KR102351383B1 - 픽티바실러스 속 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 코클로디니움 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides)를 포함하는 와편모조류에 대해 살조 활성을 가지는 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주, 배양액 또는 이로부터 분리한 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주는 유해 적조생물인 코클로디니움 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides)를 포함하는 와편모조류에 대해서만 선택적으로 살조 활성을 나타내기 때문에 적조 제어시 수생태계의 교란을 최소화할 수 있으며, 균주를 직접 처리하지 않고 배양액을 처리하더라도 비교적 안정적으로 살조 활성을 유지하므로, 국내 양식장에 큰 피해를 입히는 코클로디니움 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides)를 포함하는 와편모조류를 살조하는데 더욱 유용하게 사용될 수 있다.

Description

픽티바실러스 속 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물 {Composition for controlling red tide comprising Fictibacillus sp. or their medium as effective component}
본 발명은 적조를 일으키는 원인종인 와편모조류에 선택적인 살조 효과를 나타내는 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주, 이의 배양액 또는 상기 균주로부터 분리된 선택적인 살조효과를 나타내는 L-페닐알라닌과 안트라닐산의 용도에 관한 것이다.
적조(red tide)는 플랑크톤이 번식하기에 알맞은 환경을 만나 대량 번식하여 해수의 색깔이 변하는 현상을 말한다. 적조 현상은 전 세계 연안에서 발생하고 있으며, 우리나라 뿐만 아니라 여러 국가에서 발생 지역과 발생 횟수가 지속적으로 증가하고 있으며, 적조로 인한 수산 양식 산업의 경제적 피해는 해를 거듭할수록 증가하고 있다. 산업과 도시의 발달로 질소(N)와 인(P)을 많이 함유한 생활, 농업, 산업 폐수방출이 늘어남에 따라, 바다의 부영양화에 의한 적조의 발생 빈도가 높아져 가고 있다.
이러한 적조를 유발하는 생물의 종류는 전 세계적으로 200종이 넘고, 한국 연안에서 출현하는 적조생물은 34종 이상이 보고되고 있다. 1980년대까지는 캐토세로스(Chaetoceros), 스켈레토네마(Skeletonema), 탈라시오시라(Thalassiosira) 및 니츠쉬이아(Nitzschia) 속 등의 규조류가 주요 원인생물이었으나, 1981년부터 알렉산드리움(Alexandrium), 코클로디니움(Cochlodinium), 짐노디니움(Gymnodinium) 및 헤테로시그마(Heterosigma) 속 등의 편모조류가 주요적조 원인생물로 나타나고 있다. 특히, 유독성 와편모류인 알렉산드리움(Alexandrium) 속은 전 세계적으로 30여 종이 보고되고 있고, 일부 종은 독성은 다르지만 화학적으로 유사한 20여 종의 신경성 독소(neurotoxins)를 생산한다.
와편모조류는 적조나 유해조류대발생(harmful algal blooms)을 일으키는데, 이는 물고기와 갑각류의 떼죽음을 이끌고, 농업과 관광산업에도 엄청난 금전적 손실을 가져오기도 한다. 이중 코클로디니움(Cochlodinium) 속은 바닷물 속에 휴면포자 상태로 잠복해 있다가 수온이 섭씨 23℃ 이상 높아지고 영양염류가 풍부해지면 활동을 시작하여 24시간 만에 2배로 급격히 늘어나는 식물플랑크톤이다. 광합성 작용을 하지만 편모로 와류를 일으켜 이동이 가능하기 때문에 동물성의 특징도 지니고 있다. 1개 또는 수개의 세포가 연결되어 있으며 세포의 크기는 20~40㎛(1㎛은 100만분의 1m)로 자체적으로 독성을 갖고 있지는 않지만 점액질 성분이 많아 1㎖당 3,000 개체 이상이면 수 시간 이내에 어류를 호흡곤란 등으로 치사시킬 수 있다. 우리나라 연안에서는 1989년부터 어패류를 치사시키고 있으며, 특히 1990년부터 1993년까지 충무연안, 연대-학림도 주변, 사량도 및 남해 미조지선에서 8~10월, 1995년 9~10월 중에 대량으로 어패류를 치사시켰다. 현재 주 발생 지역으로는 전남 고흥 나로도에서 여수해만, 남해, 통영, 부산연안 및 동해 남부로 나타나고 있다.
