ES2391298T3

ES2391298T3 - Composición antiincrustación

Info

Publication number: ES2391298T3
Application number: ES07001141T
Authority: ES
Inventors: Charlotte Horsmans Poulsen; Karsten Matthias Kragh
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 1999-06-04
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2012-11-23
Anticipated expiration: 2020-06-02
Also published as: EP1282669A2; KR100751791B1; KR20020010153A; NO328988B1; WO2000075293A2; US20130224820A1; AU5097800A; US20140363478A1; AU777162B2; NZ515111A; CN1364185A; EP1282669B1; JP4679776B2; DE60033187D1; PL200268B1; MXPA01012448A; EP1811001B1; EP1811001A2; ES2280216T3; PL353234A1

Abstract

Una composición antiincrustación que comprende (i) un material de recubrimiento de superficie (ii) una primera enzima y un primer sustrato, en el que dicho sustrato es un oligómero o un polímero de un segundo sustrato, siendo dicho segundo sustrato un sustrato para una enzima oxidativa, y en donde dicha dicha primera enzima es capaz de generar dicho segundo sustrato a partir de dicho primer sustrato; y (iii) una segunda enzima, en donde dicha segunda enzima es una oxidasa; y en donde dicha segunda enzima genera una composición antiincrustación cuando actúa sobre dicho segundo sustrato.

Description

Composicion antiincrustacion.

La presente invencion se refiere a una composicion antiincrustacion. En particular, la presente invencion se refiere a una composicion antiincrustacion que comprende una enzima capaz de producir un compuesto que tiene un efecto antiincrustacion.

Como se discute en la patente de EEUU A-5071479 se necesitan biocidas en ambientes muy diferentes, tales como agentes antihongos en pinturas de casas, algicidas en agua dulce, y agentes antiincrustacion en estructuras marinas expuestas a la flora y fauna del agua del mar. Como se sabe, pueden crecer mohos o hongos sobre pinturas de casas o similares, y utilizan el medio pintura como un nutriente, o en algunos casos, el sustrato inferior, tal como la madera, como nutriente. Por razones obvias, esto puede causar a la superficie pintada un deterioro en la apariencia de la superficie pintada. Se puede incorporar un biocida a la pintura y cuando el micelio o cuerpos fructiferos del hongo contactan o penetran la pelicula de pintura y asi, a traves del contacto intimo con el biocida en la pelicula, los hongos se destruyen. En torres de enfriamiento que utilizan agua dulce, se puede desarrollar verdin, mohos y algas si no estan presentes compuestos eficaces para combatir su crecimiento.

Como se discute en la patente de EEUU A-5071479 el crecimiento de organismos marinos sobre las partes sumergidas del casco de un barco es un problema particular. Tal crecimiento incrementa la resistencia de rozamiento del casco al paso del agua, llevando a un incremento del consumo de combustible y/o a una reduccion de la velocidad del barco. El crecimiento marino se acumula tan rapidamente que la solucion de limpiar y repintar que se hace en dique seco generalmente se considera demasiado cara. Una alternativa que se ha practicado con eficacia incrementada con el paso de los afos, es limitar la cantidad de incrustacion mediante la aplicacion en el casco de una pintura de recubrimiento que incorpora agentes antiincrustacion. Los agentes antiincrustacion son biocidas que se liberan de la superficie de la pintura durante un periodo de tiempo a una concentracion letal para organismos marinos en la superficie del casco. La pintura antiincrustacion falla solo cuando la concentracion de biocida disponible en la pintura superficial cae por debajo de la concentracion letal y con las pinturas modernas se puede esperar una vida util de hasta dos afos.

Un biocida usado muy ampliamente, en particular en agentes antiincrustantes marinos, es tributil estafo (TBT). Sin embargo, hay una preocupacion creciente sobre los efectos medioambientales causados por biocidas de estafo organicos a sus niveles comerciales actuales como un ingrediente activo antiincrustacion en composiciones de recubrimiento para aplicaciones acuaticas (marinas). Se ha mostrado que, debido al amplio uso de compuestos de tipo tributil estafo en particular, a concentraciones tan altas como 20% en peso en pinturas para fondo de barcos, la contaminacion del agua de alrededor debido a lixiviacion ha alcanzado tal nivel que causa la degradacion de mejillones y organismos de concha. Estos efectos se han detectado a lo largo de la costa de la Bretafa francesa y un efecto similar se ha confirmado en aguas EEUU y Extremo Oriente. Segun la normativa de restriccion mas reciente, con excepciones limitadas, los barcos de recreo de hasta 25 metros de longitud ya no se les permite usar pintura antiincrustacion que contiene niveles altos de compuestos de tributil estafo.

Las investigaciones han mostrado que siempre que la velocidad de lixiviado del estafo se pueda mantener a o por debajo de 4 Ig/cm2 por dia, parece que la vida acuatica no se ve afectada a largo plazo. Sin embargo, tambien se ha encontrado que para ser eficaz en el control de algas marinas, asi como con organismos marinos mas desarrollados, desde la superficie pintada del fondo de los barcos, se requiere una cierta velocidad minima de lixiviacion de estafo de aproximadamente 9 a 16 Ig/cm2/dia. Normalmente, esta velocidad de lixiviado mas alta se logra con una concentracion del compuesto tributil estafo de aproximadamente 15% a 20% en peso de pintura.

En vista de la eficacia de TBT las autoridades reguladoras han acordado con reticencia que siempre que no haya un sustituto adecuado de los ingredientes de estafo activos de antiincrustacion organica, los barcos grandes, es decir los que tienen una longitud mayor de 25 metros, aun se les permite usar tales compuestos para minimizar la incrustacion. Por tanto hay un deseo de proporcionar biocidas alternativos a los compuestos con base TBT.

La patente de EEUU A-4297137 describe que los efectos de una composicion antiincrustacion se pueden prolongar mediante la moderacion de la liberacion de los constituyentes antiincrustacion. Este documento describe pinturas antiincrustacion que comprenden al menos una sustancia toxica para organismos marinos que esta incorporada uniformemente en una matriz solida discontinua que es insoluble en agua de mar y esta dispersa en la pintura. La matriz esta formada al menos parcialmente a partir de al menos una sustancia que se vuelve soluble en agua de mar bajo la accion de enzimas liberadas por los organismos marinos que hay que inhibir y/o mediante la pelicula bacteriana en contacto con la pintura. Asi cuando el organismo marino se asocia con la superficie pintada, la sustancia toxica se libera y los organismos se inhiben. Al igual que las descripciones de tecnicas anteriores, las sustancias toxicas previstas en la patente de EEUU A-4297137 solo incluyen los compuestos con base de cobre y estafo muy conocidos, tal como TBT.

Abarzua et al., Mar. Ecol. Prog. Ser., vol. 123:301-312, 1995 "Biotechnological investigation for the prevention of biofouling. L Biological and biochemical principles for the prevention of biofoulding" proponen la extraccion de agentes biogenicos que tienen propiedades antibacterianas, antialgas, antiprotozoos y anti macroincrustacion a partir de algas e invertebrados marinos. Se propone que se pueda determinar la estructura de los agentes extraidos, posteriormente sintetizada y se use el agente sintetizado para evitar la bioincrustacion. No se proporciona metodo de extraccion o de sintesis.

La patente EP A-0866103 describe un metodo para controlar la liberacion de compuestos que tienen actividad antimicrobiana y composiciones de recubrimiento que utilizan este sistema. El metodo comprende la incorporacion de una enzima y un sustrato en una matriz. La enzima actua en el sustrato para proporcionar un compuesto. En una realizacion prevista sobre el compuesto puede actuar posteriormente otra enzima. El sustrato y enzima(s) producen un compuesto que tiene actividad antimicrobiana.

