KR20140118411A - 해초 외생적 세균 스트렙토마이세스 비올라세오루베르 ｓｃｈ―09의 배양 추출물로부터 분리된 화합물 및 이를 포함하는 방오제 - Google Patents

해초 외생적 세균 스트렙토마이세스 비올라세오루베르 ｓｃｈ―09의 배양 추출물로부터 분리된 화합물 및 이를 포함하는 방오제 Download PDF

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Abstract

해초와 관련된 세균은 방오 화합물을 생산하여 숙주 생물을 생물부착으로부터 보호하는데 돕는 역활을 한다. 방오 화합물을 개발하기 위하여, 외생적 세균을 해초로부터 분리하고, 배양 추출물을 스크리닝하였다. 활성의 표생성 세균은 운다리아 핀나티피다(Undaria pinnatifida)로부터 분리하였으며 16S rDNA 서열 분석을 기초로 하여 스트렙토마이세스 비올라세오루베르(Streptomyces violaceoruber)로 확인하였다. 배양 추출물로부터, 2개의 활성 화합물을 실리카 겔 크로마토그래피 및 고 성능 액체 크로마토그래피로 분리하였다. 구조를 핵 자기 공명 및 고 분해능 전자 이온화 질량 분석법으로 분석하였다. 화합물은 푸라논 유도체: 3-옥타-1',3'-디에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온(1)(omF1), 및 3-옥타-1'-에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온(2)(omF2)으로 확인되었다. 이들 화합물은 다음의 부착 생물: 구멍갈파래[울바 페르투사(Ulva pertusa)]의 유주자, 조류 나비쿨라 안넥사(Navicula annexa), 및 홍합 미틸루스 에둘리스(Mytilus edulis)에 대해 0.02 내지 0.1㎍/ml의 EC50 범위의 방오 활성을 나타내었다. 어린 세바스테스 슐레겔리이(Sebastes schlegelii) 어류, 브라인 슈림프(brine shrimp) 아르테미아 살리나(Artemia salina) 및 미세조류 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica)에 대한 급성 독성 시험에서, 상기 2개 화합물은 각각 13.9 내지 118.9 및 14.8 내지 81.9㎍/ml의 LC50의 범위를 나타내었다.

Description

해초 외생적 세균 스트렙토마이세스 비올라세오루베르 ＳＣＨ―09의 배양 추출물로부터 분리된 화합물 및 이를 포함하는 방오제{Compounds isolated from a culture extract of seaweed epibiotic bacteria Streptomyces violaceoruber SCH-09 and an antifouling agent comprising the same}
본 발명은 구멍갈파래[울바 페르투사(Ulva pertusa)]의 유주자, 조류 나비쿨 라 안넥사(Navicula annexa), 및 홍합 미틸루스 에둘리스(Mytilus edulis)에 대해 방오 활성을 갖는 화합물에 관한 것이다.
해양 환경에서, 천연 및 인공 기층(man-made substrata)은 "생물부착(biofouling)"으로 간주되는 과정에서 부착 생물(fouling organism)들에 의해 신속하게 군체형성(colonization) 또는 군집화된다[1,2]. 생물부착은 전세계에서 수 생태계, 양식업, 및 해군에게 심각한 문제들을 유발한다[3]. 부착 생물은 그물 개방(net openings)을 제한하고 수류(water flow)를 감소시킴으로써[4], 양식업에서 부영양화를 초래하고[5], 산업용수 파이프 내의 수류를 감소시킨다. 선박에서 부착은, 선박 운송에 의한 외래종(non-indigenous species: NIS)의 의도되지 않은 도입을 통하여 생태계 변화를 유발한다[6]. 수개의 연구들이, 생물부착이 NIS의 분포에 있어서 중요한 역활을 담당했다고 보고하였다[7]. 갈라쉬(Gallash)[6]는, NIS 도입의 경로가 모든 선박평형수 샘플(ballast water sample) 중 38%, 모든 정착 샘플(settlement sample) 중 57% 및 모든 선체 샘플의 96%에서 기록되었다고 보고하였다. 이들 데이타는, 선체 부착이 도입의 지배적인 매개체임을 지적하였다. NIS는 먹이 연쇄 역학(food chain dynamics)에서 서식지의 과번식 및 변화로 인해 생태학에서의 부정적인 영향을 나타내었다[8]. 부착 생물을 방지하기 위하여, 이르가롤 및 디우론과 같은 부착방지 화학물질을 함유하는 도료(coating)가 적용되어 왔으나, 이들은 환경 오염을 유발하며 비-표적 생물에게 독성이어서, 광합성 억제 및 발암 활성을 유발한다[9-11].