대표적인 와편모조류는 알렉산드리움 아핀(Alexandrium affine), A. 미누텀(A. minutum), A. 루시타니컴(A. lusitanicum), A. 타마렌스(A. tamarense), A. 카테넬라 (A. catenella), A. 퍼시피컴(A. pacificum), A. 인수에텀(A. insuetum), 코클로디니엄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 쿨리아 카나리엔시스(Coolia canariensis), C.말라이엔시스(C. malayensis), 갬비에르디스커스 카리베우스(Gambierdiscus caribeaus), 짐노디니움 아우레올럼(Gymnodinium aureolum), G. 카테나텀(G. catenatum), G. 인스트리아텀(G. instriatum), 헤테로캡사 트리쿼트라(Heterocapsa triquetra), L.폴리에드럼(L. polyedrum), 또는 스크립시엘라 트로코이데아(Scrippsiella trochoidea) 등이 알려져 있다.
이러한 유해 적조 생물에 의한 수산 양식 산업의 막대한 경제적 피해를 대처하고자 적조 현상 방제를 위해 물리적, 화학적 방법이 많이 연구되어 왔다. 물리적 방법은 수차, 터빈 등을 이용하여, 적조 현상 발생지역의 해수를 흩트려 적조 생물의 밀도를 낮추거나, 온도가 상대적으로 낮은 기저해수를 펌핑하여 표면으로 분사시켜 적조 미생물을 흩으면서 동시에 해수 표면의 온도를 낮춤으로 인해 적조 현상을 억제하는 것인데, 바다에 물리적 충격을 주는 것이어서 바다를 오염시키거나 생태계 교란 현상은 적지만, 효과가 일시적이어서 지속적인 방제 효과를 내기 위해서는 많은 수의 선박과 인원이 투입되어야 하는 문제점이 있다.
한편, 화학적 방법은 활성탄과 같은 다공성 물질로 적조 생물을 흡착하는 흡착제, 실리카겔과 같이 적조 생물을 응집시키는 응집제, 황토, 산성백토 등과 같이 적조 생물과 함께 수중으로 침강하는 침강제, 황산구리, 은나노 이온, 오존 등과 같이 적조 생물의 세포막을 파괴하여 적조 생물을 사멸시키는 살조제을 이용하는 것이다. 그런데 이들 방법들은 현재 적조 현상의 발생장소에서 적조 생물의 방제를 위하여 사용되고는 있지만, 환경에 미치는 영향에 비하여 그다지 효과적이지 못한 문제점들이 있다. 이외에 적조의 천적 미생물이나 생물을 이용하여 적조 생물을 사멸시키거나 포식하게 하는 생물학적 방법이 있으나, 아직 구체적으로 실용화되지 않은 실정이다.
한편, 한국등록특허 제1971250호에는 알렌산드리움 타마렌스 및 코클로디니움 폴리크리코이데스에 대해 살조 활성을 가지는 올레야 속 M5A2M 균주 및 이의 용도에 대해 개시하고 있고, 한국등록특허 제1661543호는 살조능을 갖는 슈도모나스 속 균주 및 이를 이용한 살조 미생물 제제를 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1746667호는 항조류 활성을 가지는 키메라 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물을 개시하고 있고, 한국등록특허 제1405275호에는 '나프토퀴논 유도체를 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물'에 대해 개시하고 있다.
하지만, 본 발명의 적조를 일으키는 원인종인 와편모조류에 선택적인 살조 효과를 나타내는 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주 및 상기 균주로부터 분리된 선택적인 살조효과를 나타내는 L-페닐알라닌과 안트라닐산의 용도에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
한국등록특허 제1971250호 한국등록특허 제1661543호 한국등록특허 제1746667호 한국등록특허 제1405275호
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주, 이의 배양액 및 상기 균주로부터 분리된 L-페닐알라닌과 안트라닐산이 와편모조류에 대해서만 선택적인 살조 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 살조 활성을 가지는 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주(KCTC18769P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.
