KR101344075B1 - 디케토피페라진을 포함하는 친환경 방오제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 디케토피페라진(Diketopiperazines)계 화합물을 포함하는 친환경 방오제에 관한 것으로서, 포자 부착방지 및 포자 발아억제 효능을 가지며, 독성을 갖는 화학제품에 의한 환경오염을 방지할 수 있는 디케토피페라진(Diketopiperazines)계 화합물 bmDKP를 포함하는 친환경 방오제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 친환경 방오제는 디케토피페라진(diketopiperazines)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 디케토피페라진(diketopiperazines)은 해양생물 스트렙토마이세스 파라에콕스 291-11의 추출물로부터 분리되는 것을 특징으로 한다.상기 디케토피페라진계 화합물은 하기의 화학식을 갖는 bmDKP(1) 또는 imDKP(2)인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 해양 구조물 등에 각종 해양생물의 부착 및 발아를 효과적으로 저해할 수 있으며, 종래의 독성이 있는 화학제품의 사용으로 인한 자연 생태계의 파괴 및 해양환경 오염을 방지할 수 있다.
Figure 112012030727512-pat00003

Description

디케토피페라진을 포함하는 친환경 방오제{ECO-FRIENDLY ANTI-FOULING AGENT CONTAINING DIKETOPIPERAZINE}
본 발명은 디케토피페라진(Diketopiperazines)을 포함하는 친환경 방오제에 관한 것으로서, 포자 부착방지 및 포자 발아억제 효능을 가지며, 독성을 갖는 화학제품에 의한 환경오염을 방지할 수 있는 디케토피페라진(Diketopiperazines)을 포함하는 친환경 방오제에 관한 것이다.
부착성 생물은 선박, 어망 및 양식시설 등의 인공 구조물에 심각한 피해를 야기시킨다. 대부분의 방오 기술은 Irgarol, chlorothalonil 및 diuron 와 같은 방오제를 포함하는 코팅에 의존한다. 그러나, 이러한 방오제들은 유해하며, 수중에서 이러한 방오제가 탐지되고, 다양한 수중 환경에서 이들의 침전 물질이 탐지되고 있다는 많은 연구 결과들이 보고되고 있다(Voulvoulis N, Hdb . Env . Chem ., 5,155-170 (2006)). 환경적으로 파괴없이 오래 사용가능한 방오제를 개발하기 위해, 최근 연구들은 미생물의 습성, 바이오필름 형성 및 대사산물의 생산에 초점을 두고 있으며, 이들은 해양 무척추생물의 유충(larva)의 부착 및 아가 포자의 부착을 방지할 수 있다.
규조의 경우. Daume et al .은 단일 특이적인 규조 바이오필름에 의해 Haliotis rubra(전복) 부착이 저해됨을 보고하고 있다(Daume S, et al.. Appl . Phycol ., 12, 479-488 (2000)). Thalassiosira rotula 로부터 분리한 불포화알데히드는 Sphaechinus granularis, Crassostrea gigas, and Calanus helgolandicus.에서 유생 발달 및 발생과정(morphogenesis)을 방해한다(Adolph S, et al.. Exp . Biol ., 207, 2935 - 2946 (2004)). Achnantes parvula 및 Nizchia frustulum 의 추출액은 각각 Semibalanus balanoides의 부착 및 attachment of B. neritina 부착을 방해한다(Dahms H-U, et al... Exp . Mar . Biol . Ecol ., 313, 191-209 (2004))) 이는 Pseudoalteromonas sp.의 밀도를 증가시키는 것과 음의 관계에 있다.
A Pseudoalteromonas sp. extacts 추출물은 만각류, Balamus amphitrite 의 cyprid 부착을 방해하며, Ulva lactuca, Chatonella sp., Gymnodium sp., Nitzschia paleacea 및 Navicula sp.에서의 반아가 활성(antiagal activity)을 나타낸다. lteromonas sp. KK10304 에서 분리한 유비퀴논과 Acinetobacter sp.에서 분리한 6-브로모인돌-3-카브알데하이드(6-bromoindole-3-carbaldehyde)는 만각류 Balamus amphitrite .의 부착을 방해한다(Kon-ya K, S et al., Cell . Mol . Lif . Sci., 51,153-155 (1995)).
또한, Halomonas marina , Vibrio campbelli 및 Micrococcus sp.도 만각류 Balamus amphitrite .의 부착을 방해한다. 그러나, 제한된 일부의 미생물만이 방오 활성을 나타낸 것으로 보고되고 있다. 더욱이, 대부분의 방오 대사 산물은 이러한 미생물로부터 보고되고 있지는 않으며, 적은 수의 미생물만이 주로 알려지지 않은 고분자 카보하이드레이트(carbohydrates) 물질로 보고되고 있다.
