CN115926514A - 基于白真菌素的防污组合物及其应用 - Google Patents
基于白真菌素的防污组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于白真菌素和/或其衍生物的防污组合物,以及防污组合物用于抑制生物体在物体或表面上生长和/或沉积的应用,以及进一步用于抑制海洋环境中的生物污着和生物膜形成的应用。本发明的防污组合物能够有效改善物体的性能并且提高其使用寿命,进而降低物体的维护成本。
Description
技术领域
本发明涉及海洋涂料领域,具体地,涉及一种基于白真菌素及其衍生物的防污组合物,及其用于抑制生物体生长和/或沉积、进而抑制生物膜形成的应用。
背景技术
海洋生物污着是不受欢迎的微生物和巨生物在水下人工表面上的自然定殖。这些生物体大致分为细菌和硅藻等污着微生物(microfouler)以及藤壶、贻贝、管虫和草苔虫等污着巨生物(macrofouler)(Callow and Callow,2002)。细菌生物膜由形成群落的多种菌落的细胞组成。生物膜是细菌的多维(3-D)聚集体,细菌附着在表面并包裹在由多糖、蛋白质、e-DNA和磷脂组成的细胞外聚合物基质(EPS)中(Srinivasan et al.,2021)。与微生物相比,基质占干物质的90%以上,多种机制使得不同的生物能够牢固地附着于表面,与细胞相互作用,并构建复杂的结构(Satpathy et al.,2016)。通过污着微生物形成生物膜来进行定殖会吸引污着巨生物如管虫(Hydroides elegans)的附着,它们更喜欢在生物膜表面定殖(Ralston and Swain,2009)。生物膜细菌对抗生素的抗性是浮游细菌的10至1,000倍(Stewart and Costerton,2001)。海水中几乎所有的海洋结构都被形成生物膜的细菌定殖。污着生物会定殖于船体、水下管道和码头,给海洋作业造成巨大的经济损失,并且会造成环境问题,例如入侵物种的引入(Hellio and Yebra,2009)。例如,由于污着生物的附着所带来的额外负担,船舶需要额外的动力,导致高的燃料消耗和沉重的发动机压力(Bixlerand Bhushan,2012)。
已经开发了各种防污技术来防止生物污着,包括在海洋涂料中添加防污剂,如吡啶硫酮铜、百菌清、吡啶硫酮锌和SeaNine 211(Qian et al.,2013)。此外,含有杀菌剂三丁基锡(TBT)的防污涂料在防止污着生物的沉积和生长方面非常有效,但它对非目标生物同样具有毒性并能在海洋环境中持久存在。因此,该防污涂料在船舶上的应用已被国际海事组织(IMO)禁止(Champ,2000)。
近年来,已经发现了源自各种天然来源的防污化合物。特别是,细菌来源的生物活性化合物是优选的,因为它们可以被繁殖并规模化生产,以确保用于商业化的产品供应(Heidarian et al.,2019)。不可否认的是,从细菌发酵中分离出来的天然产物是开发防污化合物的巨大资源。例如,从海洋细菌微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)中分离出的丁烯酸内酯可以防止主要的污着生物(藤壶、管虫和苔藓虫)的沉积,且具有低毒性(Xuet al.,2010),从脱氮假弧菌(Pseudovibrio denitrificans)中分离出来的3,3-二吲哚甲烷表现出对藤壶和苔藓虫的防污活性,并且具有与商业防污剂SeaNine 211相当的现场性能(Wang et al.,2015)。先前报道的具有防污活性的天然产物还包括脂肪酸、内酯、萜烯、类固醇、苯环型化合物、苯醚、聚酮化合物、生物碱、核苷和肽(Wang et al.,2017)。然而,由于防污化合物的快速释放、化学合成过程复杂以及防污剂的低收率,很难开发基于海洋天然产物的防污涂料(Sisson et al.,2013)。为了解决与化合物释放控制相关的问题,以使用丙烯酸甲硅烷基酯作为防污剂载体的自抛光共聚物通过水解和降解产生自更新的表面,从而控制防污化合物的释放(Bressy et al.,2010;Xie et al.,2019)。
因此,本领域仍然非常需要一种无毒、低成本且环境友好的防污组合物及防污方法。
发明内容
本发明人发现,通过将白真菌素及其衍生物与可水解且可降解的聚合物组合形成的涂料在涂布于船体表面时,可以有效抑制细菌和硅藻等污着微生物以及藤壶、贻贝、管虫和草苔虫等污着巨生物在船体表面的附着、生长或沉积。此外,为提高白真菌素的产量,本发明人还通过工程化野生型冠霉素链霉菌(Streptomyces chrestomyceticus)BCC24770菌株,以生物途径高效地合成白真菌素及其衍生物。由此,发明人完成了本发明。
因此,在本发明的第一方面,提供了一种防污组合物,其包含至少一种涂料组分和式I、II、III或IV所示的化合物或其任一组合:
在第二方面,提供了一种用于抑制生物体在物体或表面上生长和/或沉积的方法,包括通过将包含式I、II、III或IV所示的化合物或其任一组合的组合物施用于所述物体或者表面来使所述组合物与所述生物体接触的步骤:
在第三方面,提供了一种用于改善物体或表面的性能和/或寿命的方法,包括将包含式I、II、III或IV所示的化合物或其任一组合的组合物施用于所述物体或表面的步骤:
本发明通过工程化冠霉素链霉菌(S.chrestomyceticus)以生物途径合成式I-IV的白真菌素及其衍生物,并将其与可水解且可降解的聚合物结合得到防污组合物,生产成本低廉且环境友好。这种基于白真菌素及其衍生物的防污组合物能够有效地抑制生物体如细菌和真核生物在物体或表面的生长和/或沉积,由此能够特别地用作海洋环境中的物体或表面的涂层以防止生物污着和生物膜的形成,并且可以用于可能暴露于细菌污染的医学设备以抑制细菌的生长。本发明的防污组合物能够有效地改善物体的性能并提高其使用寿命,进而降低物体的维护成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些示例性实施方式,而并非旨在将本发明限制于这些实施方式。
图1示出了从冠霉素链霉菌(Streptomyces chrestomyceticus)BCC24770中分离出的式I-IV的白真菌素类化合物的化学结构。
图2A-2E分别示出了式I-IV的白真菌素类化合物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、微球菌(Micrococcus sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、庞蒂亚克亚硫酸盐杆菌(Sulfitobacter pontiacus)和海绵假单胞菌(Pseudomonaspachastrellae)的生物膜形成的抑制。误差线代表SD(n=9,来自3批微生物培养物的9个孔)。通过单因素ANOVA分析与对照生物膜相比的显著性差异,*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001。
图3A-3G示出了式I-IV的白真菌素类化合物对纹藤壶(Amphibalanusamphitrite)和草苔虫(Bugula neritina)的防污活性。图3A和图3B分别示出了纹藤壶经浓度为0.625μg mL-1至40μg mL-1的式I-IV的白真菌素类化合物处理48小时后的幼虫沉积率和幼虫死亡率。误差线代表SD(n=9,来自3批微生物培养物的9个孔)。通过单因素ANOVA分析显著性差异,*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。图3C示出了式I的白真菌素处理纹藤壶幼虫的刺激率曲线。误差线代表SD(n=9,来自3批微生物培养物的9个孔)。图3D示出了生物测定期间纹藤壶和草苔虫幼虫的不同条件,比例尺=100μm。图3E和图3F分别示出了草苔虫经浓度为0.625μg mL-1至40μg mL-1的式(I)的白真菌素处理后的幼虫沉积率和幼虫死亡率。误差线代表SD(n=9,来自3批微生物培养物的9个孔)。通过单因素ANOVA分析显著性差异,*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。图3G示出了式I的白真菌素处理草苔虫幼虫的刺激率曲线。误差线代表SD(n=9,来自3批微生物培养物的9个孔)。
图4A-4D:图4A示出了过表达载体的构建;图4B示出了阳性接合体的PCR验证。M:D2000标记;1~2:来自24770/pPWW-alb22的接合体;3~4:来自24770/pPWW-alb45的接合体;图4C示出了24770/pPWW-alb22、24770/pPWW和24770/pPWW-alb45在7天时的粗提物(溶解在甲醇中);图4D示出了用于计算白真菌素产量的标准曲线。