또 다른 예로, 본 발명은 상기 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리한 L-페닐알라닌 또는 안트라닐산을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주 또는 이의 배양액을 적조 발생 지역에 처리하는 단계를 포함하는 적조를 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리한 L-페닐알라닌 또는 안트라닐산을 적조 발생 지역에 처리하는 단계를 포함하는 적조를 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주를 배양하는 단계를 포함하는 적조 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주, 이의 배양액 또는 상기 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리된 L-페닐알라닌 또는 안트라닐산은 유해 적조생물인 와편모조류에 대해서만 선택적으로 살조 활성을 나타내기 때문에 해양 일차생산자 생태계의 영향을 최소화하면서 적조를 효율적으로 제어할 수 있으므로, 생물학적 살조제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주 배양액을 첨가 24시간 후 코클로디니움 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides)에 대한 살조능을 알아보기 위하여 대조군과 비교하여 Chl-α(클로로필-a) 또는 카로테노이드에 대한 색소농도 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주 배양액을 첨가 24시간 후 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 대조군이고, (B)는 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주 배양액을 처리한 군이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 코클로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)에 대한 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주(cells) 또는 배양여액(filtrate)의 살조효과에 관한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리하여 활성 성분으로 동정된 L-페닐알라닌의 구조식을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리하여 활성 성분으로 동정된 L-페닐알라닌에 대한 ESI-mass spectrum 분석 결과를 나타낸 것이다(위: positive mode, 아래: negative mode).
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리하여 활성 성분으로 동정된 안트라닐산의 구조식을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리하여 활성 성분으로 동정된 안트라닐산에 대한 ESI-mass spectrum 분석 결과를 나타낸 것이다(위: positive mode, 아래: negative mode).
도 8은 본 발명의 일 구현 예에 따른 코클로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)에 대한 L-페닐알라닌의 농도별 살조효과에 관한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 구현 예에 따른 코클로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)에 대한 안트라닐산의 농도별 살조효과에 관한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현 예에 따른 다른 미세조류에 대한 L-페닐알라닌 또는 안트라닐산의 농도별 살조효과에 관한 비교 결과를 나타낸 것이다. 와편모조류에 속하는 코클로디니움 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides LIMS-PS-2335), 알렉산드리움 타마렌스 (Alexandrium tamarense)와 알렉산드리움 인수에툼 (Alexandrium insuetum LIMS-PS-2305) 그리고 규조류에 속하는 탈라시오시라 웨이스플로기 (Thalassiosira weissflogii LIMS-PS-0545)와 케토세로스 심플렉스 (Chaetoceros simplex LIMS-PS-0608) 그리고 침편모조류인 헤테로시그마 아카시오 (Heterosigma akashiwo LIMS-PS-2143)에 대해 살조능이 있는지 확인 및 비교하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 살조 활성을 가지는 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주를 제공한다.
상기 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주는 국내 남해지역의 거제 인근에서 다양한 균주를 분리하기 위하여 마린 브로스 2216배지에 도말하여 25℃에서 24-48시간 배양하였다. 순수한 미생물을 분리하기 위하여 서너 차례 계대배양을 하였다. 순수 분리한 미생물에서 살조능이 우수한 미생물을 최종 선별하였다. 선별된 균주의 기탁번호는 KCTC 18769P이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 살조 활성은 와편모조류에 대한 살조 활성일 수 있고, 상기 와편모조류는 알렉산드리움 아핀(Alexandrium affine), A. 미누텀(A. minutum), A. 루시타니컴(A. lusitanicum), A. 타마렌스(A. tamarense), A. 카테넬라 (A. catenella), A. 퍼시피컴(A. pacificum), A. 인수에텀(A. insuetum), 코클로디니엄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 쿨리아 카나리엔시스(Coolia canariensis), C.말라이엔시스(C. malayensis), 갬비에르디스커스 카리베우스(Gambierdiscus caribeaus), 짐노디니움 아우레올럼(Gymnodinium aureolum), G. 카테나텀(G. catenatum), G. 인스트리아텀(G. instriatum), 헤테로캡사 트리쿼트라(Heterocapsa triquetra), L.폴리에드럼(L. polyedrum), 또는 스크립시엘라 트로코이데아(Scrippsiella trochoidea)인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주에서 분리된 L-페닐알라닌 또는 안트라닐산을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 '적조 방제'란 항적조, 적조 방지, 살조 및 항조류 등의 여러 가지 용어로 사용되며, 적조를 일으키는 조류(algae)의 생장을 억제하거나, 사멸시키거나, 운동성을 억제하는 등 조류의 증식을 막아 적조를 일으키는 현상을 제거하는 것을 의미한다. 또한, 보다 넓게는 적조를 일으키는 원인 조류를 사멸시키거나 생육을 억제한다는 의미도 포함한다.
