KR100737446B1 - 구제역바이러스 구조단백질 유전자를 함유하는재조합베큘로바이러스 및 이를 이용한 재조합 단백질의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역바이러스를 구성하는 구조단백질을 코딩하는 유전자와 비구조단백질인 3C 유전자를 적어도 포함하는 재조합베큘로바이러스를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 재조합베큘로바이러스를 숙주세포에 형질전환시켜 구제역바이러스 백신용 항원 및 진단용 항원제시용 재조합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

베큘로바이러스, 백미드, P1, 3C, 항원

Description

구제역바이러스 구조단백질 유전자를 함유하는 재조합베큘로바이러스 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법{Recombinant Baculovirus Comprising Genes Coding Structural Proteins of FMDV and Production Method of Recombinant Protein}

도 1은 국내 분리 구제역 바이러스의 P1과 3C 단백질을 코딩하는 유전자를 베큘로바이러스 발현 벡터 pFastBacDual에 클로닝한 모식도이다.

도 2는 재조합 베큘로바이러스가 감염된 Sf9 세포에서 발현된 구제역 바이러스의 P1-3C항원을 구제역 음성 혈청, 구제역 양성 혈청, 구제역 특이 단클론 항체를 이용하여 간접형광항체 검출법으로 검출한 각각의 사진이다.

도 3은 CsCl을 이용하여 발현 단백질을 침강별로 분획 회수한 후 면역크로마토 스트립을 이용하여 발현된 단백질의 반응성을 확인하였고, 또한 VP1 특이 단클론 항체를 이용하여 웨스턴블롯을 실시한 사진이다. 1-4 레인은 발현된 구제역 바이러스 P13C 단백질이며 5번 레인은 감염되지 않은 대조 Sf9세포이고, 6번레인은 야생형 AcMNPV 감염세포의 용해액이고, M은 Intron사의 단백질 크기 마커이다.

도 4는 재조합 베큘로바이러스에서 발현된 구제역 P13C 단백질이 자가 결합(self-assembly)된 것을 전자현미경으로 관찰한 사진이다. 그 단백질의 크기는 직 경 7-8nm를 나타낸다.

도 5는 재조합 단백질의 마우스에서의 면역원성 실험을 실시한 실험 결과이다.

도 6은 재조합 단백질과 돼지 구제역 양성 및 음성 대조 혈청을 이용한 ELISA법 실시 결과를 나타낸 그림이다.

도 7은 재조합 단백질과 소 구제역 양성 및 음성 대조 혈청을 이용한 ELISA법 실시 결과를 나타낸 그림이다.

본 발명은 구제역 바이러스 백신용 항원 및 진단용 항원의 제조에 사용될 수 있는 재조합베큘로바이러스에 관한 것으로, 보다 상세하게는 기존의 불활화 바이러스를 이용하는 백신 내지는 진단용 항원의 제조기술에 의존하지 않고, 유전자조작에 의하여 감염성이 없는 구조단백질로 구성되는 소단위체 제조를 가능하게 하는 재조합베큘로바이러스 및 이를 이용한 재조합단백질의 제조방법에 관한 것이다.

구제역(foot-and-mouth disease)은 가축에게 매우 중요한 질병으로 국제수역사무국(Office International des disease)에서 A급으로 분류하고 있는 질병이며 우리나라에서도 제 1종 가축전염병에 속한다. 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 등 발굽이 둘로 갈라진 모든 동물(우제류)이 감염될 수 있으며, 상기 질병은 전염성이 매우 강하며 감염초기에는 입술, 혀, 잇몸, 코, 발굽 사이 등에 수포가 생기고 체온이 급격히 상승되며 식욕이 저하되는 등의 증상이 나타나다가 급성폐사에 이르게 된다. 질병 발생에 따른 직접적인 피해 뿐만 아니라 발생국은 구제역이 발생할 경우, 비발생국에 동물 및 축산물을 수출하지 못하는 등의 국제적인 제재를 당하는 등 경제적으로 큰 피해를 입게 된다.

