylenosorbitanu i wyższych kwasów tłuszczowych), w celu uniknięcia gromadzenia się nadtlenku wodoru w wodzie otaczającej dializator. Stosowane stężenia katalazy mieściły się w zakresie od 0,000001 do

100 CU, gdzie 1 CU definiowany jest jako aktywność degradowania przez katalazę 1 μmola nadtlenku wodoru na minutę w temp. 30°C w 50 mM buforze fosforanu sodu, pH 7,0, jak opisano dla katalazy w katalogu Sigma: Biochemicals Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents, Sigma Chemical Company 1995, str. 221.

Kompozycje według wynalazku skutecznie zapobiegają porastaniu.

P r z y k ł a d 5 - trwałość HOX w farbie

Pomalowane przednie części pipet przenośnych opisanych w przykładzie 1, przechowywano w temperaturze pokojowej przez 2 miesiące, a następnie poddawano badaniu w mieszaninie odczynników zgodnie z opisem w przykładzie 2.

T a b e l a 2

	Aktywność
1	2
Farba na bazie wody, ślepa próba	0
0,2 g HOX	+
0,5 g HOX	++
1,0 g HOX	nie oznaczano
farba olejowa, ślepa próba	0
0,2 g HOX	+++

PL 200 268 B1 cd. tabeli 2

1	2
0,5 g HOX	+++
1,0 g HOX	+++
kontrola, odczynnik plus wolny HOX	nie oznaczano

Z rezultatów z tabeli 2 wynika wyraźnie, że HOX zachowuje trwałość przez dwa miesiące w temperaturze pokojowej w suchej matrycy farby.

P r z y k ł a d 6 - badanie powłoki

Ustalenie układu testowego dla kompozycji przeciwporostowej

Próbki od 0,5 do 5 ml wody z jeziora lub morskiej pobierano do rurek testowych z jeziora koło Aarhus, Dania i z Morza Bałtyckiego w okolicy Aarhus. W dniu pobierania próbek, kompozycję badaną dodawano do rurek i zaklejano je za pomocą ParafiIm™.

Rurki inkubowano w temperaturze pokojowej w pobliżu okna w celu umożliwienia dostępu światła dziennego. Porastanie kontrolowano wizualnie przez 4 tygodnie na podstawie wyglądu wzrastającej warstwy mikroorganizmu na ścianach rurki. Dla porównania, jako kontrolę pozytywną i negatywną stosowano rurkę z 0,1% azydkiem sodowym i rurkę bez kompozycji przeciwporostowej.

Rurki badane oceniono odpowiednio na 1 i 5, w skali od 1 do 5, określającej aktywność przeciwporostową od wysokiej do jej braku.

Stosowano handlowe materiały powłokowe przeciwporostowe nie zawierające dodatku przeciwporostowego biocydu. Kompozycje przeciwporostowe według wynalazku mieszano z materiałem powłokowym i nanoszono na powierzchnię płytek metalowych, szklanych lub z tworzywa sztucznego, zgodnie z instrukcją producenta pokrywanego materiału.

Pokryte płytki zanurzano w wodzie z jeziora lub morskiej. Porastanie płytek kontrolowano wizualnie przez 2 lata w oparciu o wygląd porastającej warstwy mikrobiologicznej na płytkach i oceniano w skali od 1 do 5 zgodnie z powyższym opisem. Jako kontrolę negatywną stosowano powłokę bez kompozycji przeciwporostowej.

Kompozycje według wynalazku skutecznie zapobiegają porastaniu.

P r z y k ł a d 7 - trwałość kompozycji przeciwporostowej w wodzie akwaryjnej

Do 10,0 g farby (olejowa Histor 9010) dodano 500 mg skrobi (Merck 1253), 50 mg HOX (produkt fermentacji Hansenula Polymorpha z DaniscoCultor) spryskując nią skrobię (10 U/g).

Przenośną plastikową pipetę jednorazowego użytku (Sarstedt) zanurzano (część przednia) w farbie. Pipetę pozostawiono na 24 godziny do wyschnięcia na powietrzu. Następnie trzymano ją przez 2 miesiące w 250 ml wody akwaryjnej w butelce Kautexa. Butelka stała na oknie w pełnym świetle. Po dwu miesiącach przód pipety przemyto, wysuszono i poddano ocenie w całkowitym odczynniku HOX. HOX w dalszym ciągu wykazywała pełną aktywność.

