KR101703424B1

KR101703424B1 - 해조류 유래의 스트렙토마이세스로부터 분리된 페나진 유도체를 포함하는 방오물질

Info

Publication number: KR101703424B1
Application number: KR1020150064337A
Authority: KR
Inventors: 홍용기; 신현웅; 조지영
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2015-05-08
Filing date: 2015-05-08
Publication date: 2017-02-08
Also published as: KR20160131583A

Abstract

본 발명은 방오능을 가지는 해조류 유래의 해양방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) PK-28의 배양 추출물 및 이로부터 분리된 페나진 유도체 화합물에 관한 것이다. 본 발명에서 스트렙토마이세스 속 PK-28로부터 방오효능을 나타내는 4종의 물질을 NMR과 HR-MS로 분석한 결과, 이들 물질은 페나진 유도체인 것을 확인하였으며, 부착성 세균을 대상으로 한 실험에서 우수한 부착방지 효능을 나타냄을 확인하였다.

Description

해조류 유래의 스트렙토마이세스로부터 분리된 페나진 유도체를 포함하는 방오물질{PHENAZINE DERIVATIVES HAVING ANTI-MICROFOULING EFFECTS ISOLATED FROM SEAWEED DERIVED STREPTOMYCES}

본 발명은 방오능을 가지는 해조류 유래의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) PK-28의 배양 추출물 및 이로부터 분리된 페나진 유도체 화합물에 관한 것이다.

수해양 환경에서 부착생물은 배의 선체와 인공구조물 또는 양식장의 그물 등에 부착하여 기술적 경제적 손실을 야기시키고 있다(Callow and Edyvean, 1990). 부착생물 방지를 위한 대부분의 방오물질은 Irgarol, chlorothalonil 및 diuron과 같은 방오제를 포함하고 있으며, 이러한 방오제들은 해양생물에 독성을 나타내며, 다양한 수중 환경에서 이들 물질의 침전을 경고하는 많은 연구 결과들이 보고되고 있다(Voulvoulis N, Hdb, 2006).

친환경의 방오물질 개발을 위해 많은 해양생물군으로부터 benzoids, steroids, fatty acids와 terpenoids, amino acids 등 다양한 구조의 방오후보물질이 분리되었다고 보고되고 있다(Fusetani, 2011).

한편, 해양방선균인 스트렙토마이세스는 세포독성, 항균, 항균 등의 다양한 생물학적 활성을 나타내는 천연물의 풍부한 자원보고이다. 해양방선균의 육상 방선균과 유전자 분석에서는 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있지만, 배양시 해양배지에서만 자라는 특징이 있다(Fenical 1999). 스트렙토마이세스는 다양한 해양환경에서 분리 보고되고 있으며, 배양조건에 따라 다양한 물질을 생산하는 것으로 보고되고 있다.

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 해양방선균인 해조류 유래의 스트렙토마이세스 속 PK-28의 추출물로부터 분리된 미세생물의 부착을 억제하는 물질을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 미생물의 배양 추출물을 포함하는 부착성 해양생물 방오용 조성물을 제공한다.

상기 미생물은 스트렙토마이세스 속 PK-28(Streptomyces sp. PK-28) 균주인 것이 바람직하다.

상기 조성물은 초기 부착성 해양생물의 방오용인 것이 바람직하다.

상기 초기 부착성 해양생물은 초기 부착성 세균인 것이 바람직하다.

상기 초기 부착성 세균은 알테로모나소 속(Alteromonas sp.) 또는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 다음의 구조식 1 내지 구조식 4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 페나진 유도체를 포함하는 부착성 해양생물 방오용 조성물을 제공한다:

[구조식 1]

;

[구조식 2]

;

[구조식 3]

; 및

[구조식 4]

.

상기 초기 부착성 세균은 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) 또는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)인 것이 바람직하다.

본 발명에서 스트렙토마이세스 속 PK-28로부터 방오 효능을 나타내는 4종의 물질을 NMR과 HR-MS로 분석한 결과, 이들 물질은 페나진 유도체인 것을 확인하였으며, 부착성 세균을 대상으로 한 실험에서 우수한 부착방지 효능을 나타냄을 확인하였다.