La patente de EEUU A-5747078 esta relacionada con productos alimentarios. El documento muestra que la contaminacion microbiana de comidas y alimentos, que puede causar graves problemas de salud, se puede inhibir por una composicion que comprende un sistema lactoperoxidasa que mantiene una liberacion continua de peroxido de hidrogeno. Despues el peroxido de hidrogeno reacciona con tiocianato, catalizado por lactoperoxidasa, para producir hipotiocianato. El hipotiocianato despues puede actuar como un agente antimicrobiano. Este documento proporciona un antecedente que muestra el sistema enzimatico inmovilizado. El documento no habla sobre agentes antiincristacion o cualquier microorganismo que tenga propiedades incrustantes.

La presente invencion mitiga el problema de la tecnica previa.

En las reivindicaciones del apendice se definen aspectos de la presente invencion. Estos y otros aspectos preferentes se discuten a continuacion.

Se ha encontrado que la provision de un sistema integrado para la generacion de un compuesto antiincrustacion que utiliza una enzima a partir de un organismo marino proporciona un sistema estable que

tiene eficacia a largo plazo en ambientes sucios tales como ambientes marinos

requiere menos sustrato que sistemas de tecnicas previas para proporcionar un efecto antimicrobiano dado. Las enzimas a partir de organismos marinos, tal como hexosa oxidasa (HOX) de alga, tiene valores bajos Km para glucosa, concretamente 2,7 mM. Este Km bajo significa que la enzima tiene una afinidad muy alta por la glucosa. Al contrario que enzimas no marinas tal como glucosa oxidasa (GOX) no marina puede tener un valor Km al menos 10 veces mas alto para glucosa. En otras palabras los sistemas enzimaticos previos tienen una afinidad mucho mas baja para glucosa que el de la presente invencion. En aplicaciones antiincrustacion, esto dara una diferencia significativa, ya que una enzima con alta afinidad por la glucosa sera capaz de transformar toda la glucosa presente. Por otro lado una enzima con afinidad mas baja para glucosa se espera que permita la lixiviacion de glucosa al ambiente de alrededor. La lixiviacion de glucosa contrarrestara la actividad antiincrustacion deseada debido a que la glucosa sera un sustrato para organismos incrustantes. La lixiviacion de glucosa por tanto deriva en un incremento de la incrustacion.

: requiere menos enzimas que sistemas de tecnicas previas para proporcionar un efecto antimicrobiano dado. Las enzimas de organismos marinos, tal como HOX de algas, tambien tienen bajo valor Km para oxigeno de nuevo mas bajo que el valor Km para oxigeno de sistemas de tecnicas previas tal como GOX. De nuevo esta afinidad mas alta para el sustrato da a HOX de algas una ventaja. Esto es debido a que en aplicaciones antiincrustacion la peor incrustacion estara en ambientes "cerrados" como puertos con bajo intercambio de agua y alto crecimiento de algas y otros organismos incrustantes. Exactamente en esos lugares la incrustacion era peor, el contenido de oxigeno del agua tambien sera el mas bajo comparado con el mar abierto. Por tanto seran ventajosas las enzimas de organismos marinos con alta afinidad para oxigeno.

: proporciona actividad mejorada a temperaturas probables de trabajo. En composiciones de recubrimiento de superficies tal como pintura antiincrustacion el componente antimicrobiano (antiincrustacion) normalmente tiene que ser activo entre 15 y 30°C. Para composiciones antiincrustacion esta es la temperatura del agua de mar donde la incrustacion supone un problema. Al contrario que en sistemas de tecnicas previas, las enzimas de organismos marinos, tal como HOX de alga, tienen temperatura optima de actividad exactamente a la temperatura optima para la incrustacion y estas enzimas por lo tanto son perfectamente adecuadas como un agente antiincrustacion. La temperatura optima se muestra en el ejemplo 9.

utiliza sustratos seguros y de disponibilidad inmediata.

tiene tolerancia mejorada a la sal lo que conduce a una actividad mas mejorada en ambientes marinos.

es resistente a la degradacion por organismos de incrustacion. Las enzimas de organismos marinos, tal como HOX de alga, son enzimas marcadamente resistentes a proteasas. Sobreviviran a tratamiento con pronasa (preparacion de proteasas de amplio espectro) sin perdida alguna de actividad. Esta resistencia a proteasa se considera especialmente importante en la aplicacion antiincrustacion ya que por lo tanto la enzima sera resistente a degradacion por proteasas de los organismos antiincrustacion que estan intentando adherirse a la superficie recubierta.

En la presente especificacion "incrustantes" referidos mediante los terminos "antiincrustante(s)", "antiincrustacion" y "antiincrustacion" incluye organismos que pueden habitar y/o crecer sobre la superficie a tratar con la presente composicion. Los organismos incluyen microorganismos tales como bacterias, hongos y protozoos, y algas y organismos tales como algas, plantas y animales. El organismo puede ser organismo marino.

La composicion de la presente invencion comprende una enzima precursora y un sustrato precursor, en la que la enzima precursora y el sustrato precursor generan un sustrato para la enzima de la presente invencion mediante la accion de la enzima precursora sobre el sustrato precursor. Esta combinacion de enzima precursora y sustrato precursor sera referida en la presente memoria de aqui en adelante como "sustrato generador".

La enzima del presente sistema se puede obtener o puede ser obtenible a partir de un microorganismo marino.

Preferentemente la enzima del presente sistema se obtiene o es obtenible a partir de un alga marina. Preferentemente la enzima del presente sistema se obtiene o es obtenible a partir de Chondrus crispus.

Preferentemente, el compuesto antiincrustacion es peroxido de hidrogeno.

Preferentemente, la enzima es una oxidasa. Preferentemente, la enzima se selecciona a partir de glucosa oxidasa, L aminoacido oxidasa, D amino oxidasa, galactosa oxidasa, hexosa oxidasa, piranosa oxidasa, malato oxidasa, colesterol oxidasa, arilalcohol oxidasa, alcohol oxidasa, latosterol oxidasa, aspartato oxidasa, amino oxidasa, D glutamato oxidasa, etanolamina oxidasa, NADH oxidasa, urato oxidasa (uricasa) y sus mezclas. Preferentemente, la enzima es hexosa oxidasa.

ENZIMA HEXOSA OXIDASA (HOX)

La hexosa oxidasa (D-hexosa: O2-oxidoreductasa, EC 1.1.3.5) (tambien llamada HOX) es una enzima que en presencia de oxigeno es capaz de oxidar D-glucosa y varios otros azucares reductores incluyendo maltosa, lactosa y celobiosa a sus correspondientes lactonas con posterior hidrolisis de los acidos aldobionicos respectivos. Consecuentemente, HOX difiere de otra oxidorreductasa, glucosa oxidasa, que solo puede transformar D-glucosa, en que la enzima puede utilizar un amplio rango de sustratos de azucar. La oxidacion catalizada por HOX se puede ilustrar como sigue:

D-glucosa + O2 - y-D-gluconolactona + H2O2,

o

D-galactosa + O2 - y-D-galactonolactona + H2O2

HOX se produce naturalmente por diversas especies de algas marinas. Tales especies se encuentran inter alia en la familia Gigartinaceae. Como se usa en la presente memoria, el termino "HOX" denota una enzima que es capaz de oxidar los sustratos seleccionados del grupo que consiste en D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, maltosa, lactosa y celobiosa.