P r z y k ł a d 8 - dowód na koncepcję generowania substratu

W celu znalezienia układu generującego substrat w sposób ciągły, skrobię, korzystnie nienaruszony granulat skrobi z pszenicy, kukurydzy lub ziemniaczanej w stężeniu od 0,01 ng do 100 mg na ml kompozycji przeciwporostowej, zastosowano łącznie z HOX amyloglukozydazę (AMG) (enzym piekarniczy GRINDAMYL™ AG 10000 z DaniscoCultor lub inny produkt handlowy amyloglukozydazy) w stężeniach zapewniających od 0,000001 do 100 AGU na ml kompozycji przeciwporostowej.

Do 10,0 ml farby (olejowa Histor 9010) dodano 500 mg skrobi (Merck), HOX (produkt fermentacji Hansenula Polymorpha z DaniscoCultor) spryskiwaną na skrobi (10 U/g) i AMG (10000 AGU/g) jak wskazano w tabeli.

Przenośne plastikowe pipety jednorazowego użytku (Sarstedt) zanurzano (część przednia) w farbie. Przenośne pipety pozostawiano do wyschnięcia na powietrzu na 3 godziny.

Aktywność oksydazy heksozowej (HOX) mierzono zanurzając pipetę pokrytą farbą w rurce szklanej z 2 ml odczynnika HOX bez glukozy, dla odczynnika patrz przykład 1, aktywność HOX wywodziła się z HOX w farbie, a jedynym substratem dla HOX generowanej przez AMG w farbie przez hydrolizę skrobi w farbie do glukozy.

Rurki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin.

Jako ślepą próbę stosowano farbę bez dodatku HOX i AMG.

PL 200 268 B1

T a b e l a 3

	Aktywność
50 mg HOX + 10 mg AMG	+
50 mg HOX + 20 mg AMG	+
50 mg HOX	-
ślepa próba (bez enzymów)	-

Rezultaty przedstawione w tabeli 3 wskazują, że kombinacja HOX i AMG działa zgodnie z zamierzeniem. AMG generuje glukozę z jednocześnie unieruchomionej skrobi w farbie, a HOX generuje nadtlenek wodoru z generowanej glukozy.

P r z y k ł a d 9 - zależność aktywności od temperatury

Oksydazę heksozową (oczyszczoną HOX) oceniano pod kątem aktywności w funkcji temperatury i porównywano z handlową oksydazą glukozową (Amano 081443/00018)

Procedura:

Próbka: próbkę enzymu rozpuszczano w wodzie i odsalano na kolumnie PD10 stosując 20 mM bufor fosforanowy pH 6,3 i rozcieńczano do 0,4 U/ml.

Do kubka Elisa dodawano:

150 μl 100 mM glukozy w 100 mM buforu fosforanowego, pH 6,3 120 μl 100 mM buforu fosforanowego, pH 6,3 μl o-dianizydyny (3 mg/ml w wodzie) μl peroksydazy (0,10 mg/ml w 100 mM buforze fosforanowym, pH 6,3) μl próbka

Oznaczano przez 10 min w 30°C i mierzono przy 405 nm.

Rezultaty

Rezultaty z pomiaru aktywności w funkcji temperatury przedstawiono w tabeli 4 i na fig. 1.

T a b e l a 4

Temperatura	Oksydaza heksozowa	Handlowa oksydaza glukozowa
°C	Aktywność względna, %	Aktywność względna, %
10,0	70	67
25,0	98	67
27,5	100	72
32,5	98	78
37,5	94	78
42,0	83	85
45,0	81	100
50,0	59	94

Rezultaty badań aktywności w zależności od temperatury wyraźnie wskazują na różnicę profilu aktywności.

Oksydaza heksozowa ma optimum temperaturowe pomiędzy 25-35°C, które nieomal pokrywa się z optimum maksymalnej temperatury porastania. W przeciwieństwie do tego widać, że GOX posiada optymalną temperaturę przy 50°C, znacznie przekraczającą temperatury występujące w morzu.