도 1은 본 발명의 물질 Pn-1 구조분석을 위한 COSY(굵은선)와 HMBC(화살표) 관계를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

친환경적인 신규 방오화합물을 개발하기 위한 노력의 일환으로서, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 PK-28은 해조류 미역(Undaria pinnatifida)의 근권 부분에서 분리되었다. 해조류는 유기물질을 주변환경으로 방출하여 외생생물(epibiotic bacteria)에게 영양물질을 제공하고, 외생생물은 대사물질을 생산하고 해조류 표면에 생물막을 형성하여 부착생물로부터 숙주인 해조류의 보호에 도움이 되는 것으로 알려져 있다(Keats et al., 1997). 본 발명에서는 해조류의 외생생물이 생산하는 대사물질로부터 부착효능을 나타내는 물질의 분리 구조분석에 대한 보고이며, 활성검증 실험 결과도 함께 기술하였다.

해양방선균인 악티노마이세테스(actinomycetes) 과(class)의 미생물은 16S rDNA 서열 분석에 의해 육상의 방선균과 유전적 유사성을 보이지만, 해양배지에서만 자라는 특징을 보인다. 그 중 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)의 미생물은 세포 독성, 항균, 항염증 등의 생리활성 물질을 생산하는 능력으로 인해 많은 주목을 받아왔다. 본 발명에서는 스트렙토마이세스 속 PK-28로부터 방오활성을 나타내는 페나진 유도체를 분리하였다. 페나진은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) 등의 세균에서 분리되는 것으로 보고되고 있고, 항진균 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 해조류 표면에 외생하고 있는 방선균인 스트렙토마이세스 속 PK-28(Streptomyces sp. PK-28) 균주의 배양액 추출물로부터 4종의 페나진 유도체를 실리카겔 크로마토그래피(silica-gel chromatography), HPLC 등을 이용하여 분리하였고 HR-Mass와 NMR을 이용하여 구조분석을 실시하였다. 분리된 물질은 2종의 부착성 세균을 대상으로 방오효능을 검증하였다.

따라서, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 미생물의 배양 추출물을 포함하는 부착성 해양생물 방오용 조성물을 제공한다.

상기 미생물은 스트렙토마이세스 속 PK-28(Streptomyces sp. PK-28) 균주인 것이 바람직하다. 상기 PK-28 균주는 Streptomyces sp.(NCBI accession No. AB516410)와 99%의 서열 상동성을 가지므로, 바람직한 구체예로서, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 미생물로서 공지된 Streptomyces sp.(NCBI accession No. AB516410)을 사용할 수 있을 것이다.

한편, 해양에서의 부착은 부착세균, 미세조류 및 포자, 따개비 및 담치류 등의 순서로 이루어지며, 미세생물인 부착세균과 미세조류의 부착은 연성부착성(soft fouling) 생물과 강성부착성(soft fouling) 생물의 부착을 순차적으로 유도한다. 초기 미세생물의 부착을 억제하는 것은 연성 및 강성생물의 부착을 억제할 수 있다. 본 발명에서는 초기 미세생물의 부착을 억제하는 방법을 적용하였다.

따라서, 본 발명의 상기 조성물은 초기 부착성 해양생물의 방오용인 것이 바람직하다.

상기 초기 부착성 세균은 알테로모나소 속(Alteromonas sp.) 또는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)인 것이 바람직하며, 슈도모나스 속의 경우 슈도모나스 아르기로사(Pseudomonas aetuginosa)를 예로 들 수 있다.

[구조식 1]

;

[구조식 2]

;

[구조식 3]

; 및

[구조식 4]

.

상기 구조식 1의 화합물은 1-4-메틸펜트-2-에닐-6-메톡시-페나진(1-4-methylpent-2-enyl-6-methoxy-phenazine)으로 명명되며, 본 명세서에서는 물질 Pn-1으로도 명명된다.

상기 구조식 2의 화합물은 1-히드록시-6-메톡시페나진(1-hydroxy-6-methoxyphenazine)으로 명명되며, 본 명세서에서는 물질 Pn-2로도 명명된다.