Preferentemente, la hexosa oxidasa es obtenible o se obtiene a partir del alga marina Chondrus crispus.

En un aspecto la enzima hexosa oxidasa es una enzima tratada en la descripcion EP-A-0832245.

PRODUCCION DE HEXOSA OXIDASA (HOX)

El gen que codifica la enzima HOX se ha clonado a partir del alga marina Chondrus crispus (Stougaard and Hansen 1996, Hansen and Stougaard, 1997). La levadura metilotrofica Hansenula polymorpha (desarrollada en Rhein Biotech, Dusseldorf/Alemania como un sistema de expresion para proteinas heterologas) tambien se ha usado para producir la enzima HOX (la proteina nativa se purifico a partir de alga marina (Poulsen and H0strup, 1998)). La patente WO 96/40935 y WO 98/13478 tambien describe la clonacion y expresion en organismos huesped recombinantes de un gen que codifica una proteina con actividad HOX.

En una realizacion preferente, la enzima hexosa oxidasa comprende la secuencia de aminoacidos presentada en SEC ID N° 1 o uno de sus variantes, homologo, derivativo o fragmento. En una realizacion preferente, la enzima hexosa oxidasa comprende la secuencia de aminoacidos presentada en SEC ID N° 1.

En una realizacion preferente, la enzima hexosa oxidasa esta codificada por una secuencia de nucleotidos presentada en SEC ID N° 1 o una de sus variantes, homologo, derivativo o fragmento. En una realizacion preferente, la enzima hexosa oxidasa esta codificada por una secuencia de nucleotidos presentada en SEC ID N° 1.

En una realizacion preferente, la enzima hexosa oxidasa esta codificada por una secuencia de nucleotidos capaz de hibridar la secuencia de nucleotidos presentada en SEC ID N° 1 o una de sus variantes, homologo, derivativo o fragmento o una secuencia complementaria a la secuencia de hibridacion. En una realizacion preferente, la enzima hexosa oxidasa esta codificada por una secuencia de nucleotidos capaz de hibridar a la secuencia de nucleotidos presentada en SEC ID N° 1 o una secuencia complementaria a la secuencia de hibridacion.

La enzima, preferentemente la enzima hexosa oxidasa se puede preparar de un modo descrito en la solicitud de patente britanica n° 9927801.2.

VARIANTES/HOMOLOGOS/DERIVATIVOS (SECUENCIA DE AMINOACIDOS)

Las secuencias de aminoacidos de la presente invencion se presentan en SEC ID N° 1 o son secuencias obtenibles a partir de la enzima HOX de la presente invencion pero tambien incluyen secuencias homologas obtenidas de cualquier fuente, por ejemplo, proteinas virales/bacterianas relacionadas, homologos celulares y peptidos sinteticos, asi como sus variantes o derivativos.

Asi, la presente invencion trata variantes, homologos o derivativos de las secuencias de aminoacidos presentadas en la presente memoria, asi como variantes, homologos o derivativos que codifican las secuencias de nucleotidos para esas secuencias de aminoacidos.

En el contexto de la presente invencion, se toma una secuencia homologa para incluir una secuencia de aminoacidos con al menos 75, 85 o 90% identicos, preferentemente al menos 95 o 98% identicos al nivel de aminoacidos sobre al menos, por ejemplo, la secuencia de aminoacidos segun se presenta en SEC ID N° 1 de la secuencia que se lista en la presente memoria. En particular, la homologia normalmente deberia considerarse con respecto a esas regiones de la secuencia que se sabe que son esenciales para la actividad enzimatica mas que para secuencias vecinas no esenciales. Estas regiones incluyen pero no estan limitadas los dominios de union al FAD putativo en HOX tal como SGGH79C, LGGH146I y LGGH320A. Aunque la homologia tambien se puede considerar en terminos de similitud (por ejemplo, restos de aminoacidos que tienen propiedades/funciones quimicas similares), en el contexto de la presente invencion es preferente expresar homologia en terminos de identidad de secuencia.

Las comparaciones de homologia se pueden llevar a cabo a ojo, o mas normalmente, con la ayuda de programas de comparacion de secuencias facilmente disponibles. Estos programas informaticos comercialmente disponibles pueden calcular el % de homologia entre dos o mas secuencias.

El % de homologia se puede calcular sobre secuencias continuas, por ejemplo se alinea una secuencia con la otra secuencia y cada aminoacido de una secuencia se compara directamente con el correspondiente aminoacido de la otra secuencia, un resto cada vez. Esto se llama un alineamiento "sin huecos". Normalmente, tales alineamientos sin huecos se llevan a cabo solo sobre un numero relativamente corto de restos.

Aunque este es un metodo muy simple y consistente, falla al tener en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias identicas, una insercion o delecion causara que el siguiente resto del aminoacido salga del alineamiento, esto potencialmente da como resultado una gran reduccion del % de homologia cuando se lleva a cabo un alineamiento global. Como consecuencia, la mayoria de los metodos de comparacion de secuencias, estan disefados para producir alineamientos optimos que tengan en cuenta posibles inserciones y deleciones sin penalizar excesivamente el resultado total de homologia. Esto se logra insertando "huecos" en la secuencia de alineamiento para tratar de maximizar la homologia local.

Sin embargo, estos metodos mas complejos asignan "huecos de penalizacion" a cada hueco que se da en el alineamiento de modo que, para el mismo numero de aminoacidos identicos, una secuencia de alineamiento con los menos huecos posibles -que refleja una relacion mas alta entre las dos secuencias comparadaslograra una puntuacion mas alta que una con muchos huecos. Los "costes de huecos afines" son usados normalmente y cargan un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalizacion mas pequefa por cada resto posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuacion de huecos mas usado comunmente. La penalizacion alta por hueco por supuesto que producira alineamientos optimos con menos huecos. La mayoria de los programas de alineamiento permiten modificar la penalizacion por huecos. Sin embargo, es preferente usar los valores predeterminados cuando se usan tales programas para comparacion de secuencias. Por ejemplo cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit (ver a continuacion) la penalizacion por hueco omitido para secuencias de aminoacidos es -12 para un hueco y -4 para cada extension.

El calculo del % maximo de homologia por lo tanto requiere en primer lugar la produccion de un alineamiento optimo, teniendo en cuenta la penalizacion por huecos. Un programa de ordenador adecuado para llevar a cabo tal alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Ejemplos de otros softwares que pueden llevar a cabo comparaciones de secuencias incluyen, pero no estan limitados, el paquete BLAST (ver Ausubel et al., 1999 ibid -Chapter 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y la coleccion de herramientas de comparacion GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA para investigacion en linea o fuera de linea (ver Ausubel et al., 1999 ibid, paginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, es preferente usar en programa GCG Bestfit.

Aunque el % final de homologia se puede medir en terminos de identidad, el proceso de alineamiento en si mismo normalmente no esta basado en una comparacion de todos o ningun par. En cambio, generalmente se usa una matriz de puntuacion de similitud con escala que asigna puntos en cada comparacion de pares en base a similitud quimica o distancia evolutiva. Un ejemplo de tal matriz comunmente usada es la matriz BLOSUM62 la matriz omitida de la coleccion de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente usan o bien los valores predeterminados publicos o una tabla de comparacion de simbolos a medida si se proporciona (ver el manual del usuario para mas detalles). Es preferente usar los valores predeterminados publicos para el

5 paquete GCG, o en el caso de otro software, al matriz omitida BLOSUM62.