또한, 현재 사용되고 있는 구제역 백신 및 진단항원은 모두 감염성 바이러스를 불활화 하여 사용하고 있어 특수한 시설 및 기술을 필요로 하므로 이와 같은 시설 및 기술을 보유하고 있지 않은 나라에서는 사실상 위와 관련된 일을 하기가 어려운 실정이다.

본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 제시된 것으로, 그 목적은 일반적인 실험실 규모에서도 구제역 바이러스 백신용 항원 및 진단용 항원의 제조가 가능하며, 또한 감염성에 대한 우려가 없어 안전한 항원의 공급을 가능하게 하는 재조합베큘로바이러스를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합베큘로바이러스를 숙주세포에 형질전환시켜 구제역바이러스 백신용 항원 및 진단용 항원제시용 재조합단백질을 제조하는 방법을 제공함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 구제역바이러스를 구성하는 구조단백질을 코딩하는 유전자와 비구조단백질인 3C 유전자를 적어도 포함하는 재조합베큘로바이러스를 제공한다.

상기 재조합베큘로바이러스는 숙주세포내에서 펜타머(pentamer) 형태의 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는 능력을 가지고 있다. 상기에서 '재조합 단백질'은 감염성 야생형의 서브유닛과 구조적 성질을 대부분 보유하는 바이러스 구조단백질의 대부분 또는 모두로 구성되는 서브유닛 단위체를 의미한다. 상기 입자는 숙주세포와 상호작용하는 경우 적절한 핵산서열이 존재하지 않기 때문에 자손바이러스를 생산하는 능력은 결핍되어 있다. 상기 입자는 내부에 핵산을 포함하고 있지 않거나, 자손바이러스의 생산과는 관련성이 없는 RNA를 포함할 수는 있지만 전체적인 구조는 야생형의 서브유닛과 유사하다.

상기에서 재조합단백질은 캡시드를 구성하는 P1을 포함하며, 여기에는 VP1, VP2, VP3 및 VP4 단백질이 포함된다. 구제역 바이러스의 P1과 3C 유전자는 서열번호 1 및 2에 각각 나타낸 염기서열 또는 이들의 변형서열을 포함하며, 이때 변형서열이라 함은 서열번호 1 및 2에 나타난 염기배열과는 상이하지만, 상기 단백질 또는 이들과 삼차원적 구조가 동일한 단백질의 아미노산 배열로부터 추론될 수 있는 염기서열을 포함한다.

본 발명에 따른 재조합베큘로바이러스는 공지의 시판되는 전이벡터에 P1 및 3C 유전자를 삽입하고 이를 DH10Bac 컨피턴트 세포 등에 형질전환시켜 제조되어질 수 있다. P1 및 3C의 유전자의 증폭을 위해서 RT-PCR 방법이 이용될 수 있다. 상기에서 전이벡터는 바람직하게는 베큘로바이러스에서 유래된 폴리헤드린 프로모터와 p10 프로모터를 갖는 것이 좋으며, 예를 들어, 인비트로겐(Invitrogen)사의 pFastBac Dual과 같이 시판되고 있는 것을 이용하여도 좋다.

상기 전이벡터의 구체적인 제조과정은 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 수행하면 충분하며, 이에 따라 얻어지는 재조합 전이벡터는 DH10Bac 컨피턴트 세포 등에 형질전환시켜 재조합 바이러스를 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 재조합베큘로바이러스를 숙주세포에 감염시켜 재조합 구조단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 숙주세포는 통상적으로 곤충세포이며, 베큘로바이러스가 발현되기에 좋은 환경을 제공하는 한 특별한 종류에 한정될 필요는 없으며 유전자 발현을 위해 숙주시스템으로 개발된 것 또는 시판되고 있는 곤충세포로서, 에스에프(Sf) 계열의 세포, 특히 Sf9 등을 들 수 있다. 재조합베큘로바이러스의 감염은 통상적으로 제조사로부터 제공되는 트랜스펙션 과정이 그대로 적용될 수 있다.

