DE60033187T2

DE60033187T2 - Bewuchsverhindernde zusammensetzung

Info

Publication number: DE60033187T2
Application number: DE60033187T
Authority: DE
Inventors: Horsmans Charlotte POULSEN; Matthias Karsten KRAGH
Original assignee: Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 1999-06-04
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2020-06-03
Also published as: ES2391298T3; EP1282669A2; AU5097800A; EP1811001A2; DK1811001T3; MXPA01012448A; NO328988B1; KR100751791B1; US20020106361A1; EP1282669B1; CN1364185A; EP1811001B1; AU777162B2; BR0010932A; NO20015831L; ATE352592T1; PL353234A1; US20140363478A1; PL200268B1; NZ515111A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine bewuchsverhindernde Zusammensetzung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine bewuchsverhindernde Zusammensetzung, umfassend ein Enzym, welches in der Lage ist, eine Verbindung mit bewuchsverhindernder Wirkung zu erzeugen.
Wie es in der US-A-5,071,479 diskutiert ist, sind Biozide in vielen verschiedenen Umgebungen erforderlich, wie beispielsweise Antipilzmittel in Anstrichfarben für Häuser, Frischwasser-Algizide und bewuchsverhindernde Mittel für Meeresstrukturen, die der Flora und Fauna im Meerwasser ausgesetzt sind. Wie bekannt ist, können Schimmel und Pilze auf Hausanstrichfarben und dergleichen wachsen und nutzen das Farbmedium als Nährstoff oder sie nutzen in einigen Fällen das darunterliegende Substrat, wie Holz, als Nährstoff. Aus offensichtlichen Gründen kann dies die angestrichene Oberfläche beschädigen und/oder zu einer Verschlechterung des Erscheinungsbilds der angestrichenen Oberfläche führen. Ein Biozid kann in die Farbe aufgenommen werden, und wenn das Mycel und die Fruchtkörper der Pilze mit dem Farbfilm in Kontakt treten oder diesen durchdringen, wird dadurch ein enger Kontakt mit dem Biozid in dem Film hergestellt und die Pilze werden vernichtet. In Kühltürmen, die Frischwasser verwenden, können sich Schlamm, Schimmel und Algen entwickeln, wenn keine wirksamen Verbindungen vorliegen, um deren Wachstum zu bekämpfen.
Wie es in der US-A-5,071,479 diskutiert wird, stellt das Wachstum von Meeresorganismen auf den unter Wasser liegenden Teilen einer Schiffsoberfläche ein besonderes Problem dar. Ein solches Wachstum erhöht den Reibungswiderstand des Schiffsrumpfs beim Gleiten durch Wasser, was zu einem erhöhten Brennstoffverbrauch und/oder zu einer Verringerung der Geschwindigkeit des Schiffs führt. Meeresbewuchs sammelt sich so schnell an, daß die Abhilfe, die in der Reinigung und dem Neuanstrich, je nach Erfordernis, im Trockendock besteht, allgemein als zu teuer angesehen wird. Eine Alternative, die mit zunehmender Effizienz über die Jahre praktiziert wurde, besteht darin, das Ausmaß des Bewuchses zu beschränken, indem man auf den Schiffsrumpf einen Deckanstrich aufbringt, in den bewuchsverhindernde Mittel aufgenommen sind. Die bewuchsverhindernden Mittel sind Biozide, die über einen Zeitraum in einer Konzentration, die für Meeresorganismen auf der Rumpfoberfläche tödlich ist, von der Oberfläche des Anstrichs freigesetzt werden. Der bewuchsverhindernde Anstrich versagt nur dann, wenn die Konzentration an verfügbarem Biozid auf der Anstrichoberfläche unter die letale Konzentration abfällt, und bei modernen Anstrichfarben wird eine Lebensdauer von bis zu zwei Jahren erwartet.
Ein Biozid, welches insbesondere in bewuchsverhindernden Zusammensetzungen zur Verwendung im Meer überaus weltverbreitet Anwendung findet, ist Tributylzinn (TBT). Es besteht jedoch eine zunehmende Besorgnis bezüglich der Auswirkungen solcher organischer Zinnbiozide in ihren derzeitigen kommerziellen Mengen als aktiver, bewuchsverhindernder Inhaltsstoff in Beschichtungszu sammensetzungen für Wasser-(Meeres-)Anwendungen auf die Umwelt. Es wurde gezeigt, daß aufgrund der weitverbreiteten Verwendung insbesondere von Verbindungen des Tributylzinntyps bei Konzentrationen von bis zu 20 Gew.-% in Anstrichfarben für Schiffsunterseiten die Verschmutzung des umgebenden Wassers aufgrund von Auswaschen ein Niveau erreicht hat, das die Zersetzung von Muscheln und Muschelorganismen verursacht. Diese Auswirkungen wurden entlang der französisch-britischen Küstenlinie beobachtet, und ähnliche Auswirkungen wurden in Gewässern in den USA und in Fernost bestätigt. Gemäß den jüngsten behördlichen Bestimmungen dürfen mit wenigen Ausnahmen Vergnügungsschiffe mit einer Länge von bis zu 25 Metern keine bewuchsverhindernde Mittel enthaltenden Anstrichfarben mehr verwenden, die große Mengen an Tributylzinnverbindungen enthalten.
Die Forschung hat gezeigt, daß, solange die Auswaschrate von Zinn auf oder unterhalb von etwa 4 μg/cm² pro Tag gehalten werden kann, Wasserlebewesen allem Anschein nach auf lange Sicht nicht beeinträchtigt werden. Es wurde jedoch auch herausgefunden, daß, um Meeresalgen sowie höher entwickelte Meeresorganismen in effektiver Weise kontrollieren zu können, eine bestimmte Mindestauswaschrate von Zinn von der angestrichenen Oberfläche von Schiffsböden von etwa 9 bis 16 μg/cm²/Tag erforderlich ist. Für gewöhnlich wird diese höhere Auswaschrate mit einer Konzentration an Tributylzinnverbindung in einer Menge von etwa 15 Gew.-% bis 20 Gew.-% der Farbe erzielt.
Im Hinblick auf die Wirksamkeit von TBT haben die Aufsichtsbehörden widerstrebend zugestimmt, daß, solange es keinen zufriedenstellenden Ersatz für die bewuchsverhindernden aktiven Inhaltsstoffe aus organischem Zinn gibt, größere Schiffe, d.h. diejenigen mit einer Länge von mehr als 25 Metern, weiterhin solche Verbindungen verwenden dürfen, um den Bewuchs zu minimieren. Daher besteht der Wunsch, alternative Biozide zu Verbindungen auf TBT-Basis bereitzustellen.
Die US-A-4,297,137 offenbart, daß die Auswirkungen einer bewuchsverhindernden Zusammensetzung verlängert werden können, indem man die Freisetzung der bewuchsverhindernden Bestandteile einschränkt. Dieses Dokument offenbart bewuchsverhindernde Anstrichfarben, die wenigstens eine für Meeresorganismen toxische Substanz umfassen, die in einer diskontinuierlichen festen Matrix, die in Meerwasser unlöslich ist und die in der Farbe dispergiert ist, einheitlich aufgenommen ist. Die Matrix ist wenigstens teilweise aus wenigstens einer Substanz gebildet, die unter der Wirkung von Enzymen, die durch die Meeresorganismen, die gehemmt werden sollen, und/oder durch den Bakterienfilm, der mit der Farbe in Kontakt ist, freigesetzt werden, in Meerwasser löslich wird. Wenn sich somit Meeresorganismen an die angestrichene Oberfläche anheften, wird die toxische Substanz freigesetzt und die Organismen werden gehemmt. Ähnlich wie Offenbarungen des Standes der Technik umfassen die von der US-A-4,297,137 in Betracht gezogenen toxischen Substanzen nur die gut bekannten Verbindungen auf Basis von Kupfer und Zinn, wie TBT.
Abarzua et al., Mar. Ecol. Prog. Ser. Band 123: 301-312, 1995 "Biotechnological investigation for the prevention of biofouling. I. Biological and biochemical principles for the prevention of biofouling" schlagen die Extraktion von biogenen Mitteln mit antibakteriellen, Anti-Algen-, Anti-Protozoen- und gegen großen Bewuchs wirkenden Eigenschaften aus Algen und wirbellosen Meerestieren vor. Es wird vorgeschlagen, daß die Struktur der extrahierten Mittel bestimmt werden kann, daß sie anschließend synthetisiert werden können und daß das synthetisierte Mittel bei der Prävention gegen biologischen Bewuchs verwendet werden kann. Es wird keine Lehre bezüglich der Extraktion oder der Synthese bereitgestellt.
Die EP-A-0 866 103 offenbart ein Verfahren für die kontrollierte Freisetzung von Verbindungen mit antimikrobieller Aktivität und Beschichtungszusammensetzungen, die dieses System verwenden. Das Verfahren umfaßt die Aufnahme eines Enzyms und eines Substrats in eine Matrix. Das Enzym wirkt auf das Substrat, wodurch eine Verbindung bereitgestellt wird. In einer in Betracht gezogenen Ausführungsform kann ein weiteres Enzym auf die Verbindung einwirken. Das Substrat und das Enzym (die Enzyme) erzeugen eine Verbindung mit antimikrobieller Aktivität.
Die US-A-5,747,078 betrifft Nahrungsmittelprodukte. Das Dokument lehrt, daß die Kontamination von Nahrungs- und Futtermitteln durch Mikroben, die zu schwerwiegenden gesundheitlichen Problemen führen kann, durch eine Zusammensetzung, umfassend ein Lactoperoxidasesystem, welches die nachhaltige Freisetzung von Wasserstoffperoxid bereitstellt, gehemmt werden kann. Das Wasserstoffperoxid wird durch die Umsetzung einer Oxidoreduktase mit einem oxidierbaren Substrat hergestellt. Das Wasserstoffperoxid reagiert dann mit Thiocyanat unter Katalyse durch Lactoperoxidase unter Erzeugung von Hypothiocyanat. Das Hypothiocyanat kann dann als antimikrobielles Mittel wirken. Dieses Dokument liefert eine Hintergrund-Lehre zu immobilisierten Enzymsystemen. Das Dokument sagt nichts zu bewuchsverhindernden Mitteln oder über irgendeinen Mikroorganismus, der zu bewuchsbildenden Eigenschaften führt, aus.
Die vorliegende Erfindung mindert das Problem des Standes der Technik.
Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in den anhängenden Ansprüchen definiert. Diese und weitere bevorzugte Aspekte werden unten diskutiert.
Es wurde herausgefunden, daß die Bereitstellung eines integrierten Systems für die Erzeugung einer bewuchsverhindernden Verbindung unter Verwendung eines Enzyms aus einem Meeresorganismus ein stabiles System liefert, welches