Una vez que el software ha producido un alineamiento optimo, es posible calcular el % de homologia, preferentemente el % de identidad de la secuencia. Normalmente el software hace esto como parte de la secuencia de comparacion y genera un resultado numerico.

Los terminos "variante" o "derivativo" en relacion con las secuencias de aminoacidos de la presente invencion

10 incluyen cualquier sustitucion, variacion, modificacion, reemplazo, delecion o adicion de uno (o mas) aminoacidos de o a la secuencia siempre que la secuencia de aminoacidos resultante tenga una actividad enzimatica, preferentemente que tenga al menos la misma actividad enzimatica que la secuencia de aminoacidos presentada en SEC ID N° 1.

SEC ID N° 1 se puede modificar para usar en la presente invencion. Normalmente, las modificaciones se hacen

15 de modo que mantienen la actividad enzimatica de la secuencia. Las sustituciones de aminoacidos se pueden hacer, por ejemplo, de 1, 2 o 3 a 10 o 20 sustituciones siempre que la secuencia modificada retenga la actividad enzimatica requerida. Las sustituciones de aminoacidos pueden incluir el uso de analogias que se dan de manera no natural.

SEC ID N° 1 de la presente invencion tambien puede tener deleciones, inserciones o sustituciones de restos de

20 aminoacidos que producen un cambio inapreciable y dan como resultado una enzima funcionalmente equivalente. Las sustituciones deliberadas de aminoacidos se pueden hacer en base a similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia, y/o la naturaleza antipatica de los restos siempre que se retenga la actividad enzimatica de la enzima HOX. Por ejemplo, aminoacidos cargados negativamente incluyen acido aspartico y acido glutamico; aminoacidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y aminoacidos con

25 grupos polares sin carga que tienen valores similares de hidrofilia incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Se pueden hacer sustituciones conservadoras, por ejemplo segun la tabla siguiente. Los aminoacidos del mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma linea en la tercera columna se pueden sustituir entre ellos:

ALIFATICO: NO POLAR G A P

I L V

POLAR SIN CARGA: C S T M

N O

POLAR CARGADO: D E

K R

AROMATICO: H F W Y

VARIANTES/HOMOLOGOS/DERIVATIVOS (SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS)

Un experto entendera que numerosas secuencias de aminoacidos diferentes pueden codificar la misma enzima HOX como resultado de la degeneracion del codigo genetico. Ademas, se entiende que los expertos pueden, usando tecnicas rutinarias, hacer sustituciones de nucleotidos que no afectan a la enzima HOX codificada por la

35 secuencia de nucleotidos de la invencion para reflejar el uso de codones de cualquier organismo huesped particular en el que se expresa la enzima HOX de la presente invencion.

Los terminos "variante", "homologo" o "derivativo" en relacion con las secuencias de nucleotidos presentado en SEC ID N° 1 de la presente invencion incluyen cualquier sustitucion, variacion, modificacion, reemplazo, delecion o adicion de uno (o mas) acidos nucleicos de o a la secuencia siempre que la secuencia de nucleotidos

40 resultante codifique una enzima HOX que tenga una actividad enzimatica, preferentemente que tenga al menos la misma actividad enzimatica que la secuencia de nucleotidos presentada en SEC ID N° 1 de la secuencia de la lista.

Como se indico anteriormente, con respecto a la homologia de la secuencia, preferentemente hay al menos 75%, mas preferentemente al menos 85%, mas preferentemente al menos 90% de homologia en las secuencias 45 mostradas en la secuencia de la lista de la presente memoria. Mas preferentemente hay al menos 95%, al menos mas preferentemente 98% de homologia. Las comparaciones de homologia de nucleotidos se pueden

llevar a cabo como se describio anteriormente. Un programa de comparacion de secuencias preferente es el programa GCG Wisconsin Bestfit descrito anteriormente. La matriz de puntuacion omitida tiene un valor de coincidencia de 10 para cada nucleotido identico y 9 para cada no coincidencia. La penalizacion de creacion del hueco de omision es -50 y la penalizacion de cada hueco de omision de extension es -3 para cada nucleotido.

La presente invencion tambien engloba secuencias de nucleotidos que son capaces de hibridar selectivamente a las secuencias presentadas en la presente memoria, o cualquier variante, fragmento, o derivativo, o al complemento de cualquiera de los anteriores. Las secuencias de nucleotidos tienen preferentemente una longitud de 15 nucleotidos, mas preferentemente longitud de al menos 20, 30, 40 o 50 nucleotidos.

SUSTRATO

Preferentemente, el sustrato se selecciona a partir de peptidos, L aminoacidos, e hidratos de carbono/azucares, incluyendo hexosas, preferentemente glucosa, galactosa, lactosa, 2-desoxiglucosa, piranosa, xilano, celulosa, inulina, almidon, dextrano, pectina y sus mezclas.

En una realizacion muy preferente, la combinacion enzima/sustrato se selecciona a partir de glucosa/hexosa oxidasa, glucosa/glucosa oxidasa, L aminoacido/L aminoacido oxidasa, galactosa/galactosa oxidasa, lactosa /�galactoxidasa/hexosa oxidasa, lactosa /�-galactoxidasa/glucosa oxidasa, 2-desoxiglucosa/glucosa oxidasa, piranosa/piranosa oxidasa, y sus mezclas.

En un aspecto la composicion antiincrustacion se genera por la accion de la enzima sobre el sustrato que esta presente en la composicion. Asi el compuesto antiincrustacion se genera mediante un proceso de "una etapa". En algunos casos el sustrato se puede preparar in situ. En estos casos, la composicion ademas comprende una enzima precursora y un sustrato precursor en la que la enzima precursora y el sustrato precursor se seleccionan de modo que la enzima precursora genera el sustrato. En este ultimo aspecto la composicion antiincrustacion se genera mediante un proceso de "dos etapas".

En el proceso de una etapa preferentemente la enzima se selecciona a partir de hexosa oxidasa, glucosa oxidasa, L aminoacido oxidasa, galactosa oxidasa, piranosa oxidasa, y sus mezclas.

En el proceso de una etapa preferentemente el sustrato se selecciona a partir de una hexosa, preferentemente glucosa, L aminoacido, galactosa, 2-desoxiglucosa, piranosa, y sus mezclas.

En el proceso de una etapa preferentemente la combinacion enzima/sustrato se selecciona a partir de glucosa/hexosa oxidasa, glucosa/glucosa oxidasa, L aminoacido/L aminoacido oxidasa, galactosa/galactosa oxidasa, 2-desoxiglucosa/glucosa oxidasa, piranosa/piranosa oxidasa, y sus mezclas.

En el proceso de dos etapas preferentemente la enzima es hexosa oxidasa.

En el proceso de dos etapas preferentemente el sustrato es glucosa.

En el proceso de dos etapas preferentemente la enzima precursora es amiloglucosidasa.

En el proceso de dos etapas preferentemente el sustrato precursor es almidon.

Asi en el proceso de dos etapas preferentemente la combinacion sustrato precursor/ enzima precursora/ enzima es almidon/amiloglucosidasa/hexosa oxidasa.

Preferentemente, el sustrato precursor en el proceso de dos etapas se selecciona a partir de oligomeros y polimeros de sustratos para enzimas oxidativas, almidon, lactosa, celulosa, dextrosa, peptido, inulina, y sus mezclas.

La provision de sustratos precursores son particularmente preferentes porque proporcionan liberacion prolongada y/o continua de sustrato por accion de la enzima precursora sobre el sustrato precursor.