图5A-5D示出了过表达的调节子对白真菌素生产的影响。图5A示出了24770/pPWW(亲本菌株)、24770/pPWW-alb22和24770/pPWW-alb45过表达菌株生产的白真菌素(mg L-1)。误差线代表SD(n=3个独立的培养物)。通过单因素ANOVA分析显著性差异,*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。图5B示出了24770/pPWW、24770/pPWW-alb45和24770/pPWW-alb22在7天时的粗提物的HPLC分析(300nm)。图5C-5D示出了24770/pPWW、24770/pPWW-alb45和24770/pPWW-alb22菌株中alb45和alb22的相对表达水平。GAPDH用作参考基因,24770/pPWW用作对照。误差线代表SD(n=3个独立的培养物)。通过Student’s t检验分析显著性差异,*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
图6A-6D示出了两个月后现场测试中基于白真菌素的共聚物涂料的防污效果。图6A示出了含5重量%、10重量%和15重量%白真菌素的共聚物涂布于PVC板上。对照仅涂布有共聚物。图6B和图6C分别示出了1个月和2个月后生物污着生物的覆盖率。误差线代表SD(n=3)。通过单因素ANOVA分析显著性差异,*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。图6D示出了白真菌素被释放进人工海水中的时间依赖性释放率。误差线代表SD(n=3)。
图7A-7C示出了基于16s rRNA扩增子分析的基于白真菌素的共聚物涂料的微生物群落结构的改变。图7A示出了在基于5重量%白真菌素的共聚物涂料和仅使用共聚物涂料的对照中形成的生物膜的主要细菌门的相对丰度(变形菌门被进一步分类)。图7B示出了基于白真菌素的共聚物涂料和仅使用共聚物涂料的对照的实测OTU。误差线代表SD。通过Student’s t检验分析显著差异,*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。图7C示出了基于白真菌素的共聚物涂料和仅使用共聚物涂料的对照的Shannon-Weiner多样性指数(al-1、al-2、al-3、al-4和对照-1、对照-2)。误差线代表SD。通过Student’s t检验分析显著性差异,*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
具体实施方式
在下文中,将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解,以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明,而无意于对本发明的范围进行限制,本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且,本领域技术人员理解,在不背离本发明的精神和主旨的情况下,可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义,否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前,提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中,例如浓度范围、百分比范围或比率范围,应当理解,除非上下文另有明确规定,否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中,并且此类实施方案也包括在所述主题内,受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中,排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中,除非明确指出,当表示要素、组分、组件等的名词前没有数量词定义时,该名词不仅可以表示一个要素、组分、组件的情况,也可以表示多个要素、组分、组件的情况。
在本发明的上下文中,很多实施方案使用表述“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或者“基本上/主要由……组成”或它们的变体。表述“包含”、“包括”、具有”、“含有”或“基本/主要由……组成”或它们的变体在通常情况下可以理解为开放式表述,表示不仅包括该表述后面具体列出的各要素、组分、组件、方法步骤等外,还包括其他没有列出的要素、组分、组件、方法步骤。另外,在本文中,表述“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或者“基本上/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述,表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤,而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时,该表述等同于表述“由……组成”。
短语“基本上由……组成”表示权利要求涵盖包含指定材料或步骤的实施方案以及不会实质影响权利要求的基本和新颖特征的实施方案。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围,除非另外指出,否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此,除非相反地指出,否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值,其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少,每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
在本发明的上下文中,范围以简写形式陈述,以避免必须冗长地列出和描述范围内的每个值。在适当的情况下,可以选择范围内的任何合适的值作为范围的上限值、下限值或范围的端值。例如,范围1-10表示端值1和10,以及中间值2、3、4、5、6、7、8、9、以及1-10范围内的所有中间范围,例如2-5、2-8和7-10。此外,当本文使用范围时,范围的组合和子组合(例如,所公开的范围内的子范围)和其中的具体实施方案旨在被明确地包括在内。
如本文所用的,短语“基于微生物的组合物”是指包含由于微生物或其他细胞培养物的生长而产生的组分的组合物。因此,基于微生物的组合物可以包含微生物本身和/或微生物生长的副产物。生长的副产物可以是例如代谢物、细胞膜组分、表达的蛋白质和/或其他细胞组分。微生物可以是完整的或裂解的。微生物可以存在于组合物中或从组合物中除去。微生物可以与它们在其中生长的肉汤一起存在于所述基于微生物的组合物中。例如,细胞可以以至少1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012CFU/毫升组合物、或更高的浓度存在。
本发明进一步提供了“基于微生物的产品”,其是要在实践中应用以实现期望结果的产品。基于微生物的产品可以仅仅是从微生物培养过程中收获的基于微生物的组合物。或者,基于微生物的产品可以进一步包含已添加的额外成分。这些额外成分可以包括,例如,稳定剂、缓冲剂、合适的载体(例如水、盐溶液或任何其他合适的载体)、添加以支持进一步的微生物生长的营养成分、非营养成分生长促进剂(例如植物激素)、和/或有助于所应用的环境中追踪微生物和/或组合物的剂。基于微生物的产品还可以包含基于微生物的组合物的混合物。基于微生物的产品还可以包含已经以一些方式加工(例如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等)的基于微生物的组合物的一种或多种组分。
如本文所用,“收获的”是指从生长容器中移出一些或全部基于微生物的组合物。
如本文所用,“分离的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽、蛋白质、或有机化合物如小分子(例如,下文描述的那些)基本上不含在自然界中与其相关的其他化合物,例如细胞物质。纯化的或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))不含在其天然存在的状态下与其侧接的基因或序列。纯化的或分离的多肽不含在其天然存在的状态下与其侧接的氨基酸或序列。分离的微生物菌株意味着该菌株已从其在自然界中存在的环境中移出。因此,分离的菌株可以作为例如生物学纯培养物存在,或作为与载体结合的孢子(或菌株的其他形式)存在。
如本文所用,“载体”是指用于将核苷酸构建体(例如DNA构建体)引入宿主细胞的DNA分子,例如质粒。克隆载体通常包含一个或少量的限制性核酸内切酶识别位点以及标记基因,其中外源DNA序列可以以可确定的方式插入该限制性核酸内切酶识别位点,而不造成载体的基本生物功能的损失,而标记基因适用于鉴定并选择用克隆载体转化的细胞。标记基因通常包括提供可选择特征(例如四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性)的基因。
如本文所用,在描述两个或多个多核苷酸序列的上下文中,术语“同一性”或“同一性百分比”是指两个或多个序列或子序列是相同的或在比较的区域具有指定百分比的相同核苷酸。例如,当用于本发明方法的同源核苷酸序列与参考序列在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时,该同源核苷酸序列与参考序列具有至少80%的序列同一性,优选地具有85%、90%、91%、92%、93、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的同一性,如使用比较算法或通过手动比对和目视检查测量的。关于多核苷酸序列,该定义还指测试序列的互补序列。