• in rauhen Umgebungen, wie Meeresumgebungen, über eine Langzeit-Wirksamkeit verfügt,
• weniger Substrat erfordert als Systeme aus dem Stand der Technik, um eine gegebene antimikrobielle Wirkung bereitzustellen. Enzyme aus Meeresorganismen, wie Hexoseoxidase (HOX) aus Algen, haben niedrige Km-Werte für Glucose, nämlich 2,7 mM. Dieser niedrige Km bedeutet, daß das Enzym eine sehr hohe Affinität für Glucose hat. Im Gegensatz dazu haben nicht aus Meeresorganismen stammende Enzyme, wie nicht-marine Glucoseoxidase (GOX), möglicherweise einen um wenigstens das Zehnfache höheren Km-Wert für Glucose. Mit anderen Worten, frühere Enzymsysteme haben eine viel geringere Affinität für Glucose als das System der vorliegenden Erfindung. In bewuchsverhindernden Anwendungen macht dies einen signifikanten Unterschied aus, da ein Enzym mit hoher Glucoseaffinität in der Lage ist, die gesamte vorhandene Glucose umzuwandeln. Andererseits wird angenommen, daß ein Enzym mit geringerer Glucoseaffinität ein Auswaschen von Glucose in die umliegende Umgebung ermöglicht. Das Auswaschen von Glucose wirkt der gewünschten bewuchsverhindernden Aktivität entgegen, da Glucose ein Substrat für bewuchsbildende Organismen sein wird. Das Auswaschen von Glucose führt daher zu vermehrter Bewuchsbildung.
• weniger Enzym erfordert als Systeme aus dem Stand der Technik, um eine gegebene antimikrobielle Wirkung bereitzustellen. Enzyme aus Meeresorganismen, wie Algen-HOX, haben auch einen niedrigen Km-Wert für Sauerstoff, welcher wiederum niedriger ist als der Km-Wert für Sauerstoff aus Systemen des Standes der Technik, wie GOX. Diese höhere Affinität für das Substrat verleiht Algen-HOX wiederum einen Vorteil. Dies ist darauf zurückzuführen, daß in bewuchsverhindernden Anwendungen der schlimmste Bewuchs in "abgeschlossenen" Umgebungen, wie Häfen, stattfindet, wo wenig Wasseraustausch stattfindet und Algen und andere bewuchsbildende Organismen ein starkes Wachstum zeigen. Genau an den Orten, an denen der Bewuchs am schlimmsten ist, ist auch der Sauerstoffgehalt des Wassers im Vergleich zu dem Sauerstoffgehalt im offenen Meer am niedrigsten. Enzyme aus Meeresorganismen mit einer hohen Affinität für Sauerstoff sind daher vorteilhaft.
• verbesserte Aktivität bei wahrscheinlichen Betriebstemperaturen liefert. In Oberflächenbeschichtungszusammensetzungen, wie bewuchsverhindernder Anstrichfarbe, muß die antimikrobielle (bewuchsverhindernde) Verbindung typischerweise bei zwischen 15 und 30°C aktiv sein. Für bewuchsverhindernde Zusammensetzungen ist dies die Meerwassertemperatur, bei der Bewuchs ein Problem darstellt. Konträr zu Systemen des Standes der Technik haben Enzyme aus Meeresorganismen, wie Algen-HOX, eine optimale Aktivitätstemperatur, die exakt der optimalen Temperatur für Bewuchsbildung entspricht, und diese Enzyme eignen sich daher perfekt als bewuchsverhindernde Mittel. Die optimale Temperatur ist in Beispiel 9 gezeigt.
• sichere und leicht erhältliche Substrate verwendet.
• eine verbesserte Salztoleranz besitzt, was zu einer weiter verbesserten Aktivität in Meeresumgebungen führt.
• beständig gegen Zersetzung durch bewuchsbildende Organismen ist. Enzyme aus Meeresorganismen, wie Algen-HOX, sind insbesondere Protease-resistente Enzyme. Sie überleben eine Behandlung mit Pronase (einem Proteasepräparat mit großer Wirkungsbreite), ohne daß es zu irgendeinem Aktivitätsverlust kommt. Diese Proteasebeständigkeit wird bei der bewuchsverhindernden Anwendung als besonders wichtig erachtet, da das Enzym demnach gegenüber einem Abbau durch Proteasen aus den bewuchsverhindernden Organismen, die versuchen, sich an die beschichtete Oberfläche anzuheften, beständig ist.