숙주세포는 이미 알려진 배양조건하에 배양되며, 통상적인 발효산물의 회수방법에 따라 수집한 후 파쇄시켜 그로부터 재조합 단백질을 회수 및 정제할 수 있다. 이와 같이 제조되는 재조합 단백질은 구제역바이러스를 구성하는 구조단백질을 포함하며 항원으로서 제공되어진다. 상기 재조합 항원은 백신 용도 또는 구제역바이러스 진단용 항원으로서 제공되어질 수 있다. 상기 본 발명에 따라 제조되는 항원은 기존에 살아있는 바이러스를 불활화하여 이용되어온 백신 및 진단용 항원의 제조시 요구되는 특수한 시설 및 기술이 필요하지 않아 간단하게 제조할 수 있으며, 감염성이 없고, 장기간 보존해도 그 역가를 유지하는 장점을 가지고 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1> 구제역 바이러스 RNA 추출 및 cDNA합성

실험에 사용할 구제역 바이러스 O/SKR/2002는 국내 감염돈의 조직 및 수포에서 추출한 것을 사용하였다. 국내 발생한 감염돈의 조직 및 수포액을 균질화한 다음 구아니디움 티오시아네이트(guanidium thiocynate;GTC)을 함유한 용해 완충액 0.9㎖에 0.1㎖의 비율로 혼합하였다. 10분간 상온에서 실리카로 흡착한 다음 원심분리하여 상층액을 버리고 GTC를 함유한 세척액과 에탄올, 아세톤의 순서로 펠렛을 세척한 다음 56℃에서 건조시켰다. 여기에 RNase 억제제를 첨가한 정제수를 넣고 65℃에서 5분간 열을 가하여 RNA를 용출하였다.

상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 추출한 상기 RNA를 역 프라이머와 혼합하여 5분간 끊인 후, 즉시 얼음에 넣고 5분간 냉각시켜 10,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 첫 가닥(First-strand) cDNA는 1㎍의 전체 RNA, 40 유닛 RNAsin (Promega), 50mM Tris-HCl pH8.3, 3mM MgCl₂, 75mM KCl, 10mM DTT, 0.4mM dATP, 0.4mM dCTP, 0.4mM dTTP, 0.4mM dGTP 및 역 프라이머를 20㎕의 반응액에 넣고 42℃에서 2분간 반응시킨 다음, 2000 유닛의 역전사 효소(SUPERSCIPT II RNase H-Reverse Transcriptase, Gibco-BRL)를 첨가하여 42℃에서 50분간 반응시켜 합성하였다.

<실시예 2> 클로닝 된 PCR 산물의 베큘로바이러스 발현벡터 작성

구제역바이러스 방어 단백질로 알려진 P1 단백질과 이를 가공하여 활성형으로 바꾸어주는 것으로 알려진 3C 단백질에 대한 유전자를 베큘로바이러스 발현벡터에 클로닝하기 위하여 실시예 1에서 합성된 cDNA을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. PCR 프라이머는 유전자 은행에서 검색한 구제역의 유전자 서열을 참고로 하여 작성하였다. 클로닝을 편리하게 하기 위해 P1과 3C 유전자 증폭시 양쪽 끝에 각각의 제한효소와 인식부위를 삽입하였다. 구체적으로는 P1유전자 증폭시 전방프라이머는 개시암호인 ATG 바로 앞에 BamHI 인식부위를 넣고 후방프라이머는 멈춤암호인 TAA와 XbaI을 삽입하였다. 또한 3C유전자 증폭시에는 개시 암호인 ATG 바로 앞에 XhoI를 넣고 후방프라이머는 멈춤암호와 SphI을 삽입하였다. 보다 구체적으로는 P1 유전자 합성에 전방프라이머는 SEQ No.1의 BamHI-ATGGGACAGGAACACGCTGC이고 후방프라이머는 SEQ No.2의 XbaI-TTACTGTTTCACAGGCGCCA이 이용되었고, 3C 유전자 합성을 위해 전방 프라이머는 SEQ No.3의 XhoI-ATGAGTGGTGCTCCCCCGACTG이고, 후방 프라이머는 SEQ No.4의 SphI-TTACTCGTGTGGTTCGGGGTCG가 이용되었다. cDNA는 상기 합성된 프라이머와 Taq 중합효 소(Takara)를 사용하여 Gene Amp PCR 시스템 9600(Perkin Elmer)에서 95℃에서 5분간 변성시킨 후 50∼58℃ 1분, 72℃ 2∼5분, 92∼94℃ 1∼5분씩 30∼35회 순환 반응시킨 다음 50∼58℃ 1∼5분, 72℃ 2∼5분간 반응하여 증폭하였다. PCR을 이용하여 증폭된 DNA 단편은 제한효소 처리없이 바로 pGEM-T Easy 벡터(Promega)에 클로닝하였고, 염기서열 분석법은 dedeoxy chain dye terminator cycle sequencing-kit (PE-Bio-system)을 이용하였으며, 반응 후 유전자 자동염기서열분석기(ABI)를 사용하여 분석하였다. 분석된 유전자의 염기서열은 SEQ NO.5, 6와 같다. 클로닝 된 각각의 P1 및 3C 유전자를 정제 후 P1유전자에 대해서는 BamHI과 XbaI, 3C 유전자에 대해서는 XhoI과 SphI으로 절단한 다음, 상기 사용된 제한효소로 처리된 전이 벡터 pFastBac Dual (Invitrogen)에 클로닝하여 발현벡터 pFastBac Dual P13C를 작성하였다 (도 1).