Wszystkie wymienione w zgłoszeniu publikacje są niniejszym włączone przez odniesienie. Różne modyfikacje i odmiany opisanych metod i wariantów wynalazku staną się jasne dla specjalistów bez odbiegania od zakresu i ducha wynalazku. Jakkolwiek wynalazek został opisany w powiązaniu ze szczególnymi korzystnymi odmianami wykonania, należy rozumieć, że wynalazek tak jak został zastrzeżony nie powinien być bez potrzeby do nich ograniczany. W rzeczywistości, różne modyfikacje opisanych procedur odtwarzania wynalazku, które są oczywiste dla specjalisty z dziedziny chemii lub dziedzin pokrewnych w zamierzeniu pozostają w zakresie następujących zastrzeżeń.

PL 200 268 B1

ID SEKW. Nr 1

Nazwa cząsteczki: Hoxpic

Wydrukowane sekwencje 1-1644 (Pełny) 1644 bps liniowy DNA Opis:

1

ATG GCT ACT TTG

CCA CAA AAG

GAC CCA GGT TAC ATT GTT ATT

M A

T

L

P

Q

K

D

P

G

Y

I

V

X

43

GAC GTC

AAC

GCT

GGT

ACT

CCA

GAC

AAG

CCT

GAC

CCA

AGA

TTG

D V

N

A

G

T

P

D

K

P

D

P

R

Ł

65

CCA TCC

ATG

AAG

CAA

GGT

TTC

AAC

AGA

TGG

ATT

GGT

ACC

P s

M

K

G

F

N

R

W

I

G

T

127

AAC ATC

GAT

TTC

GTT

TAC

GTC

GTT

TAC

ACT

CCA

CAA

GGT

GCT

N I

D

F

V

Y

V

Y

T

P

Q

G

A

169

TGT ACT

GCT

TTG

GAC

AGA

GCT

ATG

GAA

AAG

TGT

TCT

CCA

GGT

C T

A

D

R

A

M

E

K

c

s

P

G

211

ACC GTC

AGA

ATC

GTT

TCT

GGT

CAC

TGT

TAC

GAA

GAC

TTC

T V

R

I

V

S

G

H

c

Y

E

D

F

253

GTT TTC

GAC

GAA

TGT

GTC

AAG

GCT

ATT

ATC

AAC

GTT

ACT

GGT

V F

D

Ξ

C

V

K

A

I

N

V

T

G

295

TTG GTT

GAA

TCT

GGT

TAC

GAC

GAT

AGA

GGT

TAC

TTC

GTC

Ł V

E

s

G

Y

D

R

G

Y

F

V

337

TCT TCC

GGT

GAC

ACC

AAC

TGG

GGT

TCC

TTC

AAG

ACC

TTG

TTC

s s

G

D

T

N

W

G

s

F

K

T

L

F

379

AGA GAC

CAC

GGT

AGA

GTT

TTG

CCA

GGT

TCC

TGT

TAC

TCC

R D

H

G

R

V

L

P

G

s

C

Y

s

421

GTC GGT

TTG

GGT

CAC

ATT

GTC

GGT

GGA

GGT

GAC

GGT

ATT

V G

£>

G

H

I

V

G

D

G

I

463

TTG GCC

AGA

TTG

CAC

GGT

TTG

CCA

GTC

GAT

TGG

TTA

TCC

GGT

L A

R

L

H

G

L

P

V

D

W

L

s

G

505

GTT GAA

GTT

GTC

GTT

AAG

CCA

GTC

TTG

ACC

GAA

GAC

TCT

GTT

V E

V

K

P

V

L

T

E

D

s

V

547

CTT AAG

TAC

GTT

CAC

AAG

GAT

TCC

GAA

GGT

AAC

GAC

GGT

GAG

L K

Y.