In der vorliegenden Beschreibung umfassen der Begriff "bewuchsbildende Mittel", auf den durch die Begriffe "bewuchsverhindernde(s) Mittel", "bewuchsverhindernd" Bezug genommen wird, und der Begriff "bewuchsverhindernde Mittel" Organismen, die auf der Oberfläche, die mit der vorliegenden Zusammensetzung behandelt werden soll, leben und/oder wachsen. Die Organismen umfassen Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilze und Protozoen, und Algen und Organismen, wie Algen, Pflanzen und Tiere. Der Organismus kann ein Meeresorganismus sein.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfaßt einen Enzymvorläufer und einen Substratvorläufer, wobei der Enzymvorläufer und der Substratvorläufer ein Substrat für das Enzym der vorliegenden Erfindung erzeugen, indem der Enzymvorläufer auf den Substratvorläufer wirkt. Diese Kombination aus Enzymvorläufer und Substratvorläufer wird im folgenden als "Substraterzeuger" bezeichnet.
Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann aus einem Meeresmikroorganismus erhalten werden oder daraus erhältlich sein.
Vorzugsweise wird das Enzym des vorliegenden Systems aus einer Meeresalge erhalten oder ist daraus erhältlich. Vorzugsweise wird das Enzym des vorliegenden Systems aus Chondrus crispus erhalten oder ist daraus erhältlich.
Vorzugsweise ist die bewuchsverhindernde Verbindung Wasserstoffperoxid.
Vorzugsweise ist das Enzym eine Oxidase. Vorzugsweise ist das Enzym ausgewählt unter Glucoseoxidase, L-Aminosäureoxidase, D-Aminooxidase, Galactoseoxidase, Hexoseoxidase, Pyranoseoxidase, Malatoxidase, Cholesteroloxidase, Arylalkoholoxidase, Alkoholoxidase, Lathosteroloxidase, Aspartatoxidase, Aminoxidase, D-Glutamatoxidase, Ethanolaminoxidase, NADH-Oxidase, Uratoxidase (Uricase) und Gemischen davon. Vorzugsweise ist das Enzym Hexoseoxidase.
HEXOSEOXIDASE-(HOX-)ENZYM
Hexoseoxidase (D-Hexose: O₂-Oxidoreduktase, EC 1.1.3.5) (auch bezeichnet als HOX) ist ein Enzym, welches in der Gegenwart von Sauerstoff D-Glucose und verschiedene andere reduzierende Zucker, einschließlich Maltose, Lactose und Zellobiose zu ihren korrespondierenden Lactonen oxidieren kann, mit anschließender Hydrolyse zu den jeweiligen Aldobionsäuren. Dementsprechend unterscheidet sich HOX von einer anderen Oxidoreduktase, Glucoseoxidase, die nur D-Glucose umwandeln kann, dahingehend, daß das Enzym einen breiteren Bereich von Zuckersubstraten verwenden kann. Die durch HOX katalysierte Oxidation kann wie folgt veranschaulicht werden:
D-Glucose + O₂ → γ-D-Gluconolacton + H₂O₂ oder
D-Galactose + O₂ → γ-D-Galactonolacton + H₂O₂
HOX wird von mehreren Meeresalgenspezies natürlich hergestellt. Solche Spezies sind unter anderem in der Familie Gigartinaceae zu finden. Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff "HOX" ein Enzym, welches in der Lage ist, die Substrate, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus D-Glucose, D-Galactose, D-Mannose, Maltose, Lactose und Zellobiose, zu oxidieren.
Vorzugsweise ist die Nexoseoxidase aus der Meeresalge Chondrus crispus erhältlich oder wird daraus erhalten.
In einem Aspekt ist das Hexoseoxidaseenzym ein Enzym, welches durch die Offenbarung der EP-A-0 832 245 abgedeckt ist.
HERSTELLUNG VON HEXOSEOXIDASE (HOX)
Das Gen, welches das HOX-Enzym codiert, wurde aus der Meeresalge Chondrus crispus kloniert (Stougaard und Hansen, 1996, Hansen und Stougaard, 1997). Die methylotrophe Hefe Hansenula polymorpha (entwickelt bei Rhein Biotech, Düsseldorf/Deutschland als ein Expressionssystem für heterologe Proteine) wurde auch verwendet, um das HOX-Enzym zu produzieren (das native Protein wurde aus Meeresalgen gereinigt (Poulsen und H∅strup, 1998)). Die WO 96/40935 und die WO 98/13478 offenbaren ebenfalls die Klonierung und die Expression in rekombinanten Wirtsorganismen eines Gens, welches ein Protein mit HOX-Aktivität codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Hexoseoxidaseenzym die in SEQ ID NO:1 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Variante, ein Homologes, ein Derivat oder ein Fragment davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Hexoseoxidaseenzym die in SEQ ID NO:1 dargestellte Aminosäuresequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Hexoseoxidaseenzym durch eine Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO:1 dargestellt ist, oder durch eine Variante, ein Homologes, ein Derivat oder ein Fragment davon codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Hexoseoxidaseenzym durch eine in SEQ ID NO:1 dargestellte Nukleotidsequenz codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Hexoseoxidaseenzym durch eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, an die in SEQ ID NO:1 dargestellte Nukleotidsequenz zu hybridisieren, oder durch eine Variante, ein Homologes, ein Derivat oder ein Fragment davon oder durch eine zu der hybridisierbaren Sequenz komplementäre Sequenz codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Hexoseoxidaseenzym durch eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, an die in SEQ ID NO:1 dargestellte Nukleotidsequenz zu hybridisieren, oder durch eine zu der hybridisierbaren Sequenz komplementäre Sequenz codiert.
Das Enzym, vorzugsweise das Hexoseoxidaseenzym, kann auf eine Weise hergestellt werden, wie sie in der britischen Patentanmeldung Nr. 9927801.2 beschrieben ist.
VARIANTEN/HOMOLOGE/DERIVATE (AMINOSÄURESEQUENZ)
Bevorzugte Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung sind in SEQ ID NO:1 dargestellt oder es sind Sequenzen, die von dem HOX-Enzym der vorliegenden Erfindung erhältlich sind, sie umfassen jedoch auch homologe Sequenzen, die von irgendeiner Quelle, wie beispielsweise verwandten Virus-/Bakterien-Proteinen, zellulären Homologen und synthetischen Peptiden, sowie Varianten oder Derivaten davon erhalten wurden.
Somit umfaßt die vorliegende Erfindung Varianten, Homologe oder Derivate der hier angegebenen Aminosäuresequenzen sowie Varianten, Homologe oder Derivate der diese Aminosäuresequenzen codierenden Nukleotidsequenz.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird eine homologe Sequenz so aufgefaßt, daß sie eine Aminosäuresequenz umfaßt, die auf Aminosäureebene zu wenigstens 75, 85 oder 90% identisch, vorzugsweise zu wenigstens 95 oder 98% identisch ist, und zwar wenigstens über beispielsweise die in SEQ ID NO:1 des hier bereitgestellten Sequenzprotokolls dargestellte Aminosäuresequenz. Insbesondere sollte Homologie typischerweise eher in Bezug auf diejenigen Bereiche der Sequenz betrachtet werden, von denen bekannt ist, daß sie für die Enzymaktivität wesentlich sind, als auf die nicht-wesentlichen benachbarten Sequenzen. Diese Bereiche umfassen ohne Beschränkung hierauf die mutmaßlichen FAD-Bindungsdomänen in HOX, wie SGGH₇₉C, LGGH₁₄₆I und LGGH₃₂₀A. Obwohl Homologie auch im Hinblick auf Ähnlichkeit betrachtet werden kann (d.h. Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften/Funktionen), ist es im Kontext der vorliegenden Erfindung bevorzugt, Homologie im Hinblick auf Sequenzidentität auszudrücken.
Homologievergleiche können durch das Auge oder, was üblicher ist, mit Hilfe von leicht erhältlichen Sequenzvergleichsprogrammen durchgeführt werden. Diese kommerziell erhältlichen Computerprogramme können den Prozentsatz an Homologie zwischen zwei oder mehr Sequenzen berechnen.
Der Prozentsatz an Homologie kann über zusammenhängende Sequenzen berechnet werden, d.h. eine Sequenz wird mit der anderen Sequenz ausgerichtet und jede Aminosäure in einer Sequenz wird direkt mit der korrespondierenden Aminosäure in der anderen Sequenz verglichen, wobei Rest für Rest vorgegangen wird. Dies wird als "lückenloses" Alignment bezeichnet. Typischerweise werden solche lückenlosen Alignments nur über eine relativ kleine Anzahl von Resten durchgeführt.