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당해 분야에서 도입된 가장 효과적인 제제인 트리부틸틴-계 방오제의 사용이 2001년도에 국제 해사 기구(International Maritime Organization)에 의해 금지된 이래로, 많은 연구들이 부착 생물을 방지하기 위한 무독성 방오제의 개발에 중점을 두어 왔다.
최근에, 부착 생물을 방지하기 위하여, 이르가롤 및 디우론과 같은 부착방지 화학물질을 함유하는 도료가 적용되어 왔으나, 이들은 환경 오염을 유발하며 비-표적 유기체에게 독성이어서, 광합성 억제 및 발암 활성을 유발한다[9-11]. 또한, 최근에 대안적인 방오제로서 이르가롤, 디클로로풀루아니드, 및 디우론이 비-표적 생물에 대해 독성이며 해양 환경내에 축적된다는 것이 보고되었다. 따라서, 당해 분야에서 환경 친화적인 방오 화합물이 지속적으로 요구되고 있다.
방오제를 개발하기 위하여, 본 발명에서는, 해초와 관련된 세균이 방오제를 생산함으로써 숙주 해초를 보호하는 것으로 고려되어 있어 해초의 엽상체로부터의 95개의 세균 균주를 분리하여 이들의 방오 활성에 대해 스크리닝하였다. 그 결과, 세균 스트렙토마이세스 . 비올라세오루베르(Streptomyces . violaceoruber) SCH-09(NCBI 수탁번호 제AF503492호)로 부터 우수한 방오 활성을 가진 2개의 화합물, omF1 및 omF2를 분리하였으며, 이들 화합물들을 분석한 결과, 각각 불포화된 에닐-옥탄 및 디에닐-옥탄을 측쇄로 갖는 푸라논 그룹에 속하는, 3-옥타-1',3'-디에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온 및 3-옥타-1'-에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온의 신규 화합물임을 확인하였다.
Figure pat00001
Figure pat00002
본 발명자들은 또한, 상기 푸라논 화합물 유도체를 대표적인 부착 생물인 구멍갈파래[울바 페르투사(Ulva pertusa)]의 유주자, 조류 나비쿨라 안넥사(Navicula annexa), 및 홍합 미틸루스 에둘리스(Mytilus edulis)에 대해 시험한 결과, 이들 화합물들이 상기 부착 생물에 대해 유의적인 방오 활성을 가진 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 제공하는 2개의 푸라논 유도체, 3-옥타-1',3'-디에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온 및 3-옥타-1'-에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온은 대표적인 부착 생물인 구멍갈파래(울바 페르투사)의 유주자, 조류 나비쿨라 안넥사, 및 홍합 미틸루스 에둘리스에 대해 유의적인 방오 활성을 나타내며, 따라서, 전세계에서 생태계, 양식업, 및 해군에게 심각한 문제들을 유발시키는 생물부착을 방지하는데 효과적이다.
도 1은 해초 관련된 스트렙토마이세스 비올라세오루베르 SCH-09 배양 추출물로부터 분리된 방오 화합물의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 omF1의 주요 상관관계 분광법(COSY)(굵은 활자체) 및 이종핵 다중-밴드 상관관계 분광법(HMBC)(화살표)를 도시한 것이다.
환경 친화적인 방오 화합물을 개발하기 위한 노력의 일환으로서, 본 발명은 해초 외생적 세균(seaweed epibiotic bacteria)에 촛점을 맞추고 있다. 해초는 외생적 세균용 영양물질을 제공하여 유기 물질을 주변 환경에 방출하며, 외생생물(epibiotics)은 부착 생물로부터 숙주 해초를 보호하는 것을 돕는다[12]. 외생생물의 2개의 이론적인 보호 메카니즘이 제안되어 왔다. 하나는 부착 생물에 대해 방어하기 위한 제2의 대사물질의 생산을 포함한다[13-15]. 다른 것은, 외생적 세균이 해초의 표면 위에 생물막을 형성하는 것이다[16]. 방오 화합물을 개발하기 위하여, 전자의 메카니즘이 본 발명에서 적용되었다. 외생적 세균 중 95개 균주를 해초로부터 분리하고, 이들의 배양 추출물을 방오 활성에 대해 스크리닝(screening)하였다. 2개의 신규한 방오 화합물이 균주 스트렙토마이세스 비올라세오루베르 SCH-09로부터 확인되었다. 방오 활성은 강성 부착성(hard fouling) 및 연성 부착성(soft fouling) 생물 둘다에 대해 평가되었다. 강성 부착 생물의 경우, 홍합 미틸루스 에둘리드가 선박 및 양식 그물에서 우세한 강성 오염 생물 중 하나로서 시험되었다[17]. 연성 부착 생물의 경우, 대표적인 부착성 조류인 구멍갈파래(울바 페르투사) 및 부착성 조류인 나비쿨라 안넥사를 시험하였다[18]. 본 발명은 활성 화합물의 분리 및 확인, 및 이들의 활성의 평가를 비-부착 생물에 대한 급성 독성 시험과 함께 기술한다.