상기 구조식 3의 화합물은 페나진-카르복실산(Phenazine-carboxylic acid)으로 명명되며, 본 명세서에서는 물질 Pn-3로도 명명된다.

상기 구조식 4의 화학물은 1-히드록시-페나진(1-Hydroxy-phenazine)으로 명명되며, 본 명세서에서는 물질 Pn-4으로도 명명된다.

이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[ 실시예 ]

1. 재료 및 방법

1.1. 해양방선균 스트렙토마이세스 속 PK -28( Streptomyces sp . PK -28) 배양 및 추출

한국연안 (강릉, 포항, 울산, 부산, 통영 및 완도)을 따라 채집한 해조류에서 악티노마이세테스를 분리하였고, 분리된 87종의 균주를 4종류의 해양배지(표 1)를 이용하여 25℃에서 10일간 배양하여 그 추출물로부터 방오활성을 탐색하였다. 배양액은 진공농축기를 이용하여 배양액과 균주의 세포를 농축하였고 에탄올을 이용하여 3회 반복 추출하였다.

[표 1] 배지 조성

1.2. 해조 외생세균 스트렙토마이세스 속 PK -28의 동정

방오물질을 생산하는 PK-28 균주를 동정하기 위해, High Pure PCR Template Preparation kit (Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 염색체 DNA를 분리하였다. 16S rDNA 는 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 및 1492R universal primers (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 및 PCR premix (Bioneer, Seoul, Korea)로 PCR을 실시하였다.

1.3. 활성물질 분리

Strain PK-28 추출물은 실리카겔 플래시 컬럼(100g ; 70-230 메쉬)을 이용하여 전개용매 헥산/에틸아세테이트와 에틸아세테이트/메탄올 혼합용매를 이용하여 9개 분획구를 얻었다. 활성을 나타내는 분획구는 역상 HPLC를 이용하여 2차 분리를 실시하였다. 컬럼은 Luna C18 column (10×25 cm, 10 ㎛; Phenomenex)을 이용하였고 Agilent 1200 gradient LC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 시스템으로 분석하였으며, 220nm 자외선 탐지기로 모니터하였다. 이동상(mobile phase)은 아세토니트릴과 물을 사용하였고 40% 아세토니트릴 농도에서 2 mL/min 유속으로 하여 isocratic flow를 수행하였다.

1.4. 구조 분석

분리된 물질의 구조분석을 위해 고성능질량분석기 (HRESI-MS), JMS 700; JEOL, Tokyo, Japan)와 핵자기공명분석 (NMR, JNM-ECP 600 NMR spectrometer; JEOL)을 사용하였다. 질량분석은 JMS 700 system (JEOL, Tokyo, Japan)을 이용해 positive ion mode에서 실시하였다. 핵자기공명분석에서의 용매는 DMSO-d6를 이용하여 ¹H, ¹³C, 상관분석법(correlation spectroscopy: COSY), 이종핵 다중 결합 상관관계(heteronuclear multiple bond correlation: HMBC), 이종핵 다중 양자 결합력(heteronuclear multiple quantum coherence: HMQC)등을 측정하였다.

1.5. 방오활성 검증

초기부착생물에 대한 방오활성은 부착성 세균 2종을 이용하여 효능검증을 실시하였다. 부착성 세균은 Alteromonas sp, Pseudomonas aeruginosa를 국립수산과학원에서 분양받아 사용하였고, 세균은 1 % NaCl을 첨가한 brain heart infusion agar를 이용한 25℃에서 10³·CFU ·mL^-1로배양하였다. 200μL의 세균배양액을 96 well plate에 분주하고 활성물질을 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 600nm 흡광도에서 측정하여 MIC값을 산출하였다.

2. 결 과

2.1. 방오물질 생산 strain PK -28 균주의 동정

NCBI BLAST 분석에 기초하여 해조류 미역(Undaria pinnatifida)의 근권(rhizosphere)에서 분리된 균주 PK-28은 Streptomyces sp.(NCBI accession No. AB516410)와 99%의 염기서열 동일성을 나타내었다. 따라서, 이 균주는 Streptomyces sp. PK-28로 명명하였다. 이 균주를 이용하여 4종의 phenazine 유도체를 분리하였다.