Obwohl dies ein sehr einfaches und konsistentes Verfahren ist, wird dabei nicht berücksichtigt, daß beispielsweise in einem ansonsten identischen Paar von Sequenzen eine Insertion oder Deletion dazu führt, daß die nachfolgenden Aminosäurereste außer Alignment gebracht werden, was potentiell zu einer starken Reduktion des Prozentsatzes an Homologie führt, wenn ein globales Alignment durchgeführt wird. Folglich sind die meisten Sequenzvergleichsverfahren so ausgestaltet, daß sie optimale Alignments produzieren, die mögliche Insertionen und Deletionen berücksichtigen, ohne daß die Gesamthomologie in unangemessener Weise beeinträchtigt wird. Dies wird durch Einfügen von "Lücken" in das Sequenzalignment bewerkstelligt, um zu versuchen, die lokale Homologie zu maximieren.
Diese komplexeren Verfahren weisen jedoch jeder Lücke in dem Alignment "Lücken-Strafpunkte" zu, so daß für die gleiche Anzahl an identischen Aminosäuren ein Sequenzalignment mit so wenigen Lücken wie möglich – was eine stärkere Verwandtschaft zwischen den beiden verglichenen Sequenzen widerspiegelt – eine höhere Bewertungsziffer liefert als eines mit vielen Lücken. Typischerweise werden "affine Lücken-Strafpunkte" verwendet, die dem Vorhandensein einer Lücke ein relativ hohes Strafmaß auferlegen und jedem nachfolgenden Rest in der Lücke ein geringeres Strafmaß auferlegen. Dies ist das am häufigsten verwendete Lückenbewertungssystem. Hohe Strafen für Lücken erzeugen natürliche optimierte Alignments mit weniger Lücken. Die meisten Alignmentprogramme gestatten eine Modifizierung der Lücken-Strafpunkte. Bevorzugt werden jedoch die Standardwerte verwendet, wenn eine solche Software für Sequenzvergleiche verwendet wird. Bei Verwendung des GCG Wisconsin Bestfit-Pakets (siehe unten) beträgt das Standardstrafmaß für Lücken für Aminosäuren –12 für eine Lücke und –4 für jede Verlängerung.
Die Berechnung des maximalen Prozentsatzes an Homologie erfordert daher zunächst die Herstellung eines optimalen Alignments unter Berücksichtigung von Lückenstrafpunkten. Ein geeignetes Computerprogramm für die Durchführung eines solchen Alignments ist das GCG Wisconsin Bestfit-Paket (University of Wisconsin, USA, Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Beispiele anderer Software, die Sequenzvergleiche durchführen kann, umfassen ohne Beschränkung hierauf das BLAST-Paket (siehe Ausubel et al., 1999 ebd. – Kapitel 18), FASTA (Atschul of al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) und die GENEWORKS-Folge von Vergleichswerkzeugen. Sowohl BLAST als auch FASTA sind für Offline- und Online-Suchen erhältlich (siehe Ausubel et al., 1999, ebd., Seiten 7-58 bis 7-60). Bevorzugt wird jedoch das GCG Bestfit-Programm verwendet.
Obwohl der endgültige Prozentsatz an Homologie im Hinblick auf die Identität gemessen werden kann, basiert der Alignmentprozeß typischerweise nicht auf einem Alles-oder-nichts-Paarvergleich. Stattdessen wird im allgemeinen eine skalierte Ähnlichkeitsbewertungsmatrix verwendet, die jedem paarweisen Vergleich auf Basis der chemischen Ähnlichkeit oder des evolutionären Abstands Bewertungsziffern zuweist. Ein Beispiel einer solchen üblicherweise verwendeten Matrix ist die BLOSUM62-Matrix – die Standardmatrix für die BLAST-Programmfolge. GCG Wisconsin-Programme verwenden im allgemeinen eher die öffentlichen Standardwerte oder eine übliche Symbolvergleichstabelle, falls mitgeliefert (siehe Benutzerhandbuch für weitere Einzelheiten). Es ist bevorzugt, die öffentlichen Standardwerte für das GCG-Paket oder im Falle anderer Software die Standardmatrix, wie BLOSUM62, zu verwenden.
Sobald die Software ein optimales Alignment produziert hat, ist es möglich, den Prozentsatz an Homologie, vorzugsweise den Prozentsatz an Sequenzidentität, zu berechnen. Die Software führt dies typischerweise als Teil des Sequenzvergleichs aus und erzeugt ein numerisches Ergebnis.
Die Begriffe "Variante" oder "Derivat" in Bezug auf die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen jede Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Hinzufügung einer (oder mehrerer) Aminosäure(n) aus oder zu der Sequenz, mit der Maßgabe, daß die resultierende Aminosäuresequenz Enzymaktivität besitzt und vorzugsweise wenigstens die gleiche Enzymaktivität besitzt wie die in SEQ ID NO:1 dargestellte Aminosäuresequenz.
SEQ ID NO:1 kann zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Typischerweise werden Modifikationen vorgenommen, die die Enzymaktivität der Sequenz aufrechterhalten. Aminosäuresubstitutionen können beispielsweise in einer Zahl von 1, 2, oder 3 bis 10 oder 20 Substitutionen vorgenommen werden, mit der Maßgabe, daß die modifizierte Sequenz die erforderliche Enzymaktivität beibehält. Aminosäuresubstitutionen können die Verwendung von nicht natürlich vorkommenden Analogen einschließen.
SEQ ID NO:1 der vorliegenden Erfindung kann auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten aufweisen, die eine stille Veränderung erzeugen und in einem funktionell äquivalenten Enzym resultieren. Absichtliche Aminosäuresubstitutionen können auf Basis von Ähnlichkeiten in der Polarität, der Ladung, der Löslichkeit, der Hydrophobie, der Hydrophilie und/oder der amphipathischen Beschaffenheit der Reste durchgeführt werden, solange die Enzymaktivität des HOX-Enzyms aufrechterhalten wird. Beispielsweise umfassen negativ geladene Aminosäuren Aspa raginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin, und Aminosäuren mit ungeladenen Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophiliewerten umfassen Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.
Konservative Substitutionen können beispielsweise gemäß der nachstehenden Tabelle durchgeführt werden. Aminosäuren in dem gleichen Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in der gleichen Zeile in der dritten Spalte können gegeneinander substituiert werden:
VARIANTEN/HOMOLOGE/DERIVATE(NUKLEOTIDSEQUENZ)
Für einen Fachmann versteht es sich, daß aufgrund der Degeneration des genetischen Codes zahlreiche verschiedene Nukleotidsequenzen das gleiche HOX-Enzym codieren können. Weiterhin versteht es sich, daß Fachleute unter Verwendung von Routinetechniken Nukleotidsubstitutionen durchführen können, die das HOX-Enzym, das durch die Nukleotidsequenz der Erfindung codiert wird, nicht beeinflussen, um die Codonverwendung eines bestimmten Wirtsorganismus, in dem das HOX-Enzym der vorliegenden Erfindung exprimiert werden soll, widerzuspiegeln.
Die Begriffe "Variante", "Homologes" oder "Derivat" in Bezug auf die in SEQ ID NO:1 dargestellte Nukleotidsequenz umfaßt jede Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Addition einer (oder mehrerer) Nukleinsäure(n) aus oder zu der Sequenz, mit der Maßgabe, daß die resultierende Nukleotidsequenz ein HOX-Enzym mit einer Enzymaktivität und vorzugsweise wenigstens der gleichen Enzymaktivität wie die in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls dargestellte Nukleotidsequenz codiert.
Wie es oben angegeben wurde, bestehen im Hinblick auf die Sequenzhomologie bevorzugt wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu den in dem hier bereitgestellten Sequenzprotokoll dargestellten Sequenzen. Bevorzugter bestehen wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie. Nukleotidhomologievergleiche können wie oben beschrieben durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Sequenzvergleichsprogramm ist das oben beschriebene GCG Wisconsin Bestfit-Programm. Die Standard-Bewertungsmatrix hat einen Übereinstimmungswert von 10 für jedes identische Nukleotid und –9 für jede Nichtübereinstimmung. Das standardmäßige Lückenerzeugungsmalus beträgt –50 und das standardmäßige Lückenerzeugungsmalus beträgt –3 für jedes Nukleotid.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Nukleotidsequenzen, die selektiv an die hier präsentierten Sequenzen oder jede Variante, jedes Fragment oder jedes Derivat davon oder an das Komplement von jeder bzw. jedem der obigen hybridisieren können. Nukleotidsequenzen sind vorzugsweise wenigstens 15 Nukleotide lang, bevorzugter sind sie wenigstens 20, 30, 40 oder 50 Nukleotide lang.