如本文所用的,短语“转化的细菌细胞”是指其中细胞由本文公开的DNA载体转化的细菌细胞。
在某些实施方案中,纯化的化合物是纯度为至少60重量%的目标化合物。优选地,该制剂是纯度为至少75重量%、更优选至少90重量%、最优选至少98重量%的目标化合物。例如,纯化的化合物是纯度为至少80重量%、85重量%、90重量%、91重量%、92重量%、93重量%、94重量%、95重量%、98重量%、99重量%或100重量%的目标化合物。纯度的测量可以通过任何合适的标准方法,例如通过柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱法(HPLC)分析。
“代谢物”是指通过新陈代谢产生的任何物质或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物可以是作为新陈代谢中的原料、中间产物或终产物的有机化合物。代谢物的实例包括但不限于有机化合物、酶、酸、溶剂、醇、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸、生物聚合物和生物表面活性剂。
如本文所用,“减少”是指负向变化,“增加”是指正向变化,其中负向或正向变化是至少0.001%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的负向或正向变化。
根据本发明,包括活生物体或非活体物质在内的材料的、有害积累会导致“污着(fouling)”过程。“污着”可以导致堵塞、结垢或其他不希望的堆积。“污着”可以影响物体的效率、可靠性或功能。
如本文所用,术语“污染物”是指导致另一种物质或物体发生污损或变得不纯的任何物质。污染物可以是活体的或非活体的,可以是无机或有机的物质或沉积物。活生物体可以包括:细菌,例如亚硫酸盐杆菌(Sulfitobacter spp.)、嗜冷杆菌(Psychrobacterspp.)、蓝细菌(cyanobacteria)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、芽孢杆菌(Bacillusspp.)、肠球菌(Enterococcus spp.)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、克雷伯氏菌(Klebsiella spp.)、微球菌(Micrococcus spp.)、肠杆菌(Enterobacter spp.)和不动杆菌(Acinetobacter spp.);和真核生物,例如藻类、酵母、真菌、藤壶(例如,纹藤壶Amphibalanus amphitrite)、管虫、草苔虫(例如,总合草苔虫Bugula neritina)和贻贝。此外,污染物可以包括但不限于污垢、碳氢化合物和溶解的有机物质,例如源自生物质的氨基酸和蛋白质。“污垢”是指由例如硫酸钡、碳酸钙、硫酸钙、草酸钙、氢氧化镁、氧化镁、硅酸盐、硫酸锶、氧化铝氢氧化物、铝硅酸盐、磁铁矿或铁酸镍、氯化钠、二氧化硅、硫化铁、铁氧化物、碳酸铁、铜、磷酸盐、氧化物和任何其他可以沉淀和形成沉积物的矿物化合物的沉淀产生的任何类型的污垢。
如本文所用的,术语“生物膜”是微生物如细菌的复杂聚集体,其中细胞使用细胞外多糖基质彼此粘附和/或粘附于表面。生物膜中的细胞在生理上不同于同一生物体的浮游细胞,浮游细胞是可以在液体培养基中漂浮或游动的单细胞。
如本文所用的,术语“有效量”用于指当施用于或接触到表面或生物体时能够抑制、防止或改善污着的化合物或组合物的量。换言之,当施用于或接触表面或生物体时,该量是“有效的”。实际量将根据许多因素而有所不同,所述因素包括但不限于一种或多种导致污着的物质被抑制、防止或改善;污着的严重程度;以及施用途径。
本文中对变量的任何定义中列举的化学基团包括将该变量定义为任何单个基团或所列基团的组合。本文对变量或方面的实施方案的叙述包括作为任何单个实施方案或与任何其他实施方案或其部分组合的实施方案。
本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。
化合物
在优选的实施方案中,根据本发明的组合物和方法利用分离的白真菌素和/或其衍生物(包括例如白真菌素A、氯白真菌素、chrestoxanthone A)、和/或含有白真菌素和/或其衍生物的细菌培养提取物。白真菌素及其衍生物(包括例如白真菌素A、氯白真菌素和chrestoxanthone A)可以是纯化的形式或细菌生长产物的混合物,包括粗提物。白真菌素及其衍生物可以以重量计约0.1%至约50%、优选约1%至约15%、更优选约5%至约10%的浓度添加到组合物中。在另一个实施方案中,纯化的白真菌素及其衍生物可以与可接受的载体组合,其中白真菌素及其衍生物可以以体积计约0.1%至约50%、优选约1%至约15%、更优选约10%至约15%的浓度存在。
以下是白真菌素(式I)及其衍生物的化学式,衍生物包括白真菌素A(式II)、氯白真菌素(式III)和chrestoxanthone A(式IV):
根据本发明使用的微生物可以是天然的或遗传修饰的微生物,特别是可以合成本发明化合物的微生物。例如,所述微生物可以由特定基因转化以表现出特定特征。微生物也可以是所需菌株的突变体。如本文所用,“突变体”是指参考微生物的菌株、遗传变体或亚型,其中突变体与参考微生物相比具有一种或多种遗传变异(例如,点突变、错义突变、无义突变、缺失、重复、移码突变或重复扩增)。制备突变体的步骤在微生物学领域是众所周知的。例如,出于此目的,广泛使用质粒接合。在某些实施方案中,链霉菌(Streptomyces sp.)可以与编码转录调节子(例如alb22、alb45或它们的组合)的质粒接合。在某些实施方案中,alb22是根据SEQ ID NO:15的序列或与SEQ ID NO:15具有至少90%序列同一性的序列。在某些实施方案中,alb45是根据SEQ ID NO:16的序列或与SEQ ID NO:16具有至少90%序列同一性的序列。
SEQ ID NO:15:
GGAATTCCATATGGAGCGCGACACCGCCGGCCGGCACCCGCAGGTACGGACCGAACTCGCCCGGCTCGTACGGGACACCGCCCGGCGCCTGACCGACCATCCCTTCTACCGGGGACTGGCCGACGGAACCCTGCCGGAAGCCGCCCTGGCGCACTTCCTCCAGCAGGACCACTGGCACGTCCTGCCCGCCTACGCCGCCGCCCACGCCCGCTGTGCCGCGGTAGCCGCCGGCCACCCACACGCCCTGCTGTTCAGCCGGATGGGCACCGGCACCGCCGAGGACGCCGAACGGCGCCAGGAGCGGGTACGGCGGTGGGGCGAGGACCTCAAGCTGCCGCTCGCGGACGGCGCCCCCGCGCTGCTGCCCACCACACTCGGCTACACCGCCTTCCTGGGCGCCGCCCCGGCCCGTTCCCTGCCCGCGGGGGCCGGTGCCGTTTTACCCGCCGCCTGGCTGTTCCTGCTGGTCACCGACGAACTGCTGACCCGGTGCGTACCGGGTTCCCGGTACGCCTCGGTGATCGAGGAGTGGCACCCCGGCGACACCTATCGCGGGCTGGTGGACGTGTTCCTGGGTGCCGTGGAGGAGATCGCCGCGGAGTGCTCACCGGCCGGCCGCCGCAAACTCGTCACCTCCGCACGGCACGCCGCCTACTTCGAGTGGGCCCACGTGAACGCGGCCTGGCGGCAGGAGACCTGGCCGTTCTGAACTAGTC
SEQ ID NO:16:
GGAATTCCATATGGACATCAGCGTACTGGGGCCGTTCAGAGCGGTTCAGTCGGGAGTGTCGGTGACACCCACCGCCGTCAAGCCCCGCAAGGTGCTCGCCCTGCTCGCTCTGCAAGCCGACCAACTGGTCTCGACCTCCTCACTGGTGGAAGAAGTCTGGGGTGAGTCGCCGCCGCGCAGCGTGCAGACCACCCTGCAGACCTACATCCTCCAACTGCGCACCCTCATCTCCGCCGCCCTCGGCGAGGACCTCGCGGGACTGCCGAACGGCGCGAAGAGTGTCCTGGTGACCGAACCCGGCGGTTACCTCCTCGACACCATGGGCGGGCTGGTCGACGTCCAGGAATACGAAGCGCTGGCCACGGCCGGCCACCGGGCGCTGGAGCAGGGGGACTGGGGCGGTGCTGCGAGCTGCCTGGGCCGGGCGCTGGCGCTGTGGCACGGCCGGGCCCTGGTCGACGTGCAGTGCGGTCCACTGCTGGAGGTGGAGGTGACGCGGCTGGAGGAGTCACGGATGAGCGTCCTTCACGCGCGGATCGAGGCGGACCTGAGGCTGGGCCGCCACCATGAGGTCATCGGTGAACTGTCCGGTCTCGCCGCCCGCCACCCCCTGCACGAGGGCGTCCACGGACAGCTCATGGTGGCGCTGTACCGGGCGGGCCGCCGCGGGGACGCCCTCAACACCTACCGGCAGTTGCGTGCCGCGCTGGGCCAGCACCTCGGCCTCGACCCGTCGCCGGGCATCGAGGACCTCCAGCAGGCGGTGCTCGACTCCTCACCCCTGCTCGGCCTGGACGGCTCCCTGCCGCTCGCACGCCTGGTCCGGGCCGGCTGAACTAGTC