물질 및 방법
해양 세균 분리 및 배양
앞서의 연구에서, 95개의 세균 균주를 2006년 6월부터 2009년 8월까지, 한국의 해안(강릉, 아야진, 포항, 부산, 및 안면도)으로부터 수집한 해양 대형조류 중 26개 종으로부터 수득하였다[19]. 당해 균주를 500ml의 AlBFeC 발효 배지(1ℓ의 해수 중 20g의 전분, 4g의 효모 추출물, 2g의 펩톤, 1g의 CaCO3, 0.04g의 Fe2(SO4)34H2O, 및 0.1g의 KBr, pH 7.8)를 함유하는 1ℓ 들이의 플라스크 속에서 20℃로 215rpm으로 진탕(shaking)시키면서 성장시켰다. 7일 후에, 앰버라이트(Amberite) XAD-7 수지[20g/ℓ; 제조원: 플루카(Fluka), 시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스 소재]를 배양 현탁액에 가하고, 슬러리를 다른 6시간 동안 진탕시켰다. 수지를 치즈직포(cheesecloth)로 여과하고 1ℓ의 탈이온수로 세척하여 염을 제거하였다. 수집된 수지를 500ml의 아세톤으로 용출시키고, 아세톤을 증발시켜 조 추출물(crude extract)을 생성시켰다. 95개 균주 배양물로부터 수득된 추출물을 방오 활성에 대해 시험하였다. 가장 활성인 SCH-09 균주는 16S rDNA 서열 분석을 기초로 하여 스트렙토마이세스 비올라세오루베르(Streptomyces violaceoruber)(NCBI 수탁 번호 제AF503492호)인 것으로 확인되었다. 당해 균주를 추가의 실험을 위해 사용하였다.
활성 화합물의 분리 및 확인
조류 정착에 대한 생검정-안내에 따른 분리 후, 방오 화합물을 분리하였다. 균주 SCH-09의 조 추출물을 C18 역상 액체 섬광 컬럼(50×300 mm; 제조원: YMC-겔, 일본 교토 소재) 크로마토그래피에 적용시켜, 수 중 20 내지 100% 메탄올의 단계별 구배로 용출시켜 9개 분획을 생성시켰다. 50% 메탄올로 용출시킨 활성 분획 4를 메탄올 속에 용해하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 적용시켰다. 분석은 아질런트(Agilent) 1200 액체 크로마토그래피 시스템[제조원: 아질런트 테크놀로지(Agilent Technology), 캘리포니아주 산타 클라라 소재] 위에서 수행하였다. 분리는 에클립세(Eclipse) XDB-C18(25cm x 9.4 mm i.d., 5μm; 제조원: 아질런트 테크놀로지) 위에서, 수 중 43% 아세토니트릴을 2 ml/분의 유속으로 220nm에서 UV 검출하면서 용출시켜 수행하였다. 분리된 화합물을 고-분해 전자분무 이온화 질량 분석법(high-resolution electrospray ionization mass spectrometry: HR-EIMS) 및 핵 자기 공명(NMR)을 기초로 확인하였다(참조: 표 1). HR-EIMS 스펙트럼은 JMS 700[제조원: 제올(JEOL), 일본 도쿄 소재] 위에서 양성 이온 모드로 수득하고, NMR 스펙트럼을 CD3CN을 사용하여 JNM-ECP 600 NMR 분광계(JEOL)로 수득하였다.