본 발명의 적조 방제용 조성물은 유효성분으로서 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주, 이의 배양액, L-페닐알라닌 또는 안트라닐산의 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 효과의 안정적 발현, 적용 대상 생물로의 부착 증진, 운반 및 처리의 간편화를 위해 제제학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 방제용 조성물은 바람직하게는 유제, 수화제, 입제, 분제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있고, 제제의 부력을 위해 도넛형과 같은 제형을 통한 접촉제로서 제공되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주, 이의 배양액의 유효량을 적조 발생 지역에 처리하는 단계를 포함하는 적조를 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리한 L-페닐알라닌 또는 안트라닐산의 유효량을 적조 발생 지역에 처리하는 단계를 포함하는 적조를 방제하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주, 이의 배양액, L-페닐알라닌 또는 안트라닐산의 유효량을 유해조류가 발생되는 초기에 처리함으로써 대량증식을 사전에 차단하는 것이 바람직하며, 상기 유해조류는 와편모조류인 것이 바람직하고, 와편모조류는 알렉산드리움 아핀(Alexandrium affine), A. 미누텀(A. minutum), A. 루시타니컴(A. lusitanicum), A. 타마렌스(A. tamarense), A. 카테넬라 (A. catenella), A. 퍼시피컴(A. pacificum), A. 인수에텀(A. insuetum), 코클로디니엄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 쿨리아 카나리엔시스(Coolia canariensis), C.말라이엔시스(C. malayensis), 갬비에르디스커스 카리베우스(Gambierdiscus caribeaus), 짐노디니움 아우레올럼(Gymnodinium aureolum), G. 카테나텀(G. catenatum), G. 인스트리아텀(G. instriatum), 헤테로캡사 트리쿼트라(Heterocapsa triquetra), L.폴리에드럼(L. polyedrum), 또는 스크립시엘라 트로코이데아(Scrippsiella trochoidea)인 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명은 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주를 배양하는 단계를 포함하는 적조 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
상기 균주의 배양 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 1. 픽티바실러스 속 ( Fictibacillus sp.) 5A8M 균주의 분리 및 동정
국내 남해지역의 거제 인근에서 다양한 균주를 분리하기 위하여 마린 브로스 2216배지에 도말하여 25℃에서 24-48시간 배양하였다. 순수한 미생물을 분리하기 위하여 서너 차례 계대를 하였다. 순수 분리한 미생물에서 살조능이 우수한 미생물을 최종 선별하였다. 선별된 균주의 기탁번호는 KCTC 18769P이다.
실시예 2. 픽티바실러스 속 ( Fictibacillus sp.) 5A8M 균주의 코클로디니움 폴리크리코이데스 ( Cochlodinium polykrikoides )에 대한 살조능 분석
분리균주 픽티바실러스 속 5A8M (Fictibacillus sp.)가 코클로디니움 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides)에 대한 살조능을 알아보기 위하여 배양한 상기 균주를 O.D. 600nm 0.3 이상을 갖도록 F/2 배지에 접종한 후, 25℃에서 24시간 전배양하였다. 해양 미세조류와 분리 균주를 혼합 배양 한 후, 24시간 후 조류 세포내의 색소 농도를 측정함으로써 대조군과 비교하여 감소 정도로 살조능력을 파악하였다. 클로로필-a의 농도는 74%, 카로테노이드의 농도는 46%의 감소효과를 나타내었다 (도 1). 또한, 현미경으로 세포를 관찰해본 결과 24시간 후 대부분의 세포가 사멸하여 남아있는 세포질만 관찰되었다 (도 2).