在某些实施方案中,某些微生物可以是生产化合物白真菌素及其衍生物(包括例如氯白真菌素、白真菌素A、氯白真菌素和chrestoxanthone A)的任何细菌。白真菌素及其衍生物(包括例如白真菌素A、氯白真菌素和chrestoxanthone A)和/或相关的细菌培养提取物可以由包括链霉菌(Streptomyces spp.)在内的细菌生产。在优选的实施方案中,白真菌素及其衍生物(包括例如氯白真菌素、白真菌素A、氯白真菌素和chrestoxanthone A)由冠霉素链霉菌(Streptomyces chrestomyceticus)BCC24770生产。
在一个实施方案中,用于培养微生物的方法在约5℃至约100℃、约15℃至约60℃、约20℃至约37℃进行,优选地在约20℃至约30℃进行,或更优选在约23℃至约30℃进行。在另一个实施方案中,可以在恒温下连续培养。在另一个实施方案中,该培养可以经受变化的温度。
在一个实施方案中,该方法和培养过程中使用的设备是无菌的。培养设备如反应器/容器可以与灭菌单元(如高压釜)是分开的,但与其相连接。在某些实施方案中,细菌可以进行发酵,所述发酵包括使细菌细胞在约20℃至37℃、优选在约23℃至约30℃与种子培养基(每升蒸馏水中4g酵母提取物、10g麦芽提取物和4g D-葡萄糖)持续接触1小时至约14天、优选约12小时至约10天、或约1天至约7天、或约2天。在某些实施方案中,用于选择与质粒接合的细菌细胞的组分包括抗生素,例如安普霉素。
在一个实施方案中,本发明的组合物包括根据本发明方法产生的细菌培养物。
由目标微生物生产的微生物生长副产物可以保留在微生物中或分泌到液体培养基中。在另一个实施方案中,用于生产微生物生长副产物的方法可以进一步包括浓缩和纯化目标微生物生长副产物的步骤。在另一个实施方案中,液体培养基可以含有稳定微生物生长副产物的活性的化合物。
在某些实施方案中,白真菌素或其衍生物可以从合成该化合物的生物体中分离、纯化并使用HPLC分析以保证至少约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%的纯度。
在某些实施方案中,可以将包含白真菌素或其衍生物的组合物与聚合物组合。在某些实施方案中,白真菌素或其衍生物可以涂布在聚合物上并且聚合物可以是可水解的。在某些实施方案中,聚合物可以如下制备:甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM)的共聚物(PMSM0)通过自由基开环聚合合成(参见例如Zhou et al.,2015)。为了生产基于白真菌素(5重量%)的涂料,可以将约0.95克PMSM0和约0.05克白真菌素溶解于二甲苯和四氢呋喃(体积比为1:2)中,并在室温下剧烈混合。然后可以将溶液涂布于固体表面例如聚氯乙烯(PVC)板(4×7cm2)或玻璃上,并在约室温(例如约18℃至约25℃)干燥约1天至约14天、约3天至约10天或约7天(Ma et al.,2017)。可以使用相同的步骤来制备具有不同白真菌素浓度(例如,约10重量%或约15重量%)的其他涂料,其中调节聚合物的量以使白真菌素浓度的增加(例如,约90%PMSM0或约85%PMSM0)。
在某些实施方案中,防污组合物包含粘合剂,用于将防污组合物粘结到物体表面。粘合剂可以选自普通聚合物、丙烯酸、醇酸树脂、丙烯酸、丙烯酰胺、酚醛树脂、酚醛醇酸树脂、聚丙烯酰胺、聚氨酯、硅酮醇酸树脂、聚酯、环氧树脂、乙烯基、醋酸乙烯酯-乙烯、乙烯基醇酸树脂、无机粘合剂(硅酸钠等)、有机粘合剂(碳基)、(Daubert ChemicalCompany,Inc.,Chicago,IL)、脂肪族聚氨酯和油改性聚氨酯、或其他具有强附着力的商业化粘合剂。在优选的实施方案中,聚合物包含MMA和TBSM。可以添加其他组分以增强涂料的性能。这些添加剂可以是杀菌剂、颜料、缓冲剂、溶剂、增粘化合物或其他特定用途的成分。
在某些实施方案中,本发明的涂料组合物包含颜料或染料,其可以为油漆或其他涂料提供颜色,并可以额外保护表面或物体免受例如UV光的影响。颜料或染料可以是天然的、合成的、无机的或有机的。颜料或染料可以选自例如二氧化钛、氧化锌、锌黄、黄色染料、联苯胺黄、氧化铬绿、酞菁绿、酞菁蓝、群青、朱红色、颜料棕6、红170、二噁嗪、紫罗兰、炭黑、氧化亚铁(II)、石英砂(SiO2)、滑石、重晶石(BaSO4)、高岭土和石灰石(CaCO3)。
在某些实施方案中,组合物中使用的溶剂之一选自无机或有机溶剂,包括例如乙醇、丁醇、丙醇、脂肪烃、脂环烃、四氢呋喃(THF)、二甲苯、甲苯、酮和/或异丙醇。在一个优选的实施方案中,二甲苯和THF的组合可以是1:2的体积比。
在一个实施方案中,该组合物还可以包含缓冲剂,包括有机酸和氨基酸或其盐。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸盐、葡糖酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、乳酸盐、草酸盐、天冬氨酸盐、丙二酸盐、葡庚糖酸盐、丙酮酸盐、粘酸、戊二酸盐、酒石酸盐、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸及其混合物。也可以使用磷酸和亚磷酸或它们的盐。适合使用合成缓冲液,但优选使用天然缓冲液,例如上面列出的有机酸和氨基酸或它们的盐。
在进一步的实施方案中,pH调节剂包括氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾或碳酸氢钾、盐酸、硝酸、硫酸、或其混合物。
基于白真菌素的产品可以与促进基于白真菌素的产品粘附于待处理的表面的组合物一起施用。粘附促进物质可以是基于白真菌素的产品的组分,或者它可以与基于白真菌素的产品同时或依次施用。
可以使用通常用于涂料组合物中的其他添加剂,包括水软化剂、螯合剂、腐蚀抑制剂和抗氧化剂,它们以有效实施其预期功能的量添加。这些添加剂及其量的确认和使用完全在本领域技术人员的能力范围内。合适的水软化剂包括线性磷酸盐、苯乙烯-马来酸共聚物和聚丙烯酸酯。合适的螯合剂包括1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、1-苯基-3-异庚基-1,3-丙二酮、和2-羟基-5-壬基苯乙酮肟。腐蚀抑制剂的实例包括2-氨基甲基丙醇、二乙基乙醇胺苯并三唑和甲基苯并三唑。适用于本发明的抗氧化剂包括(BHT)2,6-二叔丁基对甲酚、(BHA)2,6-二叔丁基对苯甲醚、Eastman抑制剂OABM-草酰双(苯亚甲基酰肼)和Eastman DTBMA 2,5-二叔丁基对苯二酚。
可以包含在根据本发明的制剂中的其他合适的添加剂包括通常用于此类制剂的物质。该添加剂可以是例如载剂、粘度调节剂、防腐剂、示踪剂、杀菌剂、干燥剂、增塑剂、流动控制剂、消泡剂、乳化剂、UV稳定剂、抗结皮剂、调质剂、乳化剂、润滑剂、溶解度控制剂、防腐剂、和/或稳定剂。
任选地,产品可以在使用前储存。储存时间优选为短的。因此,储存时间可以不超过60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。储存时间最长可达1年,优选的储存温度可以在室温左右。
根据本发明的组合物可以包含其量可以有效清洁表面、形成物和设备和/或提供有效防止将来的污染物累积、污垢形成和腐蚀发生的涂层的成分。
白真菌素及其衍生物在防污组合物中的用途
在优选的实施方案中,提供了将防污组合物施用于可能被海洋无脊椎动物或细菌污染的表面上的方法,其中将白真菌素或其衍生物施用于表面上或直接施用于海洋无脊椎动物的幼虫上。使用本发明的防污组合物可以提供改进的防污用途。本发明并不是对所有应用的详尽审查。
本发明的防污组合物可以施用于各种无机或有机物体表面,例如金属,包括不锈钢、铝、钛;有机物,包括木材、橡胶;塑料;矿物质;玻璃;和混凝土。这些表面可以用于各种行业,包括医学设备、石油、水产养殖和渔业。表面可以是船舶、船体、管道、管线、针、泵、螺旋桨、浮标和绳索。该组合物可以施用于一系列温度或水生环境中的物体。可以将防污组合物添加到传统的涂料产品中,例如油漆、着色剂、粘合剂、底漆、密封剂、面漆、清漆、抛光剂、亮漆、防污物质和/或抗磨损物质。
在某些实施方案中,基于白真菌素的组合物可以抑制海洋生物体的沉积或形成。这些生物体可以包括微生物或巨生物,包括细菌、藻类和海洋无脊椎动物幼虫。在某些实施方案中,基于白真菌素的组合物可以抑制细菌的生长和/或生物膜的形成。