omF1 및 omF2에 대한 1H 및 13C-핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼 데이타
omF1 omF2
위치 δH [J(Hz)] δC δH[J(Hz)] δC
2 181.0 181.0
3 124.4 124.5
4 149.1 149.1
5 4.82 d, 4.71 d (16.0) 75.3 4.81 d, 4.69 d (16.0) 75.3
6 1.65 s 17.8 1.65 s (15.0) 17.1
1' 6.62 d (15.0) 125.1 6.31 d (15.0) 125.1
2' 6.54 t (15.0, 5.5) 129.2 5.83 dt 132.4
3' 6.35 t (14.5, 5.5) 124.6 1.87 m 33.2
4' 5.84 dt (14.5, 7.0) 132.8 1.34 m 29.5
5' 1.86 m 34.1 1.25 m 31.4
6' 1.34 m 31.9 1.24 m 31.9
7' 1.36 m 23.4 1.35 m 21.9
8' 0.91 t (8.0) 15.1 0.91 t (8.5) 15.4
생검정
방오 활성을 유. 페르투사(U. pertusa), 엔. 안넥사(N. annexa) 및 엠. 에둘리스(M. edulis)와 같은 대표적인 부착 유기체에 대해 측정하였다. 연성-부착 대형조류인, 유. 페르투사는 대한민국 서해안의 안면도로부터 2009년 7월에 수집하였다. 엽상체를 오토클레이브된 해수 속에서 세척하여 부스러기를 제거하고 12시간 동안 건조시켰다. 이들을 500ml의 해수를 함유하는 1ℓ 들이 플라스크에 이전시키고, 25℃에서 36시간 동안 100μmol/m2/s 강도의 광원에 노출시켜 포자 방출을 유도하였다. 생검정을 10% HCl로 12시간 동안 세정하고 탈이온수로 12시간 동안 세정한, 슬라이드 글래스(slide glass)를 포자 정착 부위로서 사용하여 12-웰 플레이트(well plate) 속에서 수행하였다. 3개의 슬라이드 글라스(2.5 x 1.5 cm)를 12-웰 플레이트 속에 수직으로 두고, 방출된 포자(3 x 104개 세포)를 3.5ml의 해수 속에 가하였다. DMSO 속에 용해된 각각의 화합물을 가하였다. 암실에서 20℃에서 6시간 후, 각각의 슬라이드 위에 정착된 다수의 포자를 계수하였다. 조류 억제 검정을 위해, 엔. 안넥사를 대한민국 해양 미세조류 배양 센터(Korea Marine Microalgae Culture Center: KMCC)로부터 제공받았다. 이를 F/2 배지[20] 속에서 20℃에서 70 μmol/m2/s의 광 강도하에서 12:12(광:암) 주기로 50 rpm으로 진탕시키면서 배양하였다. 엔. 안넥사(2.5 x 104개 세포/ml)를 수직으로 둔 슬라이드 글라스가 들어있는 12-웰 플레이트에 이전시키고, 시험 화합물을 가하였다. 플레이트를 7일 동안 항온처리하였다.
대표적인 강성 부착 생물인 엠. 에둘리스를 홍합 억제 검정을 위해 2008년 및 2010년 5월에 대한민국 부산의 해안가의 10m 깊이 아래에서 수집하였다. 성체 홍합(껍질 길이 5.5 ± 0.3cm)을 실험실로 수송하여 오토클레이브된 해수 속에서 세척하여 부스러기를 제거하였다. 세정된 홍합 각각을 300ml의 해수를 함유하는 1ℓ 들이의 플라스크내에 두고 암실에서 25℃로 항온처리하여 난자와 정자 방출을 유도하였다. 방출된 난자 및 정자를 각각의 플라스크로부터 별도로 입수하고, 24시간내에 수정시켰다. 유충을 정착 단계까지 3주 동안 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana)를 공급하여 재배하였다. 이들 중 약 20개를 3.5ml의 해수 속에 12-웰 플레이트로 이전시키고, 화합물을 웰에 가하였다. 플레이트를 암실에서 20℃에서 항온처리하여 유충이 정착되도록 하였다. 다수의 정착된 유충을 3일 후에 계수하였다. DMSO를 음성 대조군에 대해 사용하고 이르가롤을 양성 대조군에 대해 사용하였다.
치료가능 비(Therapeutic ratio)(LC50/EC50)
활성은 LC50/EC50 값의 치료가능 비로 표현하여 독성과 관련한 활성을 평가하였다[21]. LC50은 부착 생물 중 50%에 대한 치사 농도이고, EC50은 부착 생물의 정착을 50% 억제하는 유효 농도이다. DMSO 속에 용해된 각각의 화합물을 2배 일련 희석시켜 비-억제성 또는 비-치사성 농도를 달성하였다. LC50 및 EC50 값을 농도-반응 곡선의 추세선으로부터 계산하였다.