El almidon nativo es particularmente preferente como un sustrato precursor. Al almidon nativo proporciona cristales densamente agrupados que se pueden aplicar directamente en un recubrimiento superficial. Ademas, el almidon nativo es insoluble en agua.

La celulosa tambien es particularmente preferente como un sustrato precursor. La celulosa es un componente comun en pinturas y el uso de celulosa como un sustrato precursor reduce el numero de componentes adicionales que se deben afadir a una composicion de pintura.

Preferentemente, la enzima precursora en el proceso de dos etapas se selecciona a partir de enzimas exoactivas capaces de degradar sustratos oligomericos o polimericos a unidades monomericas, por ejemplo �galactosidasa, peptidasa; amiloglucosidasa, y sus mezclas.

Opcionalmente, la composicion ademas comprende un ligante para inmovilizar al menos uno de los constituyentes, opcionalmente para inmovilizar las enzimas.

Las composiciones de la presente invencion se pueden formular como recubrimientos, lacas, tintes, esmaltes, y similares, de aqui en adelante se referiran genericamente como "recubrimiento(s)".

Asi, en un aspecto la presente invencion proporciona un recubrimiento que consiste en una composicion como se definio anteriormente.

Preferentemente, el recubrimiento esta formulado para el tratamiento de una superficie seleccionada a partir de madera de exterior, superficie externa de un sistema de calentamiento central, y un casco de un barco marino.

El recubrimiento incluye un vehiculo liquido (disolvente) para disolver o suspender la composicion.

El vehiculo liquido se puede seleccionar a partir de cualquier liquido que no interfiere con las actividades de cualquier componente esencial de la composicion. En particular, el vehiculo liquido no debe interferir con la actividad de las enzimas esenciales y/o componente antiincrustacion. Los vehiculos liquidos adecuados se describen en la patente de EEUU A-5071479 e incluyen agua y disolventes organicos incluyendo hidrocarburos alifaticos, hidrocarburos aromaticos, tales como xileno, tolueno, mezclas de hidrocarburos alifaticos y aromaticos que tienen puntos de fusion entre 100 y 320°C, preferentemente entre 150 y 230°C; destilados de petroleo muy aromaticos, por ejemplo disolvente nafta, aceite de alquitran destilado y sus mezclas; alcoholes tales como butanol, octanol y glicoles; aceites vegetales y minerales; quetonas tales como acetona; fracciones de petroleo tales como licor mineral y queroseno, hidrocarburos clorinados, esteres de glicol, eteres de ester de glicol, sus derivados y mezclas.

El vehiculo liquido puede contener al menos un disolvente polar, tal como agua, mezclado con un disolvente organico de baja volatilidad aceitoso o similar a aceite, tal que la mezcla de disolventes aromaticos y alifaticos encontrado en alcohol blanco, tambien llamado comunmente licor mineral.

El vehiculo tipicamente puede contener al menos uno de un diluyente, un emulsionante, un humectante, un dispersante u otro agente activo de superficie. Ejemplos de emulsionantes adecuados se describen en la patente EEUU A-5071479 e incluyen esteres de oxido de nonilfenol de etileno, esteres de polioxietileno de sorbitol o esteres de acidos grasos de polioxietileno de sorbitan, sus derivados y mezclas.

Se puede incorporar cualquier material de recubrimiento de superficie en la composicion y/o recubrimiento de la presente invencion. Ejemplos de materiales de recubrimiento reconocidos son resinas de cloruro de polivinilo en un sistema con base de disolvente, gomas cloradas en un sistema con base de disolvente, resinas acrilicas y resinas de metacrilato en sistemas con base de disolvente o acuoso, sistemas cloruro de vinilo-copolimero de acetato de vinilo como dispersiones acuosas o sistemas con base de disolvente, copolimeros de butadieno tales como gomas butadieno-estireno, gomas butadieno-acrilonitrilo, y gomas butadieno-estireno-acrilonitrilo, aceites de secado tales como aceite de lino, resinas al�id, asfalto, resinas epoxi, resinas de uretano, resinas de poliester, resinas fenolicas, sus derivados y mezclas.

La composicion y/o recubrimiento de la presente invencion puede contener pigmentos seleccionados a partir de pigmentos inorganicos tales como dioxido de titanio, oxido ferrico, silicio, talco o arcilla de China, pigmentos organicos tales como negro de carbon o tintes insolubles en agua de mar, sus derivados y mezclas.

La composicion y/o recubrimiento de la presente invencion puede contener materiales tales como colofonia para proporcionar liberacion controlada del compuesto antiincrustacion, ya que colofonia es muy ligeramente soluble en agua de mar.

La composicion y/o recubrimiento de la presente invencion puede contener plasticidas, modificadores de las caracteristicas reologicas, otros ingredientes convencionales y sus mezclas.

La composicion y/o recubrimiento de la presente invencion, particularmente el recubrimiento, ademas comprende un adyuvante que convencionalmente se usa en composiciones usadas para proteger materiales expuestos a un medio acuatico. Estos adyuvantes se pueden seleccionar de fungicidas adicionales, disolventes auxiliares, aditivos de procesado tales como desespumantes, fijadores, plastificantes, estabilizantes-UV o mejoradores de estabilidad, tintes solubles en agua o insolubles en agua, pigmentos de color, secantes, inhibidores de incrustacion, agentes espesantes o antiprecipitado tales como celulosa de carboxilmetil, acido poliacrilico o acido polimet-acrilico, agentes antioxidantes, sus derivados y mezclas.

El fungicida(s) adicional usado en la composicion y/o recubrimiento de la presente invencion preferentemente es soluble en el vehiculo liquido.

En un aspecto la presente invencion proporciona un agente antiincrustante marino que consiste en una composicion como se definio anteriormente.

Preferentemente, el antiincrustante es autopulible.

En un aspecto de la presente invencion, el sustrato o sustrato generador y/o la enzima esta encapsulado. Preferentemente el sustrato/sustrato generador y/o enzima esta encapsulado por una membrana semipermeable.

El sustrato/sustrato generador y enzima pueden estar encapsulados individualmente independientemente entre ellos o pueden estar encapsulados juntos. En la realizacion anterior, el sustrato/sustrato generador o enzima se pueden activar por el agente antiincrustacion. Por ejemplo, el material encapsulado se puede seleccionar de modo que en contacto con un agente antiincrustacion, el sustrato/sustrato generador o enzima se pueden liberar al contactar con el otro sustrato/sustrato generador o enzima. De este modo, se puede proporcionar una composicion de modo que solo proporcione un compuesto antiincrustacion o incremente la provision de compuesto antiincrustacion cuando entra en contacto con un agente antiincrustacion.

La composicion de la presente invencion se puede proporcionar como un producto listo para usar o como un concentrado. El producto listo para usar puede estar en la forma de una disolucion acuosa, dispersion acuosa, disolucion en aceite, dispersion en aceite, emulsion o una preparacion en aerosol. El concentrado se puede usar, por ejemplo, como un aditivo para recubrir, o se puede diluir antes de usar con disolventes adicionales o agentes en suspension.

Una preparacion en aerosol segun la invencion se puede obtener de una manera usual mediante la incorporacion de la composicion de la presente invencion comprendida, o disuelta o suspendida en un disolvente adecuado, en un liquido volatil adecuado para usar como un propelente, por ejemplo la mezcla de cloruros y fluoruros derivados de metano y etano comercialmente disponibles bajo la marca "Freon", o aire comprimido.