在某些实施方案中,本发明的组合物可以通过防止或抑制活生物体或非活物质造成的污着来增加物体的寿命。本发明可以用于防止或抑制沉积的发生。生物体或沉淀物的分散或溶解会降低表面或物体上可用的污染物浓度。因此,本发明能够延迟或完全消除与去除沉淀物和沉积物有关的预防性维护的必要性以及更换或修理设备部件的需要。本发明的涂料组合物还可以施用于分散在例如储存和运输罐、油轮、船舶、管道和输油管线、混凝土、沥青和金属中的污垢,而不需要机械清洁溶液或有毒溶剂。
在某些实施方案中,该方法用于清洁表面,其中该表面是需要去污、去污着和/或疏通堵塞的设备或装置。有利地,本发明的方法可以用于通过改进设备的维护和正常运行来提高工业操作或设备整体的生产率。
可以使用例如喷雾瓶或加压喷雾装置通过喷雾将组合物施用于表面。也可以使用布或刷子来施用组合物,其中组合物被摩擦、涂抹或刷到表面上。此外,可以通过将表面浸湿、浸入或浸没于其中具有组合物的容器中来将组合物施用于表面上。
在一个实施方案中,可以允许材料和/或表面用组合物浸泡足够的时间以施用涂料或从物体和/或表面上提起和/或去除污染物。例如,根据需要,浸泡可以进行至少5秒、30秒、1分钟、30分钟、60分钟、12小时、24小时、36小时、48小时或72小时或更长时间。
在一个实施方案中,该方法还包括从表面除去组合物和污染物的步骤。这可以通过例如用水冲洗或将水喷洒到表面上和/或用布摩擦或擦拭表面直到组合物和污染物已从表面上除去来实现。可以在用布摩擦或擦拭表面之前和/或之后用水冲洗或喷洒。
在另一个实施方案中,可以使用机械方法从表面除去污染物和/或组合物。例如,可以将搅拌器、钻头、锤子或刮刀用于从表面上清除由于例如污染物的量或污染物的类型而特别难去除的污染物。
在某些实施方案中,白真菌素或其衍生物可以在施用于物体和/或表面后以约0.1μg cm-2天-1至约5μg cm-2天-1的速率从所述组合物中释放,例如以约0.8μg cm-2天-1至约1.4μg cm-2天-1的速率从本发明的组合物中释放。
实施方案
实施方案1:一种防污组合物,其包含至少一种涂料组分和式I、II、III或IV所示的化合物或其任一组合:
实施方案2:根据实施方案1所述的防污组合物,其中,所述化合物是经纯化的化合物本身,或者是含有所述化合物的细菌如冠霉素链霉菌的提取物形式;优选地,所述冠霉素链霉菌为经包含转录调节子alb22、alb45或其组合的DNA载体如质粒转染以过表达所述化合物的工程化冠霉素链霉菌。
实施方案3:根据实施方案1-2所述的防污组合物,其中,所述化合物占所述组合物以重量计的约0.1%至约50%、优选约1%至约15%、更优选1%至10%、最优选5%至10%。
实施方案4:根据实施方案1-3所述的防污组合物,其中,所述涂料组分包括:聚合物;以及任选的粘合剂、颜料、溶剂、缓冲剂或其任意组合。
实施方案5:根据实施方案4所述的防污组合物,其中,所述聚合物包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM),优选地,所述聚合物为甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM)的共聚物。
实施方案6:一种用于抑制生物体在物体或表面上生长和/或沉积的方法,包括通过将包含式I、II、III或IV所示的化合物或其任一组合的组合物施用于所述物体或表面来使所述组合物与所述生物体接触的步骤:
实施方案7:根据实施方案6所述的方法,其中,所述化合物是经纯化的化合物本身,或者是含有所述化合物的细菌如冠霉素链霉菌的提取物形式;优选地,所述冠霉素链霉菌为经包含转录调节子alb22、alb45或其组合的DNA载体如质粒转染以过表达所述化合物的工程化冠霉素链霉菌。
实施方案8:根据实施方案6-7所述的方法,其中,所述化合物占所述组合物以重量计的约0.1%至约50%、优选约1%至约15%、更优选1%至10%、最优选5%至10%。
实施方案9:根据实施方案6-8所述的方法,其中,所述组合物还包含涂料组分,例如聚合物,以及任选的粘合剂、颜料、溶剂、缓冲剂或其任意组合。
实施方案10:根据实施方案9所述的方法,其中,所述聚合物包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM),优选地,所述聚合物为甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM)的共聚物。
实施方案11:根据实施方案6-10所述的方法,其中,所述物体或表面浸于水中或是医学设备,例如所述浸于水中的物体或表面是船舶、船体、管道、管线、针、泵、螺旋桨、浮标或绳索。
实施方案12:根据实施方案6-11所述的方法,其中,所述组合物在施用于所述物体或表面后,所述化合物以约0.1μg天-1cm-2至约5μg天-1cm-2的速率从所述组合物中释放。
实施方案13:根据实施方案6-12所述的方法,其中,所述方法进一步抑制生物膜形成。
实施方案14:一种用于改善物体或表面的性能和/或寿命的方法,包括将包含式I、II、III或IV所示的化合物或其任一组合的组合物施用于所述物体或表面的步骤:
实施方案15:根据实施方案14所述的方法,其中,所述化合物是经纯化的化合物本身,或者是含有所述化合物的细菌如冠霉素链霉菌的提取物形式;优选地,所述冠霉素链霉菌为经包含转录调节子alb22、alb45或其组合的DNA载体如质粒转染以过表达所述化合物的工程化冠霉素链霉菌。
实施方案16:根据实施方案14-15所述的方法,其中,所述化合物占所述组合物以重量计的约0.1%至约50%、优选约1%至约15%、更优选1%至10%、最优选5%至10%。
实施方案17:根据实施方案14-16所述的方法,其中,所述组合物还包含涂料组分,例如聚合物,以及任选的粘合剂、颜料、溶剂、缓冲剂或其任意组合。
实施方案18:根据实施方案17所述的方法,其中,所述聚合物包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM),优选地,所述聚合物为甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM)的共聚物。
实施方案19:根据实施方案14-18的方法,其中,所述物体或表面浸于水中或是医学设备,例如所述浸于水中的物体或表面是船舶、船体、管道、管线、针、泵、螺旋桨、浮标或绳索。
实施方案20:根据实施方案14-19的方法,其中,所述组合物在施用于所述物体或表面后,所述化合物以约0.1μg天-1cm-2至约5μg天-1cm-2的速率从所述组合物中释放。
实施方案21:根据实施方案14-20的方法,其中,所述物体或表面的性能和/或寿命通过抑制污着生物污着来改善;优选地,所述方法进一步抑制污着微生物形成生物膜。
实施例
在下述实施例中,如无特殊说明,其中采用的试验方法均为常规方法,并且如无特殊说明,下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意,本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的,无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下,本发明的范围由随附的权利要求书确定。
材料与方法
细菌菌株和一般实验步骤
本发明使用的菌株和质粒列于表1中。葡萄球菌(Staphylococcus sp.)Z01和微球菌(Micrococcus sp.)Z02是从潮下带的在培养皿(Corning Inc.,New York,USA)上生长的海洋生物膜中分离出来的(Wang et al.,2020)。首先,将出现的生物膜从培养皿上刮下并稀释10倍和100倍。然后,将它们铺在海洋琼脂板上(BD Difco 2216,New Providence,NJ,USA)并在22℃孵育24小时。通过在解剖显微镜下观察以分离不同表型的菌落。使用8F/1492R引物(SEQ ID NO:13:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;SEQ ID NO:14:CGGTTACCTTGTTACGACTT)进行16S rRNA基因扩增子分析,然后在BGI(中国北京)进行Sanger测序以确认分离物的分类。对获得的序列在NCBI 16S核糖体RNA序列数据库和EzBioCloud数据库中进行BLAST搜索,以确定分离物的分类(Yoon et al.,2017)。微球菌的16SrRNA基因序列与云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)的16S rRNA基因序列的同一性为94.7%,葡萄球菌的16S rRNA基因序列与华氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)的16SrRNA基因序列的同一性为96.2%。
表1:细菌菌株和质粒
白真菌素类化合物的分离和结构鉴定
将冠霉素链霉菌(Streptomyces chrestomyceticus)BCC 24770培养物用乙酸乙酯萃取两次,得到粗提物,并将该粗提物进一步溶解于MeOH中,上样至C18硅胶层析柱,通过梯度增加的MeOH:H2O(20:80–100:0)得到不同的级分。使用高效液相色谱法HPLC(Waters2695,Milford,MA,USA)进一步分析该级分,并搜索与先前报道的化合物1-4(She et al.,2021)的相似UV模式。将级分中的化合物干燥并注入半制备型HPLC进行纯化。通过HPLC分析化合物的纯度,并通过Bruker NMR光谱仪(Bruker,Billerica,MA,USA)确定结构。