급성 독성 시험
비 표적 생물에 대한 급성 독성 시험을 미세조류 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 브라인 슈림프(brine shrimp) 아르테미아 살리나(Artemia salina) 및 볼낙 세바스테스 슐레겔리이(Sebastes schlegelii)를 사용하여 수행함으로써 당해 연구에서 분리한 화합물을 평가하였다. 미세조류 시험을 위해, 티. 수에시카(T. suecica)는 KMCC에서 제공받았으며, 배양 조건은 위에서 언급한 바와 동일하였다. 티. 수에시카(2.5 x 104개 세포/ml)를 시험 화합물이 들어있는 24-웰 플레이트내로 접종하고, 세포를 96시간의 노출 후 계수하였다. 브라인 슈림프 시험의 경우, 에이, 살리나(A. salina) 낭포는 웨스트우드 인더스트리(Westwood industry)(미국 유타주 그레이트 솔트 레이크 소재)로부터 구입하였으며 급성 독성 시험은 라오(Rao) 등이 기술한 변형 방법[22]을 사용하여 수행하였다. 부화된 에이. 살리나를 24시간 동안 인공 해수(1ℓ의 증류수 중 34g의 해 염) 속에서 항온처리하였다. 24시간 된 노플리우스(nauplius)의 20마리 유기체를 2ml의 인공 해수가 들어있는 24-웰 플레이트로 이전시켰다. 치사율을 실온에서 48시간 노출 후 기록하였다. 어류 시험을 위해, 48시간 미만의 에스 . 슐레겔리이(S. schlegelii)를 신-우 캄파니(Shin-Woo Company)(대한민국 서천 소재)로부터 구입하여 18℃에서 인공 해수 속에 실험 전 3일 동안 유지시켰다. 시험 과정은 수중 생물에 대한 독성 시험을 위해 미국 환경 보호국(United States Environmental Protection Agency)에서 기술한 것에 따랐다[23]. 고정된-재생(static-renewal) 및 혐기성 시험 시스템(non-aerated test system)을 적용시켰다. 10마리의 어린 어류를 200ml의 해수와 시험 화합물을 함유하는 시험 용기 속에 이전시켰다. 치사율을 96시간 노출 후 기록하였다. 화합물을 DMSO 속에 용해시키고 매 실험을 위해 사용하였다. 결과는 LC50 및 관찰할 수 없는 효과 값을 나타내는 농도(NOEC)로 표시하였다. 이르가롤을 양성 대조군에 대해 사용하고 DMSO를 음성 대조군에 대해 사용하였다.
통계학적 분석
모든 실험은 3회 수행하였다. 일원 배치 분산 분석(one-way analysis of variance)을 적용시켰다(ANOVA, p < 0.05).
결과
활성 화합물의 분리 및 확인
10ℓ의 배양물로부터의 조 추출물(1.6g)을 역상 액체 섬광 컬럼으로 분획화하였다. 50% 메탄올로 용출시킨 분획 4(208 mg)는 4.2㎍/ml의 EC50 값을 나타내었다. 이를 또한 에클립세(Eclipse) XDB-C18 속에서 역상 HPLC에 적용시켜 43% 아세토니트릴로 용출시킴으로써 4개의 화합물을 생성시켰다.
2개의 활성 화합물, omF1(21 mg) 및 omF2(9 mg)를 NMR 및 HR-EIMS 데이타를 해석하여 확인하였다. omF1의 분자식은 C13H18O2(양성 모드, m/z에서 [M+H]+: 207.1391, 계산치: 207.1384)이었다. 상관관계 분광법(COSY), 이종핵 다중 양자 상관관계(heteronuclear multiple quantum correlation), 및 이종핵 다중-밴드 상관관계 분광법(heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy: HMBC)과 함께 1H 및 13C-NMR 분석은 도 1에 나타낸 구조의 지정을 허용하였다. 1H-NMR 스펙트럼은 δ 0.91 (H-8') 및 1.65 (H-6)에서 2개의 메틸 양성자; δ4.82 (H-5), 1.86 (H-5'), 1.34 (H-6'), 및 1.36 (H-7')에서 4개의 메틸렌 양성자; 및 δ6.62 (H-1' 및 H-2'), 6.35 (H-3'), 및 5.84 (H-4')에서 4개의 메틴 양성자의 존재를 나타내었다. 13C-NMR 스펙트럼은 δ181.0 (C-2)에서 락톤 탄소; δ15.1 및 17.8(C-8' 및 C-6)에서 2개의 메틸 탄소; 및 δ34.1, 31.9, 23.4(C-5', C-6' 및 C-7')에서 3개의 메틸렌 탄소; δ34.1(C-5)에서 산소화된 메틸렌 탄소; δ125.1, 129.2, 124.6, 및 132.8(C-1', C-2', C-3', 및 C-4')에서 4개의 메틴 탄소; 및 δ124.4 및 149.1(C-3 및 C-4)에서 2개의 4급 탄소를 나타내었다. H-1' 내지 H-4'로부터의 일련의 COSY 상관관계는 4개의 메틴 양성자(단위 1)로 이루어진 4개의 탄소 단위의 확립을 허용하였다. H-5' 내지 H-8'로부터의 다른 일련의 COSY 상관관계는 3개의 메틸렌 양성자와 1개의 메틸 양성자(단위 2)로 이루어진 4개의 탄소 단위의 확립을 허용하였다. 