해양생물 악티노마이세스(actinomyces)은 중요한 새로운 화학 자원이며, 흥미로운 바이오활성을 가진 많은 분자가 해양생물 악티노마이세스(actinomyces)으로부터 분리되고 있다. 악티노마이세스(actinomyces)은 구조적으로 다양한 2차 화합물을 생산하는 놀라운 능력을 가지고 있으며 이는 종종 새로운 약학적 화합물 및 산업 화합물을 개발하는데 사용된다. 항생제나 항암제 개발에서의 많은 성공에도 불구하고, 해양 악티노마이세스(actinomyces)은 방오제의 개발에 있어서, 거의 주목을 받지 못하고 있다.
따라서, 본 발명자는 독성을 갖는 화합물질로 구성된 방오제를 대체하기 위해 해양 생물 악티노마이세스(actinomyces)로부터 친환경 방오제를 개발하고자 하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 해양 생물 악티노마이세스(actinomyces)의 배양액의 추출물로부터 방오능을 가진 물질을 분리하여 해양부착 생물에 대해서 탁월한 방오 효과를 발휘하는 신규 친환경성 방오제를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명에 따른 친환경 방오제는 디케토피페라진(diketopiperazines)계 화합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 디케토피페라진(diketopiperazines)계 화합물은 해양생물 스트렙토마이세스 파라에콕스 291-11의 추출물로부터 분리되는 것을 특징으로 한다.
상기 디케토피페라진계 화합물은 하기의 화학식을 갖는 bmDKP(1) 또는 imDKP(2)인 것을 특징으로 한다.
Figure 112012030727512-pat00001
본 발명은 S. Praecox 291-11로부터 추출한 diketopiperazine을 포함하는 친환경 방오제로서, 해양 구조물 등에 각종 해양생물의 부착 및 발아를 효과적으로 저해할 수 있으며, 종래의 독성이 있는 화학제품의 사용으로 인한 자연 생태계의 파괴 및 해양환경 오염을 방지할 수 있다.
도 1은 다른 8개의 배지에서 S. Praecox 291-11의 방오 화합물 생성을 나타낸 것으로서, 생성된 화합물은 7일 후에 분석되었다. 모든 실험은 5번 수행되었다.
도 2는 균주 291-11에 의한 세포 성장 및 diketopiperazine 의 생성을 나타낸 것이다. 세포는 25℃, TBFeC broth medium에서 배양되었다. 세포성장은 TBFeC 고체 배지에서 측정되었고, CFU/mL (●) bmDKP (□) and imDKP (△)로 표현되었으며, 각 화합물의 생성은 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)의 피크 영역을 이용하여 측정되었다.
도 3은 방오 화합물을 분리하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 프로파일을 나타낸 것이다. 실리카겔 크로마토그래피로부터 추출된 분획구 6은 역상(reverse-phase) HPLC로 분리하였으며, 2 mL/min 유속에서 100분간 25% 아세토니트릴의 등용매 유속(isocratic flow)으로 분리하였다. HPLC 프로파일에서 피크는: (1), (6S, 3S)-6-benzyl-3-methyl-2,5-diketopiperazine; (2), (6S, 3S)-6-isobutyl-3-methly-2,5-diketopiperazine 로 나타났다.
도 4는 해양 생물 Streptomycetes praecox 291-11의 배양 추출물로부터 분리된 diketopiperazines의 구조를 나타낸 것이다. (1): (6S, 3S)-6-benzyl-3-methyl-2,5-diketopiperazine, (2): (6S, 3S)-6-isobutyl-3-methly-2,5-diketopipe razine.
해양 악티노마이세스(actinomyces)은 16s rDNA 서열 분석에 의해 육상의 박테리아와 밀접하게 관련된 절대 해양 분류군(obligate marine taxa)이다. Streptomyces 속은 세포 독성을 갖는 악티노퓨라논(cytotoxic actinofuranones) 및 아자메론(azamerone)을 포함하는 다양한 생물학 활성을 갖는 물질을 생산하는 능력으로 인해 주목을 받아왔다.
본 발명자들은 해양생물로부터 유도된 스트렙토다이세스(Streptomyces)에 초점을 맞추어, 방오제를 개발하기 위해 이들의 대사산물을 사용하였다. 주된 가장 유력한 S. praecox 291-11로부터 방오 화합물의 측정과 함께 주요 방오 활성의 화합물을 분리하고 동정하였다. 이 균주로부터의 화합물 생산은 또한 8개의 다른 배지를 이용하여, 비교하였다.
본 발명에 따른 친환경 방오제는 디케토피페라진(diketopiperazines)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 디케토피페라진(diketopiperazines)은 해양생물 스트렙토마이세스 파라에콕스 291-11의 추출물로부터 분리되는 것을 특징으로 한다.