Como se discute en la patente EEUU A-5071479 la composicion y/o recubrimiento de la presente invencion puede incluir ingredientes adicionales conocidos por ser utiles en conservantes y/o recubrimientos. Tales ingredientes incluyen fijadores tales como carboxi metil celulosa, alcohol polivinilo, parafina, co-disolventes, tales como acetato de etilglicol y acetato de metoxipropilo, plasticidas tales como esteres de acido benzoico y ftalatos, por ejemplo, ftalato de dibutilo, ftalato de dioctilo y ftalato de didodecilo, sus derivados y mezclas. Opcionalmente tambien se puede incluir tintes, pigmentos de color, inhibidores de incrustacion, estabilizadores quimicos o secantes (secadores) tales como octoato de cobalto y naftenato de cobalto, dependiendo de aplicaciones especificas.

La composicion y/o recubrimiento de la presente invencion se pueden aplicar mediante cualquiera de las tecnicas conocidas en la tecnica incluyendo con brocha, spray, recubrimiento con rodillo, sumergiendo y sus combinaciones.

Las combinaciones de la presente invencion se pueden preparar simplemente por mezclado de los diversos ingredientes a una temperatura a la que no se vean afectados adversamente. Las condiciones de preparacion no son criticas. El equipamiento y metodos convencionalmente usados en la fabricacion de recubrimientos y composiciones similares se pueden emplear ventajosamente.

Ahora se describira la invencion, solo a modo de ejemplo, con los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

El efecto antiincrustacion de una composicion antiincrustacion de la presente invencion se prueba segun los siguientes ejemplos. Estos ejemplos muestran la eficacia de la presente composicion en evitar la incrustacion. Los ejemplos tambien proporcionan la optimizacion de las propiedades antiincrustacion de la presente composicion.

La hexosa oxidasa (HOX) usada en cada uno de los presentes ejemplos esta disponible de DaniscoCultor. HOX es un producto fermentado a partir de levadura Hansenula polymorfa que expresa el gen que codifica la enzima HOX clonada a partir del alga marina Chondrus crispus.

Ejemplo 1 - Preparacion de una composicion antiincrustacion ("una etapa")

Hexosa oxidasa soluble o inmovilizada u otro peroxido de hidrogeno que genera enzimas tal como glucosa oxidasa se prueba como un compuesto antiincrustacion que genera enzimas en una composicion antiincrustacion. La hexosa oxidasa se puede inmovilizar por ejemplo por union a un intercambiador de aniones, O Sepharose FFTM (disponible de Pharmacia) usando 20 mM de tampon trietanolamina, pH 7,3. Alternativamente, la hexosa oxidasa o peroxido de hidrogeno alternativo que genera enzimas se une por enlace covalente a un vehiculo adecuado tal como ShepharosaTM (Pharmacia, Suecia) activado con epoxi, agarosa activada con carbodiimida (Bio-Rad, EEUU). Otros procedimientos tradicionales conocidos en la tecnica para inmovilizacion tambien se pueden utilizar.

El intervalo de concentraciones usadas en 0,0001 a 1000 U de actividad hexosa oxidasa/peroxido de hidrogeno que genera enzimas por ml de composicion antiincrustacion. Una unidad de actividad de enzima se define como la cantidad de enzima que produce 1 Imol de H2O2 por minuto a 25°C.

Para establecer la adecuacion para usar en la presente invencion la actividad de la enzima se puede analizar como sigue. La acitividad de hexosa oxidasa (HOX) se mide segun el siguiente procedimiento.

El analisis HOX se basa en la medicion de peroxido de hidrogeno generado en la oxidacion de glucosa.

El peroxido de hidrogeno oxida �-dianisidina en presencia de peroxidada para formar un colorante. HOX

�-D-glucosa + H2O2 + O2 - D-glucono-delta-lactona + H2O2 POD

5 H2O2 + o-dianisidina -2 H2O + o-dianisinaox Reactivos

1.: 100 mM tampon fosfato, pH 6,3

2.: 100 mM D-glucosa (SIGMA, G-8270) en 100 mM de tampon fosfato, pH 6,3

3.: o-Dianisidina (SIGMA, D-3252), 3,0 mg/ml en agua destilada

10 4. Peroxidasa (SIGMA, P-8125), 0,10 mg/ml en 100 mM de tampon fosfato, pH 6,3

Analisis

120 Il reactivo 1

150 Il reactivo 2

10 Il reactivo 3

15 10 Il reactivo 4 y

10 Il disolucion de enzima

El analisis se lleva a cabo en una placa de microtitulacion. La reaccion se inicia por la adicion de disolucion enzimatica. La mezcla se incuba a 25°C durante 15 minutos agitando. La prueba en blanco contiene todos los componentes con agua en vez de disolucion enzimatica. La formacion del colorante se mide en una placa de

20 microtitulacion leida a 405 nm. La linealidad de la reaccion se puede comprobar usando un programa cinetico sobre el lector de microplaca.

Se puede construir una curva estandar de peroxido de hidrogeno usando diversas concentraciones de H2O2 (MERCK).

Ejemplo 2 - Preparacion de una composicion antiincrustacion ("dos etapas")

25 Se analiza glucosa y galactosa en concentraciones de 0,01 a 100 Ig por ml de composicion antiincrustacion como sustratos para generar un sustrato para hexosa oxidasa en los sistemas descritos en el ejemplo 1. Para proporcionar un sistema que genera un sustrato continuo se usa almidon, preferentemente granulos de almidon intacto de trigo, maiz o patata, en una concentracion de 0,01 ng a 100 Im por ml de composicion antiincrustacion, junto con amiloglucosidasa (GRINDAMYLTM AG 1500 Ba�ery Enzyme de DaniscoCultor u otro

30 producto comercial de amiloglucosidasa). Los componentes estan presentes en concentraciones que proporcionan de 0,000001 a 10 AGU por ml de composicion antiincrustacion.

1 AGU se define como la actividad de amiloglucosidasa que libera 1 Imol de glucosa por minuto a partir de maltosa (0,5% p/v) en 50 mM de acetato de sodio, pH 5,0 (ajustado con acido acetico concentrado) a 40°C. el analisis se para por la transferencia de 200 Il de mezcla de ensayo a 100 Il de 0,1 M de acido clorhidrico

35 hidroclorico y la cantidad de glucosa liberada se mide usando reactivo glucosa dehidrogenasa (Merc� n° 12193) u otro sistema de deteccion de glucosa.

Ejemplo 3 - Generacion de peroxido de hidrogeno mediante pintura que contiene HOX

Se llevo a cabo el siguiente experimento para analizar la capacidad de hexosa oxidasa (HOX) de generar peroxido de hidrogeno.

40 A 11,0 g de pintura (pintura de pared con base de agua Sadolin Glans 7 y con base de aceite Histor 9010, respectivamente) se afadio 2,0, 0,5 y 1 g, respectivamente, de HOX (DaniscoCultor producto fermentado de Hansenula polymorpha) secada por spray sobre almidon (10 U/g). A la pintura con base de agua tambien se afadio 5 g de agua por tratamiento.

Pipetas plasticas de transferencia desechables (Sarstedt) se sumergieron (la parte de la cabeza) en la pintura. 45 Las pipetas de transferencia se dejaron secar al aire durante 3 horas.

Despues se midio la actividad de hexosa oxidasa (HOX) mediante inmersion de la cabeza de la pipeta cubierta con pintura en un tubo de vidrio con 2 ml de reactivo de ensayo HOX, ver a continuacion, la unica actividad de HOX viene de HOX en la pintura.

Los tubos se incubaron a temperatura ambiente.