SUBSTRAT
Vorzugsweise ist das Substrat unter Peptiden, L-Aminosäure und Kohlehydraten/Zuckern, einschließlich Hexosen, vorzugsweise Glucose, Galactose, Lactose, 2-Desoxyglucose, Pyranose, Xylan, Zellulose, Inulin, Stärke, Dextran, Pektin und Gemischen davon ausgewählt.
In einer überaus bevorzugten Ausführungsform ist die Enzym/Substrat-Kombination ausgewählt unter Glucose/Hexoseoxidase, Glucose/Glucoseoxidase, L-Aminosäure/L-Aminosäureoxidase, Galactose/Galactoseoxidase, Lactose/β-Galactosidase/Hexoseoxidase, Lactose/β-Galactosidase/Glucoseoxidase, 2-Desoxyglucose/Glucoseoxidase, Pyranose/Pyranoseoxidase und Gemischen davon.
In einem Aspekt wird die bewuchsverhindernde Zusammensetzung durch die Einwirkung des Enzyms auf das Substrat, welches in der Zusammensetzung vorliegt, erzeugt. So wird die bewuchsverhindernde Zusammensetzung in einem "Ein-Stufen"-Prozeß erzeugt. In einigen Fällen kann das Substrat in situ hergestellt werden. In diesen Fällen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin einen Enzymvorläufer und einen Substratvorläufer, wobei der Enzymvorläufer und der Substratvorläufer so ausgewählt sind, daß der Enzymvorläufer das Substrat erzeugt. In diesem letztgenannten Aspekt wird die bewuchsverhindernde Zusammensetzung in einem "Zwei-Stufen"-Prozeß erzeugt.
In dem einstufigen Prozeß ist das Enzym vorzugsweise unter Hexoseoxidase, Glucoseoxidase, L-Aminosäureoxidase, Galactoseoxidase, Pyranoseoxidase und Gemischen davon ausgewählt.
In dem einstufigen Prozeß ist das Substrat vorzugsweise unter einer Hexose, bevorzugt Glucose, L-Aminosäure, Galactose, 2-Desoxyglucose, Pyranose und Gemischen davon ausgewählt.
In dem einstufigen Prozeß ist die Enzym/Substrat-Kombination vorzugsweise unter Glucose/Hexoseoxidase, Glucose/Glucoseoxidase, L-Aminosäure/L-Aminosäureoxidase, Galactose/Galactoseoxidase, 2-Desoxyglucose/Glucoseoxidase, Pyranose/Pyranoseoxidase und Gemischen davon ausgewählt.
In dem zweistufigen Prozeß ist das Enzym vorzugsweise Hexoseoxidase.
In dem zweistufigen Prozeß ist das Substrat vorzugsweise Glucose.
In dem zweistufigen Prozeß ist der Enzymvorläufer vorzugsweise Amyloglucosidase.
In dem zweistufigen Prozeß ist der Substratvorläufer vorzugsweise Stärke.
In dem zweistufigen Prozeß ist die Substratvorläufer/Enzymvorläufer/Enzym-Kombination daher vorzugsweise Stärke/Amyloglucosidase/Hexoseoxidase.
Bevorzugt ist der Substratvorläufer des zweistufigen Prozesses unter Oligomeren und Polymeren von Substraten für oxidative Enzyme, Stärke, Lactose, Zellulose, Dextrose, Peptid, Inulin und Gemischen davon ausgewählt.
Die Bereitstellung von Substratvorläufern ist besonders bevorzugt, da sie durch die Wirkung des Enzymvorläufers auf den Substratvorläufer eine nachhaltige und/oder verlängerte Freisetzung von Substrat bereitstellen.
Natürlich vorkommende Stärke ist als Substratvorläufer besonders bevorzugt. Natürlich vorkommende Stärke liefert dicht gepackte Kristalle, die leicht in einer Oberflächenbeschichtung verwendet werden können. Darüber hinaus ist natürlich vorkommende Stärke nicht wasserlöslich.
Zellulose ist als Substratvorläufer ebenfalls besonders bevorzugt. Zellulose ist eine übliche Komponente von Anstrichfarbe, und die Verwendung von Zellulose als Substratvorläufer reduziert die Anzahl an zusätzlichen Komponenten, die zu einer Farbzusammensetzung hinzugefügt werden müssen.
Vorzugsweise ist der Enzymvorläufer des zweistufigen Prozesses unter Lückenerzeugungsmalus von außen wirkenden Enzymen, die oligomere oder polymere Substrate zu monomeren Einheiten abbauen können, z.B. β-Galactosidase, Peptidase, Amyloglucosidase und Gemischen davon, ausgewählt.
Optional umfaßt die Zusammensetzung weiterhin ein Bindemittel, um wenigstens einen der Bestandteile zu immobilisieren und optional die Enzyme zu immobilisieren.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können als Beschichtungen, Lacke, Farbstoffe, Emails und dergleichen formuliert werden und werden im folgenden allgemein als "Beschichtung(en)" bezeichnet.
In einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung somit eine Beschichtung, bestehend aus einer Zusammensetzung wie oben beschrieben.
Vorzugsweise ist die Beschichtung für die Behandlung einer Oberfläche, ausgewählt unter Außenholzmaterial, der äußeren Oberfläche eines Zentralheizungssystems und der Oberfläche eines Seefahrzeugs, formuliert.
Die Beschichtung kann ein flüssiges Vehikel (Lösungsmittel) zum Lösen oder Suspendieren der Zusammensetzung umfassen.
Das flüssige Vehikel kann unter allen Flüssigkeiten ausgewählt sein, die die Wirkungen irgendwelcher wesentlicher Komponenten der Zusammensetzung nicht beeinträchtigen. Insbesondere sollte das flüssige Vehikel die Aktivität des wesentlichen Enzyms (der wesentlichen Enzyme) und/oder der bewuchsverhindernden Verbindung nicht beeinträchtigen. Geeignete flüssige Vehikel sind in der US-A-5,071,479 offenbart und umfassen Wasser und organische Lösungsmittel, einschließlich aliphatischer Kohlenwasserstoffe, aromatischer Kohlenwasserstoffe, wie Xylen, Toluen, Gemischen aus aliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffen mit Siedepunkten zwischen 100 und 320°C, vorzugsweise zwischen 150 und 230°C, Erdöldestillaten mit hohem Aromatengehalt, z.B. Lösungsmittel Naphtha, destilliertes Teeröl und Gemische davon, Alkoholen, wie Butanol, Octanol und Glycolen, pflanzlichen und mineralischen Ölen, Ketonen, wie Aceton, Erdölfraktionen, wie Lösungsbenzin und Kerosen, chlorierten Kohlenwasserstoffen, Glycolestern, Glycolesterethern, Derivaten und Gemischen davon.
Das flüssige Vehikel kann wenigstens ein polares Lösungsmittel, wie Wasser, im Gemisch mit einem öligen oder ölartigen schwerflüchtigen organischen Lösungsmittel, wie dem Gemisch aus aromatischen und aliphatischen Lösungsmitteln, wie es in Testbenzin, üblicherweise auch als Lösungsbenzin bezeichnet, zu finden ist.
Das Vehikel kann typischerweise wenigstens eines unter einem Verdünnungsmittel, einem Emulgiermittel, einem Netzmittel, einem Dispergiermittel oder einem anderen oberflächenaktiven Mittel enthalten. Beispiele geeigneter Emulgiermittel sind in der US-A-5,071,479 offenbart und umfassen Nonylphenol-Ethylenoxidether, Polyoxyethylensorbitolether oder Polyoxyethylensorbitanester von Fettsäuren, Derivate und Gemische davon.
Jedes geeignete Oberflächenbeschichtungsmaterial kann in die Zusammensetzung und/oder Beschichtung der vorliegenden Erfindung aufgenommen werden. Beispiele von im Handel bekannten Beschichtungsmaterialien sind Polyvinylchloridharze in einem System auf Lösungsmittelbasis, chlorierte Kautschuke in einem System auf Lösungsmittelbasis, Acrylharze und Methacrylatharze in Sy stemen auf Lösungsmittelbasis oder in wäßrigen Systemen, Vinylchlorid-Vinylacetat-Copolymersysteme, wie wäßrige Dispersionen oder Systeme auf Lösungsmittelbasis, Butadiencopolymere, wie Butadien-Styren-Kautschuke, Butadien-Acrylnitril-Kautschuke und Butadien-Styren-Acrylnitril-Kautschuke, trocknende Öle, wie Leinöl, Alkydharze, Asphalt, Epoxidharze, Urethanharze, Polyesterharze, Phenolharze, Derivate und Gemische davon.
Die Zusammensetzung und/oder Beschichtung der vorliegenden Erfindung kann Pigmente, ausgewählt unter anorganischen Pigmenten, wie Titandioxid, Eisen(III)-oxid, Kieselerde, Talk oder Porzellanerde, organischen Pigmenten, wie Kohlenschwarz oder in Meerwasser unlöslichen Farbstoffen, Derivaten und Gemischen davon, enthalten.