단위 1은 H-1'로부터 C-2, C-3, 및 C-4까지의 HMBC 상관관계로 확장시켰다. 4급 탄소(C-4)를 H-5 내지 C-4 및 H-6 내지 C-4로의 HMBC 상관관계에 의해 H-5 및 H-6에 연결시켰다. 당해 단편은 3-부타디에닐-4-메틸푸란-2-온으로 확립되었다. 단위 1 및 2를 H-3' 내지 C-5' 및 H-5' 내지 C-4'로 HMBC 상관관계에 의해 연결시켰다. 당해 정보는, 화합물 omF1의 구조가 3-옥타-1',3'-디에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온으로 확립되도록 하였다. 당해 올레핀성 결합의 기하학적 구조는 H-1'와 H-2'(15.0 Hz), 및 H-3'과 H-4'(14.5 Hz) 사이에 트랜스 인접 커플링 상수(trans vicinal coupling constant)를 기초로 1'E 및 3'E로 지정하였다(참조: 도 1a, 도 2). omF2의 분자 조성은 C13H20O2(양성 모드, m/z에서 [M+H]+: 209.1536, 계산치: 209.1541)이었다. omF2의 NMR 스펙트럼은 omF1의 것과 동일하였다. 1H-NMR 스펙트럼에서, H-3' 및 H-4'의 2개의 메틸렌 양성자 시그날이 omF1의 2개의 메틴 양성자 시그날대신 관찰되었다. 이들 데이타를 기초로 하여, omF2의 구조는 3-옥타-1'-에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온이었다(도 1b).
방오 활성
2개의 분리된 화합물(omF1 및 omF2)의 방오 활성을 해초 구멍갈파래(유. 페 르투사) 및 조류 엔 . 안넥사 및 홍합 엠. 에둘리스에 대해 시험하였다. 이들 화합물들의 활성은 하기 표 2에 나타낸다. LC50 및 EC50 값과 치료가능 비(LC50/EC50)를 계산하였다. 화합물 omF1의 EC50 값은 0.03 내지 0.1㎍/ml의 범위이었고, LC50 값은 4.7 내지 9.2 ㎍/ml의 범위이었다. 화합물 omF2는 시험한 유기체에 대해 0.02 내지 0.1㎍/ml의 EC50 값으로, 및 4.2 내지 7.5㎍/ml의 LC50 값으로 강력한 활성을 나타내었다. 이들 화합물들은 시험한 3개의 유기체에 대해 적어도 >92의 치료 비를 나타낸 반면, 양성 대조군(이르가롤)은 0.002 내지 0.08㎍/ml의 EC50 값, 0.01 내지 0.81㎍/ml의 LC50 값, 및 15 미만의 치료가능 비를 나타내었다.
스트렙토마이세스 비올라세오루베르 SCH-09로부터 분리된 푸라논 유도체의 치료가능비
시험 유기체 화합물
(㎍/ml)		 LC50 EC50 EC100 LC50/EC50
울바 페르투사

 omF1 4.7 0.05 0.205 94
omF2 4.2 0.03 0.114 140
이르가롤 0.01 0.005 0.008 2
나비쿨라 안넥사

 omF1 5.2 0.03 0.120 173
omF2 5.8 0.02 0.102 290
이르가롤 0.012 0.002 0.004 6
미틸루스 에둘리스

 omF1 9.2 0.1 0.43 92
omF2 7.5 0.1 0.28 94
이르가롤 0.81 0.08 0.17 8
LC50은 포자의 50%에 대한 치사 투여량의 농도를 나타낸다. EC50은 포자의 50%를 억제하는 최소 농도를 나타낸다.
급성 독성
2개 화합물의 급성 독성을 어린 에스 . 슐레겔리이 (S. schlegelii ) 어류, 브라인 슈림프 에이. 살리나, 및 미세조류 티. 수에시카에 대해 시험하였다. NOEC 값 및 LC50을 측정하고 표 3에 나타낸다. 전술한 방오 생물에 대한 omF1 및 omF2의 LC50 값은 부착 생물에 대해서보다 훨씬 더 높았다. 화합물 omF1은 에스 . 슐레겔리 이 어류, 브라인 슈림프 에이. 살리나, 및 미세조류 티. 수에시카에 대해 각각 56.4, 118.9, 및 13.9㎍/ml의 LC50 값을 나타내었다. omF2는 각각 40.1, 81.9, 및 14.8㎍/ml의 LC50 값을 나타내었다. omF1은 4.5 내지 41.1㎍/ml 범위의 NOEC 값을 나타내었고, omF2의 NOEC 값은 3.71 내지 32.6㎍/ml의 범위였다. 부착 생물에 대한 EC100 값은 0.102 내지 0.43㎍/ml의 범위이었다.