이하, 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
[ 실시예 1] 해양 악티노마이세스( actinomycetes ) 배양 및 추출
본 발명자들은 해안가(강릉, 포항, 울산, 부산, 통영 및 완도)를 따라 수심 10m에서 채집한 해초와 침전물에서 해양 악티노마이세스(actinomycetes)을 분리하였다. 해초에서 분리한 87 균주 및 해양 침전물에서 분리한 98 균주를 포함 총 185 균주를 배양하여, 방오 활성을 살펴보았다. 상기 균주들은 표 1의 TCG 발효 배지 500 mL 를 포함하는 1L 플라스크에서 25℃, 7일간, 215rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, 20 g/L Amberlite XAD-7 레진(Fluka, Sigma, St. Louis, MO, USA)이 상기 배양에게 첨가되었고, 6시간 동안 슬러리를 흔들어 주었다. 레진은 거즈를 통해 회수하였고, 염을 제거하기 위해 증류수 1L로 세척하고, 아세톤으로 추출하여 초기 추출액을 생성하였다. 1L 배양에서 85 - 120 mg의 추출액을 얻어, 방오 활성을 조사하였다. 추가 실험을 위하여 가장 활성이 좋은 291-11 균주가 선택되었다.
pH 8.0, 1 L 해수에서 악티노마이세스에 사용된 broth media 조성(g/L)
배지 트립톤 Casitone Glucose Starch Yeast
Extract		 Peptone CaCO3 Fe2(SO4)3 4H2O KBr
TCG
TCGC
TBFe		 3
3
3		 5
5
5		 4
4
4






1

0.04

0.1
TBFeC 3 5 4 1 0.04 0.1
A1 10 4 2
A1C 10 4 2 1
A1BFe 10 4 2 0.04 0.1
A1BFeC 10 4 2 1 0.04 0.1
[ 실시예 2] 유주자 부착 저해 분석
2010년 7월에 서해안 안면도에서 부착성 대형조류인 Ulva pertusa 를 채취하였다. 포자 방출 방식은 Cho et al ..의 방식에 따랐다. 방출된 포자는 부착 분석에 사용되었다. 슬라이드 글라스(7.5 × 2.5 cm)를 12시간 동안 10% HCl에서 세척하고, for U. pertusa 포자 부착에 사용하기 전에 12시간 증류수에 헹구었다. 3개의 슬라이드 글라스를 100 mL 비이커에 수직으로 두고, 유주자 (7 × 106 cells)를 비이커 75 mL 바닷물에 배포하였다. 각각의 박테리아 추출물(또는 화합물)은 DMSO에서 용해되어 비이커에 혼합시켰다. 포자가 부착되도록 하기 위해 비이커를 싸서, 20℃에서 6시간 동안 어두운 곳에 두었다. 이는 U. pertusa 포자가 해수 20℃에서 6시간 내에 정지기(staionay phase)를 가지기 때문이다.21) 각각의 글라스에 (4 × 2.5 cm) 에 부착된 포자의 수를 세서, 상대값 : S/C ×100 (S는 슬라이드 글라스에 부착된 포자수, C는 해수 대조군 배양에서 부착된 포자수)을 측정하였다.
[ 실시예 3] 규조 저해 분석
부경대학교 한국 해양 미세조류 배양센터에서 생물 부착 규조인 Navicula annexa를 분양받았다. 규조는 f/2 medium22 )에서 20℃, 70 μmole/m2/s 광도에서 12:12 (명기:암기)사이클에서, 50 rpm 진탕 배양하였다. 상술한 동일한 슬라이드 글라스 방법이 저해 분석에 사용되었다. 2.5 ×104 cells/ mL의 초기 세포 밀도는 75 mL 의 f/2 medium에 배분하였고, 박테리아 추출물을 추가하였다. 3일 후, 각 슬라이드(4 ×2.5 cm)에 부착된 규조 세포의 수를 측정하여, 상대값(S/C ×100)을 측정하였다.
[ 실시예 4] 방오독성율 측정
방오독성율 LC50/EC50 은 그 독성에 대한 화합물의 방오 효율을 측정하기 위해 사용되었다. LC50 는 50% 부착 미생물에 대한 화합물의 치사량이고, EC50는 부착 미생물의 50% 저해에 대한 농도이다. 분리된 화합물은 DMSO에서 용해되었고, 저해 또는 치사 효과를 없애기 위한 농도도 만들기 위해 일련의 2배 희석이 진행되었다. 농도-반응 곡선을 구해, 각 화합물에 대해 선 그래프를 완성하였다. 상업적인 방오 화합물인 Irgarol과 방오 활성을 비교하였다.
[ 실시예 5] 해양 박테리아의 동정
방오 화합물을 생산하는 Streptomyces 균주를 동정하기 위해, High Pure PCR Template Preparation kit (Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 균주 291-11의 염색체 DNA 를 분리하였다. 16S rDNA 는 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 및 1492R universal primers (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 및 PCR premix (Bioneer, Seoul, Korea)로 증폭된 중합효소 연쇄반응(PCR)이다.