추가적으로, 본 발명의 픽티바실러스 속 5A8M (Fictibacillus sp.) 균주 자체 또는 0.4 ㎛ 필터를 통과한 배양여액(filtrate)의 살조효과를 분석하였고, 그 결과는 도 3에 제시하였다.
실시예 3. 픽티바실러스 속 ( Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리한 활성성분의 분석 및 구조분석
배양액(M8-1) 약 10 L에 Diaion HP-20 resin (1 L)를 넣어 3시간 동안 교반하여 흡착시켰다. 흡착시킨 resin을 column에 충진한 후, 흡착되지 않은 pass 분획(M8-2), 30% aq. methanol (M8-3), 50% aq. methanol (M8-4), 70% aq. methanol (M8-5), 100% methanol (M8-6)로 각각 용출시킨 분획으로 나누었다. 가장 활성이 강한 M8-2 분획은 ODS column (Ø7 X 20 cm)에 loading하고 흡착되지 않은 pass 분획(M82-1)과 20% aq. methanol (M82-2), 100% methanol (M82-3)로 각각 용출시킨 분획으로 나누었다. 활성검정 결과 활성을 나타내는 M82-1 분획을 감압 농축하였으며, 농축과정에서 많은 salt가 형성되어 농축과정을 반복하며 salt를 제거하였으나 상당량은 제거되지 않았다. 농축된 M82-1 분획은 Sephadex LH-20 column chromatography (용출용매: 50% aq. methanol)를 수행하였고, 각 분획물은 HPLC 분석을 수행하였으며, 이를 바탕으로 7개의 분획(M821-1, M821-2, M821-3, M821-4, M821-5, M821-6, M821-7)으로 grouping 하였다. HPLC 분석은 아래의 조건으로 수행되었다.
HPLC system HITACHI Chromaster, HITACHI , Japan
Pump 5110, Autosampler 5210,
Column Oven 5310, PDA Detector 5430
분석조건
- Detecter: UV detector DAD
- Column: TSK-gel 100V (4.6 mm×250 mm, 5 ㎛), TOSOH, Japan
- Column Oven: 25 ℃
- Injection vol.: 10 μL
- Mobile phase: A, methanol, B, 5% aq. methanol (0.04% TFA)
7개의 분획 중 M821-4, M821-5 분획에서 활성을 나타내어, preparative HPLC (3rd 증류수)를 수행하여 활성물질 M821-4-8, M821-4-9를 정제하였다.
NMR 분광분석으로부터 본 화합물의 화학구조를 L-페닐알라닌과 안트라닐산으로 동정하였다. 첫 번째 화합물(M821-4-8)은 chiral column을 이용한 HPLC 분석을 수행한 결과 입체구조를 L-페닐알라닌으로 결정되었다 (도 3). 이의 확인을 위하여 ESI-mass 분석을 수행하였다. positive mode에서 측정한 결과 m/z 166.3에서 [M+H]+ peak, negative mode에서 측정한 결과 m/z 164.1에서 [M+H]+ peak가 관찰되어 분자량이 165임을 확인하였다 (도 4).
또한, 두 번째 화합물(M821-4-9)은 안트라닐산으로 결정되었다 (도 5). 이의 확인을 위하여 ESI-mass 분석을 수행하였다. positive mode에서 측정한 결과 m/z 138.3에서 [M+H]+ peak, negative mode에서 측정한 결과 m/z 136.2에서 [M+H]+ peak가 관찰되어 분자량이 137임을 확인하였다 (도 6).