<실시예 3> 재조합 백미드(Bacmid)의 작성

재조합 백미드를 작성하기 위해 DH10Bac (Invitrogen) 컨피턴트 세포(competent cell)가 사용되었다. 더욱 상세하게는 DH10Bac을 얼음에서 약 10분간 놓인 후 상기 pFastBac Dual P13C와 제조사의 지시대로 적당 양을 혼합한 후 30분간 얼음에 방치하였다. 42℃ 수조에서 45초간 열 충격 (heat shock)을 가하였고 2분간 얼음에 다시 방치하였다. 900ul의 배지를 첨가한 후 37℃에서 4시간 동안 진탕 배양 한 후 다양한 항생제가 함유된 배지에 접종하여 37℃에서 24시간에서 48시간 배양하였다. 자라나온 콜로니(colony)들 중 백색만을 선발하여 미니 프렙(mini- prep)을 실시하였고 원하는 재조합 백미드의 선발을 위해 PUC/M13 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 원하는 증폭 사이즈가 확인된 백미드만을 선발하여 재조합 바이러스 작성에 이용하였다.

<실시예 4> 재조합 바이러스의 작성

재조합 베큘로바이러스를 작성하기 위하여 트렌스펙션 킷트 (Invitrogen)를 사용하였다. 35mm 배양 플레이트에 Sf9세포를 4 x 10⁶의 양으로 넣은 후 1시간 실온에 방치한 다음 배지를 제거하고 새로운 배지로 3번 세척하였다. 5ul의 미니프렙 백미드를 항생제가 포함되지 않은 배지에 혼합하고 또한 약 5ul의 리포펙틴 (lipofectin; 0.1mg/ml)을 항생제가 포함되지 않은 배지에 혼합한 후 두 용액을 혼합하여 약 30분간 실온에 방치하여 상기 세척된 세포위에 한방울 씩 적하하였다.

27℃에서 5시간 배양 후 용액을 제거하고 10％ 우태아 혈청이 함유된 그레이스(Grace) 배지에서 4일간 배양하였다. 세포변성효과가 나타날 때 배양상층액을 취하여 다시 2계대하여 종독으로 사용하였다.

<실시예 5> 형광항체법에 의한 구제역 구조단백질 확인

재조합 바이러스가 감염된 세포를 4일간 배양한 커버슬라이드 글래스를 인산완충액으로 세척하여 건조 후 80％ 냉 아세톤으로 5분간 고정하였다. 이 커버슬라이드에, 구제역 바이러스를 마우스에 접종하여 본 실험실에서 생산한 구제역 구조 단백질 특이 단클론 항체, 구제역 감염 양성 소 혈청 그리고 대조 음성 혈청을 각각 적당량 희석하여 1시간 반응시키고 FITC가 접합된 각 동물의 2차 항체를 다시 1시간 반응시킨 후 현광현미경으로 특이적인 형광을 관찰하였다 (도 2).