5 Como blanco se uso pintura sin adicion de HOX.

El resultado del experimento se muestra en la tabla 1. HOX esta distribuida homogeneamente en la pintura, ya que la totalidad de la superficie de la pintura inmediatamente se puso roja cuando tomo contacto con el reactivo de ensayo HOX. El color desarrollado se observa inmediatamente indicando que la pintura no tiene ningun efecto inhibidor sobre la actividad HOX. El experimento prueba que HOX es capaz de generar peroxido de

10 hidrogeno a partir de sustrato exogeno afadido (aqui glucosa) incluso cuando se inmoviliza en una matriz de pintura tras el secado.

Tabla 1

Actividad

Pintura con base de agua, blanco 0

0,2 g HOX +

0,5 g HOX ++

1,0 g HOX +++

Pintura con base de aceite, blanco 0

0,2 g HOX +

0,5 g HOX ++

1,0 g HOX +++

Control, analisis del reactivo mas HOX libre +++

El intervalo de concentraciones usado es 0,0001 a 1000 U de actividad hexosa oxidasa o una enzima alternativa que genera peroxido de hidrogeno por ml de composicion antiincrustacion.

15 Ejemplo 4 - Sistema modelo para recubrimiento

Se usa un tubo de dialisis que contiene una composicion antiincrustacion como un sistema modelo para un recubrimiento para evitar incrustacion sobre la superficie de un material cubierto.

Una composicion antiincrustacion en el tubo de dialisis se usa para generar una concentracion de peroxido de hidrogeno sobre la superficie del tubo de dialisis eficaz para crear antiincrustacion.

20 El tubo de dialisis usado tiene un valor de corte de 10.000 Da. El tubo de dialisis es o bien un tubo de dialisis o una caja de dialisis (tal como Slide-A-LyzerTM disponible de Pierce; IL, EEUU).

El tubo de dialisis esta inmerso en un matraz de vidrio con 1 a 5 litros de agua de mar o de lago recogida como se indico anteriormente. El matraz de vidrio se agita lentamente con un agitador magnetico y se incuba a temperatura ambiente cerca de una ventana para permitir que la luz del dia penetre. Se monitoriza visualmente

25 la incrustacion sobre el tubo de dialisis durante hasta 4 semanas basandose en la aparicion de una capa de crecimiento microbiano sobre el tubo de dialisis y se valora sobre una escala de 1 a 5 como se describio anteriormente. Como control negativo se uso un tubo de dialisis que contenia agua de grifo.

Opcionalmente, la catalasa inmovilizada en piezas de membrana de nitrocelulosa, que posteriormente se han bloqueado con 0,1% Tween 20, se afaden al agua de lago o de mar para evitar la acumulacion de peroxido de

30 hidrogeno en el agua que rodea el tubo de dialisis. La concentracion de catalasa usada esta en el intervalo de 0,000001 a 100 CU, donde 1 CU se define como la actividad de catalasa que degrada 1 �mol de peroxido de hidrogeno por minuto a 30°C en 50 mM de tampon de fosfato de sodio, pH 7,0, como se describio para catalasa en el catalogo Sigma: Biochemicals Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents, Sigma Chemical Company 1995, pagina 221.

35 Las composiciones de la presente invencion son eficaces en evitar incrustacion.

Ejemplo 5 - Estabilidad de HOX en pintura.

Las cabezas pintadas de las pipetas de transferencia descritas en el ejemplo 1 se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 meses y despues se "analizaron" en la mezcla de reactivos como se describio en el ejemplo 2.

Tabla 2

Actividad Pintura con base de agua, blanco 0 0,2 g HOX + 0,5 g HOX ++ 1,0 g HOX No determinado Pintura con base de aceite, blanco 0 0,2 g HOX +++ 0,5 g HOX +++ 1,0 g HOX +++ Control, analisis del reactivo mas HOX libre No determinado

A partir de los resultados de la tabla 2 queda claro que HOX fue estable durante dos meses a temperatura ambiente en una matriz de pintura seca. Ejemplo 6 - Prueba de recubrimiento.

5 Establecimiento de un sistema de prueba para una composicion antiincrustacion. Se recogieron muestras de 0,5 a 5 ml de agua de lago o de mar en tubos de ensayo del lago Brabrands0en cerca de Aarhus, Dinamarca, y del mar Baltico en Aarhus. El dia de la toma de las muestras de agua la composicion antiincrustacion que se probaba se afadio a los tubos de ensayo y se sellaron con ParafilmTM.

Los tubos de ensayo se incubaron a temperatura ambiente cerca de una ventana para permitir que la luz del dia

10 penetrara. Se monitoriza visualmente la incrustacion durante hasta 4 semanas basandose en la aparicion de una capa de crecimiento microbiano sobre las paredes del tubo de ensayo. Para comparar se usaron como controles positivo y negativo un tubo de ensayo con 0,1% de azida de sodio y un tubo de ensayo sin composicion antiincrustacion, respectivamente.

Estos tubos de ensayo se valoraron de 1 a 5, respectivamente, sobre una escala de 1 a 5 de actividad

15 antiincrustacion altamente eficaz a sin actividad, respectivamente. Se usa material comercial de recubrimiento antiincrustacion marino sin la adicion de biocida antiincrustacion. Las composiciones antiincrustacion segun la presente invencion se mezclan con el material de recubrimiento y se aplican a la superficie de placas de metal, vidrio y plastico segun las instrucciones del fabricante del material de recubrimiento.

20 Las placas recubiertas se sumergen en agua en un lago o en agua de mar. La incrustacion sobre las placas se monitoriza visualmente durante hasta 2 afos basandose en la aparicion de una capa de crecimiento microbiano sobre las placas y valorando sobre una escala de 1 a 5 como se describio anteriormente. Como control negativo se uso un recubrimiento sin composicion antiincrustacion.

Las composiciones de la presente invencion son eficaces en prevenir incrustacion. 25 Ejemplo 7 - Estabilidad de la composicion antiincrustacion en agua de acuario. A 10,0 g de pintura (con base de aceite Histor 9010) se afadieron 500 mg de almidon (Merc� 1253), 50 mg de

HOX (producto fermentado DanisCultor a partir de Hansenula polymorpha) secada por spray sobre almidon (10 U/g). Se sumergio (la parte de la cabeza) una pipeta plastica de transferencia desechables (Sarstedt) en la pintura.

30 Las pipetas de transferencia se dejaron secar al aire durante 24 horas. Despues se mantuvo en 250 ml de agua de un acuario en una botella Kautex durante dos meses. La botella se dejo en una ventana a luz del dia. Despues de dos meses se lavo la cabeza de la pipeta, se seco con aire y despues se "ensayo" en mezcla completa de reactivo HOX. La HOX aun mostraba actividad completa.

Ejemplo 8 - Prueba del concepto de sustrato generador. 35 Para proporcionar un almidon de sistema continuo de sustrato generador, preferentemente granulos intactos de almidon de trigo, maiz o patata en una concentracion de 0,01 ng a 100 mg por ml de composicion antiincrustacion, asi como amiloglucosidasa (AMG) (GRINDAMYLTM AG 10000 Ba�ery Enzyme de

DaniscoCultor u otro producto de amiloglucosidasa comercial) en concentraciones que proporcionan de

0,000001 a 100 AGU por ml de composicion antiincrustacion se usan junto con HOX. A 10,0 g de pintura (con base de aceite Histor 9010) se afadieron 500 mg de almidon (Merc�), HOX (producto fermentado DanisCultor a partir de Hansenula polymorpha) secada por spray sobre almidon (10 U/g) y AMG

5 (10.000 AGU/g) como se indico en la tabla. Se sumergio (la parte de la cabeza) una pipeta plastica de transferencia desechables (Sarstedt) en la pintura. Las pipetas de transferencia se dejaron secar al aire durante 3 horas.