Die Zusammensetzung und/oder Beschichtung der vorliegenden Erfindung kann Materialien, wie Kolophonium, enthalten, um eine kontrollierte Freisetzung der bewuchsverhindernden Verbindung bereitzustellen, wobei Kolophonium in sehr geringem Umfang in Meerwasser löslich ist.
Die Zusammensetzung und/oder Beschichtung der vorliegenden Erfindung kann Weichmacher, Rheologieeigenschaften modifizierende Mittel und andere konventionelle Inhaltsstoffe und Gemische davon enthalten.
Die Zusammensetzung und/oder Beschichtung der vorliegenden Erfindung, insbesondere die Beschichtung, umfaßt weiterhin ein Adjuvans, wie es herkömmlicherweise in Zusammensetzungen verwendet wird, die dem Schutz von an eine Wasserumgebung ausgesetzten Materialien dienen. Diese Adjuvanzien können ausgewählt sein unter zusätzlichen Fungiziden, zusätzlichen Lösungsmitteln, Verarbeitungsadditiven, wie Entschäumern, Fixiermitteln, Weichmachern, UV-Stabilisatoren oder Stabilitätsverstärkern, wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Farbstoffen, Farbpigmenten, Trocknungsmitteln, Korrosionsinhibitoren, Verdickungsmitteln oder Antiabsetzmitteln, wie Carboxymethylzellulose, Polyacrylsäure oder Polymethacrylsäure, Hautverhinderungsmitteln, Derivaten und Gemischen davon.
Das zusätzliche Fungizid (die zusätzlichen Fungizide), das bzw. die in der Zusammensetzung und/oder Beschichtung der vorliegenden Erfindung verwendet wird bzw. werden, ist bzw. sind vorzugsweise in dem flüssigen Vehikel löslich.
In einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Meeresbewuchs verhinderndes Mittel, bestehend aus einer Zusammensetzung wie oben definiert.
Vorzugsweise ist das bewuchsverhindernde Mittel selbstglättend.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind das Substrat oder der Substraterzeuger und/oder das Enzym eingekapselt. Vorzugsweise sind das Substrat/der Substraterzeuger und/oder das Enzym in einer semipermeablen Membran eingekapselt.
Das Substrat/der Substraterzeuger und das Enzym können unabhängig voneinander einzeln eingekapselt sein oder sie können zusammen eingekapselt sein. In der erstgenannten Ausführungsform kann das Substrat/der Substraterzeuger oder das Enzym durch den Bewuchsbildner aktiviert werden. Beispielsweise kann das einkapselnde Material so ausgewählt werden, daß bei Kontakt mit einem Bewuchsbildner das Substrat/der Substraterzeuger oder das Enzym freigesetzt wird, um mit dem anderen von dem Substrat/Substraterzeuger oder Enzym in Kontakt zu treten. Auf diese Weise kann eine Zusammensetzung bereitgestellt werden, die nur eine bewuchsverhindernde Verbindung bereitstellt oder die Bereitstellung einer bewuchsverhindernden Verbindung bei Kontakt mit einem Bewuchsbildner vermehrt.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann als ein gebrauchsfertiges Produkt oder als ein Konzentrat bereitgestellt werden. Das gebrauchsfertige Produkt kann in der Form einer wäßrigen Lösung, einer wäßrigen Dispersion, einer Öllösung, einer Öldispersion, einer Emulsion oder eines Aerosolpräparats vorliegen. Das Konzentrat kann beispielsweise als Additiv für die Beschichtung verwendet werden, oder es kann vor Gebrauch mit zusätzlichen Lösungsmitteln oder Suspendiermitteln verdünnt werden.
Ein Aerosolpräparat gemäß der Erfindung kann in der üblichen Weise erhalten werden, indem man die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die ein geeignetes Lösungsmittel enthält oder darin gelöst oder suspendiert ist, in einer flüchtigen Flüssigkeit, die zur Verwendung als Treibmittel geeignet ist, beispielsweise das Gemisch aus Chlor- und Fluorderivaten von Methan und Ethan, kommerziell erhältlich unter dem Markennamen "Freon", oder Druckluft aufnimmt.
Wie es in der US-A-5,071-479 diskutiert ist, kann die Zusammensetzung und/oder Beschichtung der vorliegenden Erfindung zusätzliche Inhaltsstoffe enthalten, von denen bekannt ist, daß sie in Konservierungsstoffen und/oder Beschichtungen nützlich sind. Solche Inhaltsstoffe enthalten Fixiermittel, wie Carboxymethylzellulose, Polyvinylalkohol, Paraffin, Co-Lösungsmittel, wie Ethylglycolacetat und Methoxypropylacetat, Weichmacher, wie Benzoesäureester und Phthalate, z.B. Dibutylphthalat, Dioctylphthalat und Didodecylphthalat, Derivate und Gemische davon. Optional können in Abhängigkeit von spezifischen Anwendungsformen auch Farbstoffe, Farbpigmente, Korrosionsinhibitoren, chemische Stabilisatoren oder Trocknungsmittel (Trockner), wie Kobaltoctat und Kobaltnaphthenat, enthalten sein.
Die Zusammensetzung und/oder Beschichtung der vorliegenden Erfindung kann mit irgendeiner der auf dem Gebiet bekannten Techniken, einschließlich Streichen, Sprühen, Walzenbeschichtung, Eintauchen und Kombinationen davon, aufgebracht werden.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch einfaches Mischen der verschiedenen Inhaltsstoffe bei einer Temperatur, bei der sie nicht nachteilig beeinflußt werden, hergestellt werden. Die Herstellungsbedingungen sind nicht kritisch. Die Ausrüstung und die Verfahren, die konventionell bei der Herstellung von Beschichtungen und ähnlichen Zusammensetzungen verwendet werden, können in vorteilhafter Weise eingesetzt werden.
Die Erfindung wird nun lediglich beispielhaft in den folgenden Beispielen beschrieben.
BEISPIELE
Die bewuchsverhindernde Wirkung einer bewuchsverhindernden Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird gemäß den folgenden Beispielen getestet. Diese Beispiele zeigen die Wirksamkeit der vorliegenden Zusammensetzung bei der Verhinderung von Bewuchsbildung. Die Beispiele liefern auch die Optimierung der bewuchsverhindernden Eigenschaften der vorliegenden Zusammensetzung.
Die in jedem der vorliegenden Beispiele verwendete Hexoseoxidase (HOX) ist erhältlich von DaniscoCultor. Die HOX ist ein fermentiertes Produkt aus der Hefe Hansenula polymorpha, die das Gen exprimiert, welches das aus der Meeresalge Chondrus crispus klonierte HOX-Enzym codiert.
BEISPIEL 1 – Herstellung einer bewuchsverhindernden Zusammensetzung ("einstufig")
Lösliche oder immobilisierte Hexoseoxidase oder ein anderes Wasserstoffperoxid erzeugendes Enzym, wie Glucoseoxidase, wird als ein eine bewuchsverhindernde Verbindung erzeugendes Enzym in einer bewuchsverhindernden Zusammensetzung getestet. Die Hexoseoxidase kann beispielsweise durch Bindung an einen Anionenaustauscher, Q Sepharose FF^TM (erhältlich von Pharmacia), unter Verwendung von 20 mM Triethanolaminpuffer, pH 7,3, immobilisiert werden. Alternativ werden Hexoseoxidase oder alternative Wasserstoffperoxid erzeugende Enzyme kovalent an einen geeigneten Träger, wie Epoxy-aktivierte Sepharose^TM (Pharmacia, Schweden), Carbodiimid-aktivierte Agarose (Bio-Rad, USA), gebunden. Andere konventionelle, auf dem Gebiet bekannte Verfahren zur Immobilisierung können ebenfalls verwendet werden.
Der Bereich der verwendeten Konzentrationen beträgt 0,0001 bis 1000 Einheiten Hexoseoxidaseaktivität/Wasserstoffperoxid erzeugendes Enzym pro ml an bewuchsverhindernder Zusammensetzung.
Eine Einheit Enzymaktivität wird als die Menge von Enzym, die bei 25°C 1 μmol H₂O₂ pro Min. erzeugt, definiert.
Um die Eignung des Enzyms zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu testen, kann seine Aktivität wie folgt getestet werden. Die Hexoseoxidase-(HOX-)Aktivität wird gemäß dem folgenden Verfahren gemessen.
Der HOX-Test basiert auf der Messung von Wasserstoffperoxid, das bei der Oxidation von Glucose erzeugt wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert o-Dianisidin in der Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines Farbstoffs.
Reagenzien