通过MTT测定法评估生物膜形成
测试了细菌形成静态生物膜的能力。将海洋细菌在海洋肉汤中在22℃以220rpm搅拌(对于海绵假单胞菌(Pseudomonas pachastrellae)MCCC 1A01390、庞蒂亚克亚硫酸盐杆菌(Sulfitobacter pontiacus)MCCC1A04899和海雪嗜冷杆菌(Psychrobacter nivimaris)MCCC 1A11723)以及在30℃(对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)B04、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)Z01和微球菌(Micrococcus sp.)Z02)培养过夜,然后用补充有1%葡萄糖的海洋肉汤中稀释至107CFU mL-1;将病原菌在补充有1%葡萄糖的LB肉汤中以220rpm在37℃培养过夜。然后,取200μL稀释溶液添加到96孔板(Corning Inc.,New York,USA)的每个孔中,在22℃或30℃孵育24小时。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次去除培养基、浮游细胞和松散附着的细菌,并将紧密附着的细菌用20μL MTT(5mg mL-1)在37℃孵育3小时。弃去上清液,将甲臜溶解于150μL的DMSO中。使用MultiskanTM FC微孔板光度计(ThermoFisher Scientific,Waltham,USA)测量570nm的吸光度,并使用MRSAATCC 43300作为阳性对照。所有实验一式三份进行。
抗细菌测定和抗生物膜形成测定
白真菌素类化合物的抗细菌活性按照特定方案进行了测试(She et al.,2020)。海洋肉汤用作海洋细菌的测试培养基,MHB肉汤用作病原菌的测试培养基。将板在22℃或30℃保持过夜,并测试白真菌素类化合物的最小抑菌浓度(MIC),MIC是药物防止细菌可见生长的最低浓度。已成功形成生物膜的细菌进一步用于抗生物膜形成测定。向每个孔中加入不同浓度的白真菌素类化合物。通过如前所述的MTT测定法评估生物膜的形成。最低生物膜抑制浓度(MBIC90)是指药物有效抑制90%生物膜形成的最低浓度。使用单因素ANOVA分析数据以检测显著性差异,并使用GraphPad Prism 9计算标准偏差(SD)。所有测定一式三份进行。
纹藤壶(A.amphitrite)幼虫和草苔虫(B.neritina)幼虫的收集、培养和抗幼虫沉积的生物测定
在香港白沙湾码头(22°38'N,114°28'E)收集纹藤壶成虫,在黑暗中保持24小时后,使用光源刺激幼虫释放。在1小时内,收集幼虫并在经0.22μm过滤的海水中培养,每天喂食1×106细胞mL-1的纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)Schutt,直到它们长成介虫(cyprid),并将介虫用于抗幼虫沉积的生物测定。在香港白石角(22°43′N,114°20′E)的一个养鱼场收集草苔虫成虫,并在使用前在流动的海水中保存不超过7天。在如Xu et al.,2010所述的生物测定前30分钟内释放幼虫。生物测定在24孔聚苯乙烯组织培养板中进行,每个孔中有15-20只幼虫。对过滤天然海水(FSW)中0.1%的DMSO和浓度为0.625、1.25、2.5、5、10、20和40μg mL-1的白真菌素进行测试,一式三份。在每个孔中,含有15-20幼虫的1mLFSW和1mL不同浓度的白真菌素溶液。将组织培养板在25℃保持48小时(草苔虫幼虫保持3小时)。FSW中0.1%DMSO的孔用作阴性对照,丁烯内酯用作阳性对照。在奥林巴斯光学显微镜(奥林巴斯公司,东京,日本)下计数附着的、游泳的和死亡的幼虫的数量。沉积率计算为沉积的幼虫与每孔幼虫总数的比值,死亡率为死亡或丢失的幼虫与每孔幼虫总数的比值。测定了每种化合物的半数最大有效浓度(EC50)和半数致死浓度(LC50),并用LC50/EC50的比值来评价防污剂的毒性。实验一式三份进行。通过单因素ANOVA分析数据以检测幼虫沉积的显著性差异,并通过GraphPad Prism 9计算SD。
激活剂过表达的冠霉素链霉菌(S.chrestomyceticus)的构建和白真菌素类化合物生产的分析
由如下方式构建过表达质粒:使用表2中列出的引物,以冠霉素链霉菌的基因组DNA为模板,通过PCR获得基因序列。将每个PCR扩增子连接到用NdeI和SpeI消化的线性载体pPWW50a中。通过DNA测序确认所有构建的质粒,将其引入大肠杆菌ET12567/pUZ8002,并按照之前的方案(Gust et al.,2003)与冠霉素链霉菌BCC 24770接合。收集接合体并在含有安普霉素(apramycin)和萘啶酸(nalidixic acid)的选择性板上生长。3天后,使用Chelex100树脂(Bio-Rad,Hercules,USA)提取总DNA,并对阳性接合体进行PCR扩增(使用引物pPWW50a-check-F和pPWW50a-check-R)。将冠霉素链霉菌24770/pPWW-alb22和冠霉素链霉菌24770/pPWW-alb45的阳性接合体和亲本菌株冠霉素链霉菌24770/pPWW接种到含有安普霉素(50μgmL-1)的种子培养基(4g L-1葡萄糖、4g L-1酵母提取物、10g L-1麦芽提取物,并将pH值调节至7.0-7.4),并使其生长2天。之后,将1%的预培养物加入至含有或不含安普霉素(50μg mL-1)的发酵培养基中(4g L-1葡萄糖、4g L-1酵母提取物、10g L-1麦芽提取物,并将pH值调节至7.0-7.4),并使其在250mL摇瓶中生长9天。通过HPLC进一步分析发酵产物。根据标准曲线(如图3D)计算白真菌素的产量。在发酵的第三天结束时收集冠霉素链霉菌样品,并使用高压灭菌水清洗,并立即在-80℃下冷冻。按照制造商的说明,使用Trizol试剂(Invitrogen,Waltham,USA)制备RNA样品。使用HiScript III All-in-one RT SuperMixPerfect for qRT-PCR试剂盒(Vazyme,南京,中国)去除基因组DNA并合成cDNA。使用480SYBR Green I Master(Roche,Basel,Switzerland)在RocheDiagnostics LightCycler 480Instrument II Real-time PCR System上进行qRT-PCR分析。使用的引物列于表2中。GAPHD基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)用作内部对照,将alb22和alb45的相对表达水平标准化为GAPDH。每个转录物一式三份进行,并在qPR-PCR中重复三个独立的生物学重复。使用2-ΔΔCT方法(Livak and Schmittgen,2001)计算每个基因表达水平的相对倍数变化。使用Student’s t检验计算p值。
表2:引物序列
基于白真菌素的涂料制备和释放速率测量
分离、纯化并使用HPLC分析约1g白真菌素类化合物以保证纯度超过95%。可水解且可降解的基于白真菌素的共聚物涂料的制备方法如下:通过自由基开环聚合合成甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM)共聚物(PMSM0)(Zhou et al.,2015)。对于5重量%的基于白真菌素的涂料,将0.95克的PMSM0和0.05克白真菌素溶解于二甲苯和四氢呋喃(体积比为1:2)中,并在室温下剧烈混合。然后将溶液涂在PVC板上(4×7cm2)并在室温下干燥7天(Ma et al.,2017)。使用相同的程序制备具有不同白真菌素浓度(10重量%和15重量%)的其他涂料。使用仅PMSM0的涂层用作阳性对照。每个浓度都准备了三个生物学重复。现场测试于2021年3月至2021年4月在香港榕树澳(北纬22°24',东经114°21')的一个渔场进行,该渔场终年结垢严重。将PVC板浸入海水中0.5米深处保持2个月,取回后用海水冲洗,并拍照。污着生物覆盖的面积由Image J(Fiji-2.2.0)(Schindelin,et al.,2012)计算。单因素ANOVA分析用于比较白真菌素涂覆的板和对照板。通过HPLC测量化合物浓度来确定静态条件下白真菌素的释放速率。将基于白真菌素的涂料涂在PVC板(20×75mm2)上并浸没在人造海水(ASW)中。7天后,将PVC板转移到装有100mL ASW的各容器中。浸泡24h后,从容器中取出10mL海水,用等体积的乙酸乙酯萃取3次。在SpeedVac真空浓缩器下干燥后,将提取物溶解于100μL甲醇中,然后使用反相系统(Waters 2695)进行HPLC,所述反相系统带有Phenomenex Luna C18色谱柱,并且连接至300nm紫外检测器。确定了白真菌素的独特的UV吸收和保留时间,并从已建立的标准曲线来计算白真菌素的量,所述标准曲线是使用峰面积相对于已知的标准品的量作图获得的。