스트렙토마이세스 비올라세오루베르 SCH-09로부터 분리된 푸라논의 NOEC 및 LC50 값(㎍/ml)
생물 omF1 omF2 이르가롤
NOEC LC50 NOEC LC50 NOEC LC50
세바스테스 슐레겔리이 18.2 56.4 14.3 40.1 0.03 0.45
아르테미아 살리나 41.1 118.9 32.6 81.9 0.04 0.51
테타셀미스 수에시카 4.5 13.9 3.71 14.8 0.001 0.003
LC50: 생물의 50%에 대한 치사 투여량; NOEC: 관측된 효과 농도 없음
논의
도입된 가장 효과적인 제제인, 트리부틸틴-계 방오제의 사용이 2001년도에 국제 해사 기구에 의해 금지된 이래로, 많은 연구들이 부착 생물을 방지하기 위한 무독성 방오제의 개발에 중점을 두어 왔다. 최근에, 대안적인 방오제인 이르가롤, 디클로로풀루아니드, 및 디우론이 비-표적 유기체에 대해 독성이 있고 해양 환경내에 축적됨이 보고되었다. 방오제를 개발하기 위하여, 해초와 관련된 세균은 방오제를 생산함으로써 숙주 해초를 보호하는 것으로 고려되어 있으므로 본 발명에서 사용하였다. 2개의 방오 화합물, omF1 및 omF2가 분리되었으며, 부착 생물의 억제를 나타내었다. 이들 화합물의 방오 프로파일은 치료가능 비의 측면에서 측정하였다. >15의 치료가능 비는 효과적인 방오제를 결정하는 것으로 고려된다[24]. 2개의 화합물들은 시험한 유기체에 대해 92 내지 290 범위의 >15의 치료가능 비로 활성을 나타내었으며, 이는, 이들이 성공적인 방오제일 수 있음을 제안한다. 이르가롤은 <15의 치료가능 비를 나타내었다. 2개 화합물들을 또한 볼낙 에스 . 슐레겔리 이, 브라인 슈림프 에이. 살리나 및 미세조류 티. 수에시카를 포함하는 생물에 대해 시험하였다. 방오 화합물을 평가하기 위해, 비-부착 생물에 대한 NOEC 값을 부착 생물에 대한 EC100 값과 비교하였다. 값들(3.71 내지 41.1 ㎍/ml)은 EC100 값(0.102 내지 0.43 ㎍/ml)보다 적어도 8.6배 더 높았으며 이르가롤의 값은 0.001 내지 0.04㎍/ml이었고, EC100 값은 0.008 내지 0.17㎍/ml의 범위였다. 이들 데이타는, 시험한 비-부착 생물이 부착 생물에 대해 효과적인 농도(EC100)에서 이르가롤에 대해 민감성인 반면, 이들은 EC100에서 2개 화합물에 대해 비민감성임을 제안하였다. HPLC에 의한 화합물 분리 동안, omF1 및 omF2 외에 다른 2개의 화합물이 검출되었다. 이들 화합물을 가스 크로마토그래피-질량 분광계로 분석하여 9-옥타데센아미드 및 8-헵틸-펜타데칸으로 확인하였다. 9-옥타데센아미드는 구멍갈파래(울바 페르투사)의 유주자에 대해 EC50이 34 ㎍/ml인 약한 방오 활성을 나타내었으며, 8-헵틸-펜타데칸은 활성을 나타내지 않았다(데이타는 나타내지 않음).
본 발명에서 분리한 활성 화합물은 푸라논 그룹에 속하며, 이들 부류 중 다수는 다양한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 보고되어 왔다. 예를 들어, 해양 스트렙토마이세스로부터 분리한 악티노푸라논은 마우스 비장세포 T-세포에 대해 세포독성을 나타내며[25], 슈도모나스 아우레오파시엔스(Pseudomonas aureofaciens)로부터 분리한 3-(1-헥세닐)-5-메틸-2-(5H)-푸라논은 항진균 활성을 나타내며[26], (5-옥소-2,5-디하이드로푸란-3-일)메틸 알카노에이트는 슈도모나스 QS 시그날링 및 생물막 형성을 억제한다[27]. 수(Xu) 등[28]은, 푸라논 부류의 9개 화합물들이 해양 스트렙토마이세스로부터 분리되었으며 방오 활성을 나타내었음을 보고하였다. 이들은 다양한 알킬 측쇄를 가진 2-푸라논 환을 가지며, 2-푸라논 환은 알킬 측쇄에 따라 상이한, 방오 활성에 간여하는 중요한 기능성 그룹이다. 측쇄들은 포화된 하이드록실 옥탄 및 메틸 헵탄이다. 본 발명에서 분리된 2개의 푸라논(omF1 및 omF2)은 각각 불포화된 에닐-옥탄 및 디에닐-옥탄을 가지며, 이는 신규한 것이다. 이들과 가장 유사한 구조는 진균 포도스포라 아펜디쿨라타(Podospora appendiculata)로부터 분리된 3-(8-하이드록시논-1-에닐)-4-메틸푸란-2(5H)-온[29]이며, 이 경우 측쇄에서 다수의 탄소 및 하이드록실 그룹은 omF1 및 omF2와 상이하다.