1. 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,3
2. 100 mM D-Glucose (SIGMA, G-8270) in 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,3
3. o-Dianisidin (SIGMA, D-3252), 3,0 mg/ml in destilliertem Wasser
4. Peroxidase (SIGMA, P-8125), 0,10 mg/ml in 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,3

Test

120 μl Reagens 1
150 μl Reagens 2
10 μl Reagens 3
10 μl Reagens 4 und
10 μl Enzymlösung

Der Test wird in einer Mikrotiterplatte durchgeführt. Die Reaktion wird durch die Hinzufügung von Enzymlösung gestartet. Das Gemisch wird unter Schütteln bei 25°C für 15 Min. inkubiert. Der Leerversuch enthält alle Komponenten mit Wasser anstelle von Enzymlösung. Die Bildung des Farbstoffs wird in einem Mikrotiterplattenleser bei 405 nm gemessen. Die Linearität der Reaktion kann unter Verwendung eines Kinetikprogramms auf dem Mikrotiterplattenleser überprüft werden.
Eine Standardkurve für Wasserstoffperoxid kann unter Verwendung variierender Konzentrationen von frischem H₂O₂ (MERCK) erstellt werden.
BEISPIEL 2 – Herstellung einer bewuchsverhindernden Zusammensetzung ("zweistufig")
Glucose und Galactose in Konzentrationen von 0,01 bis 100 μg pro ml bewuchsverhindernder Zusammensetzung werden als Substrate getestet, um ein Substrat für Hexoseoxidase in dem in Beispiel 1 beschriebenen System zu erzeugen. Um ein kontinuierlich Substrate erzeugendes System bereitzustellen, wird Stärke, vorzugsweise intakte Stärkekörnchen aus Weizen, Mais oder Kartoffel, in einer Konzentration von 0,01 ng bis 100 μg pro ml an bewuchsverhindernder Zusammensetzung zusammen mit Amyloglucosidase (GRINDAMYL^TM AG 1500 Bäckerenzym von DaniscoCultor oder ein anderes kommerziell erhältliches Amyloglucosidaseprodukt) verwendet. Die Komponenten liegen in Konzentrationen vor, die 0,000001 bis 10 AGU pro ml an bewuchsverhindernder Zusammensetzung liefern.
1 AGU ist definiert als die Amyloglucosidaseaktivität, die 1 μmol Glucose pro Minute aus Maltose (0,5% w/v) in 50 mM Natriumacetat, pH 5,0 (eingestellt mit konzentrierter Essigsäure) bei 40°C freisetzt. Der Test wird gestoppt, indem man 200 μl des Testgemischs in 100 μl 0,1 M Salzsäurechlorid überführt, und die Menge an freigesetzter Glucose wird unter Verwendung von Glucosedehydrogenasereagens (Merck, Nr. 12193) oder einem anderen Glucosedetektionssystem gemessen.
BEISPIEL 3 – Herstellung von Wasserstoffperoxid durch HOX enthaltende Anstrichfarbe
Um die Fähigkeit von Hexoseoxidase (HOX) zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid zu testen, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
Zu 11,0 g Anstrichfarbe (Wandfarbe Sadolin Glans 7 auf Wasserbasis bzw. Histor 9010 auf Ölbasis) wurden 0,2, 0,5 bzw. 1 g HOX (DaniscoCultor, fermentiertes Produkt aus Hansenula polymorpha), sprühgetrocknet auf Stärke (10 Einheiten/g), zugegeben. Zu der Farbe auf Wasserbasis wurden auch 5 g Wasser pro Behandlung zugegeben.
Einweg-Übertragungspipetten aus Kunststoff (Sarstedt) wurden in die Farbe eingetaucht (Kopfteil). Die Übertragungspipetten ließ man für 3 Stunden lufttrocknen.
Die Hexoseoxidase-(HOX-)Aktivität wurde dann durch Eintauchen des mit Farbe bedeckten Pipettenkopfs in ein Glasröhrchen mit 2 ml HOX-Testreagens, siehe unten, gemessen, wobei die einzige HOX-Aktivität von der HOX in der Farbe stammte.
Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur inkubiert.
Als Blindprobe wurde Farbe ohne Zugabe von HOX verwendet.

Das Ergebnis des Experiments ist in Tabelle 1 gezeigt. HOX ist homogen in der Farbe verteilt, da die gesamte Oberfläche der Farbe sich unmittelbar rot färbt, wenn sie mit dem HOX-Testreagens in Kontakt kommt. Die Farbentwicklung wird unmittelbar beobachtet, was darauf hindeutet, daß die Farbe keinerlei hemmende Wirkung auf die HOX-Aktivität hat. Dieses Experiment beweist, daß HOX in der Lage ist, Wasserstoffperoxid aus exogen zugegebenem Substrat (hier Glucose) zu erzeugen, selbst wenn sie nach dem Trocknen in einer Farbmatrix immobilisiert ist. Tabelle 1

	Aktivität
Farbe auf Wasserbasis, Blindprobe	0
0,2 g HOX	+
0,5 g HOX	++
1,0 g HOX	+++
Farbe auf Ölbasis, Blindprobe	0
0,2 g HOX	+
0,5 g HOX	++
1,0 g HOX	+++
Kontrolle, Testreagens plus freie HOX	+++

Der Bereich der verwendeten Konzentrationen beträgt 0,0001 bis 1000 Einheiten Hexoseoxidaseaktivität oder eines alternativen Wasserstoffperoxid erzeugenden Enzyms pro ml an bewuchsverhindernder Zusammensetzung.
BEISPIEL 4 – Modellsystem für die Beschichtung
Eine Dialysierhülse, die eine bewuchsverhindernde Zusammensetzung enthält, wird als Modellsystem für eine Beschichtung verwendet, um Bewuchsbildung auf der Oberfläche eines beschichteten Materials zu verhindern.
Eine bewuchsverhindernde Zusammensetzung in der Dialysierhülse wird verwendet, um eine Konzentration von Wasserstoffperoxid auf der Oberfläche der Dialysierhülse zu erzeugen, die wirksam ist, um Bewuchsbildung zu verhindern. Die verwendete Dialysierhülse hat einen Ausschlußwert von etwa 10000 Da. Die Dialysierhülse ist entweder eine Dialysierhülse oder eine Dialysekassette (wie Slide-A-Lyzer^TM, erhältlich von Pierce, IL, USA).
Die Dialysierhülse wird in einen Glaskolben mit 1 bis 5 Litern See- oder Meerwasser, gesammelt wie oben beschrieben, eingetaucht. Der Inhalt des Glaskolbens wird mit einem Magnetrührer langsam gerührt und bei Raumtemperatur in der Nähe eines Fensters, um Tageslicht darauf einfallen zu las sen, inkubiert. Die Bewuchsbildung auf der Dialysierhülse wird für bis zu 4 Wochen auf Basis des Erscheinens einer Mikrobenwachstumsschicht auf der Dialysierhülse visuell überwacht und wie oben beschrieben auf einer Skala von 1 bis 5 bewertet. Als Negativkontrolle wird eine Leitungswasser enthaltende Dialysierhülse verwendet.
Optional wird Katalase, immobilisiert auf Nitrozellulosemembranstücken, die anschließend mit 0,1% Tween 20 blockiert wurde, zu dem See- oder Meerwasser zugegeben, um eine Ansammlung von Wasserstoffperoxid in dem die Dialysierhülse umgebenden Wasser zu vermeiden. Die verwendete Katalasekonzentration liegt im Bereich von 0,000001 bis 100 CU, wobei 1 CU als die Katalaseaktivität definiert ist, bei der 1 μmol Wasserstoffperoxid pro Minute bei 30°C in 50 nM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, abgebaut werden, wie es im Sigma-Katalog: Biochemicals Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents, Sigma Chemical Company 1995, Seite 221, für Katalase beschrieben ist.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind wirkungsvoll beim Verhindern von Bewuchsbildung.
BEISPIEL 5 – Stabilität von HOX in Farbe

Die gestrichenen Köpfe der in Beispiel 1 beschriebenen Übertragungspipetten wurden für 2 Monate bei Raumtemperatur gehalten und wurden dann im Reagensgemisch wie in Beispiel 2 beschrieben "getestet". Tabelle 2

	Aktivität
Farbe auf Wasserbasis, Blindprobe	0
0,2 g HOX	+
0, 5 g HOX	++
1,0 g HOX	nicht bestimmt
Farbe auf Ölbasis, Blindprobe	0
0,2 g HOX	+++
0,5 g HOX	+++
1,0 g HOX	+++
Kontrolle, Testreagens plus freie HOX	nicht bestimmt