PCR running 조건은 다음과 같다: 5분간, 94℃에서 예비-변성(pre-denaturation) 후, 94℃, 30초간 변성(denaturation) 30 사이클, 55℃, 30초간 어닐링, 72℃, 30초간 연장(extension), 72℃, 30초간 연장(elongation)을 수행한다. 아가로즈 겔 전기영동 후, PCR 산물은 GeneAll Gel SV 키트(Generalbiosystem, Seoul, Korea)로 정제되고, 정제된 PCR 산물은 TOPO-TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 복제되었다. 플라스미드는 GeneAll Plasmid SV 키트 (Generalbiosystem, Seoul, Korea)로 분리되었고, ABI3730XL 시퀀서(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 Big Dye Terminator Cycle DNA 시퀀싱 키트 (ABI PRISM PE, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 시퀀싱되었다. 16S ribosomal DNA 유전자 시퀀스는 BLASTN 프로그램을 이용하여, NCBI 유전자 데이터베이스와 비교하였다.
[ 실시예 6] 배양 배지 연구 및 스케일 업 배양
균주 291-11은 화합물 생산을 최대화하기 위해 8가지 다양한 배지에서 배양되었다. 배지 조성은 표 1에 나타내었다. 상기 배양은 7일간 25℃에서 발효배지 1L를 포함하는 2.8L Fernbach 플라스크에서 수행되었다. 박테리아 대사산물이 8가지 다른 배지에서 추출되었으며, 전자스프레이 이온화 양성 모드(electrospray ionization positive mode)를 갖춘 액체 크로마토그래피 질량 분석기(LC-MS)-2020 (Shimazu, Kyoto, Japan)로 분석되었다. 추출물은 유속 0.5 mL/min에서 reversed-phase Luna C8 column (4.6 mm i.d.×10 cm, 5㎛; Phenomenex, Torrance, CA, USA)으로 분리하였다. 이동상(mobile phase)은 아세토니트릴(acetonitrile)과 물 용매 시스템(water solvent systems)으로 구성된다. 희석은 30분에 걸쳐, 10-100% 농도변화를 갖는 아세토니트릴(acetonitrile)로 수행하였다. 실험은 각각의 독립적 분석으로 적어도 3번 이상 반복되었다. 실험구와 대조구 사이의 차이는 일원배치 분산분석(α= 0.05)에 의한 차이로 실험하였다.
스케일-업 배양(scale-up culture)을 위해, 균주 291-11은 25℃, 1 L의 TBFeC broth medium를 포함하며 215 rpm에서 진탕 배양한 10 레플리케이트 2.8 L Fernbach 플라스크에서 배양하였다. 세포 성장 및 화합물 생성은 9일 동안 매 12시간 마다 측정하였다. 세포 성장은 고체 TCG 배지의 단위면적당 콜로니의 수(CFU)로 측정하였다. 상술한 방법과 동일한 방법을 사용하여, LC-MS에 의해 목표 화합물의 생성을 모니터하였다. 20mL 배양 배지의 부분표본(aliquots)을 수거하여 에틸 아세테이트로 추출하여 분석하였다.
[ 실시예 7] 디케토피페라진 분리 및 동정
균주 291-11의 초기 추출물은 규조토(Celite)에서 흡착하였고 실리카겔 플래시 컬럼(100g ; 70-230 메쉬)에서 분석하였으며, 이는 헥산/이킬아세테이트와 에틸아세테이트/메탄올의 농도 구간별 혼합물로 희석하여 9개 분획구를 얻었다. reverse-phased high performance liquid chromatography (HPLC)를 위해 메탄올에서 용해되는 활성을 띄는 분획구를 얻었다. Luna C8 column (10 mm i.d. 10×25 cm, 10 ㎛; Phenomenex)에서 분리하였다. Agilent 1200 gradient LC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 시스템으로 분석하였으며, 220nm 자외선 탐지기로 모니터하였다. 이동상(mobile phase)은 아세토니트릴과 물 용매 시스템(water solvent systems)으로 구성된다. 희석은 100분간 2 mL/min 유속에서 25% 아세토니트릴의 isocratic flow으로 수행되었다.
정제된 화합물은 수소불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)를 갖춘 GC-MS-QP5050A (Shimadzu)로 분석되었고, 데이터 베이스의 스펙트럼 데이타와 비교하였다. HR-FABMS 데이터는 JMS HX 110 tandem mass spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan)으로부터 얻었다. DMSO-d 6 .를 이용하여 JNM-ECP 600 NMR spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan)에서 핵자기공명(NMR) 스펙트라를 얻었다.