결론적으로, 2개의 푸라논 유도체가 에스. 비올라세오루베르 SCH-09로부터 분리되었으며, 유의적인 방오 활성을 나타낸다. 이들은 해초 운다리아 핀나티피다(Undaria pinnatifida)의 엽상체의 표면으로부터 분리하였다. 대형조류의 표면은 세균 집단에 대한 숙주이며[30-31], 대형조류는 유기 탄소를 환경에 방출함으로써 이들에게 영양물을 제공한다[32]. 외생적 세균은 방오 화합물을 생산하여 해초를 보호하는 것으로 밝혀졌다[33]. 이들이 개발은 해양 생태학 및 방오 도료 공업에 가치가 있다. 공급 결핍과 관련된 문제를 해결하기 위해, 당해 균주의 최적 배양 조건을 연구하는 것은 후속 연구의 가치있는 주제가 될 것이다. 본 발명은 측쇄 에닐-옥탄 및 디에닐-옥탄을 함유하는 푸라논을 측정하기 위한 최초의 발명이다.
본 발명에 의해 해초와 관련된 스트렙토마이세스 비올라세오루베르 SCH-09로부터 분리된 3-옥타-1',3'-디에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온 및 3-옥타-1'-에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온은 해양에서 부착 생물, 특히 구멍갈파래(울바 페르투사), 조류 나비 쿨라 안넥사, 및 홍합 미틸루스 에둘리스의 부착을 억제하며, 해양에서의 다른 비-표적 생물에 대한 이들 화합물들의 LC50 값은 상기 부착 생물에 대한 LC50 값보다 훨씬 높다. 따라서, 상기 화합물들은, 해양에서의 다른 생물에 독성이 있으며 해양 환경내에 축적되어 환경 오염을 유발하는 당해 분야에서의 기존의 방오 화합물인 이르가롤, 디클로로풀루아니드 및 디우론과 달리, 선박용 도료 분야에서 환경친화적인 방오제로 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 화학식 1의 3-옥타-1',3'-디에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온:
    화학식 1
    Figure pat00003
  2. 화학식 2의 3-옥타-1'-에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온:
    화학식 2
    Figure pat00004
  3. 제1항에 있어서, 해초와 관련된 스트렙토마이세스 비올라세오루베르(Streptomyces violaceoruber) SCH-09(NCBI 수탁번호 제AF503492호)의 배양 추출물로 부터 분리되는 화합물.
  4. 제2항에 있어서, 해초와 관련된 스트렙토마이세스 비올라세오루베르(Streptomyces violaceoruber) SCH-09(NCBI 수탁번호 제AF503492호)의 배양 추출물로 부터 분리되는 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 방오 활성을 나타내는 화합물.
  6. 제2항에 있어서, 방오 활성을 나타내는 화합물.
  7. 제5항에 있어서, 방오 활성이 해양에서 부착 생물인 구멍갈파래[울바 페르투사(Ulva pertusa)]의 유주자, 조류 나비쿨라 안넥사(Navicula annexa), 및 홍합 미 틸루스 에둘리스(Mytilus edulis)에 대한 활성인 화합물.
  8. 제6항에 있어서, 방오 활성이 해양에서 부착 생물인 구멍갈파래[울바 페르투사]의 유주자, 조류 나비쿨라 안넥사, 및 홍합 미틸루스 에둘리스에 대한 활성인 화합물.
  9. 하기 화학식 1의 3-옥타-1',3'-디에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온 및 하기 화학식 2의 3-옥타-1'-에닐-4-메틸푸란-2(5H)-온로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 환경친화적 방오제.
    화학식 1
    Figure pat00005

    화학식 2
    Figure pat00006
  10. 제9항에 있어서, 해양에서 부착 생물인 구멍갈파래(울바 페르투사), 조류 나 비쿨라 안넥사, 및 홍합 미틸루스 에둘리스의 부착을 방지하는 친환경적 방오제.
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