실시예 4. L-페닐알라닌과 안트라닐산의 농도별 살조효과 비교분석
본 발명의 L-페닐알라닌과 안트라닐산 화합물을 이용하여 DMSO (Dimethyl sulfoxide)에 1,000ppm의 농도로 희석하여 적조 원인 종인 코클로디니움 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides)에 농도별로 처리하고 24시간 후에 살조효과를 분석하였다. 그 결과, 도 8과 9에서 보는 바와 같이 10ppm의 농도로 처리한 경우 각각 L-페닐알라닌은 68% 그리고 안트라닐산은 49%의 살조효과를 확인할 수 있었다.
실시예 5. 다른 미세조류종들에 대한 L-페닐알라닌과 안트라닐산의 살조효과 비교조사
본 발명의 정제된 L-페닐알라닌과 안트라닐산을 10ppm의 농도로 우리나라 해역에서 분리된 총 6종의 미세조류를 사용하였다. 와편모조류에 속하는 코클로디니움 폴리크리코이데스 (Cochlodinium polykrikoides LIMS-PS-2335), 알렉산드리움 타마렌스 (Alexandrium tamarense)와 알렉산드리움 인수에툼 (Alexandrium insuetum LIMS-PS-2305) 그리고 규조류에 속하는 탈라시오시라 웨이스플로기 (Thalassiosira weissflogii LIMS-PS-0545)와 케토세로스 심플렉스 (Chaetoceros simplex LIMS-PS-0608) 그리고 침편모조류인 헤테로시그마 아카시오 (Heterosigma akashiwo LIMS-PS-2143)에 대해 살조능이 있는지 확인 및 비교하였다. 적조원인 종인 코클로디니움 폴리크리코이데스와 알렉산드리움 타마렌스에 대해 각각 75%와 60% 이상의 살조능을 나타낸 반면, 알렉산드리움 인수에툼과 규조류 그리고 침편모조류에서는 20% 미만의 매우 낮은 살조능을 나타내는 것을 확인하였다. (도 9)
이상, 본 발명을 예시적으로 설명하였으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의해서 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (17)

  1. 기탁번호가 KCTC18769P인 살조 활성을 가지는 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 살조 활성은 와편모조류에 대한 살조 활성인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제3항에 있어서, 상기 와편모조류는 알렉산드리움 아핀(Alexandrium affine), A. 미누텀(A. minutum), A. 루시타니컴(A. lusitanicum), A. 타마렌스(A. tamarense), A. 카테넬라 (A. catenella), A. 퍼시피컴(A. pacificum), A. 인수에텀(A. insuetum), 코클로디니엄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 쿨리아 카나리엔시스(Coolia canariensis), C.말라이엔시스(C. malayensis), 갬비에르디스커스 카리베우스(Gambierdiscus caribeaus), 짐노디니움 아우레올럼(Gymnodinium aureolum), G. 카테나텀(G. catenatum), G. 인스트리아텀(G. instriatum), 헤테로캡사 트리쿼트라(Heterocapsa triquetra), L.폴리에드럼(L. polyedrum), 또는 스크립시엘라 트로코이데아(Scrippsiella trochoidea)인 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 기탁번호가 KCTC18769P인 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양여액을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물
  6. 제5항에 있어서, 상기 적조는 와편모조류에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는 적조 방제용 조성물
  7. 제6항에 있어서, 상기 와편모조류는 알렉산드리움 아핀(Alexandrium affine), A. 미누텀(A. minutum), A. 루시타니컴(A. lusitanicum), A. 타마렌스(A. tamarense), A. 카테넬라 (A. catenella), A. 퍼시피컴(A. pacificum), A. 인수에텀(A. insuetum), 코클로디니엄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 쿨리아 카나리엔시스(Coolia canariensis), C.말라이엔시스(C. malayensis), 갬비에르디스커스 카리베우스(Gambierdiscus caribeaus), 짐노디니움 아우레올럼(Gymnodinium aureolum), G. 카테나텀(G. catenatum), G. 인스트리아텀(G. instriatum), 헤테로캡사 트리쿼트라(Heterocapsa triquetra), L.폴리에드럼(L. polyedrum), 또는 스크립시엘라 트로코이데아(Scrippsiella trochoidea)인 것을 특징으로 하는 적조 방제용 조성물