Aus den Ergebnissen in Tabelle 2 wird klar, daß HOX für zwei Monate bei Raumtemperatur in einer trockenen Farbmatrix stabil war.
BEISPIEL 6 – Testen der Beschichtung
Aufbau eines Testsystems für eine bewuchsverhindernde Zusammensetzung
0,5 bis 5 ml Proben von See- oder Meerwasser wurden in Teströhrchen aus dem Brabands∅en-See in der Nähe von Aarhus, Dänemark, und aus der Ostsee vor Aarhus gesammelt. Am Tag der Entnahme der Wasserproben wird die zu testende bewuchsverhindernde Zusammensetzung zu den Teströhrchen zugegeben, und sie werden mit Parafilm^TM versiegelt.
Die Teströhrchen werden bei Raumtemperatur in der Nähe eines Fensters, um Tageslicht auf sie einfallen zu lassen, inkubiert. Die Bewuchsbildung wird auf Basis des Erscheinens einer Mikrobenwachstumsschicht an den Wänden des Teströhrchens für 4 Wochen visuell überwacht. Zum Vergleich werden ein Teströhrchen mit 0,1% Natriumazid und ein Teströhrchen ohne bewuchsverhindernde Zusammensetzung als Positiv- bzw. Negativkontrollen verwendet.
Diese Teströhrchen werden auf einer Skala von 1 bis 5 mit 1 bzw. 5 für hochgradig wirksam bzw. keine bewuchsverhindernde Aktivität aufweisend beurteilt.
Kommerziell erhältliches, Meeresbewuchs verhinderndes Beschichtungsmaterial ohne Zugabe von bewuchsverhinderndem Biozid wird verwendet. Bewuchsverhindernde Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden in das Beschichtungsmaterial eingemischt und gemäß Anleitung des Herstellers des Beschichtungsmaterials auf die Oberfläche von Metall-, Glas- und Kunststoffplatten aufgebracht.
Die beschichteten Platten werden in See- oder Meerwasser eingetaucht. Die Bewuchsbildung auf den Platten wird auf Basis des Erscheinens einer Mikrobenwachstumsschicht auf den Platten für bis zu 2 Jahre visuell überwacht und wie oben beschrieben auf einer Skala von 1 bis 5 bewertet. Als Negativkontrolle wird eine Beschichtung ohne bewuchsverhindernde Zusammensetzung verwendet.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind beim Verhindern von Bewuchsbildung effektiv.
BEISPIEL 7 – Stabilität von bewuchsverhindernder Zusammensetzung in Aquariumwasser
Zu 10,0 g Anstrichfarbe (Histor 9010 auf Ölbasis) wurden 500 mg Stärke (Merck 1253), 50 mg HOX (DaniscoCultor, fermentiertes Produkt aus Hansenula polymorpha), sprühgetrocknet auf Stärke (10 Einheiten/g), zugegeben.
Eine Einweg-Übertragungspipette aus Kunststoff (Sarstedt) wurde in die Farbe eingetaucht (Kopfteil). Die Übertragungspipette ließ man für 24 Stunden lufttrocknen. Sie wurde dann in 250 ml Wasser aus einem Aquarium für zwei Monate in einer Kautex-Flasche gehalten. Die Flasche stand in einem Fenster in vollem Tageslicht. Nach zwei Monaten wurde der Pipettenkopf gewaschen, luftgetrocknet und dann in vollständigem HOX-Reagensgemisch "getestet". Die HOX zeigte noch immer volle Aktivität.
BEISPIEL 8 – Beweis des Substraterzeugungskonzepts
Um ein kontinuierlich Substrat erzeugendes System bereitzustellen, wurden Stärke, vorzugsweise intakte Stärkekörnchen aus Weizen, Mais oder Kartoffel, in einer Konzentration von 0,01 ng bis 100 mg pro ml bewuchsverhindernder Zusammensetzung sowie Amyloglucosidase (AMG) (GRINDAMYL^TM AG Bäckerenzym von DaniscoCultor oder ein anderes kommerziell erhältliches Amyloglucosidaseprodukt) in Konzentrationen, die von 0,000001 bis 100 AGU pro ml bewuchsverhindernder Zusammensetzung lieferten, zusammen mit HOX verwendet.
Zu 10,0 g Anstrichfarbe (Histor 9010 auf Ölbasis) wurden 500 mg Stärke (Merck), HOX (DaniscoCultor, fermentiertes Produkt aus Hansenula polymorpha), sprühgetrocknet auf Stärke (10 Einheiten/g) und AMG (10000 AGU/g) wie in der Tabelle angegeben zugegeben.
Einweg-Übertragungspipetten aus Kunststoff (Sarstedt) wurden in die Farbe eingetaucht (Kopfteil). Die Übertragungspipetten ließ man für 3 Stunden lufttrocknen.
Dann wurde die Hexoseoxidase-(HOX-)Aktivität durch Eintauchen des mit Farbe bedeckten Pipettenkopfs in ein Glasröhrchen mit 2 ml HOX-Testreagens ohne Glucose, für das Testreagens siehe Beispiel 1, gemessen, wobei die einzige HOX-Aktivität aus der HOX in der Farbe stammte und das einzige Substrat für HOX von AMG in der Farbe durch Hydrolysieren von Stärke in der Farbe zu Glucose erzeugt wurde.
Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur für 48 Stunden inkubiert.
Als Blindprobe wurde Farbe ohne Zugabe von HOX und AMG verwendet. Tabelle 3

Aktivität

50 mg HOX 10 mg AMG +

50 mg HOX + 20 mg AMG +

50 mg HOX –

Blindprobe (keine Enzyme) –
Die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Kombination aus HOX und AMG wie beabsichtigt wirkt. AMG erzeugt Glucose aus der ebenfalls immobilisierten Stärke in der Farbe, und HOX erzeugt Wasserstoffperoxid aus der erzeugten Glucose.
BEISPIEL 9 – Temperaturaktivität
Hexoseoxidase (gereinigte HOX) wurde hinsichtlich ihrer Aktivität als eine Funktion der Temperatur bewertet und mit einer kommerziell erhältlichen Glucoseoxidase (Amano 081443/00018) verglichen.
Verfahren:
Probe: Die Enzymprobe wird in Wasser gelöst und auf einer PD10-Säule unter Verwendung von 20 mM Phosphatpuffer, pH 6,3, entsalzt und auf 0,4 Einheiten/ml verdünnt.
Zu einem Elisa-Well wird folgendes hinzugefügt:

150 μl 100 mM Glucose in 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,3
120 μl 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,3
10 μl o-Dianisidin (3 mg/ml in Wasser)
10 μl Peroxidase (0,10 mg/ml in 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,3)
10 μl Probe
Getestet 10 Min. bei 30°C und gemessen bei 405 nm.

Ergebnisse
Die Ergebnisse der Aktivitätsmessung als eine Funktion der Temperatur sind in Tabelle 4 und in 1 gezeigt. Tabelle 4
Die Ergebnisse von Aktivität gegenüber Temperatur zeigen einen klaren Unterschied im Aktivitätsprofil.
Hexoseoxidase hat eine optimale Temperatur zwischen 25-35°C, was nahezu mit dem optimalen Wert für die maximale Bewuchsbildungstemperatur zusammenfällt. Im Gegensatz dazu ist zu erkennen, daß GOX eine optimale Temperatur bei 50°C hat, was weit oberhalb der Temperatur liegt, die im Meer jemals erzielt werden kann.

Claims

Bewuchsverhindernde Zusammensetzung, umfassend (i) ein Oberflächenbeschichtungsmaterial, (ii) ein erstes Enzym und ein erstes Substrat, wobei das erste Substrat ein Oligomer oder ein Polymer eines zweiten Substrats ist, wobei das zweite Substrat ein Substrat für ein oxidatives Enzym ist, und wobei das erste Enzym das zweite Substrat aus dem ersten Substrat erzeugen kann, und (iii) ein zweites Enzym, wobei das zweite Enzym eine Oxidase aus einem Meeresorganismus ist und wobei das zweite Enzym eine bewuchsverhindernde Verbindung bildet, wenn es auf das zweite Substrat wirkt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oxidaseenzym von einer Seealge stammt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Oxidaseenzym von Chondrus crispus stammt.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Oxidaseenzym Hexoseoxidase ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Enzym Hexoseoxidase die in SEQ ID NO:1 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine Variante, ein Homologes, ein Derivat oder ein Fragment davon umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Hexoseoxidase durch Klonierung und Expression eines Gens, welches das Protein codiert, in rekombinanten Wirtsorganismen erhalten wird.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das zweite Substrat ein Zucker ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der Zucker Glucose ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das erste Enzym Amyloglucosidase ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das erste Substrat Stärke ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein Bindemittel umfaßt, um wenigstens einen der Bestandteile der Zusammensetzung zu immobilisieren, vorzugsweise um das Enzym zu immobilisieren.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung als Beschichtung, Lack, Färbemittel oder Email formuliert ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein Oberflächenbeschichtungsmaterial umfaßt, welches ausgewählt ist unter Polyvinylchloridharzen in einem System auf Lösungsmittelbasis, Chlorkautschuken in einem System auf Lösungsmittelbasis, Acrylharzen und Methacrylharzen in Systemen auf Lösungsmittelbasis oder wäßrigen Systemen, Vinylchlorid-Vinylacetat-Copolymersystemen als wäßrige Dispersionen oder Systeme auf Lösungsmittelbasis, Butadien-Copolymeren, Butadien-Styren-Kautschuken, Butadien-Acrylnitril-Kautschuken, Butadien-Styren-Acrylnitril-Kautschuken, trocknenden Ölen, Leinölen, Alkydharzen, Asphalt, Epoxidharzen, Urethanharzen, Polyesterharzen, Phenolharzen, Derivaten und Gemischen davon.
Beschichtung, bestehend aus einer Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche.
Beschichtung nach Anspruch 14, die für die Behandlung einer Oberfläche, ausgewählt unter Außenholzmaterial, der äußeren Oberfläche eines Zentralheizungssystems und einer Oberfläche eines Seefahrzeugs, formuliert ist.
Meeresbewuchs verhindernde Zusammensetzung, bestehend aus einer Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche.
Meeresbewuchs verhindernde Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die bewuchsverhindernde Zusammensetzung selbstglättend ist.
Verfahren zur Freisetzung einer bewuchsverhindernden Verbindung aus einer Oberflächenbeschichtung, wobei das Verfahren umfaßt, daß folgendes in eine Oberflächenbeschichtung aufgenommen wird: (i) ein erstes Enzym und ein erstes Substrat, wobei das erste Substrat ein Oligomer oder ein Polymer eines zweiten Substrats ist, wobei das zweite Substrat ein Substrat für ein Oxida seenzym ist, und wobei das erste Enzym das zweite Substrat aus dem ersten Substrat erzeugt, (ii) ein zweites Enzym, wobei das zweite Enzym eine Oxidase aus einem Meeresorganismus ist und wobei das zweite Enzym eine bewuchsverhindernde Verbindung erzeugt, indem es auf das zweite Substrat wirkt.