[ 실시예 8] 아미노산의 절대 배치( Absolute configuration )
화합물 1 및 2의 아미노산 구성성분의 절대 배치를 결정하기 위해 advanced Marfey method 을 적용하였다. 6 N HCl (0.5 mL)에서 각 화합물(0.5 mg)은 16시간동안 110℃에서 가열되었고, 에시드 하이드로라이세이트(acid hydrolysates)가 건조될 때까지 증발되었다. 잔여물은 H2O 에서 녹을 수 있다(200 ㎕). 반(100 ㎕)이 아세톤에서 50 ㎕의 1% (v/v) 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L- leucinamide (L-FDLA) 용액 (Tokyo Kasei Kogyo, Tokyo, Japan) 및 1 M NaHCO3 (100 ㎕)에 추가되었고, 이후 상기 혼합물은 3분 동안 80℃로 가열되었다. 이를 식힌 후, 2N HCl(50 ㎕)가 추가되고, 아세토니트릴(300 ㎕)로 희석되었다.
FDLA 유도체의 각 용액(10 ㎕)은 50분간 0.01 M TFA를 포함하는 물에 30-50% 아세토니트릴로 유속 0.7mL/min에서 C8 Luna column (4.6 mm ID ×10 cm, 5 ㎛)를 사용하여 positive mode electrospray ionization를 갖춘 LC-MS로 분석되었다. 모든 유도체는 유지 시간에 따라 동정되었고, 분자량은 FDLA 표준과 비교하였다. L-FDLA 유도 표준(derivatized standards)의 유지시간(분)은 L-Ala (25.7 분), L-Phe (31.3 분) 및 L-Val (26.4 분)이다.
[ 실시예 9: 실험 결과] 방오성분 생산 악티노마이세스 ( actinomycetes ) 동정
총 185 균주 중, 해양 침전물에서 분리된 25 균주들 및 해초로부터 분리된 39 균주들은 조추출물에 유주자 부착에 대해 EC50이 20이하를 나타내었다. 16S rDNA 일부 서열에 의한 박테리아 동정을 위해 유주자 부착에 대해 15의 EC50를 나타내는 이들 균주 291-11 중에서 선택되었다. NCBI BLAST 분석에 기초하여 해초 Undaria pinnatifida 근권(rhizosphere)에서 분리된 균주 291-11가 S. praecox (표 2)와 99% 이상의 서열 동일성을 나타내었다. 따라서, 이 균주는 S. praecox 291-11로 명명하였다. 이 균주는 2가지 방오 디케토피페라진인 bmDKP 및 imDKP를 분리하는데 사용되었다.
[ 실시예 10] 스트렙토마이세스에서 방오 화합물 생성
균주 291-11는 TCG 배지를 포함하는 8가지 다른 배지에서 배양되었으며, 방오 화합물을 생산하는 적절한 배양 배지를 동정하기 위해 화합물 생성이 측정되었다. 박테리아 대사산물이 추출되어 LC-MS로 분석되었다. 대사 산물의 무게 비율은 크로마토그래피의 피크에서 측정되었다. 결과적으로, 화합물의 생성은 A1 기반의 배양에서 보다 TCG-기반 배양에서 현저히 높았다. bmDKP의 농도는 TBFeC 배지 (0.48 mg/L)에서 가장 높았고, A1C 배지 (0.10 mg/L)에서 가장 낮았다. imDKP의 농도는 TCGC 배지 (0.42 mg/L)에서 가장 높았고, A1C 배지 (0.19 mg/L)에서 가장 낮았다.
[ 실시예 11] 세포 성장 및 화합물의 생산
균주 291-11의 성장 곡선 및 TBFeC 배지에서 생성된 방오 화합물은 매 12시간 마다 측정되었다(도 2). 균주 291-11은 접종 후 72-132 시간에 제1국면(first phase)을 나타내었다. 제2국면은 132-168시간에 발생하였고, 이후 감소하였다. 이균주는 84시 전후로 2가지 타겟 화합물을 생성하였고, 생성이 세포 성장에 비례하여 증가하였다. 생성된 화합물은 제2국면 말기에 최대가 되었다. bmDKP 생성은 168시간까지 증가하였고, 0.48 mg/L에서 최대였으며, 이후 즉시 감소하였다. imDKP 생성도 168시간에 0.31 mg/L로 최대였으나, 12시간 더 지속되었고, 180 시간 이후 감소하였다. 따라서, 균주 291-11은 1 L의 발효배지를 포함하는 10 레플리케이트의 2.8 L 플라스크에서 배양되었고, 상술한 방법과 동일한 방식을 이용하여 168시간에 추출되었다.
[ 실시예 12] 방오 화합물의 분리
유주자 부착에 대한 바이오 에세이-가이드 분리 이후에, 추출물(1.2 g)은 실리카 겔 컬럼으로 분획화되었고, 활성 분획구(97mg)인 분획구 6은 에틸 아세테이트: 메탄올 (4 : 1, v/v)로 분리되었으며, 방오활성 EC50가 13이었다. 상기 분획구는 역상-HPLC로 더 분리하였다. HPLC로부터 6개의 피크가 각각 8, 18, 39, 47, 65 및 78분에 생성되었다. 활성 화합물은 39분(화합물 2), 78분(화합물 1)에 분리하였다(도 3). 화합물(1)인 bmDKP는 10L 배양으로부터 0.4% 수득하여 4.8 mg이었으며, EC50는 2.2를 나타내었다. 화합물(2), imDKP는 0.25% 수득하여 3.1 mg이었으며, EC50는 3.1을 나타내었다. 8분 및 28분에 분리된 피크는 EC50 300 이하의 매우 약한 활성을 나타내었다. 47분 및 65분에 분리된 피크는 각각 EC50가 125, 167이었다.