2.2. 활성물질의 분리

부착성세균 Alteromonas sp.에 대한 억제 활성을 기준으로 효능물질을 분리하였다. 20L의 strain PK-28의 배양액으로부터 얻은 추출물 (1.5g)을 실리카겔 크로마토그래피로 분획하였고, 활성이 나타난 분획구 6 (84mg)은 에틸아세테이트:메탄올(8:2)을 전개용매로 하였다. 분리된 분획구 6은 역상 HPLC를 이용하여 2차 분리를 실시하였고 활성을 나타내는 4개의 피크는 36분 (Pn-4, 6.3 mg), 42분 (Pn-3, 5.1 mg), 53분 (Pn-2, 4.9mg), 71분 (Pn-1, 4.2 mg)에 각각 분리되었다.

2.3. 활성물질의 구조분석

Streptomyces sp. PK-28로부터 분리된 방오 화합물은 NMR 및 HR-MS 데이터를 해석하여 동정하였다.

방오 화합물 Pn-1의 분자 조성은 C₁₉H₂₁N₂O이며, HR-MS를 이용한 분자량은 293.3819 (positive mode, [M+H]+) 로 확인되었다. 1H-NMR 스펙트럼에서는 7.34, 7.48, 7.81, 7.24, 7.61, 7.59 ppm의 6개의 방향족 수소가 나타났고, 3.24 ppm에서 1개의 CH₂ 수소, 6.12와 5.46ppm에서 2개의 이중결합 수소가 나타났다. 2.71ppm에서는 1개의 CH수소가 나타났으며 1.23ppm 에서는 2개의 CH₃ 수소, 3.84ppm에서는 산소와 결합한 CH₃ 수소가 나타났다. 13C-NMR 스펙트럼에서는 9개의 CH 탄소와, 1개의 CH₂ 탄소, 3개의 CH₃ 탄소가 나타났으며, 4차탄소는 6개로 확인되었다. COSY 스펙트럼을 통해 H-2, H-3, H-4는 순차적으로 연결되며 (부분구조 1), H-7, H-8, H-9도 순차적으로 연결된다 (부분구조 2). H-1'는 H-2'와 연결되고 (부분구조 3) H-3', H-4', H-5', H-6'도 순차적으로 연결되어 부분구조를 이룬다 (부분구조 4). 부분구조 1은 HMBC 스펙트럼에서 H-2와 연결되는 C-1, C-10a, C-1' 통해 연장되어 부분구조 3과 연결되고 H-3는 C-4a로 연결된다. H-1'와 연결되는 C-3' 스펙트럼은 부분구조 3과 4가 연결되는 것을 보여준다. 부분구조 3과 4는 4-methylpent-2-enyl을 나타낸다. H-1'와 연결되는 C-1 스펙트럼은 부분구조 1과 3, 4가 연결되는 것을 보여주어 새로운 부분구조를 형성한다 (부분구조 A). 부분구조 2의 H-7은 HMBC 스펙트럼에서 C-6과 연결되고 H-8은 C-9a와 연결된다. O-CH₃ 수소는 HMBC를 통해 C-6과 연결되어 새로운 부분구조를 형성한다 (부분구조 B). HR-MS 데이터를 통해 물질은 두 개의 N를 포함하고 있은 것을 확인할 수 있으며 두 부분구조 A와 B는 2 개의 N으로 연결되어 phenazine 구조를 형성한다. 따라서 물질 Pn-1은 4-methylpent-2-enyl 을 포함하는 phenazine 물질로 1-4-methylpent-2-enyl-6-methoxy-phenazine이며 보고된바 없는 신규한 구조의 물질이다.

물질 Pn-2의 분자 조성은 C₁₃H₁₁N₂O₂이며, HR-MS를 이용한 분자량은 227.2347 (positive mode, [M+H]+) 로 확인되었다. 1H-NMR 스펙트럼에서는 7.13, 7.41, 7.58, 7.16, 7.51, 7.55ppm의 6개의 방향족 수소가 나타났고, 3.71 ppm에서 1개의 O-CH₃ 수소, 5.21 ppm에서 OH 수소가 나타났다. 13C-NMR 스펙트럼에서는 6개의 CH 탄소와, 1개의 O-CH₃ 탄소가 나타났으며 4차탄소는 6개로 확인되었다. 물질 Pn-2는 기존의 결과와 비교하여 1-hydroxy-6-methoxyphenazine로 확인되었다.