核酸提取、16S rRNA扩增子测序和分析
用于生物膜形成的现场测试在香港白沙湾码头(北纬22°38',东经114°28')进行。将带有白真菌素/共聚物涂层的玻璃片浸入距海面0.5米的深度保持12天,然后立即运送到实验室进行生物膜提取。使用无菌棉签刮擦生物膜并收集在TE缓冲液(10mM Tris·Cl;0.5mM EDTA)中。将样品以4000rpm离心5分钟,弃去上清液。使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根,北京,中国)提取基因组DNA,并通过BioDrop(Biochrom Ltd,Cambridge,UK)确认质量。使用Illumina双端平台对提取的基因组DNA进行16s rRNA扩增子测序,以在Novogene(中国北京)生成250bp的双端原始读段(Raw PE)。使用微生物生态学社区软件Mothur(Schloss et al.,2019)对六个样品的序列数据进行质量控制和分析。低质量读段(平均质量得分<25)和长度不正确的读段(不短于400bp不超过430bp)、任何不明确的碱基和长于8bp的均聚物均被删除。嵌合序列由Mothur程序包中的Chimera.uchime识别并去除。然后将剩余的高质量序列以97%的相似性聚类到操作分类单元(OUT)中。在进行下游分析之前去除Singleton和doubleton。使用Mothur中的Classify.OUT并用Silver.132数据库进行分类注释。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物(包括所有图和表)以不与本说明书的明确教导相抵触的范围通过引用整体并入本文。
以下是说明实施本发明的步骤的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。除非另有说明,所有百分比均以重量计,所有溶剂混合物比例均以体积计。
实施例1:白真菌素类化合物的结构和生物活性
总共分离出如图1所示的式I-IV四种化合物:即,白真菌素(式I);其去甲氧基产物白真菌素A(式II);其一氯代衍生物氯白真菌素(式III),及其脱氨基衍生物chrestoxanthone A(式IV)。所有这些都是从冠霉素链霉菌(S.chrestomyceticus)BCC24770培养物中大量提取的(Bunyapaiboonsri et al.,2016;She et al.,2021)。如先前报道的,白真菌素类化合物显示出多种生物活性,例如针对“ESKAPE病原体”的潜在抗生素作用,针对病原真菌的抗真菌活性,以及针对不同癌细胞系的抗肿瘤活性(Bunyapaiboonsriet al.,2016;She et al.,2021)。白真菌素类化合物对革兰氏阳性细菌的强抗生素作用与肼基的存在有关(She et al.,2021),并且其作用方式被确定为细菌转糖基酶的抑制剂(Wuet al.,2018)。此外,白真菌素A通过诱导细胞凋亡来抑制癌细胞增殖(She et al.,2021)。由于其突出和多样化的生物活性,白真菌素类化合物在生物膜控制方面具有巨大潜力,并因此在抗微生物污着活性方面也具有巨大潜力。
实施例2:白真菌素的抗生物膜活性
使用6种具有代表性的海洋细菌评估了式I-IV的白真菌素类化合物的抗生物膜活性,这些细菌或从潮下带海洋生物膜中分离出来,或被描述为浸没表面的主导的主要定殖菌,包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、微球菌(Micrococcus sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、庞蒂亚克亚硫酸盐杆菌(Sulfitobacter pontiacus)、海绵假单胞菌(Pseudomonas pachastrellae)和海雪嗜冷杆菌(Psychrobacter nivimaris);以及病原菌,包括MRSA ATCC 43300、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)B-65371、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)NRRL-B-425和大肠杆菌k12。测试结果如下表3-表7和图2A-2E所示。
表3:式I-IV化合物对革兰氏阳性海洋细菌的生物膜抑制试验。结果表示为最小生物膜抑制浓度(MBIC),单位为ng mL-1。
表4:式I-IV化合物对革兰氏阴性海洋细菌的生物膜抑制试验。结果表示为最小生物膜抑制浓度(MBIC),单位为μg mL-1。
表5:式I-IV化合物对革兰氏阳性海洋细菌的细菌生长抑制试验。结果表示为最小抑制浓度(MIC),单位为ng mL-1。
表6:式I-IV化合物对革兰氏阴性海洋细菌的细菌生长抑制试验。结果表示为最小抑制浓度(MIC),单位为μg mL-1。
表7:式I、II和IV化合物对致病菌的生物膜抑制试验。结果表示为最小生物膜抑制浓度(MBIC),单位为μg mL-1。
由表3和表4可知,式I-IV化合物能够强烈地阻止所有选定菌株的生物膜形成。式I-IV化合物对革兰氏阳性细菌菌株的生物膜形成的MBIC90值处于低的微摩尔范围内(参见表3)。具体地说,由图2A-2E可知,浓度分别在0.03μg mL-1至0.5μg mL-1、0.06μg mL-1至0.5μg mL-1以及1.25ng mL-1至0.2μg mL-1范围的式I-IV化合物几乎完全抑制(>90%)金黄色葡萄球菌、微球菌和葡萄球菌的生物膜形成。对于革兰氏阴性细菌菌株,式I和式II化合物对庞蒂亚克亚硫酸盐杆菌和海绵假单胞菌表现出很强的抗生物膜活性,MBIC90范围为0.02μgmL-1至0.50μg mL-1,而式III和式IV化合物对这些细菌仅表现出中等活性,其MBIC90范围为10μg mL-1至20μg mL-1(参见表4)。然而,所有这些化合物在低于20μg mL-1的浓度下对海雪嗜冷杆菌均没有明显的生物膜抑制作用。此外,式I-IV化合物表现出针对革兰氏阳性细菌菌株的抗菌活性,MIC范围为0.8ng mL-1至50ng mL-1,同时还表现出针对革兰氏阴性细菌菌株的抗菌活性,MIC范围为0.008μg mL-1至20μgmL-1(参见表5和表6)。这些结果表明,白真菌素对生物膜的抑制可能是由于对细菌生长的抑制。由于式I-IV化合物在之前的研究中表现出对病原菌的抗菌活性,因此在本研究中评估了它们的抗生物膜活性。由表7的结果可知,式I和式II化合物在低的微摩尔范围内对所有细菌(尤其是MRSA)均具有强的抗生物膜活性,式IV化合物在0.13μg mL-1至2.5μg mL-1范围对MRSA和鲍曼不动杆菌具有强的抗生物膜活性。与抗菌结果一致,含有肼基但不含氯代环的式I和式II化合物表现出比式III和式IV化合物更强的抗生物膜活性。根据初步构效关系分析,与式I化合物相比,式II化合物的环F中存在羟基而非甲氧基使该化合物对革兰氏阴性细菌具有更高的抗生物膜活性。
实施例3:白真菌素类化合物对纹藤壶和草苔虫幼虫的防污活性
接着,评估了式I-IV的白真菌素类化合物对纹藤壶和草苔虫的幼虫沉积的抗巨生物污着的活性,结果如图3A-3G和表8所示。结果表明,在孵育48h后,式I和式II化合物处理的纹藤壶的沉积率显著低于对照组(FSW中0.1%DMSO),而式III和式IV化合物与FSW对照组相比并没有引起显著性差异(参见图3A、3B和3D)。用2.5μg mL-1的式I化合物处理的纹藤壶的幼虫沉积率为33%(±5.3%),用20μg mL-1的式II化合物处理纹藤壶的幼虫沉积率为17%(±12.7%),两者均显著低于FSW对照组。对于纹藤壶,式I化合物表现出强抑制作用,EC50为1.6μg mL-1,式II化合物表现出中等抑制作用,EC50为12.2μg mL-1(参见图3C和表8)。在这些测试的化合物中,式I化合物对纹藤壶幼虫沉积的防污活性与丁烯内酯(根据EC50值,该物质是一种高效的防污化合物)的防污活性相当。特别是,高达40μg mL-1的白真菌素对纹藤壶具有非常低的致死效应(参见图3A-3B)。同时,式I化合物对草苔虫幼虫的防污活性是浓度依赖性的,并且在本研究中测试的最高浓度下也没有显示出显著的致死作用(参见图3E-3G)。用2.5μg mL-1的式I化合物处理有44%(±9.0%)的草苔虫幼虫沉积,显著低于FSW对照组(参见图3E-3F)。
表8:式I-IV化合物针对纹藤壶和草苔虫的幼虫的EC50和LC50
实施例4:候选激活基因的过表达