[ 실시예 13] 화합물의 동정 및 방오 효능 검정
S. praecox 291-11로부터 분리된 방오 화합물은 NMR 및 MS 데이터를 해석하여 동정되었다. 방오 화합물(1)의 분자 조성은 C12H14N2O2 (positive mode, m/z 에서 [M+H]+ 값 219.14, 측정 분자량, 218.25)이었다.
1H-NMR 스펙트럼은 1.67 ppm (H-1'')에서 1개의 methylene protons, 2.91 ~ 3.24 ppm에서 methylene protons(H-1'), 4.61 및 4.84 ppm 에서 nitrogen 옆에 2개 methine protons(H-3, H-6), 7.17 - 7.31 ppm 에서 5개 aromatic protons(H-3' ~ H-7')과 6.95 - 7.12 ppm 에서 2개의 amide protons(H-1, H-4)을 확인하였다.
13C NMR 스펙트럼으로부터 170.2 ppm에서 2개 carbonyl carbons (C-2, C-5), 18.1 ppm에서 1개의 methyl carbon (C-1''), 38.3 ppm에서 1개의 methylene carbons (C-1'), 52.4 및 55.8 ppm에서 nitrogen 옆에 2개 methine carbons(C-3, C-6), 127.3 ~129.7 ppm에서 5개의 aromatic carbons(C-3'-C-7'), 140.1 ppm에서 또 다른 4개의 carbon (C-2')을 확인하였다.
H-6 내지 H-7'스펙트럼으로부터, amide proton (H-1) 및 carbonyl carbon (C-5)은 phenylalanine 단편의 존재를 밝혔으며, H-3,to H-1'' 스펙트럼으로부터 amide proton (H-4) 및 1 이상의 carbonyl carbon (C-2)는 alanine 단편의 존재를 확인하였다.
이러한 2 단편의 구조를 통해 이 화합물을 아미노산 phenylalanine 및 alanine으로 구성된 diketopiperazine 으로 밝혀졌다(도 4 및 표 3 참조). 이 결과로부터, 화합물 1은 bmDKP로 동정되었다.
디케토피페라진(diketopiperazines)의 핵자기공명(NMR) 스펙트럼 데이타


(6S, 3S)-6benzyl-3-methyl-2,5-diketopiperazine (6S, 3S)-6-isobutyl-3-methly-2,5-diketopipe razine
Position dC dH dC dH
1 6.95 6.95
2 170.2 169.8
3 52.4 4.61 52.1 4.82
4 7.12 7.11
5 170.2 168.2
6 55.8 4.84 56.1 4.57
1' 38.3 3.24, 2.91 41.2 1.84, 1.98
2' 140.1 23.4 1.79
3' 129.1 7.24 23.2 1.16
4' 129.6 7.31 23.2 1.16
5' 129.7 7.31
6' 127.3 7.17
7' 129.4 7.24
1'' 18.1 1.67 18.3 1.18
Ala 단위의 배치는 25.5분에 화합물의 Ala 단위로 FDLA 표준 (L: 25.7 분 및 D-derivatized: 32.1 분)의 유지 시간을 비교함으로써 확인되었다. Phe units의 L- 및 D-유도 표준의 유지 시간은 각각 31.3분 및 39.2분이었다. 화합물의 Phe unit은 31.7분에 분리되었다.
Marfey의 테크닉에 기초하여, 절대 배치는 L- 대 D-FDLA 유도체의 분리 순서에 기초하여 결정되었다(표 4). 따라서, 화합물 (1)의 절대 배치는 L-Ala 및 L-Phe 이고, 3S, 6S.로 배치될 수 있다. 따라서, 화합물(1)은 (6S, 3S)-6-benzyl-3-methyl-diketopiperazine로 확인되었다.
화합물 1 및 2의 D, L-FDLA 유도 아미노산의 보유 시간(분)
[M+H]+
m/z		 Std
FDLA		 bmDKP
L-FDLA		 imDKP
L-FDLA
L-Ala 384.2 25.7 (L) 25.5 25.1
32.1 (D)
L-Phe 460.1 31.3 (L) 31.7
39.2 (D)
L-Val 412.1 26.4 (L) 26.7
40.3 (D)
화합물(2)의 방오 화합물의 분자 구성은 C9H16N2O2 (positive mode, m/z에서 [M+H]+ 값 185.11, 측정 분자량 184.24)이었다. 1H-NMR 스펙트럼은 1.16-1.18ppm에서 3개 methyl protons(H-3', 4', 1''), 1.84 -1.98 ppm 에서 1개 methylene protons(H-1'), 4.57 and 4.82 ppm 에서 nitrogen 옆에 2개의 methine protons(H-6, H-3), 1.79 ppm 에서 1개 이상의 methine proton(H-2'), 6.95 및 7.11 ppm 에서 2개의 amide protons(H-1, H-4)을 확인하였다.