Despues se midio la actividad de hexosa oxidasa (HOX) mediante inmersion de la cabeza de la pipeta cubierta de pintura en un tubo de vidrio con 2 ml de reactivo de ensayo HOX sin glucosa, ver el ejemplo 1 para el 10 reactivo de ensayo, la unica actividad de HOX venia de HOX en la pintura y el unico sustrato para HOX

generado por AMG en la pintura mediante hidrolisis de almidon a glucosa en la pintura. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 48 horas. Como blanco se uso pintura sin HOX ni AMG afadido. Tabla 3 Actividad

50 mg HOX+ 10 mg AMG + 50 mg HOX+ 20 mg AMG + 50 mg HOX -Blanco (sin enzimas) -

15 Los resultados que se dan en la tabla 3 muestran que la combinacion de HOX y AMG funciona como se pretende. AMG es generador de glucosa a partir de almidon inmovilizado en la pintura y HOX es generador de peroxido de hidrogeno a partir de la glucosa generada.

Ejemplo 9 - Temperatura de actividad. Se evaluo hexosa oxidasa (HOX purificada) en relacion con la actividad como una funcion de la temperatura y

20 comparado con una glucosa oxidasa comercial (Amano 081443/00018). Procedimiento: Muestra: la muestra de enzima se disolvio en agua y se desalo sobre una columna PD10 usando 20 mM de

tampon fosfato pH 6,3 y se diluyo a 0,4 U/ml. Se afade a una placa Elisa:

25 150 �l 100 mM glucosa en 100 mM tampon fosfato, pH 6,3 120 �l 100 mM tampon fosfato, pH 6,3 10 �l 0-dianisidina (3 mg/ml en agua) 10 �l peroxidada (0,10 mg/ml en 100 mM tampon fosfato, pH 6,3) 10 �l muestra

30 Se ensayo 10 minutos a 30°C y se midio a 405 nm. Resultados Los resultados de la medicion de actividad como una funcion de la temperatura se muestran en la tabla 4 y en la

figura 1.

Tabla 4

Temperatura: Hexosa oxidasa Glucosa oxidasa comercial

°C: Actividad relativa, % Actividad relativa, %

10: 70 67

25: 98 67

27,5: 100 72

32,5: 98 78

37,5: 94 78

42: 83 85

45: 81 100

50: 59 94

Los resultados de actividad frente a temperatura ilustran claramente una diferencia en el perfil de actividad.

La hexosa oxidasa tiene su temperatura optima entre 25-35°C, que casi es coincidente con la temperatura de incrustacion maxima. Por el contrario parece que GOX tiene una temperatura optima a 50°C que esta muy por encima de las temperaturas que se pueden alcanzar en el mar.

SEC ID N° 1

Nombre de la molecula: hoxpic: 1644 bbs ADN linear

Secuencia impresa: 1-1644 (completa): Fecha de impresion 04 junio 1999

Descripcion:

LISTA DE SECUENCIAS �0135� �110� Danisco A/S �120� Composicion

�130� P006441EPA �140� 07001141,6 �141� 02-06-200 �150� GB 9913050,2

5 �151� �160� 2 �170� version de patente 3.4 �210� 1 �211� 1644

10 �212� ADN �213� Chondrus crispus �220� �221� CDS �222� (1) .. (1964)

15 �400� 1

�210� 2 �211� 546 �212� PRT �213� Chondrus crispus �400� 2

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion antiincrustacion que comprende

(i)

un material de recubrimiento de superficie

(ii)

una primera enzima y un primer sustrato, en el que dicho sustrato es un oligomero o un polimero de un segundo sustrato, siendo dicho segundo sustrato un sustrato para una enzima oxidativa, y en donde dicha dicha primera enzima es capaz de generar dicho segundo sustrato a partir de dicho primer sustrato; y

(iii) una segunda enzima, en donde dicha segunda enzima es una oxidasa; y en donde dicha segunda enzima genera una composicion antiincrustacion cuando actua sobre dicho segundo sustrato.
2.

Una composicion segun la reivindicacion 1 en donde la segunda enzima se selecciona de glucosa oxidasa, L aminoacido oxidasa, D amino oxidasa, galactosa oxidasa, hexosa oxidasa, piranosa oxidasa, malato oxidasa, colesterol oxidasa, arilalcohol oxidasa, alcohol oxidasa, latosterol oxidasa, aspartato oxidasa, amino oxidasa, D glutamato oxidasa, etanolamina oxidasa, NADH oxidasa, urato oxidasa (uricasa) y sus mezclas.
3.

Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la enzima es hexosa oxidasa.
4.

Una composicion segun la reivindicacion 3, en donde la hexosa oxidasa se obtiene por clonacion y expresion en organismos huesped recombinantes de un gen que codifica la proteina.
5.

Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el segundo sustrato es un azucar.
6.

Una composicion segun la reivindicacion 4 en donde el azucar es glucosa.
7.

Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la primera enzima es amiloglucosidasa.
8.

Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el primer sustrato se selecciona de almidon, lactosa, celulosa, dextrosa, peptido, inulina, y sus mezclas.
9.

Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el primer sustrato es almidon.
10.

Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la composicion ademas comprende un ligante para inmovilizar al menos uno de los constituyentes de la composicion, preferentemente para inmovilizar la enzima.
11.

Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la composicion se formula como un recubrimiento, una laca, un tinte o un esmalte.
12.

Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la composicion ademas comprende un material de recubrimiento de superficie seleccionado de resinas de cloruro de polivinilo en un sistema con base de disolvente, cauchos clorados en un sistema con base de disolvente, resinas acrilicas y resinas de metacrilato en sistemas con base de disolvente o acuoso, sistemas copolimeros de cloruro de vinilo- acetato de vinilo como dispersiones acuosas o sistemas con base de disolvente, copolimeros de butadieno, cauchos butadieno-estireno, cauchos butadienoacrilonitrilo, cauchos butadieno-estireno-acrilonitrilo, aceites de secado aceite de lino, resinas al�id, asfalto, resinas epoxi, resinas de uretano, resinas de poliester, resinas fenolicas, sus derivados y mezclas.
13.

Un recubrimiento que consiste en una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
14.

Un recubrimiento segun la reivindicacion 13 formulado para el tratamiento de una superficie seleccionada de madera de exteriores, superficies externas de un sistema de calentamiento central, y un casco de un barco marino.
15.

Un agente antiincrustacion marino que consiste en una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
16.

Un agente antiincrustacion marino segun la reivindicacion 15 en el que el agente antiincrustacion es autopulible.
17.

Un metodo para liberar un compuesto antiincrustacion de un revestimiento de superficie, metodo que comprende incorporar en un revestimiento de superficie:

(i)

una primera enzima y un primer sustrato, en donde dicho sustrato es un oligomero o un polimero de un segundo sustrato, siendo dicho segundo sustrato un sustrato para una enzima oxidasa, y en donde dicha primera enzima general dicho segundo sustrato a partir de dicho primer sustrato;

(ii)

una segunda enzima, en donde dicha segunda enzima es una oxidasa; y en donde dicha segunda enzima genera un compuesto antiincrustacion al actuar sobre dicho segundo sustrato.

Actividad como una funcion de la temperatura.

Temperatura, °C

Figura 1