<실시예 6> 면역 블로팅법에 의한 발현 단백질 확인

재조합 바이러스가 감염된 곤충세포인 Sf9세포를 4일간 배양 한 후 그 세포를 수확하여 세포를 3000rpm에서 30분간 원심 후 상층액을 버리고 세포 펠렛을 배양 배지의 1/10의 양의 트리톤-100이 1％ 함유된 인산완충액용액에 혼합하여 그 세포를 분해시킨 후 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하고 이를 니트로셀룰로스 종이에 전이하여 이 재조합 단백질에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 이용하여 면역 블로팅을 실시하여 발현 단백질의 특이 밴드를 확인하였다 (도 3).

<실시예 7> 엘라이자 법에 의한 구제역 재조합 구조 단백질의 확인

재조합 베큘로바이러스를 Sf9세포에 0.1 m.o.i되게 접종한 후 4-6일간 배양하면서 세포변성효과가 80-90％ 출현하였을 때 3,000rpm에서 30분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. 침전된 세포를 최초 배양액의 1/10되게 인산완충액으로 부유하고 -70℃에서 3번 얼리고 녹여 세포를 완전히 파괴한 다음 15,000rpm에서 40분간 원심하여 상층액을 수확하여 구제역 양성 혈청 및 음성혈청을 이용하여 ELISA 역가를 측정하였다. 생산된 재조합 구조단백질은 구제역 양성 혈청과는 높은 반응성을 나타낸 반면 음성혈청과는 거의 반응성을 보이지 않았다 (도 6, 7).

<실시예 8> 구제역 재조합 구조단백질의 농축 및 정제

상기 실시예 6에서 생산된 재조합 단백질을 세슘클로라이드 그래디언트(Cesium Chloride gradient)법을 이용하여 농축 및 정제를 실시하였다. 보다 상세하게는 40％ 와 5％의 세슘클로라이드 용액을 각각 제작한 후 이 두 용액을 선상 그래디언트가 형성되도록 초원심 튜브에 혼합한 후 베크만(Beckman) 초원심기를 이용하여 120,000g에서 6시간 원심을 실시하고 그래디언트의 각각의 분획 분석하여 농축된 재조합 단백질 분획만을 수확하고 이를 하루밤 동안 투석을 실시하여 농축 및 정제된 재조합 단백질을 획득하였다.

<실시예 9> 재조합 단백질의 전자 현미경에 의한 확인

상기 실시예 8에서 농축 및 정제된 재조합 단백질을 전자현미경 확인을 위한 시료로 사용하였다. 투과전자현미경 (TEM)에 의해 직경 약 7-8nm의 구제역 펜타머릭 소단위 (pentameric subunits)을 확인 할 수 있었다 (도 4).

<실시예 10> 재조합 단백질의 마우스에 대한 면역원성 실험

상기 실시예 8에서 제조한 재조합 단백질을 마우스의 근육에 3 주간격으로 2회 접종 후 6주까지 채혈하여 ELISA을 실시한 바 불활화 구제역 바이러스를 접종한 마우스보다는 약간 떨어지지만 구제역바이러스에 대한 항체가 형성된 것을 확인하였으며 결과는 도 5와 같다.

본 발명에 의하면 특별한 시설 및 기술이 필요하지 아니하며, 일반적인 실험실 규모에서도 구제역 바이러스 백신용 항원 및 진단용 항원의 제조가 가능하다. 따라서, 생산단가를 획기적으로 절감시키며, 또한 감염성에 대한 우려가 없어 안전한 항원의 공급이 가능해진다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 구제역바이러스를 구성하는 구조단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 코딩하는 유전자와 비구조단백질인 3C 유전자를 적어도 포함하는 재조합베큘로바이러스
2. 구제역바이러스를 구성하는 구조단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 코딩하는 유전자와 비구조단백질인 3C 유전자를 적어도 포함하는 재조합베큘로바이러스를 숙주에 트랜스펙션시켜 재조합 단백질을 제조하는 방법
3. 제 2항에 있어서, 숙주는 곤충세포인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질을 제조하는 방법
4. 삭제
5. 제 2항에 있어서, 구조단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4는 펜타머릭 소단위체를 형성하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질을 제조하는 방법

Images