13C NMR 스펙트럼으로부터, 169.8, 168.2 ppm에서 2개의 carbonyl carbons (C-2, C-5), 18.3-23.2 ppm에서 3개 methyl carbon (C-1'', 3', 4'), 41.2 ppm 에서 1개의 methylene carbons (C-1'), 56.1 and 52.1 ppm, 에서 nitrogen 옆에 2개 methine carbons(C-6, C-3) 및 23.4 ppm에서 1개 이상의 methine carbon (C-2')을 확인하였다. H-6 내지 H-4' 스펙트럼, amide proton (H-1) 및 carbonyl carbon (C-5)는 valine 단편의 존재를 밝혔고, H-3 내지 H-1'', amide proton (H-4) 및 1개 이상의 carbonyl carbon (C-2)는 alanine 단편의 존재를 밝혔다. 이러한 2개의 단편 구조로 이 화합물을 valine 및 alanine 로 구성된 diketopiperazine 임을 확인하였다(도 4, 표 3). 상기 결과로부터, 화합물(2)는 imDKP로 밝혀졌다.
Ala unit 의 구조는 화합물(1)과 같다. Ala 단위의 배치는 25.5분에 화합물의 Ala 단위로 FDLA 표준 (L: 25.7 분 및 D-derivatized: 32.1 분)의 유지 시간을 비교함으로써 확인되었다. Phe units의 L- and D-유도 표준의 유지 시간은 각각 31.3분 및 39.2분이었다. 화합물의 Phe unit은 31.7분에 분리되었다. Val unit의 배치는 26.7분에 화합물의 Val unit으로 FDLA 표준 (L: 26.4 min and D-derivatize: 40.3 min)의 유지 시간을 비교함으로써, 결정되었다. 따라서, 화합물(2)의 절대 배치는 L-Ala 및 L-Val 이며, 3S, 6S로 배치된다. 따라서, 화합물(2)는 (6S, 3S)-6-isobutyl-3-methyl-diketopiperazine로 확인되었다. bmDKP는 유주자 저해의 치료 계수(LC50/EC50)이 17.7이었으며, imDKP는 21을 나타내었다. 반면, 양성 대조군(positive control, Irgarol)은 2 였다(표 5). bmDKP는 규조 저해를 위한 치료계수 263이었고, imDKP는 120.2를 나타내었고, Irgarol은 6을 나타내었다(표 6).
diketopiperazines에 의한 Ulva pertusa의 유주자 부착 저해
Compounds (㎍/mL) LC50 EC50 LC50/EC50
Compound (1) 139.1 2.2 17.7
Compound (2) 65.3 3.1 21
Irgarol 0.01 0.005 2
* LC50은 50% 의 포자에서의 치사 농도를 나타냄.
* EC50은 50% 의 포자에서의 최소 저해농도를 나타냄.
diketopiperazines에 의한 Navicula annexa의 규조 부착의 저해
Compounds (㎍/mL) LC50 EC50 LC50/EC50
Compound (1) 210.4 0.8 263
Compound (2) 132.3 1.1 120.2
Irgarol 0.012 0.002 6
* LC50은 50% 의 microalgae에서의 치사 농도를 나타냄.
* EC50은 50% 의 microalgae에서의 최소 저해농도를 나타냄.
해양 악티노마이세스(actinomyces)는 세포독성, 항균, 항생 활성 등 다양한 생물학적 활성을 나타내는 천연 산물의 풍부한 자원보고이다. 화합물의 많은 생합성 클래스가 해양 악티노마이세스(actinomyces)로부터 보고되고 있음에도 불구하고, 단지 4개의 DKP만 해양 악티노마이세스(actinomyces)로부터 보고되어 오고 있다. DKP는 미래에 큰 잠재력을 가진 바이오 활성을 가진 펩티드로서, 비교적 미개척된 클래스이다. 본 발명에서, 2개의 DKP는 스트렙토마이세스 속으로부터 분리되었고, 부착성 조류에 대해 활성이 있다.