V

H

K

D

s

E

G

K

D

G

E

589

TTG TTT

TGG

GCT

CAC

ACT

GGT

GGA

GGT

GGA

GGT

AAC

TTC

GGT

L F

W

A

H

T

G

N

F

G

631

ATT ATC

ACC

AAA

TAC

TTC

AAG

GAT

TTG

CCA

ATG

TCT

CCA

I I

T

K

Y

F

K

D

Ł

P

M

s

P

673

AGA GGT

GTC

ATC

GCT

TCT

AAC

TTA

CAC

TTC

TCT

TGG

GAC

GGT

R G

V

I

A

s

N

L

H

F

s

W

D

G

715

TTC ACT

AGA

GAT

GCC

TTG

CAA

GAT

TTG

ACT

AAG

TAC

TTC

F T

R

D

A

L

Q

D

L

T

K

Y

F

757

AAG TTG

GCT

AGA

. TGT

GAT

TGG

AAG

AAT

ACT

GTT

GGT

AAG

TTC

K L

A

. R

C

D

W

K

N

T

V

G

K

F

PL 200 268 B1

799

CAA ATC

TTC F

CAC H

CAA GCA GCT

GAA GAG

TTT GTT ATG TAC TTG

Q

I

Q

A

E

F

V

M

Y

L

841

TAT

ACA

TCC

TAC

TCT

AAC

GAC

GCC

GAG

AGA

GAA

GTT

GCC

CAA

y

T

s

Y

s

N

D

A

E

R

E

V

A

Q

883

GAC

AGA

CAC

TAT

CAT

TTG

GAG

GCT

GAC

ATT

GAA

CAG

ATC

TAC

D

R

' H

Y

H

L

E

A

D

I

E

Q

I

Y

925

AAA

ACA

TGC

GAG

CCT

ACC

AAA

GCT

CTT

GGT

CAT

GCT

GGT

K

T

c

E

P

T

K

A

L

G

H

A

G

9S7

TGG

GCT

CCT

TTC

CCT

GTT

AGA

CCT

AGA

AAG

AGA

CAC

ACA

TCC

W

A

P

F

P

V

R

P

R

K

R

H

T

s

1009

AAG

ACT

TCT

TAT

ATG

CAT

GAC

GAG

ACT

ATG

GAC

TAC

CCT

TTC

K

T

s

Y

M

H

D

E

T

M

D

Y

P

F

1051

TAC

GCT

TTG

ACT

GAG

ACT

ATC

AAC

GGT

TCC

GGT

CCT

AAT

CAG

Y

A

L

T

E

T

I

N

G

s

G

P

H

Q

1093

AGA

GGT

AAG

TAC

AAG

TCT

GCT

TAC

ATG

ATC

AAG

GAC

TTT

CCA

R

G

K

Y

K

s

A

Y

M

I

K

D

F

P

1135

GAC

TTC

CAG

ATT

GAT

GTT

ATC

TGG

AAA

TAC

CTT

ACT

SAG

GTT

D

F

Q

I

D

V

I

W

K

Y

L

T

E

V

1177

CCT

GAC

GGT

TTG

ACT

AGT

GCC

GAA

ATG

AAG

GAT

GCT

CTT

P

D

G

L

T

S

A

E

M

K

D

A

L

1219

CAG

GTT

GAT

ATG

TTC

GGT

GAG

ATT

CAC

AAG

GTT

TGG

Q

V

D

M

F

G

E

I

H

K

V

W

1261

GAT

GCT

ACT

GCA

GTT

GCT

CAG

AGA

GAG

TAC

ATC

AAA

CTG

D

A

T

A

V

A

Q

R

E

Y

I

K

L

1303

CAG

TAC

CAG

ACA

TAC

TGG

CAG

GAA

GAC

AAG

GAT

GCA

GTT

Q

Y

Q

T

Y

w

Q

E

Ξ

D

K

D

A

V

1345

AAC

TTG

AAG

TGG

ATT

AGA

GAC

TTT

TAC

GAG

ATG

'tat

GAG

N

L

K

W

I

R

D

F

Y

Ξ

E

M

Y

E

1387

CCT

TAT

GGT

GTT

CCA

GAC

CCT

AAC

ACT

CAG

GTT

GAG

AGT

P

Y

G

V

P

D

P

N

T

Q

V

E

S

1429

GGT

AAA

GGT

GTT

TTT

GAG

GGA

TGC

TAC

TTC

AAC

TAC

CCT

GAT

G

K

G

V

F

E

G

C

Y

F

N

Y

P

D

1471

GTT

GAC

TTG

AAC

TGG

AAG

AAC

GGT

AAG

TAT

GGT

GCC

TTG

V

D

L

N

W

K

N

G

K

Y

G

A

L

1513

GAA

CTT

TAC

TTT

TTG

GGT

AAC

CTG

AAC

AGA

TTG

ATC

AAG

GCC

E

L

Y

F

L

G

N

L

N

R

L

I

K

A

1555

AAA

TGG

TTG

TGG

GAT

CCT

AAC

GAG

ATC

TTC

ACA

AAC

AAA

CAG

K

W

L

W

D

P

N

E

I

F

T

N

K

Q

1597

TCT

ATC

CCT

ACT

AAA

CCT

CTT

AAG

GAG

CCT

AAG

CAG

ACT

AAA

s

X

P

T

K

P

L

K

E

P

K

Q

T

K

1639

TAG

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Kompozycja przeciwporostowa, znamienna tym, że zawiera:

(i) materiał powłokotwórczy;

(ii) enzym oksydazę otrzymaną z organizmu morskiego lub oksydazę otrzymaną przez klonowanie i ekspresję w rekombinantowym organizmie gospodarza genu kodującego oksydazę otrzymaną z organizmu morskiego; oraz (iii) enzym prekursorowy i substrat prekursorowy, które są wybrane tak, że substrat dla enzymu utleniającego jest generowalny przez działanie enzymu prekursorowego na substrat prekursorowy, przy czym zakres stężenia wynosi od 0,0001 do 1000 U aktywności oksydazy na ml kompozycji przeciwporostowej i

PL 200 268 B1 gdzie

- materiał powłokotwórczy jest wybrany spośród żywic polichlorku winylu na bazie rozpuszczalnika, chlorowanych kauczuków na bazie rozpuszczalnika, żywic akrylowych i metakrylowych na bazie rozpuszczalnika lub w układach wodnych, kopolimerów chlorek winylu - octan winylu w dyspersjach wodnych lub na bazie rozpuszczalnika, kopolimerów butadienu, kauczuków butadienowo-styrenowych, kauczuków butadienowo-akrylonitrylowych, kauczuków butadienowo-styrenowo-akrylonitrylowych, olejów schnących, oleju lnianego, żywic alkidowych, asfaltu, żywic epoksydowych, żywic uretanowych, żywic poliestrowych, żywic fenolowych i ich mieszanin;

- enzym prekursorowy jest wybrany spośród enzymów działających jak egzoenzymy, zdolnych do degradacji oligomerycznych lub polimerycznych substratów na jednostki monomeryczne;

- substrat prekursorowy wybrany jest spośród oligomerów i polimerów substratów dla enzymów utleniających;

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że organizmem morskim jest glon morski.

3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, organizm morski stanowi Chondrus cripus.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że enzym stanowi oksydaza heksozowa.

5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że enzym oksydaza heksozowa obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w ID SEKW. Nr 1 lub jej odmianę, homolog, pochodną lub jej fragment, która jest co najmniej w 75% identyczna z ID SEKW. Nr 1.

6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że substrat stanowi cukier.

7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że cukier stanowi glukoza.

8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że enzym prekursorowy stanowi amyloglukozydaza.

9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że substrat prekursorowy stanowi skrobia.

10. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera dodatkowo spoiwo do immobilizacji co najmniej jednego ze składników kompozycji, korzystnie do immobilizacji enzymu.

11. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że enzym oksydazy wybrany jest spośród oksydazy glukozowej, oksydazy L-aminokwasowej, oksydazy D-aminokwasowej, oksydazy galaktozowej, oksydazy heksozowej, oksydazy piranozowej, oksydazy jabłczanowej, oksydazy cholesterolowej, oksydazy aryloalkoholowej, oksydazy alkoholowej, oksydazy latosterolowej, oksydazy asparaginianowej, oksydazy aminowej, oksydazy D-glutaminianowej, oksydazy etanoloaminowej, oksydazy NADH, oksydazy mocznikowej - urykazy i ich mieszanin.

12. Zastosowanie kompozycji określonej według zastrz. 1, jako materiału powłokowego, przy czym materiał powłokowy obejmuje ciekły nośnik do rozpuszczania lub zawieszania kompozycji.

13. Zastosowanie kompozycji według zastrz. 12, do obróbki powierzchni wybranych spośród zewnętrznych wyrobów drewnianych, powierzchni zewnętrznych systemów centralnego ogrzewania i kadłubów statków morskich, obejmujące nanoszenie na tę powierzchnię wymienionej powłoki.

14. Sposób uwalniania związku przeciwporostowego z kompozycji przeciwporostowej określonej według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje generowanie związku przeciwporostowego przez działanie enzymu oksydazy na substrat, przy czym substrat dla utleniającego enzymu wytwarza się przez działanie enzymu prekursorowego na substrat prekursorowy.