为了提高白真菌素的产量,在冠霉素链霉菌BCC24770中操纵转录调节子alb22和alb45。alb22和alb45分别编码转录增强子A(TenA)家族调节剂和链霉菌抗生素调节蛋白(SARP)家族调节剂,被确定为白真菌素生物合成的正调节子(She et al.,2021)。如图4A和4B所示,基本上,将这两个正调节子分别克隆到pPWW50a质粒中,并在强组成型启动子ermE*p的控制下启动它们的表达。将得到的构建体引入野生型冠霉素链霉菌BCC24770以产生过表达菌株24770/pPWW-alb22和24770/pPWW-alb45。带有空质粒的BCC24770用作阴性对照(24770/pPWW)。由图5C和图5D的qRT-PCR分析显示,与亲本菌株相比,alb22和alb45过表达菌株中两个调节基因的转录水平分别增加了0.6倍和3.0倍。这一发现进一步支持了这两个调控基因被成功地过表达。同时,使用高效液相色谱法分析过表达菌株和亲本菌株的发酵结果,结果表明,与亲本菌株相比,alb22和alb45的过表达在5天后分别使白真菌素产量提高了37%和91%。值得注意的是,在培养7天后,24770/pPWW-alb22菌株和24770/pPWW-alb45菌株在平行发酵中分别产生115±9.4和153±22.7mg L-1的白真菌素,产量分别比亲本菌株高0.7倍和1.3倍(参见图5A和5B)。由于白真菌素是一种黄色粉末,其产量可以通过粗提物的颜色来表示。如图4C所示,溶解在甲醇中的24770/pPWW-alb22和24770/pPWW-alb45粗提物的颜色显然比亲本菌株的颜色深。此外,调节基因的过表达对冠霉素链霉菌的生长没有显著影响。这些发现表明,24770/pPWW-alb45是生产白真菌素的优选的转基因菌株。
实施例5:白真菌素和可降解共聚物涂料在海洋现场试验中的防污效果
在防污筛选中,式I的白真菌素显示出显著的抗微生物污着和抗巨生物污着活性,并且对目标生物的毒性低,同时,大规模发酵白真菌素高产菌株可以在实验室条件下很容易地以低成本提供克量级的化合物。因此,在现场研究中评估了白真菌素的防污效果。从7升冠霉素链霉菌24770/pPWW-alb45的细菌培养物中获得1g纯的式I的白真菌素,然后将其掺入不同的防污涂料中。然后将这些涂料涂在PVC板上,并将其在海洋环境中浸泡60天。值得注意的是,如图6A所示,在1个月后,在全部三种浓度(5重量%、10重量%和15重量%)下,几乎没有污着巨生物沉积在涂有白真菌素的PVC板的表面上,而阴性对照组的表面则被草苔虫和多毛类管虫(H.elegans)(在热带和亚热带地区分布最广)污着。如图6A-6C所示,在海水中浸泡2个月后,对照组中PVC板的96%的表面被污着巨生物覆盖,而涂有白真菌素组中的污着区域明显更小。
在35天内测量了白真菌素从含有不同浓度白真菌素的涂层中释放到人造海水中的速率。总体而言,如图6D所示,释放速率在整个观察期间都较低,并且与白真菌素浓度呈正相关。15重量%、10重量%和5重量%的白真菌素的最高释放率在第一天分别达到1.4μg天-1cm-2、1.1μg天-1cm-2和0.86μg天-1cm-2,并且以时间相关的方式下降至约0.08μg天-1cm-2。
实施例6:白真菌素和可降解共聚物涂层引起的微生物群落结构的变化
进一步研究了现场中白真菌素和可降解共聚物涂层上生物膜的发展。在12天的观察中,对照组中的板表面的生物膜快速生长,该生物膜由多种微生物组成,而涂覆有5重量%白真菌素的涂层的板表面上的微生物的多样性显著降低。从6个生物膜样本中分析了总共1,687,617个测序读段,这些生物膜中的微生物被分为31个门。超过12天的生物膜在此被称为“老生物膜”(12-20天的生物膜)(Chung et al.,2010),如图7A所示,主要为变形菌门(Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和放线菌门(Actinobacteria)。如图7A-7C所示,阿尔法多样性用于指示基于白真菌素的涂层组和对照组中的微生物群落多样性。Shannon-Weiner多样性指数和实测OTU的结果在基于白真菌素的涂层组中显著降低,表明微生物群落结构发生了改变。微生物群落的丰富度和多样性也低于对照组。
应当理解,本文所描述的实施例和实施方案仅用于说明目的,并且本领域的技术人员可以据此提出的各种修改或变化,这些修改和变化也包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。此外,本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他要素或限制(单独或以任何组合)或任何其他发明或其实施方案组合,并且所有此类组合包括在本发明的范围内,但不限于此。参考文献:
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Claims (21)
2.根据权利要求1所述的防污组合物,其中,所述化合物是经纯化的化合物本身,或者是含有所述化合物的细菌如冠霉素链霉菌的提取物形式;优选地,所述冠霉素链霉菌为经包含转录调节子alb22、alb45或其组合的DNA载体如质粒转染以过表达所述化合物的工程化冠霉素链霉菌。
3.根据权利要求1或2所述的防污组合物,其中,所述化合物占所述组合物以重量计的约0.1%至约50%、优选约1%至约15%、更优选1%至10%、最优选5%至10%。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的防污组合物,其中,所述涂料组分包括:聚合物;以及任选的粘合剂、颜料、溶剂、缓冲剂或其任意组合。
5.根据权利要求4所述的防污组合物,其中,所述聚合物包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM),优选地,所述聚合物为甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM)的共聚物。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,所述化合物是经纯化的化合物本身,或者是含有所述化合物的细菌如冠霉素链霉菌的提取物形式;优选地,所述冠霉素链霉菌为经包含转录调节子alb22、alb45或其组合的DNA载体如质粒转染以过表达所述化合物的工程化冠霉素链霉菌。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其中,所述化合物占所述组合物以重量计的约0.1%至约50%、优选约1%至约15%、更优选1%至10%、最优选5%至10%。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法,其中,所述组合物还包含涂料组分,例如聚合物,以及任选的粘合剂、颜料、溶剂、缓冲剂或其任意组合。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,所述聚合物包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM),优选地,所述聚合物为甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM)的共聚物。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的方法,其中,所述物体或表面浸于水中或是医学设备,例如所述浸于水中的物体或表面是船舶、船体、管道、管线、针、泵、螺旋桨、浮标或绳索。
12.根据权利要求6-11中任一项所述的方法,其中,所述组合物在施用于所述物体或表面后,所述化合物以约0.1μg天-1cm-2至约5μg天-1cm-2的速率从所述组合物中释放。
13.根据权利要求6-12中任一项所述的方法,其中,所述方法进一步抑制生物膜形成。
15.根据权利要求14所述的方法,其中,所述化合物是经纯化的化合物本身,或者是含有所述化合物的细菌如冠霉素链霉菌的提取物形式;优选地,所述冠霉素链霉菌为经包含转录调节子alb22、alb45或其组合的DNA载体如质粒转染以过表达所述化合物的工程化冠霉素链霉菌。
16.根据权利要求14或15所述的方法,其中,所述化合物占所述组合物以重量计的约0.1%至约50%、优选约1%至约15%、更优选1%至10%、最优选5%至10%。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法,其中,所述组合物还包含涂料组分,例如聚合物,以及任选的粘合剂、颜料、溶剂、缓冲剂或其任意组合。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述聚合物包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM),优选地,所述聚合物为甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸三丁基甲硅烷酯(TBSM)的共聚物。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的方法,其中,所述物体或表面浸于水中或是医学设备,例如所述浸于水中的物体或表面是船舶、船体、管道、管线、针、泵、螺旋桨、浮标或绳索。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法,其中,所述组合物在施用于所述物体或表面后,所述化合物以约0.1μg天-1cm-2至约5μg天-1cm-2的速率从所述组合物中释放。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的方法,其中,所述物体或表面的性能和/或寿命通过抑制污着生物污着来改善;优选地,所述方法进一步抑制污着微生物形成生物膜。
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