해양 환경에서 생물부착(biofouling)은 규조 및 대형조류의 유주자를 포함한 미생물의 기질의 1차 콜로니를 포함한다. 미생물 세포는 세포외 폴리머와 바이오필름을 생성하며, 해양 무척추 라바는 부착 지표로서, 이러한 바이오 필름을 이용한다. 1차 콜로니를 저해하는 것은 부착 미생물을 제거하는 효과적인 방법일 수 있다. 따라서, 조류의 규조 및 조류 포자에 대하여 2종류의 DKPs가 분석되었다. LC50 와 EC50의 측면에서 2 화합물의 방오 활성은 표 3 및 표 4에 나타내었다. 치료 계수(therapeutic ration, LC50/EC50)는 15 이상이며, 무해한 방오제임을 나타낸다36). 2개의 화합물은 15 이상의 치료 계수를 가지며, 규조와 유주자를 저해한다. 반면 상업적 화합물인 Irgarol은 치료 계수 15 이하를 나타낸다(표 3 및 표 4). 양 화합물이 모두 DKP 구조를 갖기 때문에, 이의 일부(moiety)는 방오 활성에 중요한 기능기(functional group)일 가능성이 있다. 규조 및 유주자 저해 실험 모두에서, bmDKP는 EC50값 0.8-2.2 ㎍/mL 값으로, imDKP 값보다 약 1.4배 더 강력하며, benzyl moiety가 바이오 활성에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다.
해양 악티노마이세스로, 특히 스트렙토마이세스 속으로부터 분리된 생물학적 대사산물은 약 1 mg/L 이하의 비교적 낮은 생산성을 가진다. 예를 들어, Streptomyces sp. CNB-982은 0.1 mg/L 항염증 사이클로마린(anti-inflammatory cyclomarin)을 생산한다. Streptomyces sp. YM14-060는 약 0.35-0.93 mg/mL의 항균 피레리시딘(antimicrobial piericidins)를 생산한다. Wu et al.은 Streptomyces sp. M491로부터 분리한 0.12-0.44mg/mL는 amorphane 생산성을 보고하고하였다(Wu SJ, Fotso S, Li F, Qin S, and Laatsch H, J. Nat . Prod., 70 , 304-306 (2007). 그러나, 색소는 8-44 mg/mL에 달하였다. 다른 배지의 조성은 종종 이러한 화합물의 생산율을 향상시키기도 한다. 본 발명에서는 균주 291-11은 생물학적 대사산물을 생산하기 위해 해양 악티노마이세스 배양에 적합한 것으로 알려진 영양 배양 배지를 이용하여 2가지 DKP를 생성하였다(표 1). 2개의 DKP는 녹말-기반의 배양에서보다 글루코오즈-기반의 배양에서 비교적 더 높은 수준으로 생성되었다. 글루코오즈 기반의 배지에 CaCO3를 추가함으로써, imDKP 수준이 증가하였으며, 2개의 무기화합물 (Fe2(SO4)3 4H2O 및 KBr)을 추가함으로써, bmDKP 수준이 증가하였다. 이러한 결과에도 불구하고, 균주 291-11의 세포 성장은 8개의 다른 배양 조건하에서 거의 동일하였다(데이터 미도시). 글루코오즈 기반의 배양에서 TCG 배지(TCGC)에 CaCO3가 첨가되었을 때, imDKP 생산량은 TCG 배지와 비교해서 1.44배 증가하였다. 추가적인 Fe2(SO4)3 4H2O 및 KBr가 추가되었을 때(TBFeC), bmDKP는 TCG 배지와 비교해서 1.77배 증가하였다. 반면, imDKP는 TCGC에서와 비교할 때, 1.35 배 감소하였다. 2개의 무기화합물(Fe2(SO4)3 4H2O 및 KBr)가 녹말-기반의 배양에 추가되면(A1BFe), 2개의 DKPs 생산량이 약간 증가한 반면, 다른 3종류의 녹말-기반 배양은 DKP 생산량이 감소함을 나타내었다.
이러한 방오 화합물의 생산은 해양 생태계에 이로울 뿐만 아니라, 무독성 도료 조성물을 찾고자 하는 방오 도료 산업에도 유용하다. 해초나 무척추 생물에서 분리된 방오 활성을 갖는 많은 천연 해양 화합물이 보고되고 있음에도 불구하고, 배양 가능한 해양 미생물은 공급의 부족 문제 때문에, 방오 화합물을 개발하기 위해 좋은 목표 자원이 될 수 있다. 최적의 배양 조건을 연구하는 것은 가치있는 미래의 조사 대상이 될 것이다.

Claims (3)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 디케토피페라진(diketopiperazines)계 화합물을 포함하고,
    상기 디케토피페라진(diketopiperazines)계 화합물은 해양생물 스트렙토마이세스 파라에콕스 291-11의 추출물로부터 분리되며,
    상기 디케토피페라진계 화합물은 하기의 화학식을 갖는 bmDKP(1) 또는 imDKP(2)인 것을 특징으로 하는 친환경 방오제.
    Figure 112013095644938-pat00002
KR1020120040254A 2012-04-18 2012-04-18 디케토피페라진을 포함하는 친환경 방오제 KR101344075B1 (ko)

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