물질 Pn-3의 분자 조성은 C₁₃H₉N₂O₂이고, HR-MS를 이용한 분자량은 225.2267 (positive mode, [M+H]+) 로 확인되었다. 1H-NMR 스펙트럼에서는 8.51, 7.82, 8.38, 8.17, 7.64, 7.65, 8.11ppm의 7개의 방향족 수소가 나타났고, 5.61 ppm에서 OH 수소가 나타났다. 13C-NMR 스펙트럼에서는 7개의 CH 탄소가 나타났으며 4차탄소는 5개로 확인되었고 165.1 ppm에서 C=O 탄소가 나타났다. 물질 Pn-3는 기존의 결과와 비교하여 Phenazine-carboxylic acid 로 확인되었다.

물질 Pn-4의 분자 조성은 C₁₂H₉N₂O이며, HR-MS를 이용한 분자량은 197.2136 (positive mode, [M+H]+) 로 확인되었다. 1H-NMR 스펙트럼에서는 7.18, 7.43, 7.57, 8.12, 7.71, 7.72, 8.15 ppm의 7개의 방향족 수소가 나타났고, 4.26 ppm에서 OH 수소가 나타났다. 13C-NMR 스펙트럼에서는 7개의 CH 탄소가 나타났으며 4차탄소는 5개로 확인되었다. 물질 Pn-4는 기존의 결과와 비교하여 1-Hydroxy-phenazine으로 분석되었다.

[표 2] Phenazine 유도물질 Pn -1의 NMR 데이터

[표 3] Phenazine 유도물질 Pn -2, 3, 4의 13C 및 1H- NMR 데이터

2.4. Phenazine 유도체의 방오활성

본 발명에서, 4개의 phenazine 유도체는 부착성 세균에 대해 높은 방오활성을 나타내었으며, 그 결과는 표 4에 나타내었다. 부착세균 (Alteromonas sp., Pseudomonas aeruginosa)에 대한 MIC값은 2.12 - 21.3 μg /mL의 범위에서 나타났다.

[표 4] 부착성세균에 대한 phenazine 유도체의 MIC 값

해조류의 외생생물은 해조류로부터 영양물질을 공급받으며 생존하고 2차 대산물질을 생산하여 해조류를 다른 부착생물로부터 보호하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 해조류의 외생생물인 스트렙토마이세스는 부착방지물질 개발을 위한 우수한 자원이 될 것이며, 본 발명을 통해서 부착방지물질인 4종의 phenazine 유도체 (Pn-1, Pn-2, Pn-3, Pn-4)를 분리하였다. Pn-1은 보고된 바 없는 신규 물질이며 기존에 보고된 Pn-3과 Pn-4에 비해 우수한 방오효능을 나타낸다. Pn-2는 방오효능에 대해 보고된 바 없는 물질이며 Pn-4 물질에 메톡실 그룹이 추가된 구조로 4종의 phenazine 유도체 중 가장 높은 효과를 나타낸다.

Claims

스트렙토마이세스 속 PK-28(Streptomyces sp. PK-28) 미생물의 배양 추출물을 포함하는 부착성 해양생물 방오용 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 초기 부착성 해양생물의 방오용인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 초기 부착성 해양생물은 초기 부착성 세균인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 초기 부착성 세균은 알테로모나소 속(Alteromonas sp.) 또는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)인 것을 특징으로 하는 조성물.
다음의 구조식 1 내지 구조식 4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 페나진 유도체를 포함하는 초기 부착성 세균 방오용 조성물:
[구조식 1]

;
[구조식 2]

;
[구조식 3]

; 및
[구조식 4]

.
삭제
삭제
제 6항에 있어서,
상기 초기 부착성 세균은 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) 또는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)인 것을 특징으로 하는 조성물.