  8. 기탁번호가 KCTC18769P인 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리한 L-페닐알라닌 또는 안트라닐산을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물
  9. 제8항에 있어서, 상기 적조는 와편모조류에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는 적조 방제용 조성물
  10. 제9항에 있어서, 상기 와편모조류는 알렉산드리움 아핀(Alexandrium affine), A. 미누텀(A. minutum), A. 루시타니컴(A. lusitanicum), A. 타마렌스(A. tamarense), A. 카테넬라 (A. catenella), A. 퍼시피컴(A. pacificum), A. 인수에텀(A. insuetum), 코클로디니엄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 쿨리아 카나리엔시스(Coolia canariensis), C.말라이엔시스(C. malayensis), 갬비에르디스커스 카리베우스(Gambierdiscus caribeaus), 짐노디니움 아우레올럼(Gymnodinium aureolum), G. 카테나텀(G. catenatum), G. 인스트리아텀(G. instriatum), 헤테로캡사 트리쿼트라(Heterocapsa triquetra), L.폴리에드럼(L. polyedrum), 또는 스크립시엘라 트로코이데아(Scrippsiella trochoidea)인 것을 특징으로 하는 적조 방제용 조성물
  11. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 기탁번호가 KCTC18769P인 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양여액의 유효량을 적조 발생 지역에 처리하는 단계를 포함하는 적조를 방제하는 방법
  12. 제11항에 있어서, 상기 적조는 와편모조류에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는 적조를 방제하는 방법
  13. 제12항에 있어서, 상기 와편모조류는 알렉산드리움 아핀(Alexandrium affine), A. 미누텀(A. minutum), A. 루시타니컴(A. lusitanicum), A. 타마렌스(A. tamarense), A. 카테넬라 (A. catenella), A. 퍼시피컴(A. pacificum), A. 인수에텀(A. insuetum), 코클로디니엄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 쿨리아 카나리엔시스(Coolia canariensis), C.말라이엔시스(C. malayensis), 갬비에르디스커스 카리베우스(Gambierdiscus caribeaus), 짐노디니움 아우레올럼(Gymnodinium aureolum), G. 카테나텀(G. catenatum), G. 인스트리아텀(G. instriatum), 헤테로캡사 트리쿼트라(Heterocapsa triquetra), L.폴리에드럼(L. polyedrum), 또는 스크립시엘라 트로코이데아(Scrippsiella trochoidea))인 것을 특징으로 하는 적조를 방제하는 방법
  14. 기탁번호가 KCTC18769P인 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주로부터 분리한 L-페닐알라닌 또는 안트라닐산의 유효량을 적조 발생 지역에 처리하는 단계를 포함하는 적조를 방제하는 방법
  15. 제14항에 있어서, 상기 적조는 와편모조류에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는 적조를 방제하는 방법
  16. 제15항에 있어서, 상기 와편모조류는 알렉산드리움 아핀(Alexandrium affine), A. 미누텀(A. minutum), A. 루시타니컴(A. lusitanicum), A. 타마렌스(A. tamarense), A. 카테넬라 (A. catenella), A. 퍼시피컴(A. pacificum), A. 인수에텀(A. insuetum), 코클로디니엄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 쿨리아 카나리엔시스(Coolia canariensis), C.말라이엔시스(C. malayensis), 갬비에르디스커스 카리베우스(Gambierdiscus caribeaus), 짐노디니움 아우레올럼(Gymnodinium aureolum), G. 카테나텀(G. catenatum), G. 인스트리아텀(G. instriatum), 헤테로캡사 트리쿼트라(Heterocapsa triquetra), L.폴리에드럼(L. polyedrum), 또는 스크립시엘라 트로코이데아(Scrippsiella trochoidea)인 것을 특징으로 하는 적조를 방제하는 방법
  17. 기탁번호가 KCTC18769P인 픽티바실러스 속 (Fictibacillus sp.) 5A8M 균주를 배양하는 단계를 포함하는 적조 방제용 조성물의 제조 방법
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